JP3964809B2 - ジヌクレオチドの製造法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、慢性気管支炎、副鼻腔炎などの治療薬として有用なＰ1−（２’−デオキシシチジン５’−）Ｐ4−（ウリジン５’−）テトラホスフェートの効率的な製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
下記式［Ｉ］で表されるＰ1−（２’−デオキシシチジン５’−）Ｐ4−（ウリジン５’−）テトラホスフェートまたはその塩は、Ｐ２Ｙ２および／またはＰ２Ｙ４プリン受容体（purine receptor）の選択的アゴニスト（agonist）であり、慢性気管支炎（chronic bronchitis）、副鼻腔炎などの治療薬としての開発が期待されている化合物である（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
【化１】
【０００４】
従来、Ｐ1−（２’−デオキシシチジン５’−）Ｐ4−（ウリジン５’−）テトラホスフェートは結晶としては取得されておらず、凍結乾燥させて得た白色粉末（white solid）としてのみ調製されていた。しかし、従来の粉末品は純度が低く（ＨＰＬＣ純度：８２％）、特に原料であるウリジン５’−トリリン酸とＰ1−（２’−デオキシシチジン５’−）Ｐ4−（ウリジン５’−）テトラホスフェートとの分離が難しく、従来精製に使用されていたイオン交換クロマトグラフィー法だけでは高純度のＰ1−（２’−デオキシシチジン５’−）Ｐ4−（ウリジン５’−）テトラホスフェートを調製することは非常に困難なことであった（例えば、特許文献１参照）。
かかる純度の低い白色粉末品は、吸湿しやすい等の欠点を有することから、Ｐ1−（２’−デオキシシチジン５’−）Ｐ4−（ウリジン５’−）テトラホスフェートを医薬品として製剤化する際には湿気に配慮した特別の製造装置を必要としたり、製剤製造後も厳重な包装を必要とした。さらに、従来の粉末品は安定性が悪いため、有効期限の非常に短い薬剤とならざるを得ず、高純度の安定結晶体の取得が望まれていた。
【０００５】
Ｐ1−（２’−デオキシシチジン５’−）Ｐ4−（ウリジン５’−）テトラホスフェートは、２’−デオキシシチジン５’−モノリン酸とウリジン５’−トリリン酸を出発原料とし、活性化剤としてジサイクロヘキシルカルボジイミドを用いて合成されていたが、従来法の合成収率は約９％と極めて低く（例えば、特許文献１、実施例２０参照）、到底実用的な方法とはなり得なかった。従って、高収率で大量合成に適した製造法の開発も切望されていた。
【０００６】
【特許文献１】
国際公開第９８／３４９４２号
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、医薬品として製剤化するのに適したＰ1−（２’−デオキシシチジン５’−）Ｐ4−（ウリジン５’−）テトラホスフェートの大量合成に適した効率の良い製造法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはＰ1−（２’−デオキシシチジン５’−）Ｐ4−（ウリジン５’−）テトラホスフェートの安定化に関して鋭意研究を重ねた結果、陰イオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィー処理と活性炭を用いたクロマトグラフィー処理を併用することにより純度９５％以上のＰ1−（２’−デオキシシチジン５’−）Ｐ4−（ウリジン５’−）テトラホスフェートを調製することができ、このような高純度のＰ1−（２’−デオキシシチジン５’−）Ｐ4−（ウリジン５’−）テトラホスフェートを調製することにより初めてＰ1−（２’−デオキシシチジン５’−）Ｐ4−（ウリジン５’−）テトラホスフェートの結晶化に成功した。得られたＰ1−（２’−デオキシシチジン５’−）Ｐ4−（ウリジン５’−）テトラホスフェート結晶は従来品と比較して格段に純度が高く、吸湿性がなく、優れた安定性を有するものであることを確認した。
