Opis wynalazku Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania p 1 ,p 4 -di(urydyno-5'-)czterofosforanu lub jego soli z urydyno-5'-monofosforanu (UMP) jako materia lu wyj sciowego przy u zyciu difenylofosfochloryda- nu (DPC) i pirofosforanu (PPi). Sól czterosodowa p 1 ,p 4 -di(urydyno-5'-)czterofosforanu (U 2 P 4 · 4Na) przedstawiona poni zszym wzorem (I): ma dzia lanie wywo luj ace wykrztuszanie i jest zwi azkiem, który mo ze by c wykorzystywany jako srodek wykrztu sny lub srodek leczniczy stosowany przy zapaleniu pluc (np. opisy patentowe Stanów Zjedno- czonych Ameryki US-5 789 391, US-5 763 447 i US-5 635 160). Do tej pory nie uda lo si e otrzyma c U 2 P 4 w postaci krystalicznej, gdy z jest on otrzymywany jedy- nie w postaci liofilizowanego produktu (patrz przyk lad 1 publikacji patentowej WO 99/05155). Zazwy- czaj wytwarzany w konwencjonalny sposób U 2 P 4 charakteryzuje si e tak ma la czysto scia jak 90% i zawiera produkty uboczne. Przyk lady produktów ubocznych obejmuj a nukleozydo-5'-(poli)fosforany, takie jak urydyno-5'-czterofosforan (UP 4 ), urydyno-5'-trifosforan (UTP), urydyno-5'-difosforan (UDP) i urydyno-5'-monofosforan (UMP) oraz dinukleozydowe polifosforany takie jak P 1 ,P 4 -di(urydyno-5'-)- -trifosforan (U 2 P 3 ) i p 1 ,p 4 -di(urydyno-5'-)difosforan (U 2 P 2 ). Szczególnie trudno jest rozdzieli c od U 2 P 4 nukleozydo-5'-(poli)fosforany, takie jak UTP, a bardzo oczyszczony U 2 P 4 jest wytwarzany za pomoca konwencjonalnych metod oczyszczania, tj. chromatografii jonowymiennej ze znacznymi trudno sciami (WO 99/05155, Biochimica et Biophysica Acta, 438, (1976) 304-309). Powy zszy oczyszczony i liofilizowany produkt ma jednak tak a niekorzystn a cech e, jak znaczna higroskopijno sc. Dlatego wytwarzanie leku z U 2 P 4 musi by c prowadzone w specjalnym urz adzeniu o dobrze regulowanej wilgotno sci. Nawet po wytworzeniu leku produkt musi by c szczelnie zawijany. Ponadto, poniewa z lek ma bardzo krótki okres wa zno sci z powodu s labej stabilno sci liofilizowanego preparatu, to po zadane jest otrzymywanie wysoko oczyszczonych i stabilnych kryszta lów U 2 P 4 . U 2 P 4 syntetyzuje si e z urydyno-5'-monofosforanu (UMP) za pomoc a srodka aktywuj acego, ta- kiego jak difenylofosfochloridan (DPC) i srodka fosforyzuj acego, takiego jak pirofosforan (PPi). Jed- nak, konwencjonalny sposób daje ma la wydajno sc syntezy, tj. tak mala, jak w przybli zeniu 10% wa- gowych (przyk lad 4B z publikacji patentowej WO 99/05155) i nie mo ze nigdy s lu zy c jako praktyczny sposób. Dlatego po zadane jest rozwijanie sposobu wytwarzania U 2 P 4 z du za wydajno sci a i na du za skal e. W swietle powy zszego, celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie sposobu wydajnego wy- twarzania P 1 ,P 4 -di(urydyno-5'-)czterofosforanu (U 2 P 4 ) lub jego soli z urydyno-5'-monofosforanu (UMP) jako materia lu wyj sciowego przy u zyciu difenylofosfochlorydanu (DPC) i pirofosforanu (PPi) na du za skal e. Twórcy niniejszego wynalazku prowadzili wcze sniejsze badania nad sposobem oczyszczania U 2 P 4 oraz sposobem syntezy U 2 P 4 z UMP. Stwierdzili, ze U 2 P 4 oczyszczony przez chromatografi e anionowymienn a i chromatografi e z u zyciem w egla aktywowanego (chromatografia na w eglu aktywo- wanym) mo ze by c latwo krystalizowany i ze stosowanie specyficznych warunków reakcji daje dra- styczne zwi ekszenie wydajno sci U 2 P 4 w syntezie U 2 P 4 lub jego soli z UMP s luzacego jako materia l wyj sciowy i przy u zyciu DPC i PPi. Niniejszy wynalazek jest oparty na tych stwierdzeniach. Zgodnie z tym, niniejszy wynalazek dostarcza sposobu wytwarzania p 1 ,p 4 -di(urydyno-5'-)- -czterofosforanu lub jego soli z urydyno-5'-monofosforanu (UMP) s lu zacego jako materia l wyj sciowyPL 206 867 B1 3 i przez u zycie difenylofosfochlorydanu (DPC) i pirofosforanu (PPi), który to sposób obejmuje co