HU229225B1

HU229225B1 - Dinucleotide crystals

Info

Publication number: HU229225B1
Application number: HU0201531A
Authority: HU
Inventors: Kenya Mori; Takanori Miyashita; Hideaki Maeda; Hiroshi Sato; Yutaka Noda
Original assignee: Inspire Pharmaceuticals Inc Raleigh
Priority date: 1999-06-30
Filing date: 2000-06-30
Publication date: 2013-09-30
Also published as: DE60006814T2; EP1191032A4; DE60021629T2; CN1144811C; PL202200B1; CN1359387A; BR0012205A; KR100593723B1; EP1362862A1; EP1191032B1; CZ20014502A3; ZA200110468B; EP1191032A1; US6617444B1; PL202176B1; ES2245431T3; PL352363A1; JP3421666B2; NO20016381D0; AU767136B2

Description

A találmány tárgya P¹-(2' -dazozicítioin 5'-) P⁴- {uridin. 5'}tetrafoszfát <dCP4U) vagy győgyászatilag elfogadható sóinak (erek után egyszerűen ,_;D€P4ű-ként utalunk rá a leírásban) kristályai, amelyek terápiás szerként használhatók krónikus hörghurut, orrmeiléküreg-gyulladás, és hasonlók kezelésére; eljárás a kristályok előállítására; és eljárás a dCP4U hatékony előállítására .

Az I általános képlettel kifejezett dCP4ü vagy sója:

ii'L.: 0 σ

OH

HO a P2Y2 purin receptor és/vagy P2Y4 purin receptor szelektív agonistája és egy olyan vegyület, amely valószínűleg terápiás szerként hasznosítható a krónikus hörghurut, orrmelléküreqgyuliadás, és hasonlók kezelésére (lásd WO 98/34942 számú közzétételi irat). Napjainkig nem volt lehetőség a dCP4U kristályos alakjának kinyerésére, és a dCP4U-t csak fehér por (fehér szilárd anyag) alakban állították elő fagyasztva szárítás útján. A hagyományosan nyert dCP4U porszerű termékek csak 82%-os tisztaságúak (HPLC-vel mérve). Különösképpen nehéz elválasztani a ki«9«. ♦ * < Χ«φ)ι * 9 Φ ♦:*» χ*Φ 99* 494 my ágként szolgáló uridin S*'-tri foszfátot (OTP) dCP4U~től, és a nagyon tiszta dCP4U~t csak nagy nehézségek árán állították elé hagyományosan alkalmazott ioncserés kromatográfia segítségével (WO 38/34942 számú PCT közzétételi irat). Az alacsony tisztaságú előbb említett fehér pornak hátránya a higroszkőpossága.. Következésképpen a d€F4ü~böl történő gyógyszer előállítását egy olyan speciális berendezésben kell elvégezni, amely-

OS ·*	nedvesség te	iijesen	szabályozott.	kiég a győ	í gy s z a r e I ő á 11 í
t ss a t	kő ve t ő en í s,	a termi	2két szorosan	kell csórna	tgoini. Továbbá,
mivel	a gyógyszer	nagyon	rövid ideig	használna	• t ő a porte rmék
gyenge	stabilitása	miatt,	ezért a dCP4>	1 nagyon t	aszta és stabil

kristályainak kinyerése a kívánatos,

A d€P4U-t 2* -dezoxicítidín 5* -monofoszfátből (dC'MP) és OTPbői állítjuk elő egy akti válószer, például dicik.lohex.ilkarbodíimi-d (DCC) alkalmazásával. Azonban a hagyományos eljárások számottevően alacsony előállítási hozamot biztosítanak? azaz a hozam körülbelül 8 tömeg % (lásd a WO 98/34942 számú PCT közzétételi irat 20. példája), és így soha nem képes gyakorlatban történő felhasználásra alkalmas eljárásként szolgálni. Ennek megfelelően, magas hozamú és ipari méretű dCP4ü előállítási eljárás kifejlesztése is kívánatos.

Az előzőek tekintetében a találmány tárgya olyan stabil dCP40 kristályok biztosítása, amelyek alkalmasak gyógyszerek előállítására. A találmány egy másik tárgya eljárás a kristályok előállítására. A taláimány egy még további tárgya hatékony eljárás, amely alkalmas a dCP4ü ipari méretű előállítására.

intenzív kutatásokat végeztünk a dCP4C stabilizálására, és azt találtuk, hogy 35 %-os vagy ennél nagyobb tisztaságú dCP4U ♦ V fc * fcfcfc fc fc fc X fcfcfcfc fc fcfc XKfc fcfc állítható elő aníoncserélő kromatográfia és aktív szenet elhalmaró kromatográfia (aktív szén-kromatográfia; komto-ínálása segítségévei és a dCP4U kristályok az ilyen nagy tisztaságú dCPiü-ból állíthatók elő. Az igy kapott dCP4D kristályok jelentősen nagyobb tisztaságúnak bizonyulnak» mint a hagyományosan előállított O.CP4D porok» valamint nem nedvességszivö hatásúak és nagy stabilitásűak.