また、本発明者らは、高価なウリジン５’−トリリン酸ではなく、安価なウリジン５’−モノリン酸を用いたＰ1−（２’−デオキシシチジン５’−）Ｐ4−（ウリジン５’−）テトラホスフェートの合成法に関しても鋭意研究を重ねた結果、ジフェニルホスホロクロリデートおよびピロホスフェートを用いることにより効率よくＰ1−（２’−デオキシシチジン５’−）Ｐ4−（ウリジン５’−）テトラホスフェートを製造できることを見いだし、これらの知見を基に本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、ウリジン５’−モノリン酸、２’−デオキシシチジン５’−モノリン酸、ジフェニルホスホロクロリデートおよびピロホスフェートを反応させることを特徴とするＰ1−（２’−デオキシシチジン５’−）Ｐ4−（ウリジン５’−）テトラホスフェートの製造法を提供するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明のＰ1−（２’−デオキシシチジン５’−）Ｐ4−（ウリジン５’−）テトラホスフェート（以下、「ｄＣＰ４Ｕ」と記載することもある）の製造法は、ウリジン５’−モノリン酸（以下、「ＵＭＰ」と記載することもある）、２’−デオキシシチジン５’−モノリン酸（以下、「ｄＣＭＰ」と記載することもある）、ジフェニルホスホロクロリデート（以下、「ＤＰＣ」と記載することもある）およびピロホスフェート（以下、「ＰＰｉ」と記載することもある）を反応させることを特徴とする。
【００１１】
より具体的には、最初にＵＭＰとＤＰＣを反応させてＵＭＰジフェニルホスフェート（ＵＭＰ−ＤＰＰ）を合成し、これにＰＰｉを反応させて反応液中にウリジン５’−トリリン酸（ＵＴＰ）を生成させ、得られたＵＴＰを単離することなく、ＤＰＣ存在下、ＵＴＰとｄＣＭＰとを反応させて目的とするｄＣＰ４Ｕを製造する方法である。
【００１２】
ＵＭＰからＵＭＰ−ＤＰＰの合成は、例えば、常法により調製したＵＭＰトリアルキルアミン塩（例：ＵＭＰトリブチルアミン塩）をＤＭＦ、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）等のアミド系溶媒、ジオキサン、テトラヒドロフラン等の環状エーテル系溶媒、アセトン等のケトン系溶媒、ジメチルイミダゾリジノン、ヘキサメチルリン酸トリアミド等の単独または混合溶媒に溶解し、ＤＰＣと必要によりトリアルキルアミンを加え、１０〜５０℃で３０分〜５時間程度反応させることにより実施できる。
【００１３】
ＵＭＰ−ＤＰＰと反応させるＰＰｉとしては、ＰＰｉ−有機アルカリ塩が好ましく、具体的にはＰＰｉのヘキシルアミン塩、ジブチルアミン塩、トリエチルアミン塩、トリブチルアミン塩等が挙げられる。
【００１４】
ＵＭＰ−ＤＰＰとＰＰｉ−有機アルカリ塩との反応は、ＰＰｉ−有機アルカリ塩をＤＭＦ、ＤＭＡＣ、ホルムアミド等のアミド系溶媒、ジオキサン、テトラヒドロフラン等の環状エーテル系溶媒、アセトン等のケトン系溶媒、ジメチルイミダゾリジノン、ヘキサメチルリン酸トリアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル等の単独または混合溶媒に溶解し、これを上記のＵＭＰ−ＤＰＰ合成液に添加し、１０〜５０℃で３０分〜５時間程度反応させることにより行うことができる。