naj- mniej jeden z nast epuj acych etapów obróbki: (a) dodawanie difenylofosforanu UMP (UMP-DPP) w podzielonych porcjach podczas etapu re- akcji UMP-DPP z alkaliczn a sol a organiczn a PPi; (b) prowadzenie etapu reakcji UMP-DPP z alkaliczn a sol a organiczn a PPi w obecno sci zasady; i (c) dalsz a alkaliczn a obróbk e zsyntetyzowanego U 2 P 4 . Krótki opis rysunków Figura 1 przedstawia widmo dyfrakcji promieniami X krystalicznego czterowodzianu U 2 P 4 · 4Na wykrystalizowanego z roztworu etanolowego. Figura 2 przedstawia widmo dyfrakcji promieniami X krystalicznego oktawodzianu U 2 P 4 · 4Na wykrystalizowanego z roztworu etanolowego. Figura 3 przedstawia widmo dyfrakcji promieniami X U 2 P 4 otrzymanego przez liofilizacj e. Figura 4 przedstawia fotografi e postaci krystalicznej oktawodzianu U 2 P 4 · 4Na wykrystalizowa- nego z roztworu etanolowego. Fotografi e zrobiono pod spolaryzowanym mikroskopem (powi ekszenie: 440), gdzie 1 cm na obrazie odpowiada 23 µm. Figura 5 przedstawia widmo absorpcyjne IR krystalicznego oktawodzianu U 2 P 4 · 4Na wykrysta- lizowanego z roztworu etanolowego. Figura 6 przedstawia widmo absorpcyjne IR U 2 P 4 otrzymanego przez liofilizacj e. Figura 7 przedstawia widmo dyfrakcji promieniami X krystalicznego oktawodzianu U 2 P 4 · 4Na wykrystalizowanego z roztworu metanolowego. Najlepszy sposób realizacji wynalazku Kryszta ly U 2 P 4 lub jego sól mo zna otrzyma c poprzez oczyszczanie surowego U 2 P 4 lub jego soli stosuj ac specyficzne srodki oraz dodawanie hydrofilowego organicznego rozpuszczalnika do roztworu oczyszczonego U 2 P 4 lub jego soli dla wytr acania substancji rozpuszczonej z roztworu. (1) Oczyszczanie U 2 P 4 lub jego soli U 2 P 4 lub jego sól mog a by c oczyszczane przez chromatografi e anionowymienn a i chromatogra- fi e na w eglu aktywowanym stosowane w po laczeniu. Chocia z te dwie techniki chromatografii mog a by c prowadzone w dowolnej kolejno sci, to dla poprawy czysto sci U 2 P 4 , korzystnie chromatografia anionowymienna poprzedza chromatografi e na w eglu aktywowanym. Jako anionowymienne zywice w wy zej opisanych technikach chromatografii mog a by c stoso- wane zywica styrenowa lub akrylowa. Przyk lady zywic, które mog a by c stosowane obejmuj a silnie zasadowe zywice anionowymienne, takie jak AMBERLITE IRA 402 (Rohm & Haas Co.), DIAION PA- -312 i DIAION SA-11A (Mitsubishi Chemical Co. Ltd.), oraz s labo zasadowe zywice anionowymienne, takie jak AMBERLITE IRA 67 (Rohm & Haas Co.) i DIAION WA-30 (Mitsubishi Chemical Co. Ltd.). W egiel aktywowany mo ze by c w postaci w egla aktywowanego w rodzaju stosowanych do chromatografii, który jest pokruszony lub ukszta ltowany w cz astki i mo ze obejmowa c handlowo do- st epne produkty (np. Wako Pure Chemical Industries, Ltd. i Futamura Kagaku Kogyo). Chromatografia mo ze by c prowadzona zbiornikowo lub przy u zyciu kolumny. W przypadku chromatografii kolumnowej jako eluent anionowymiennej chromatografii mo ze by c stosowany wodny roztwór kwasu lub jego mieszanina z sol a o zwi ekszonej sile jonowej, tak a jak chlorek sodu, a jako eluent w chromatografii na w eglu aktywowanym mo ze by c stosowana woda lub wodny roztwór zasady takiej jak wodorotlenek sodu. Mo zna przeprowadzi c wst epne testy na ma la skal e, aby dok ladnie okre- sli c st ezenie ka zdego eluenta w zakresie od 0,001 M do 10 M. (2) Krystalizacja U 2 P 4 lub jego soli U 2 P 4 lub jego sól krystalizuje przez dodanie hydrofilowego rozpuszczalnika organicznego do roztworu zawieraj acego oczyszczony U 2 P 4 lub jego sól. Przyk lady hydrofilowych rozpuszczalników organicznych, które mog a by c zastosowane obejmu- ja alkohole maj ace sze sc lub mniej atomów w egla, takie jak metanol i etanol; ketony takie jak aceton; etery takie jak dioksan; nitryle takie jak acetonitryl i amidy takie jak dimetyloformamid. Spo sród nich szczególnie korzystne