Intenzív kísérleteket végeztünk a dCP4ü előállítására szolgáló eljárásokkal kapcsolatban drága DTP helyett olcsó nridin 5'-monofoszfát (bMP; alkalmazásának segítségével, és azt találtuk, hogy a dCPáü hatékonyan előállítható difenil-fosztoroklorldát (DPC) és a pirofoszfát (PPi) alkalmazásával. A találmány ezen felfedezéseken alapulva valósitható meg.

Ennek, megfelelően a találmány dCP4ü kristályokat biztosit.

A találmány eljárást Is biztosít a dCPáü kristályok előállítására, amely eljárás nyers dCPáü anioncserélő kromatográfia és aktív szén-kromatográfla segítségévei történő tisztításából és a hidrofil szerves oldószer tisztított dCPáü oldathoz történő hozzáadásából áll, hogy ezáltal képezzünk dCP4ü csapadékot kristályok alakjában.

A találmány egy eljárást is biztosít dCP4U előállítására, amely DMP, őCAP, DPC, és PPi reagáltatásából áll.

Az 1. ábra egy fénykép, amely a kristályos dCP4U-4N.a (3,5hidrát; kristály alakját mutatja be. A fényképet polarizáló mikroszkóp alatt készítettük (nagyítás: x44ö) , ahol az 1 mm a képen a valóságban 25 gm-nek felel meg.

A 2. ábra a kristályos dCPáUAba ' (3,ó-hidrát) röntgenéirfrakcióé spektrumát mutatja be.

* * za *«♦ X*X X* k r í s t á 1 νo s dC P 4 ü · 4 Na (de kahi d rá t) röntgeneiffrakciös spektrumát mutatja be,

A 4. ábra a fehér porszerű dCP4U (fagyasztva szári tort termék) röntgenéitfrakcíós spektrumát mutatja be.

Az 5. ábra a kristályos dCP4U-4Na {3,5-hlöiát) ^A3OCPMA.S*~MHR spektrumát mutatja be.

A 6, ábra a kristályos dCF4ü'4Ha (dekahidrát} ^I3C-~CPMAS-RMK spektrumát mutatja be.

A 7. ábra a fehér perszerű clCPáb (fagyasztva szárított termék) ¹³C-CPMAS-hMR spektrumát mutatja be.

A találmány szerinti dCP4Ü kristályokat a nyers dCP4U specifikus eszközökkel történő tisztításávai, majd egy hidrofil szerves oldószer tisztított dCP4U oldatához történő hozzáadásával nyerjük, melynek során a dCP4U-t kristályokként csapjuk ki. A találmányt ezek után a dCP4ü tisztításával íl) és a dCP4d átkristályositásával (2) kapcsolatosan fogjuk Ismertetni.

(1) A dCP4ü tisztítása

A dCP4U anioncserélő kromatográfiávaí tisztítható aktív szenes kromatográfiávaí kombinálva. Jóllehet a két kromatográfiás technika tetszés szerinti sorrendben végrehajtható, előnyösen az anioncserélö kromatográfia megelőzi az aktív szenes kromatográfiai, a dCP4d tisztaságának javítása érdekében.

Sztirolgyanta és ukriioyanta alkalmazható anioncserélö gyantaként az előzőekben ismertetett kromatográfiás technikák során. Az alkalmazható gyantákra példák magukban foglalják az erősen bázíkus anioncserélö gyantákat, ilyenek például az AMBERLITE 1RA 402 (Rohm & Haas Co.)_f DIAFON PA-312, és O1A1OR SA-11A (Mitsubishi Chemical Co. Ltd.),· és a gyengén bázikus anioncserélő > > ** gyantákat, ilyenek például az AMBERLITE IRA 67 (Rohm & Haas Co.} és DIAION WA-3Q (Mitshubishi Chemical. Co. Ltd.}.

Az aktív szén kromatográfiás tisztaságú aktív szén alakjában lehet, amelyeket aprítunk, és szemcsékké alakítunk, és amely magában foglalhatja a kereskedelemben kapható termékeket {például, a l^ako Fűre Chemical Industries, Ltd. és Futamúra Chemical Industries, Co_M Ltd. termékei)·.

A kromatográfia szakaszos módon hajtható végre egy oszlop alkalmazásával, stb. amikor oszlopkromatográfiát hajtunk végre vizes savoldatok vagy fokozott, ionerősségű sókkal,· például nátrium-kloriddal alkotott keverékei használhatók. eiuensként az anioncserélő kromatográfiához; illetve víz vagy egy bázis., például nát.ríum-hidro-xid vizes oldata használható eiuensként aktív szenes oszlopfcromatográfiához. Kisüzemi előzetes vizsgálatok végezhetők azért, hogy kiválasszuk az eiuensek megfelelő koncentrációit a 0,001 H és IC M közötti tartományból.

; .·:’5 A d^:·....:.··''·!;.; kristályosítása

A dCP4d~t az előzőek szerint tisztított dCP4ü-~t tartalmazó oldathoz egy hidrofil szerves oldószer hozzáadásán keresztül kristályosítjuk.

Az alkalmazható hidrofil szerves· oldószerekre példák magukban foglalják a hat vagy kevesebb szénatomos alkoholokat, például a metanolt és etanolt·; a ketonokat, például az a.cetont; étereket, például a dioxánt; nitrileket, például acetonitrilt; és amidokat, például dimet..il-f ormamidot. Ezek közűi az alkoholok, különösen az etanol a kifejezetten előnyös anyagok.