【００１５】
上記のＰＰｉ−有機アルカリ塩とＵＭＰ−ＤＰＰとの反応は、任意の塩基を共存させて反応させてもよく、かかる塩基としては、例えばピリジン、２，６−ルチジン，２，４−ルチジン、α−ピコリン，β−ピコリン、γ−ピコリン、２−，４−ジメチルアミノピリジン、α−コリジン、β−コリジン、γ−コリジン等のピリジン系塩基等が挙げられ、特にピリジンが好ましい。なお、かかる塩基が反応溶媒を兼用してもかまわない。使用する塩基の濃度は特に制限されず、原料として使用したＵＭＰに対して６当量以上、望ましくは１８当量以上を添加するのが好ましい。
【００１６】
上記ＰＰｉ−有機アルカリ塩とＵＭＰ−ＤＰＰとの反応により反応液中にはＵＴＰが合成される。この反応液中に生成したＵＴＰとｄＣＭＰを、ＤＣＰの存在下、反応させることによりｄＣＰ４Ｕを合成する。
用いるｄＣＭＰは、ｄＣＭＰそのものであってもよく、またＵＭＰと同様に、ｄＣＭＰジフェニルホスフェート（ｄＣＭＰ−ＤＰＰ）に変換後、反応液に添加してもかまわない。
【００１７】
ｄＣＰ４Ｕの合成反応は、上記のＵＴＰ合成液に、原料として使用したＵＭＰに対して１．１当量以上のＤＰＣと０．５〜１．５当量のｄＣＭＰまたはｄＣＭＰ−ＤＰＰを添加し、１０〜５０℃で３０分〜５時間程度反応させることにより行うことができる。
【００１８】
このようにして得られたｄＣＰ４Ｕは、以下の方法で精製、結晶化することで、ｄＣＰ４Ｕ結晶を取得することができる。
【００１９】
ｄＣＰ４Ｕの結晶は、粗ｄＣＰ４Ｕを特定の手段で精製し、精製されたｄＣＰ４Ｕ溶液に親水性有機溶媒を加えてｄＣＰ４Ｕを結晶として析出させることにより得られる。以下、▲１▼精製と▲２▼結晶化に分けて説明する。
【００２０】
▲１▼ｄＣＰ４Ｕの精製
ｄＣＰ４Ｕの精製は、陰イオン交換クロマトグラフィーと活性炭クロマトグラフィーの２つのクロマトグラフィーを併用することにより行うことができる。両クロマトグラフィ−を用いた精製は何れを先に行ってもよいが、最初に陰イオン交換クロマトグラフィーを行い、次いで活性炭クロマトグラフィーを行うことが、ｄＣＰ４Ｕの純度向上の点から好ましい。
【００２１】
ここで用いられる陰イオン交換樹脂としては、スチレン系或いはアクリル系樹脂を基材とする樹脂であればよく、強塩基性陰イオン交換樹脂（例えば、アンバーライトＩＲＡ４０２〔ローム＆ハース社製〕、ダイアイオンＰＡ−３１２、ダイアイオンＳＡ−１１Ａ〔三菱化学社製〕）、または弱塩基性陰イオン交換樹脂（例えば、アンバーライトＩＲＡ６７〔ローム＆ハース社製〕、ダイアイオンＷＡ−３０〔三菱化学社製〕）のいずれを用いてもかまわない。
活性炭としては、破砕状或いは粒状に整形されたクロマト用活性炭を使用すればよく、例えば和光純薬工業社、二村化学工業社製等の市販品を使用できる。
【００２２】
各クロマトグラフィーは、バッチ式、カラム式等いずれの形式であってもよく、カラムクロマトグラフィーを行う場合、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーの溶出剤としては、酸（例：塩酸）水溶液或いはこれに食塩等を添加してイオン強度を高めたもの、活性炭カラムクロマトグラフィーの溶出剤としては、水またはアルカリ（例：水酸化ナトリウム）水溶液をそれぞれ使用することができる。各溶出剤の濃度は、０．００１〜１０Ｍの範囲内から好適なものを小規模試験により適宜決定すればよい。
【００２３】
▲２▼ｄＣＰ４Ｕの結晶化