s a alkohole, zw laszcza etanol. Bardziej dok ladnie roztwór oczyszczonego U 2 P 4 lub jego soli, albo zawiesina otrzymana przez zat ezanie roztworu jest ewentualnie obrabiana tak, aby dostosowa c pH do zakresu 6-9, do roztworu lub zawiesiny dodawany jest hydrofilowy rozpuszczalnik organiczny w temperaturze 60°C lub poni zej, dla wytr acenia substancji rozpuszczonej jako stabilnych kryszta lów U 2 P 4 .PL 206 867 B1 4 Tak otrzymane kryszta ly U 2 P 4 zawieraj a (1) U 2 P 4 w ilo sci 95% lub wi ecej i (2) inne zwi azki ho- mologiczne w ilo sci 5% lub mniejszej. Inne zwi azki homologiczne obejmuj a nukleozydo-5'-(poli)fosforany, takie jak UP 4 , UTP, UDP i UMP oraz dinukleozydowe polifosforany takie jak U 2 P 3 i U 2 P 2 . Bardziej dok ladnie kryszta ly U 2 P 4 zawieraj a (1) U 2 P 4 w ilo sci 97% lub wi ekszej, (2) UDP w ilo sci 1% lub mniejszej i (3) UTP w ilo sci 1% lub mniejszej. Szczególnie korzystnie krysztaly U 2 P 4 zawieraj a (1) U 2 P 4 w ilo sci 98% lub wi ekszej, (2) UDP w ilo sci 0,5% lub mniejszej i (3) UTP w ilo sci 0,5% lub mniejszej. Tak wysoko oczyszczone kryszta ly U 2 P 4 moga by c w postaci soli, wodzianu lub wodzianu soli. Przyk lady soli obejmuj a farmaceutycznie dopuszczalne sole takie jak sole sodowe i sole potasowe; sole metali ziem alkalicznych takie jak sole wapnia i sole magnezu, oraz sole amonowe. U 2 P 4 mo ze by c podstawiony 1-4 atomami metalu dla utworzenia soli. Wodziany mog a zawiera c 3-8 cz asteczek wody, które s a przy laczone do lub przywieraj a do jednej cz asteczki U 2 P 4 , a wodziany soli mog a zawiera c 3-8 cz asteczek wody, które s a przy laczone do lub przywieraj a do jednej cz asteczki soli metalu ziem alkalicznych U 2 P 4 . Przyk lady korzystnych kryszta lów U2P4 obejmuj a kryszta ly U 2 P 4 · 4Na i jej wodziany. Kryszta ly U 2 P 4 · 4Na wykazuj a na widmie dyfrakcji promieniami X z u zyciem promieni Cu-K a charakterystyczne piki w s asiedztwie k atów dyfrakcji (2 T) 5,9, 11,5, 12,4, 15,4, 17,2, 18,0, 19,8 i 20,5 (°) (zakres b ledu ± 0,1°), a na widmie absorpcyjnym IR wykazuj a charakterystyczne piki przy d lugo sci fali w s asiedztwie 1690, 1277, 1233, 1146, 1116 i 890 (cm -1 ) (b lad w zakresie ± 2 cm -1 ) . Ponadto kryszta ly U 2 P 4 · 4Na s a latwe do obchodzenia si e z nimi i s a znacznie bardziej u zyteczne w porównaniu z konwencjonal- nymi liofilizowanymi produktami, poniewa z kryszta ly s a stabilne w wysokiej temperaturze, w warun- kach du zej wilgotno sci a zawartosc wody w kryszta lach jest ustabilizowana w zakresie 5-15% wago- wych, co t lumi dalsze przyjmowanie wody. Jak wy zej opisano, kryszta ly U 2 P 4 · 4Na otrzymane powy zej opisanym sposobem zawieraj a (1) U 2 P 4 w ilo sci 95% lub wi ekszej i (2) inne zwi azki homologiczne w ilo sci 5% lub mniejszej. Ponadto jak wy zej opisano, przyk ladowe kryszta ly U 2 P 4 obejmuj a takie kryszta ly zawieraj ace (1) U 2 P 4 w ilo sci 97% lub wi ekszej, (2) UDP w ilo sci 1% lub mniejszej i (3) UTP w ilo sci 1% lub mniejszej, zw laszcza kryszta ly zawierajace (1) U 2 P 4 w ilo sci 98% lub wi ekszej, (2) UDP w ilo sci 0,5% lub mniejszej i (3) UTP w ilo sci 0,5% lub mniejszej. Ponadto kryszta ly U 2 P 4 lub jego soli mog a wyst epowa c w ró znych postaciach tautomerycznych. Kryszta ly U 2 P 4 lub jego soli mog a by c ewentualnie suszone w konwencjonalny sposób, taki jak suszenie pod zmniejszonym ci snieniem, suszenie w przep lywaj acym powietrzu lub suszenie przez ogrzewanie, nast epnie s a umieszczane w pojemniku (np. butelce, torebce, puszcze, ampu lce). Pako- wanie w pojemnik mo ze by c prowadzone tak, ze pojemnik jest otwierany, zamykany, uszczelniany przed dop lywem powietrza lub zamykany. Warunki otwarte nie s a korzystne dla utrzymywania stabil- no sci przechowywanych kryszta lów. Niniejszym zostanie opisany wydajny sposób syntetyzowania U 2 P 4 wed lug wynalazku. Konwencjonalnie