Részletesebben, az előzőek szerint tisztított dCP4ü oldatát, vagy az oldatok töményílésével kapott sűrű szussoenziót adott

4 XX» 4 * esetben a pH S-lö^:, előnyösen 6-9 értékre történő beállítás érdekében kezeljök, és egy hidrofil szerves oldószert adunk az oldathoz vagy sűrű szuszpenzióhoz €ö*C-on vagy alacsonyabb hőmérsékleten, előnyösen 2^:0°C-on vagy alacsonyabb hőmérsékleten, hogy a dCP4U stabil kristályaiként kicsapjuk az oldott anyagot..

Az ily módon nyert, találmány szerinti dCP4ü kristályai a dCP4ü-t 95 '%-os vagy ennél nagyobb mennyiségben, míg az UTP-t 3 %-os vagy ennél kisebb mennyiségben tartalmazzák. Előnyösen a dC?4ü kristályok 9? % vagy nagyobb mennyiségű dCP4U~t_f és 2 % vagy kisebb mennyiségű UTP-t tartalmaz. Még előnyösebben a tíCPáü kristályok 98 % vagy nagyobb mennyiségű. dC?4U-t, és 1 % vagy kisebb mennyiségű UT?~t tartalmaz.

Az ilyen nagytisztaságú dCIMO kristályok só, hidrát vagy hídrátsó alakúak lehetnek. A sókra példák a győgyászatilag elfogadható· sók, például az alkáli fémsók, például a nátrium sók és kálium sók; az alkáli földfém sók, például kalcium sók és magnézium sók; és ammónium sók, A dCPÚö 1-4 fématommal lehet helyettesítve sóképzés céljából.

A fenti hidrátok 1-14 molekula vizet tartalmazhatnak,, amelyek egy molekula dCPO-hoz kapcsolódnak vagy tapadnak, és a fenti hidrátsók 1-14 molekula vizet tartalmazhatnak, amelyek egy molekula dCP4U-alkálí fémsóhoz kapcsolódnak vagy tapadnak.

Ezen kívül a találmány szerinti dCP4ü kristályok a tautomereiket is magukban foglalják.

Az így nyert dCP4U kristályokat adott esetben egy szokásos eljárással, például alacsony nyomású szárítással, légár amos szárítással, vagy melegítéssel történő szárítással szárítjuk és ezt követően egy tartályba (például üveg, tasak, doboz, asitpulai he7 ·φ·ι

4>#« **♦ lyezzük. A tartályba történő -csomagolás úgy végezhető# hogy a tartályt kinyitjuk, bezárjuk# légmentesítjük#. vagy lezárjuk. A levegőre nyitott állapotú csomagolás ne® előnyös a kristályok tárolási stabilitásának fenntartása miatt.

A találmány szerinti dCP4U előállítási eljárása az ÖMP, dCHP# DPC# és PPi reakciójából áll.

Pontosabban az eljárás az U-MP DPC-vei történő reakciójából áll, ezáltal OMP-dif enil-foszf. átot (UMP-DPP) állítunk elő; az UMP-DPP-t tartalmazó reakcíóelegyet tovább kezeljük PPi-vel, ezáltal OTP képződik az elegyben; és az így kialakult OTP-t# az reakcio-elegytől történő elkülönítés nélkül# dCMP-vel reagáltakjók DPC jelenlétében#- ezáltal a megcélzott clCPéU képződik.

Az ÜMP-DPP UMP-ből történő szintézise során# szokásosan előállított üMP trialkilamin só {például UMP-tributílamin só) egy oldószerben oldható fel. Az oldószerekre példák az araidok, például a BMP és a dimeti1-aeetsm.d {DMAC); gyűrűs éterek# például dioxán -és- tetrahidrofurán; ketonok#· például aceton; és a dímetíl-imidazolidínon, hexametil-foszfortriamid# vagy ezek közül kettő vagy több elegye. Ezt követően DPO-t és a tetszés szerinti tríalkilamínt az oldathoz adjuk# és az eiegyet reagálni hagyjuk 10-50‘X-on körülbelül 30 per-c-S órán keresztül.

A PPÍ~k# amelyek az íMP-DPP~vei reagálnak, előnyösen PPiszerves alkáli sok. A sókra példák a hexilamin só, dibutilamir;

só, trietilamin só, és tríbntiiamin só.

Az UMP-DPP PPi-szerves alkáli sóval történő reakciójában, a PPi-szerves alkáli sót egy -oldószerben oldjuk. Ilyen oldószerekre példák az amidok, például a DJ4F, DMAC, és formamid; gyűrűs éterek, például dioxán és tetrahidrofurán; ketonok, például aceketonok .χ «Χ’Χβ **-*♦ * ** ♦ χ χ * X» *

XXX * »**« «XX XXX «** *** ** tón; és dimetilimidazolidinon, hexametil-foszfor-tríamid, dimeti 1-szulfoxid, acetonitrii, vagy ezek közül kettő vagy több elegye. Ezt követően az oldatot az ily módon előállított UMP-DPP oldathoz adjuk, és reagálni hagyjuk az elegyet lö-Sö^C-on körülbelül 30 perc“5 órán keresztül.