ｄＣＰ４Ｕの結晶化は、得られた精製ｄＣＰ４Ｕ溶液に親水性有機溶媒を加えてｄＣＰ４Ｕを結晶として析出させることにより行われる。
【００２４】
ここで使用できる親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール等炭素数６以下のアルコール類、アセトン等のケトン類、ジオキサン等のエーテル類、アセトニトリル等のニトリル類、ジメチルホルムアミド等のアミド類等を例示することができ、特にアルコール類、エタノールが好ましい。
【００２５】
より具体的には、精製ｄＣＰ４Ｕ溶液或いはこれを濃縮して得られるスラリー液に、所望によりｐＨを５〜１０、好ましくは６〜９に調整後、６０℃以下、好ましくは２０℃以下の温度条件下で親水性有機溶媒を添加し、ｄＣＰ４Ｕを結晶として析出させることによりｄＣＰ４Ｕの安定結晶を得ることができる。
【００２６】
かくして得られた本発明のｄＣＰ４Ｕ結晶は少なくとも、ｄＣＰ４Ｕが９５％以上、ＵＴＰが３％以下、の純度を有するものである。このようなｄＣＰ４Ｕ結晶の中でもさらに、ｄＣＰ４Ｕが９７％以上、ＵＴＰが２％以下、の純度を有するものが好ましく、さらにｄＣＰ４Ｕが９８％以上、ＵＴＰが１％以下、の純度を有するものが特に好ましい。
【００２７】
このような高純度のｄＣＰ４Ｕ結晶は、塩、水和物または含水塩の形態であってもよく、塩としてはナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の薬学的に許容される塩が例示される。塩の置換数は、１〜４個の金属が置換したものが挙げられる。
【００２８】
また、水和物としてはｄＣＰ４Ｕ１分子に対し１〜１４分子の水が結合または付着したものが例示される。さらに、含水塩としては、例えばｄＣＰ４Ｕ結晶のアルカリ金属塩１分子に１〜１４分子の水分子が結合または付着したものを挙げることができる。
【００２９】
なお、本発明のｄＣＰ４Ｕの結晶には互変異性体も包含されうる。
【００３０】
このようにして得られたｄＣＰ４Ｕの結晶は、必要により減圧乾燥、通風乾燥、加熱乾燥等の通常の方法により乾燥後、容器（ビン、袋、カン、アンプル等）に充填する。容器における封入状態は、開放、密閉、気密、密封のいずれの状態であってもよいが、保存安定性を維持する観点から開放状態でない方が好ましい。
【００３１】
【実施例】
以下、実施例を示し本発明を具体的に説明するが、本発明がこれに限定されないのは明らかである。
【００３２】
実施例１ ＵＭＰからのｄＣＰ４Ｕの合成
脱水したピロリン酸のトリエチルアミン塩（ＴＥＡ−ＰＰｉ）(１０ｍｍｏｌ)、フォルムアミド２．５ｍｌおよびピリジン７．６ｍｌを加えて撹拌した。一方、別の容器に脱水したウリジン５'−モノリン酸のトリブチルアミン塩（ＵＭＰ−ＴＢＡ）（１０ｍｍｏｌ）にＤＭＡＣ３．６ｍｌ、ジオキサン３．２ｍｌおよびトリブチルアミン３．３ｍｌを加えて撹拌し、ＤＰＣ２．３ｍｌを滴下した。室温で１時間撹拌してＵＭＰ−ＤＰＰを生成させ、先に調製しておいたＴＥＡ−ＰＰｉ脱水液に加えた。室温で１時間撹拌し、ＵＴＰを生成させた。さらに別の容器に２’−デオキシシチジン５'−モノリン酸のトリブチルアミン塩(ＴＢＡ−ｄＣＭＰ)４．９ｇ(１０ｍｍｏｌ)にＤＭＡＣ７．２ｍｌを加えて懸濁し、ＤＰＣ２．２ｍｌ（１．１当量）を加えて４０分間撹拌した。その後、トリブチルアミン（ＴＢＡ）９．５ｍｌを加えてさらに２０分間撹拌し、ｄＣＭＰ-ＤＰＰを調製した。得られたｄＣＭＰ-ＤＰＰ溶液を、先に調製しておいたＵＴＰ合成液に加えて室温で５６時間撹拌した。反応液に水を加えて反応を停止し、３０％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを１１に調整した。濃縮により溶媒を留去した後、６ｍｏｌ／Ｌ塩酸でｐＨを７．０に調整し、酢酸エチルで分液を行った。分液後の水層をＨＰＬＣ（２７２ｎｍ）で分析した結果、ｄＣＰ４Ｕの合成収率は３７．７％であった。