U 2 P 4 lub jego sole s a g lównie syntetyzowane z urydyno-5'-monofosforanu (UMP) s lu zacego jako materia l wyj sciowy ze stosowaniem srodka aktywuj acego, takiego jak di- fenylofosfochlorydan (DPC) i srodka fosforyzuj acego, takiego jak pirofosforan (PPi). Specyficznie DPC i tributyloamina dodawane s a do soli tributyloaminowej UMP, dla wytworzenia difenylofosforanu UMP (UMP-DPP) s luzacego jako reaktywny zwi azek po sredni który poddaje si e reakcji z pirofosforanem tri- butyloaminy (TBA-PPi), tak otrzymuje si e U 2 P 4 lub jego sole z wydajno scia w przybli zeniu 9,6% (przy- k lad 4B z WO 99/05155). Sposób wed lug wynalazku charakteryzuje si e tym, ze przeprowadzany jest co najmniej jeden z nast epuj acych etapów obróbki: (a) dodawanie UMP-DPP w podzielonych porcjach podczas kon- wencjonalnego etapu reakcji UMP-DPP z alkaliczn a sol a organiczn a PPi; (b) prowadzenie etapu reak- cji UMP-DPP z alkaliczn a sol a organiczn a PPi w obecno sci zasady i (c) dalsz a alkaliczn a obróbk e zsyntetyzowanego U 2 P 4 . Dwa lub wi ecej z powy zszych etapów mog a by c polaczone. Etap „(a) dodawania UMP-DPP w podzielonych porcjach” odnosi si e do dodawania UMP-DPP który musi by c dostarczony w co najmniej dwukrotnie wi ekszej ilo sci okre slonej molowo ni z alkaliczna sól organiczna PPi, w kilku porcjach, a nie w jednej porcji. Na przyk lad alkaliczn a sól organiczn a PPi poddaje si e reakcji z równomolow a ilo sci a UMP-DPP w i ten etap powtarza si e. Chocia z nie ma szczególnego ograniczenia co do liczby porcji UMP-DPP, to dla zwi ekszenia wydajno sci korzystne s a 2-3 porcje.PL 206 867 B1 5 Przyk lady alkalicznych soli organicznych PPi obejmuj a sól heksyloaminow a, sól dibutyloamino- w a, sól trietyloaminow a i sól tributyloaminow a. W reakcji z UMP-DPP, alkaliczna sól organiczn a a PPi mo ze by c rozpuszczona w rozpuszczalniku. Przyk lady rozpuszczalników obejmuj a amidy, takie jak DMF, DMAC i formamid; cykliczne etery, takie jak dioksan i tetrahydrofuran; ketony, takie jak aceton; oraz dimetyloimidazolidinon, triamidy heksametylofosforowe, dimetylosulfotlenek, acetonitryl lub mie- szaniny dwóch lub wi ecej z nich. Nast epnie do roztworu dodaje si e UMP-DPP i mieszanin e pozosta- wia do przereagowania w pokojowej temperaturze na w przybli zeniu 30 minut do pi eciu godzin. Etap „(b) prowadzenie reakcji UMP-DPP z alkaliczn a sol a organiczn a PPi w obecno sci zasady” odnosi si e do reakcji prowadzonej w obecno sci zasady. Przyk lady zasad obejmuj a zasady pirydyno- we, takie jak pirydyna, 2,6-lutydyna, 2,4-lutydyna, 2,4,6-pikolina, 2,4-dimetylaaminopirydyna i 2,4,6-ko- lidyna, przy czym korzystna jest pirydyna. Zasadowy rozpuszczalnik srodowiska reakcji jest równie z wliczony jako zasady stosowane w niniejszym wynalazku. St ezenie zasady nie jest szczególnie ogra- niczone. Korzystnie zasada jest dodawana w ilo sci 6 ekwiwalentów lub wi ecej, liczone na UMP, bar- dziej korzystnie 18 ekwiwalentów lub wi ecej. Ponadto, etap „(c) dalszej alkalicznej obróbki zsyntetyzowanego U 2 P 4 ” odnosi si e do gaszenia cieczy zawieraj acej zsyntetyzowany U 2 P 4 wod a i obróbk e mieszaniny roztworem organicznej lub nie- organicznej zasady, takiej jak wodorotlenek sodu, amoniak, wodorotlenek potasu, pirydyna, trietylo- amina lub w eglan sodu. Konwencjonalnie sama zgaszona ciecz jest bezpo srednio oczyszczana. Jed- nak alkaliczna obróbka mo zliwa popraw e wydajno sci izolowania U 2 P 4 w porównaniu z metod a kon- wencjonaln a. Alkaliczna obróbka cieczy zawieraj acej zsyntetyzowany U 2 P 4 obejmuje gaszenie wod a i doda- wanie zasady do mieszaniny tak aby pH mieszaniny wynosi lo w przybli zeniu 8-13, korzystnie 10-12. Mieszanin e pozostawia si e do przereagowania w temperaturze pokojowej na w przybli zeniu 10 minut do pi eciu godzin. UMP-DPP mo ze by c syntetyzowany z UMP w konwencjonalny sposób. Na