Az UHP-DPP és a PPi-szerves alkáli só közötti reakció elegendő mennyiségű bázis jelenlétében hajtható- végre, A bázisokra példák a piridin bázisok, például a piridin, 2,6-lutidin, 2,4.ütidin, a-pikolin, β-pikoiin, y-píko-lin,

2,4-dimetílaminoa oiridin külcnöpiridin, a-kollidih, β-koilidín és y-kollidin, sen előnyős. A reakcióhoz használható-- bázikus oldószer ís a találmányban használt bázisok közé tartozik- A bázis koncentrációja nem különösebben korlátozott. A bázist előnyösen 6 vagy több ekvivalens mennyiségben, előnyösebben 13 vagy több ekvivalens mennyiségben adagoljuk az üMP-t alapul véve.

Az üMP-DPP és PPi-s2erv.es alkáli só közötti reakció során

UTP~t állítunk elő a re akelőélégyben. Az igy képződött U’TP-t és dCMP-t PPC jelenlétében reagáltáljuk, ezáltal dCP4U-t állítunk elő.

Habár a dCMP önmagában adható a reakciőelegyhez, a dCMP dQ4P-difeni.l-foszfáttá idCMP-DPP) alakul át az HM? esetében al-

kaImazotthoz	hasonló módon,	majd a öCMP-DFP-t	is hozzáa*	Iható az
e .légyhez -
A dCPiü	reakció a kij	„ndu.lási. anyagként	alkalmazót	;t UhP-t
alapul véve	1,1 ekvivalens	vagy nagyobb menny	isé-gű DPC	és 0,5-
1,5 ekvivele?	is· vagy nagyobb	mennyiségű dCMP va<	gy ÖCMP-DF	P előző-
ebben ismert	.etettek szerín	t előállított ΠΤΡ	oldathoz	történő
K <7 -y χ, .-s g? íp Λ V^? ÍÍV á.'v!.íí,^VÁ»«J Cl V Ci .i	; hajtható végr	ti' f ΓΠ.3 } Q íl Q y' } ti K 3. Z	elegyet	reagálni

fcfc fc fc fcfc * < fc fc* fcfcfc fcfcfc fcfcfc lö-5G°C“on körülbelül 30 perc-S órán keresztül.

Az így kapott dCP4h-t az előzőekben ismertetett módon tisztítjuk és kristályosítjuk, ezáltal a találmány szerinti. dCP4U kristályokat nyerünk.

Példák

A találmányt a következőkben részletesebben a példák segítségével ismertetjük, amelyet nem kell a találmány azokra való korlátozásaként értelmezni.

1Példa. A dCP4ü'4Ma kristályok előállítása (1) DCC-t alkalmazó eljárás

A dCP4O-t egy rutin eljárással állítottuk elő a WO 98/34942 számú PCT közzétételi irat szerint OTP, dCPh? és DCC alkalmazásával. A reakciót 20 mmolos méretben végeztük.

Az így kapott dCP4O oldatot vízzel hígítottuk, hogy ezáltal a teljes térfogatot 1000 ml-re állítsuk be, és a hígított oldatot alkalmazzuk a közepesen bázikus anioncserélő gyantával •AMBERLITS IRA--67, a Rohm & Haas Co. terméked töltött oszlopon. Az elueiöt egymás után végeztük víz, 0,18 M vizes sósav oldat,

0,5 nátrium-klóridőt tartalmazó 0,005 (4 vizes sósavoldat alkalmazásával végeztük, ezáltal dCP4d-t tartalmazó frakciókat gyűjtöttünk. Az igy kapott ŐCP4U frakciókat (4000 ml; alkalmaztuk kromatográfiás minőségű aktív szénnel (Taíko Granuiar Activeted Charcoal SGP, a Futamura Chemical Industries, Co., Ltd.) töltött oszlopon, majd a dCP4U~t ö,05 M vizes nátrium-hídroxid oldat (9000 ml) alkalmazásával eluáltuk.

zeontjük	és	töményitjük.
e 1 ő. A	sűrű	szuszpenzió
penziót	keve	rtetjük, mi-

* Φ közben fokozatosan hozzáadjak az etanolt e sűrű sznozoenzióhoz, és a kapott sűrű szaszpenziot tovább kötjük lö ^cC-ra keverés mellett, ezáltal kicsapjuk a düP4ü-bba kristályokat, A kristályokat elválasztjuk, hogy 8,9 g dCPÍU-áda kristályokat kapjunk. A.z elkülönített kristályokat alacsony nyomáson körülbelül 60'%'on szárítjuk körülbelül 4 órán keresztül, majd ezek után műszeres vizsgálatnak vetjük alá.

{2} DPC-t alkalmazó eljárás üTP*3da-t (12,8 kg) vízben (135 1) oldunk, és a kapott oldatot egy kationcseréiö gyantával (a Mitshubísbi Chemical Co. Ltd. terméke) töltött oszlopon alkalmazzuk. Az oszlopon áthaladó oldatot és a vízzel elvált frakciókat, összeöntjük, majd az összeöntött oldathoz fokozatosan tríbutílamínt (TBA; 13,6' kg) adunk keverés mellett semlegesítés céljából. Az oldatot toményítjük, és formamídot (10 kg) adunk az oldathoz, A. kapott oldatot dioxánnal történő forralás segítségével dehidratáljuk, Ezt követően a dehldratált anyagot piridinnel (11,6 kg) hígítjuk, hogy az OTP piridín oldatát állítsuk elő.

Egy metanolt (IS 1) tartalmazó másik tartályhoz dCMP-t (7,5 kg) adunk. Az oldathoz TBA-t (4,5 kg) adunk fokozatosan keverés mellett, majd az oldatot 60'' -ra melegítjük. Miután az ad.kötőelemek feloldódnak az oldatot szárazra toményítjük. A száraz. anyagot tovább szárítjuk ?5°C-on, majd elporítjuk. Az elporitott anyagot (lö, 3 kg) dímetíiacetamídban. (DMAC) (16, 7 kg) szuszpendáljuk, majd difenll-foszforokloridátot ÍDPC) (4,4 kg) adunk a szuszpenziöhoz, és az elegyet lö percig keverjük. Est követően TBA-t (10,8) is adunk az elegyhez és a kapott elegyet 30 percig keverjük, hogy dCMP-EPP oldatot állítsunk elő.

φ ΦΦΦ'Χ ΦΦΦ* * ** φφφ φ φ* φ φ φ*» φφφ ·*· ♦** φ φ φ * φ * χφφ Φφφ ΦΦΦ ΧΦΦ Φ Φ

As így elkészített dCM'P-DPP oldathoz OTP pirldlnes oldatát adjuk keverés mellett, amelyet, az előzőekben említett módon állítunk elő. Az oldat hozzáadásának befejezése után az elegyet szobahőmérsékleten éjszakán át keverjük, majd a reakciót ioniaentesített víz hozzáadásával zárjuk le.

A fenti eíegyhez 30 %-os vizes náfríum-hidroxíd oldatot (31

1): adunk. Az elegyet 30 percig keverjük, és a felszabadult TBA-t egy elválasztó részen keresztül eltávolítjuk. 6 mol/1 sósavas oldatot adunk a vizes réteghez, hogy az oldat pH~ját körülbelül

7~re állítsuk be. Az oldatot az oldószer eltávolításával törnényitjuk és megegyező térfogatú 95 %-os etanoit adunk a tömény oldathoz. A kapott elegyet éjszakán át állni hagyjuk. Az elegy felső rétegét, azaz etanolos réteget egy szivóesövön keresztül eltávolítjuk és vizet adunk a kapott ragacsos csapadékhoz, hogy feloldjuk a csapadékot. A maradék oldószert az oldószer tömény!résével távolitjuk el.

Az ily módon előállított dCP4U oldat teljes térfogatát 2500 l-re állítjuk be, majd az oldatot egy közepesen bázikus anioncserélő gyantával (AMBEBLITR IRá-97, a Rohm & Haas Co. terméke) töltött oszlopon alkalmazzuk. Az eiucíót egymás után vízzel, 0,1 mol/l-es vizes sósavoldattal, és Q, 4 m.ol/1. nátriumkloridot tartalmazó 0,005 mol/1 vizes sósav oldattal végezzük, ezáltal d€P4ü-t tartalmazó frakciókat gyűjtünk össze.

Az így nyert dCP4H frakciókat {2100 1; egy kromatográfiás tisztaságú aktív szénnel (Tarkó Granular Activated Carbon 5GP,

Futamúra Chemical Industries, Co., Ltd, terméke) töltött oszlopon alkalmazzuk, majd a dCPád-t 0,05 mol/1 vizes nátriumhidroxid oldat (1200 1) alkalmazásával eluáijufc.

φ ** ♦ *·χ φ ««« «** * φ * * * *

ΦΦΧ ΦΧ-Χ #ΦΦ *♦

As Így nyert frakciókat összeöntjük és töményitjük. A kapott oldat pB-ját ?,5~re állítják be 30 %-os vizes nátrium-hidroxid oldat alkalmazásával. Az oldatot addig keverjük, amíg a 95 %~os etanol fokozatosan az oldathoz adjuk, ezáltal kicsapjuk a •áCP4U'4Na kristályokat. A kristályokat elválasztjuk, majd 60’íjon szárítjuk 4 órán át, hogy ezáltal 4,2 kg dCP4U'4Na kristályokat kapunk (víztartalom; 5,3 %, elkülönített hozam: 22 %) .

<A dCP4ü'4üa kristályok fizikai tulajdonságaid

Az 1 példa (11 vagy (2) pontjai szerint előállított dCP4ü‘4Na kristályokat és a WO 98/34342 számú PCT közzétételi Irat 20 példájában ismertetett eljárással azonos módon előállított dCP4ü'4Na fehér port (fagyasztva szárított termék) műszeres vizsgálatnak vetjük alá, A kristályokat a fizikai tulajdonságok tekintetében hasonlítjuk Össze a fagyasztva szárított termékkel. (3) Műszeres vizsgálat

1) Tisztasági vizsgálat

Az I példa (1) és (2) pontban nyert dCP40‘4Na kristályokat és a kromatográfiás lépésekkel történú tisztítás után kapott dCP4ü frakciókat tisztasági vizsgálatnak vetjük alá nagyteljesítményű folyadékkromatográfxa segítségévei. Az eredményeket az 1 és 2 táblázatban mutatjuk be, A nagyteljesítményű 1olyadékkromatögráfia körülményeit az alábbiakban ismertetjük.