przyk lad, sól trialki- loaminow a UMP tak a jak sól tributyloaminow a UMP wytworzon a w konwencjonalny sposób rozpusz- cza si e w rozpuszczalniku. Przyk lady rozpuszczalników obejmuj a amidy, takie jak DMF i dimetyloace- tamid (DMAC); cykliczne etery takie jak dioksan i tetrahydrofuran; ketony, takie jak aceton oraz dime- tyloimidazolidinon, triamid heksametylofosforowy lub ich mieszaniny. Nast epnie dodaje si e do roztwo- ru DPC i, je zeli jest potrzebna, trialkiloamin e i mieszanin e pozostawia si e do przereagowania w tem- peraturze pokojowej na w przybli zeniu 30 minut do pi eciu godzin, tak zsyntetyzowany UMP-DPP s luzy jako reaktywny zwi azek po sredni. Przyk lady Niniejszy wynalazek zostanie opisany bardziej szczegó lowo za pomoc a poni zszych przyk ladów. P r z y k l a d 1. Synteza U 2 P 4 lub jego soli (1) Wp lyw zasady DMAC (8 ml) dodano do odwodnionej soli tributyloaminowej urydyno-5'-monofosforanu (UMP- -TBA) (6,2 mmola) i do mieszaniny z mieszaniem dodano kroplami DPC (1-7 ml). Tak otrzyman a mie- szanin e poddano reakcji w temperaturze pokojowej przez jedna godzin e dla otrzymania UMP-DPP, po czym do mieszaniny reakcyjnej dodano TBA (7,6 ml), mieszanin e mieszano przez dalsze 10 minut. W mi edzyczasie rozpuszczono odwodniony TEA-PPi (3,0 mmola) w pirydynie (1,7 ml) i tak otrzymany roztwór dodano do mieszaniny reakcyjnej UMP-DPP. Nast epnie mieszanin e mieszano w temperaturze pokojowej przez trzy godziny dla zatrzymania reakcji, do mieszaniny dodano wody. Otrzyman a mie- szanin e reakcyjn a zanalizowano za pomoc a HPLC (przy 262 nm), która wykaza la, ze otrzymano do- celowy U 2 P 4 z wydajno sci a 18,3%. Jak wida c z tego wyniku, gdy UMP-DPP poddaje si e reakcji z TEA- -PPi w obecno sci zasady (pirydyna), mo zna zsyntetyzowa c U 2 P 4 z oko lo dwukrotnie wy zsz a wydajno- sci a ni z wydajnosc metody konwencjonalnej. (2) Wp lyw lacznego stosowania zasady i alkalicznej obróbki DMAC (8 ml) dodano do odwodnionej soli tributyloaminowej urydyno-5'-monofosforanu (UMP- -TBA) (6,2 mmola) i do mieszaniny z mieszaniem dodano kroplami DPC (1,7 ml). Tak otrzyman a mie- szanin e poddano reakcji w temperaturze pokojowej przez jedna godzin e dla otrzymania UMP-DPP, po czym do mieszaniny reakcyjnej dodano TBA (7,6 ml), a mieszanin e mieszano przez dalsze 10 minut. W mi edzyczasie odwodniony TEA-PPi (3,0 mmola) rozpuszczono w pirydynie (1,7 ml), tak otrzymany roztwór dodano do mieszaniny reakcyjnej UMP-DPP. Nast epnie mieszanin e mieszano w temperaturze pokojowej przez trzy godziny, dla zatrzymania reakcji do mieszaniny dodano wod e.PL 206 867 B1 6 Do tak otrzymanej mieszaniny reakcyjnej dodano 30% wodorotlenek sodu dla dostosowania pH do 10,0 i mieszanin e pozostawiono na noc. Otrzyman a mieszanin e reakcyjn a analizowano za pomoc a HPLC (przy 262 nm), która wykaza la ze otrzymano docelowy U 2 P 4 z wydajno sci a 29,7%. Jak wida c z tego wyniku, gdy UMP-DPP poddaje si e reakcji z TEA-PPi w obecno sci zasady (pirydyna) a potem obróbce alkalicznej to U 2 P 4 mo ze by c syntetyzowany z trzykrotn a wydajno scia w porównaniu do wy- dajno sci otrzymanej w konwencjonalny sposób. (3) Wp lyw zasady i dodawania UMP-DPP w kilku porcjach Formamid (1,5 ml) i pirydyn e (1,5 ml) dodano do soli trietyloaminowej odwodnionego kwasu pi- rofosforowego (TEA-PPi) (6 mmoli) i mieszanin e mieszano w naczyniu. W mi edzyczasie w innym na- czyniu dodano DMAC (4,3 ml), dioksan (4,8 ml) i tributyloamin e (TBA) (5,8 ml) do odwodnionej soli tributyloaminowej urydyno-5'-monofosforanu (UMP-TBA) (12 mmoli), mieszanin e mieszano. Nast epnie do mieszaniny dodano kroplami DPC (2,5 ml), tak otrzyman a mieszanin e dalej mieszano w temperatu- rze pokojowej przez jedn a godzin e dla otrzymania UMP-DPP. Po low e mieszaniny reakcyjnej UMP- DPP dodano kroplami do naczynia zawieraj acego TEA-PPi i pozostawiono do reagowania w