Oszlop: HITACBIGEL #3013-N (a Hitachi Keísokuki. Service terméke) .

Eluens; lö % CihCN, 0,18 d NH«CI, 0,03 M KH₂PO₄, és 0,03' M

KdíPCu .

.at

Detektálási módszer: UV detektálás 252 nm hullámhosszon lázat (DCC eljárás)

	dCP4ü-tartalom (%)	OTP-tartalom (%)
Reakcíóelegy	55,0	28,6
'IS* kromatográfia után	(-)	C-)
A.C* kromatográfia után	97 , 4	0,4
Kristályosítás után	98, 3	0,4

ί~) : nem mértük., *j : IS: ioncserélő, AC: aktív szenes 2 táblázat (DPC eljárás)

	dC P 4 ü -1 a r t a 1 om (%)	UTP-tartalora (%)
Reakcíóelegy	55,0	28,6
IS* kromatográfia után	(...)	(-)
AC* kromatográfia után	97,4	0,4
Kristályosítás után	98, 3	0,4

(-) :: nem mértük, *) : IE: ioncserélő, AC: aktív szenes

2) Krístálya.lak

Az 1 ábra mutatja a dCEiü*4Na (3,5-hidrát) kristályok jellegzetes kristályalakjainak fényképét,

3) Víztartalom

A dCP4U’4Ka kristályok víztartalmát Kari Fischer módszerrel mérjük.. A dCPáü-áNa kristályokról azt találtak, hogy 6,9-17,4 tömeg % közötti víztartalomnál stabilizálódnak, amely a szárítás mértékének megfelelően változik, A számítási eredmények kétségtelenül azt mutatják, hogy 3,5-10 vízmolekula kötődik vagy tapad egy dCP4U molekulához.

4) Olvadáspont

A dC?4U’4Na kristályok olvadáspontját hagyományos eljárással mérjük, Az olvadáspontot 2Q2~210*€~nak találtuk, A fagyasztva, szárított termék olvadáspontja 195~210°€ körüli volt.

5; Ront gén d i f f ra k e ie

ΦΦ χ * » * χχχ «χχ * «**

X χ X * *

Χ9Χ XXX XXX ♦*» * *

A dCPáü'lda kristályokat röntgenéi!frakciónak vetjük alá egy röntgendiffrakcíós berendezés (Módéi: RINT2S0OV, Rigaku Denki termék) alkalmazásával a következő körülmények között (mérési hiba: iö,!}. A dCP4U”4Ea 3,5-hidrát így kapott röntgendif£rakcíós spektrumát és csúcsok adatait a 2. ábra, illetve a 3, táblázat mutatja. Ebhez hasonlóan, a dCPW·4 Na dekahidrát röntgendiffrakciós spektrumát és a csúcsok adatait a 3, ábra, illetve a 4. táblázat mutatja. Ezen felöl a fagyasztva szárított termék röntgenéi ffrakcíós spektrumát referenciaként a 4, ábra matatja.

(a mérések körülményei)

Röntgenlámpa: Cu-Ka

Röntgenkimenet: 50 kV-300 mA

Pásztázási sebesség: 4,0'“/perc

Pásztázási tartomány: 0,02° .Szögmérés! tartomány 2-4 0°

Optikai rés; DS-0,5% RS-0,15 nra, SS-O,5*

Előkezelés; achát mozsár alkalmazásával történő őrlés

3. táblázat

Kristályos dCP4ü-4ba 3:_f 5-hidrát

Csúcs	2θ (Ί	Relatív intenzitás
1	6,18	39
	O £? ^z' V r G eb	38
3	11,50	27
4	12, 32	7 9
5	13, 7 6	39
6	14,4 4	83

* φφ *Φ * « φφφ ♦

φφφ ΦΦ

ΦΦΦΦ Χ*«»

8	16, 34	29
9	16,84	34
10	17,68	100
11	19, 02	81
12	19, 72	36
13	20,86	35
14	22,28	78
15	2 3, 54	47
1 δ	2 5,04	43

4* táblázat

Φ φφφ φ** « φ

Φ X X ·* * « ΦΦΦ

Kristályos dCP40’íNs dekahidrát

Csúcs	29 (Ί	Relatív intenzitás
1	5,58	28
··>	11/34	62
3	11,94	34
4	12/92	27
5	14,08	4 9
6	14, 96	66
7	15, 60	49
8	16, 62	25
9	17,08	46
10	18,28	27
11	18/90	28
12	20, 20	39
13	21, 66	72
14	22,02	100
15	23, 02	90

ίό « »«χ-φ »φ φ * ΧΦΦ

6j Víζfelvevő képesség

A körülbelül. 17,4 % víztartalommal rendelkező dCP4tb4N& kristályokat (dekahidrát) két napig állni hagyjuk a következő aj, b) és ej körülmények között; a) 25’C és 57 % relatív páratartalom; a) 25 ''C és 75 % relatív páratartalom; és a) 25 C és 93 % relatív páratartalom. Az előző három esetben nem figyeltünk meg bomlást vagy a tömeg bárminemű változását. A kristályok stabilnak bizonyultak és nem vettek lei nedvességet. Ezen felül, ugyanezeket a kristályokat 7 napig állni hagyjuk a következő szigorú d) körülmények között: d) 40’C és 7 3 % relatív páratartalom. Ebben az. esetben sem volt változás megfigyelhető..

Ezzel ellentétben, amikor egy fagyasztva szárított terméket (kezdeti víztartalom: körülbelül 1 %} kező b; vagy o) körülmények között:: fo) 25IC és 7 5 % relatív páratartalom; c) 2.5 “C és 93 % relatív páratartalom, akkor a tárolás- második napján a termék iszapszerű állapotot vesz fel a víztartalom fokozatos növekedése miatt.

7) Stabilitás

A dCP4U· 4b^!a kristályokat (dekahidrát)' és egy fagyasztva szárított terméket egyenként üvegbe helyezzük, amelyeket ezután lezárjuk és 13 napig tároljuk 6ü^öC-on (felgyc napig tárolunk a kövei rsított vizsgálat)

bem; figyeltük meg a	kristályok fo-oi	rlását. Ezzel ellentétben, a
fagyasztva	szárított	termék esetén	részleges bomlást találtunk,
amit a te;	znék körűit	>elűl 2,2 %-os	tisztaság-vesztésének megfi-
gyel.ésével	>··».·$ ·φ<Χ'Τ\Χ'·λ +·,·*> 4?· A.' A. -<.· 2 i V i. ü- X? m	tünk.

») NMR

A dCP4O-4Na kristályok mindegyikét és a fagyasztva szárított terméket közvetlenül egy cirkónium(IV)-oxidből készült ro~ π

»«♦* *·* «9 4 9 * 9X9 *?

99

9 9 3· »Χ 8

99Χ γ 9 9«

V# χ*« 9 9 torba töltünk, majd mérjük a megfelelő ^Í3C-CPMAS ~NMR spektrumé A mérés körülményeit az alábbiakban ismertétjük. ⁿC-CPMAS-NM.R

1) Berendezés be r é s· x élj ar a s

3} Mérési hőmérséklet

4} Megfigyelt meg

5) A megfigyelés frekvenciája 6} A proton gerjesztés impu1züss z é1es s ége

7) Tartózkodási idő

8) Mérési szélesség

9) A mérés pontjai lö) Adatpontok

11} Ismétlési idő13) Mintaforoatásí sebesség

CMX-300 (Chemagnetics termék) CPMAS (oldal-sáv elnyomás}

Szobahőmérséklet ^{1 3}C

75,502: MHz

4,3 us

0,5 ms

30,03 kH z

2048

1638 4

15,0: s

60, Ö s hexametilhenzol (külsőst andard 17,35 ppm}· kHz <6 és ?. ábra) ;5. ábra)

14} Integrálás

Az 5. ábra és az 5. táblázat mutatja a kristályos dCR4Ú'4ba

3,5-hidrát ^1JC-CPMAS-CC3 spektrumát, illetve a csúcsok adatait. A

6. ábra és a 6. táblázat mutatja a kristályos dCP4ü-4Na dekahidrát 'C-CPMAS-HME spektrumát, illetve a csúcsok adatait. A 7. ábra és a 7. táblázat mutatja a fehér por alakú dCPsü-4Ha (fagyasztva szárított termék} ^í3C~CPMAS~HME spektrumát, illetve a csúcsok adatait. Az. 5-7. ábrákon lévő számozás az 5-7 bán lévő megfelelő- csúcsok számaira utal.

táblázat.· ** iS

5-. táblázat

Kristályos	dCP4Ü*4Na	3,S-hidrát	(ppm)
(1) 166,1	(2)	156,2	(3)	150,9	(4)	141, 6
(5) 138,4	(6)	.101,3	(7)	99,2	(3)	93, 2
(3) 84,9	(10)	8 0, 6	(11)	76, 7	(12)	73,1
(18) 69-,0	(14)	67,2	(15)	6 2,2	(16)	43,9
6. táblázat
Kristályos	dCP4ü-4Na	deka-hidrát	(ppm.)
(1) 167,4	(2)	157,3	(3)	151,6	(4)	139,0
(5) 117,3	(6)	10 .2, 6	(?)	99, 3	(8)	33,3
(9) 90,1	(10}	87, 3	(11)	80,6	(12)	77,2
(13) 75,0	(14)	7 3, 9	(15)	72,0	(16)	67,0
(17) 63,1	(18)	60, 4	(19)	42,0	(20)	4 0,3
7. táblázat
dCP4ü fehér	por (tag)	zasztva szárított	termék)	(ppm)
Cl) 166,5	(2)	157, 4	(35	149, 9	(4)	14 0, 9
(5) 103,0	(6)	39, 0	(7)	96, 9	(8)	85, 9
(9) ?3,4	(10 5	71,7	(11)	67, i	(12)	42,0
(13) 39,3