temperaturze pokojowej przez jedn a godzin e. Nast epnie do mieszaniny dodano pirydyn e (1,5 ml), a pozostala mieszanin e reakcyjn a UMP-DPP dodano kroplami do naczynia. Tak otrzymana mieszani- na reakcyjna dalej reagowa la w temperaturze pokojowej przez jedn a godzin e, dla zatrzymania reakcji do mieszaniny dodano wody. Otrzyman a mieszanin e reakcyjn a analizowano za pomoc a HPLC (przy 262 nm), która wykaza la ze otrzymano docelowy U 2 P 4 z wydajno sci a 29,5%. Jak wida c z tego wyniku, gdy UMP-DPP dodaje si e w dwóch porcjach a UMP-DPP reaguje z TEA-PPi w obecno sci zasady (pirydyna), to mo zna wytworzy c U 2 P 4 z wydajno scia oko lo trzykrotnie wi eksz a ni z otrzymana konwen- cjonalnym sposobem. Wida c równie z ze dodanie UMP-DPP w dwóch porcjach daje wydajno sc 29,5%, to jest oko lo 1,6 razy wi eksz a ni z wydajnosc otrzymana w powy zszym punkcie (1) (18,3%). (4) Wp lyw alkalicznej obróbki Formamid (1,5 ml) i pirydyn e (1,5 ml) dodano do soli trietyloaminowej odwodnionego kwasu piro- fosforowego (TEA-PPi) (6 mmoli) i mieszanin e mieszano w naczyniu. W mi edzyczasie i w innym naczy- niu dodano DMAC (4,3 ml), dioksan (4,8 ml) i tributyloamin e (TBA) (5,8 ml) do odwodnionej soli tributy- loaminowej urydyno-5'-monofosforanu (UMP-TBA) (12 mmoli) i mieszanin e mieszano. Nast epnie do mieszaniny dodano kroplami DPC (2,5 ml) i tak otrzyman a mieszanin e dalej mieszano w temperaturze pokojowej przez jedn a godzin e dla otrzymania UMP-DPP. Po low e mieszaniny reakcyjnej UMP-DPP dodano kroplami do naczynia zawieraj acego TEA-PPi, mieszanin e pozostawiono do reagowania w tem- peraturze pokojowej przez jedn a godzin e. Nast epnie do mieszaniny dodano pirydyn e (1,5 ml), a reszt e mieszaniny reakcyjnej UMP-DPP dodano kroplami do naczynia. Tak otrzyman a mieszanin e reakcyjn a dalej poddawano reakcji w temperaturze pokojowej przez jedn a godzin e, dla zako nczenia reakcji do mieszaniny dodawano wody. Do tak otrzymanej mieszaniny reakcyjnej dodano 30% roztwór wodorotlen- ku sodu dla dostosowania pH do 11,0, mieszanin e pozostawiono w spoczynku przez noc. Otrzyman a mieszanin e reakcyjn a analizowano za pomoc a HPLC (przy 262 nm), która pokaza la, ze otrzymano do- celowy U 2 P 4 z wydajno sci a 32,2%. Jak wida c z tego wyniku, gdy doda si e alkaliczn a obróbk e do wy zej opisanego sposobu (3) to wydajno sc wzrasta o oko lo 10%, tj. z 29,5% na 32,2%. P r z y k l a d 2. Wytwarzanie kryszta lów U 2 P 4 · Na Formamid (10 ml) i pirydyn e (15 ml) dodano do soli trietyloaminowej odwodnionego kwasu piro- fosforowego (TEA-PPi) (40,5 mmoli) i mieszanin e mieszano w naczyniu. W mi edzyczasie i w innym naczyniu dodano DMAC (50 ml), dioksan (34 ml) i tributyloamin e (TBA) (30 ml) do odwodnionej soli tri- butyloaminowej urydyno-5'-monofosforanu (UMP-TBA) (80 mmoli) i mieszanin e mieszano. Nast epnie do mieszaniny dodano kroplami DPC (17,8 ml) i tak otrzyman a mieszanin e dalej mieszano w temperaturze pokojowej przez jedn a godzin e dla otrzymania UMP-DPP. Po low e mieszaniny reakcyjnej UMP-DPP dodano kroplami do naczynia zawieraj acego TEA-PPi, mieszanin e pozostawiono do reagowania w tem- peraturze pokojowej przez jedn a godzin e. Nast epnie do mieszaniny dodano 4-di-metyloaminopirydyn e (DMPA) (50 mg) i pirydyn e (15 ml), a reszt e mieszaniny reakcyjnej UMP-DPP dodano kroplami do na- czynia. Tak otrzyman a mieszanin e reakcyjn a dalej poddawano reakcji w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, dla zako nczenia reakcji do mieszaniny dodano wody. Mieszanin e reakcyjn a rozcie nczono wod a do ca lkowitej obj eto sci 700 ml i dodano roztwór wodorotlenku sodu dla dostosowania pH do 10. Mieszanin e zat ezono do 200 ml i do zat ezonego roztworu z mieszaniem dodano etanol (250 ml). Roz- twór pozostawiono w temperaturze 4°C przez noc, a supernatant usuni eto przez dekantacj e. Tak otrzy- many roztwór