2. Példa: A. dCP40 előállítása UMP-ből

A pirofoszfát dehidratál.t. tributiiamín sóhoz (10 mól) (TEAPP1) formamídot (2,5 ml) és píridint (7,6 ml) adunk, melyet a reakeióelegy keverése követ. Egy másik edényben elhelyezett uridin 5'-monofoszfát dehidratált tribafcilamin sójához (UME-TSA) (.10 mmol; öMAC-t (3,6 rai), dioxánt (3,2' ml), és fcrxbutilamint (3,3 ml): adunk, és keverjük, majd ehhez DEC-t (2,3 ml) adunk csepp-enként. Az elegyet szobahőmérsékleten keverjük egy órát, ezáltal UMP-DPP alakul ki, amelyet a fent említett előre elké59 * **** ^φ ** *X « ¥ * * '*

X ««a >«» * * * X ♦ * ««X- «»« ««« «·* ** szített TEA-FPi dahidratált. oldathoz adunk, A reakeióelegyet szobahőmérsékleten. keverjük egy órát, UTP-t képezve. DMAC~t (7.,2 ral) adunk a másik edényben elhelyezett 2'-dezoxieitidin 5'raonofoszf áthoz (TBA-dCMP) <4,9 g, 10 raraol), hogy ezáltal egy szuszpenziót alakítsunk ki, majd DPC-t (2,2 ml, 1,1 ekvivalens} adunk a szuszpenzióhoz, A kapott elegyet 40 percig keverjük, és tricutilamint (TBA) (9,5 ml) adunk az eiegyhez. További ZQ perc keverést végzünk, hogy ezáltal dCMP-DPP-t állítsunk elő. Az igy előállított dCMP-DPP oldatot adjuk a fent említett módon szintetizált UTP oldathoz, amelyet előre elkészítünk, majd az elegyet

viz hoz?; ás	i d a a
állítjuk	be 30
Miután az	oi do-
állítjuk	bé β

szert töményítéssel eltávolítjuk, a pH-t 7,0-ra állítjuk be mol/l-es sósav adagolásával. Az elegyet etil-aoetáttal választjuk szét. A szétválasztással képezett vizes réteget HPLCvizsgálatnak (272 ren) vetjük alá, amelynek során kimutattuk, hogy a dC?4U előállítási hozama 37,7 %.

Ipari alkalmazhatóság

Amint az előzőekben ismertettük a találmány szerinti eljárással nyert dCP4ü kristályok nagy tisztasággal és nagy stabilitással rendelkeznek és nem higroszkóposak a fagyasztva szárított termékhez képest, így hasznos nyersanyagként szolgál gyógyszer előállítására.

A találmány szerinti düráü előállítására szolgáló eljárás lehetővé teszi az olcsó 0MB alkalmazását nyersanyagként, és magas hozamot eredményez. így az. eijárás alkalmas a d.CP4V ipari méretű előállítására.

* » X

Claims

SZABADALMI IGNNYBÖNTOK

4 *» χχ_{Λβ >x} * · « « * *'♦ « « » » 9 »* X ΧΧχχ

1. A F¹-(2^f-dezoxicitidin 5'~5 P⁴~(uridin 5^f ~}-tefcrafoszfát vagy sójának kristályai,
2. A P^A- (.2'' -dezoxicitidin S' -) P⁴~ (uridin 5' -} ~ tstrafoszfát-4Na kristályai.
3. Az 1. vagy 2. igénypontok bármelyike szerinti kristályok, amelyek legalább 95 % tisztaságnak.
4. Az 1. vagy 2. igénypontok bármelyike szerinti kristályok, amelyek legalább 97 % tisztaságiak és 2 % vagy kevesebb uridin
5'-trífoszfátot tartalmaznak.

5. Az 1. vagy 2. igénypontok bármelyike szerinti kristályok, amelyek legalább .98 % tisttaságűak és 1 % vagy kevesebb uridin

5'-trífoszfátot tartalmaznak.

€. Eljárás az l. igénypont szerinti kristályok előállítására, azzal jellemezve, hegyez eljárás a következő lépésekből áll: a nyers P~~(2'~ dezoxicitidin 5^! ·-} P⁴~ (uridin 5^; ) tetraf oszf át ot egy anioncserélő kromatográfiás és aktív szenes tisztítási eljárásnak vetjük alá, és a tisztított P^l~(2'-dezoxicitidin 5 ’-} F⁴-(uridin 5'--)·tetrafoszfát kapott oldatához egy hidrofil szerves oldószert adunk, miáltal a F¹- (2' -dezoxicitidin 5¹(uridin 5'~)~tetra~ foszfátnak kristályos formában történő kicsapódását idézzük elő.
7. A 8, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tisztítási eljárás első lépésben anioncserélö kromatográfiából, majd ezt követően aktív szenes kromatográfiából áll.
8, Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti kristályok, ahol

1-14 vizmolekuia kötődik vagy tapad egy molekula 9^-(2^« ¢:

* * *· fcfc ♦ X X fc ♦ fc fc dez.oxicitidin 5’ ~) p— (nridin 5'-} tetrafÜsóTátkó'S ••vagy*»* annak sójához.
9. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti kristályok, ahol 3,5 vizmolekula kötődik vagy tapad egy molekula P¹-^'dszoxicitiáin 5 'P⁴~ (nridin 5' ·· ) tetrafoszfáthoz vagy annak j uil iö. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti kristályok, ahol 10 vizmoiekula kötődik vagy tapad egy molekula Ρ*-(2^Λdezoxícitídin 5’ ~) P⁴~(nridin 5'-)tetrafoszfáthoz vagy annak sójához.