rozcie nczono wod a do ca lkowitej obj eto sci 250 ml i analizowano za pomoc a HPLC (przy 262 nm), która wykaza la ze otrzymano zwi azek docelowy U 2 P 4 z wydajno sci a 30,0%.PL 206 867 B1 7 Tak otrzymany roztwór (110 ml) rozcie nczono woda do ca lkowitej obj eto sci 2000 ml i rozcie n- czony roztwór stosowano na s labo anionowymienn a kolumn e (AMBERLITE IRA-67) (typ C1) (200 ml). Nast epnie kolumn e przemyto wod a, wymyto produkty uboczne 0,18 M kwasem solnym, po czym do- celowy U 2 P 4 wymyto 0,005 M roztworem kwasu solnego zawieraj acym 0,3 5 M NaCl (procentowy odzysk: 82,7%) . Dla tak otrzymanego eluatu dodano roztwór wodorotlenku sodu dla dostosowania pH do 2,5. Nast epnie eluat wprowadzano na kolumn e z w eglem aktywowanym (Taiko SGP), a kolumn e przemyto wod a i eluowano 0,05 M roztworem wodorotlenku sodu (procentowy odzysk: 84,9%). Tak otrzymany eluat ustawiono pH na 7,6 i eluat zat ezono do 38 ml. Nast epnie do zat ezonego roztworu dodano etanol (57 ml) i otrzymano 3,1 g kryszta lów U 2 P 4 · Na (zawarto sc wody: 7,8%) (wy- dajno sc wydzielania:18,4%). (Fizyczne w la sciwo sci kryszta lów U 2 P 4 · Na) Kryszta ly U 2 P 4 · 4Na wytworzone w przyk ladzie 2 wysuszono w temperaturze 60°C przez cztery godziny stosuj ac suszark e z przep lywaj acym powietrzem i poddano analizie instrumentalnej. Ponadto przygotowano liofilizowany produkt U 2 P 4 · 4Na w taki sam sposób jak opisano w przyk ladzie 1 publi- kacji patentowej WO 99/05155 i tak otrzymany produkt porównywano z kryszta lami pod wzgl edem w la sciwo sci fizycznych. (1) Analiza instrumentalna 1) Analiza czysto sci Kryszta ly U 2 P 4 · 4Na otrzymane w przyk ladzie 2 i frakcje zawieraj ace U 2 P 4 po oczyszczaniu po ka zdej chromatografii poddawano analizie czysto sci za pomoc a wysokosprawnej chromatografii cie- czowej. Wyniki przedstawiono w tabeli 1. Warunki prowadzenia wysokosprawnej chromatografii cie- czowej podano poni zej. Kolumna: HITACHIGEL # 3013-N (produkt Hitachi Keisokuki Service) Eluent: 10% CH 3 CN, 0,18 M NH4CI, 0,03 M KH 2 PO 4 i 0,03 M K 2 HPO 4 Sposób wykrywania: detekcja UV przy 262 nm T a b e l a 1 Porcje substancji (% wagowych) U 2 P 4 i jego analogi Mieszanina reakcyjna Po kolumnie anionowymiennej Po kolumnie z w eglem aktyw. Po krystalizacji UMP 7,5 0,5 0,3 (-) U 2 P 2 29,8 0,4 (-) (-) UDP 2,5 0,1 0,2 0,1 U 2 P 3 17,6 0,2 (-) (-) UTP 13,0 0,8 0,4 0,1 U 2 P 4 21,0 97,9 98,6 99,8 UP 4 7,3 (-) (-) (-) (-) poni zej granicy wykrywalno sci (2) Zawarto sc wody Kryszta ly U 2 P 4 · 4Na poddawano pomiarom zawarto sci wody metod a Karla Fischera, która wy- kaza la zawarto sc wody 5-15% wagowych, zmieniaj ac a si e w zale zno sci od stopnia wysuszenia. Te wyniki pokazuj a, ze trzy do o smiu cz asteczek wody wiaze si e lub przywiera do jednej cz asteczki U 2 P 4 . 3) Temperatura topnienia Kryszta ly U 2 P 4 · 4Na poddano pomiarowi temperatury topnienia za pomoc a konwencjonalnej metody, wykaza la ona punkt rozk ladu przy oko lo 223°C. Punk rozk ladu dla liofilizowanego produktu wynosi oko lo 220°C. 4) Dyfrakcja promieniami X Kryszta ly U 2 P 4 · 4Na poddano pomiarom dyfrakcji promieniami X stosuj ac aparat do dyfrakcji pro- mieniami X (Model: RINT2500V, produkt Rigaku Denki) w nast epuj acych warunkach. Otrzymane widma dyfrakcji promieniami X przedstawiono na figurach 1 i 2, a dane dotycz ace pików podano w tabeli 2 i 3.PL 206 867 B1 8 (Warunki pomiaru) rura do promieni X: Cu-K a wyj scie promieni X: 50 kV - 300 mA szybko sc skanowania: 4,0°/minut e odst ep skanowania: 0,02° zakres pomiaru k ata: 2-4° szpara: DS-0,5°, RS-0,15 mm, SS-0,5° wst epna obróbka: mielenie w agatowym mo zdzierzu T a b e l a 2 Numer piku 29 (°) Wzgl edna intensywno sc (I/I o ) 1 5,96 100 5 11,58 38 6 12,42 79 10 15,42 48 13 17,18 45 15 18,04 55 16 19,86 84 17 20,56 73 18 21,18 51 19 21,40 51 25 25,22 42 29 27,52 45 30 27,98 47 35 30,60 40 T a b e l a 3 Numer piku 20 (°) Wzgl edna intensywno sc (I/I o ) 1 5,96 100 5 11,56 41 6 12,42 90 10 15,42 51 13 17,18 48 15 18,04 63 16 19,86 90 17 20,58 90 18 21,20 56 19 21,42 59 25 25,20 50 29 27,54 56 30 27,96 57 35 30,60 48PL 206 867 B1 9 Figura 1 i tabela 2 pokazuj a, ze dane dla kryszta lu czterowodzianu U 2 P 4 · Na, a fig. 2 i tabela 3 pokazuj a dane dla kryszta lów oktawodzianu U 2 P 4 · 4Na. Ponadto widmo dyfrakcji promieniami X liofili- zowanego produktu przedstawiono na fig. 3 jako odniesienie. (5) Higroskopijnosc Kryszta ly U 2 P 4 · 4Na (oktawodzian) o zawarto sci wody w przybli zeniu 14% pozostawiono na dziewiec dni w nast epuj acych warunkach: a) 25°C wzgl edna wilgotno sc 57%; b) 25°C wzgl edna wil- gotno sc 75%; i c) 40°C wzgl edna wilgotno sc 75%. Nie zaobserwowano rozk ladu lub zmiany wagi w powy zszych trzech przypadkach. Kryszta ly wykaza ly, ze s a stabilne i nie higroskopijne. Kryszta ly U 2 P 4 · 4Na (czterowodzian) o zawarto sci wody w przybli zeniu 8% pozostawiono na dziewi ec dni w wa- runkach 40°C i wzgl ednej wilgotno sci 75%. W tym przypadku zawarto sc wody zwi ekszy la si e do 14- -15%. Jednak zawarto sc wody nie zwi eksza la si e ju z wiecej, kryszta ly by ly stabilne. W przeciwie nstwie do tego, gdy liofilizowany produkt (pocz atkowa zawarto sc wody: w przybli- zeniu 1%) pozostawiono na dziewiec dni w warunkach 40°C i wzgl ednej wilgotno sci 75%, to zawar- tosc wody zwi ekszy la si e stopniowo, po siedmiu dniach przechowywania produkt oceniono jako stan mulisty z powodu rozp lywania si e pod wp lywem wilgoci z powietrza. (6) Stabilnosc Kryszta ly U 2 P 4 · 4Na (oktawodzian) i liofilizowany produkt umieszczono w odpowiednich butel- kach, które nast epnie zamkni eto i pozostawiono na 13 dni w temperaturze 60°C (test przyspieszony). Nie zaobserwowano rozk ladu kryszta lów ale zaobserwowano cz esciowy rozk lad liofilizowanego pro- duktu potwierdzony przez strat e wagi U 2 P 4 · 4Na, która wynosi la w przybli zeniu 1,4%. (7) Posta c krystaliczna Figura 4 przedstawia fotografi e typowej postaci krystalicznej kryszta lów U 2 P 4 · 4Na (oktawodzian). (8) widma absorpcji IR Widma IR kryszta lów U 2 P 4 · 4Na (oktawodzian) i liofilizowanego produktu mierzono w standar- dowy sposób stosuj ac spektrofotometr JASCO 5000. Wyniki przedstawiono na fig. 5 i 6. Liofilizowany produkt U 2 P 4 · 4Na wykazuje piki przy 3416, 1702, 1266, 1116, 1079 i 906 (cm -1 ) (fig. 6), podczas gdy kryszta ly U 2 P 4 · 4Na wykazuj a piki przy 3386, 1690, 1277, 1233, 1146, 1116 i 890 (cm -1 ) (fig. 5). P r z y k l a d 3. Wytwarzanie kryszta lów U 2 P 4 · 4Na oktawodzian Frakcj e zawieraj ac a U 2 P 4 otrzymana po obróbce na kolumnie w przyk ladzie 2 zatezano do wy- tworzenia zawiesiny, pH dostosowano do 7,0. Stopniowo do zawiesiny z mieszaniem dodawano me- tanol, zawiesin e dalej mieszano z ch lodzeniem do 10°C, dla wytr acenia kryszta lów U 2 P 4 · 4Na. Zawarto sc wody w tak otrzymanych i wysuszonych kryszta lach U 2 P 4 · 4Na zosta la zmierzona metod a Karla Fischera i tak stwierdzono, ze kryszta ly s a oktawodzianami. Widmo dyfrakcji promie- niami X kryszta lów pokazano na fig. 7, a dane obrazuj ace piki przedstawiono w tabeli 4. T a b e l a 4 Numer piku 29 (°) Wzgl edna intensywno sc (I/I o ) 1 5,96 100 5 11,58 30 6 12,42 77 8 15,40 50 10 17,20 38 11 18,04 38 12 19,84 82 13 20,62 66 14 21,42 48 19 25,38 36 25 27,58 39 24 27,98 37 30 30,64 33PL 206 867 B1 10 Zastosowanie przemys lowe Jak wy zej opisano U 2 P 4 lub jego sole otrzymane sposobem wed lug wynalazku maj a duza czy- stosc i stabilnosc oraz s a mniej higroskopijne w porównaniu do liofilizowanego produktu, zatem mog a s lu zy c jako u zyteczny surowiec do wytwarzania leków. Sposób wytwarzania U 2 P 4 lub jego soli wed lug wynalazku zapewnia du za wydajnosc i umo zli- wia syntez e zwi azku na skal e przemys low a. PL