【００３３】
参考例 ｄＣＰ４Ｕ・４Ｎの結晶の製造
（１）ＤＣＣを用いる方法
ＵＴＰ、ｄＣＭＰ、およびＤＣＣを用い、２０ｍｍｏｌｅの反応スケールでｄＣＰ４Ｕを常法（ＷＯ９８／３４９４２）により調製した。
得られたｄＣＰ４Ｕ合成液を水で１０００ｍｌに液量調整後、中塩基性アニオン交換樹脂（アンバーライトＩＲＡ−６７［ローム＆ハース社製］）を充填したカラムにアプライし、水、０．１８Ｍ塩酸水溶液および０．５Ｍ食塩含有０．００５Ｍ塩酸水溶液の順で溶出し、ｄＣＰ4Ｕ含有画分を取得した。
得られたｄＣＰ４Ｕ画分４０００ｍｌをクロマト用活性炭（太閤顆粒活性炭ＳＧＰ［二村化学工業（株）社製］）を充填したカラムにアプライし、０．０５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液８０００ｍｌを用いてｄＣＰ４Ｕを溶出した。
上記ｄＣＰ４Ｕ画分を濃縮してスラリーを調製後、ｐＨ６．０に調整し、撹拌しながら徐々にエタノールを添加し、さらに１０℃に冷却しながらスラリーを撹拌してｄＣＰ４Ｕ・４Ｎａ結晶を晶析させ、これを分離してｄＣＰ４Ｕ・４Ｎａ結晶８．９ｇを得た。得られた結晶は約６０℃で約４時間減圧乾燥後、機器分析等に供した。
【００３４】
（２）ＤＰＣを用いる方法
ＵＴＰ・３Ｎａ１２．８ｋｇを１３５Ｌの水に溶解し、カチオン交換樹脂［三菱化学（株）］を充填したカラムにアプライし、通過液と水溶出分画を集め、撹拌しながらトリブチルアミン（ＴＢＡ）１３．６ｋｇを徐々に加えて中和した。得られた液を濃縮し、フォルムアミド１０ｋｇを加え、ジオキサンを用いて共沸脱水を行った。脱水後、ピリジン１１．６ｋｇを加えて希釈し、ＵＴＰのピリジン溶液を調製した。
一方で別のタンクにメタノール１８ＬにｄＣＭＰ７．５ｋｇを加え、撹拌しながらＴＢＡ４．５ｋｇを徐々に加え６０℃に加温した。溶解後、濃縮を行い乾固させた。７５℃で真空乾燥し、割砕した後、その中の１０．３ｋｇをジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）１６．７ｋｇに懸濁し、ジフェニルホスホロクロリデート（ＤＰＣ）４．４ｋｇを加えて１０分間撹拌した。その後、ＴＢＡ１０．８ｋｇを加えて３０分間撹拌し、ｄＣＭＰ-ＤＰＰ溶液とした。
得られたｄＣＭＰ-ＤＰＰ溶液を、先に調製しておいたＵＴＰのピリジン溶液に撹拌しながら添加した。添加後、室温で一晩撹拌し、脱イオン水を加えて反応を停止した。
３０％水酸化ナトリウム水溶液３１Ｌを加えて３０分間撹拌し、分液により遊離したＴＢＡを除去した。その後、６ｍｏｌ／Ｌ塩酸溶液でｐＨを約７に調整した。濃縮により溶媒を除去し、９５％エタノールを同容量加えて一晩静置した。上層のエタノール層を吸引除去した後、水あめ状の沈殿に水を加えて溶解し、濃縮により残留した溶媒を除去した。
得られたｄＣＰ４Ｕ合成液を２５００Ｌに液量調整し、中塩基性アニオン交換樹脂（アンバーライトＩＲＡ−９７［ローム＆ハース社製］）を充填したカラムにアプライした。水、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸水溶液および０．４ｍｏｌ／Ｌ食塩含有０．００５ｍｏｌ／Ｌ塩酸水溶液の順で溶出し、ｄＣＰ４Ｕ含有分画を取得した。
得られたｄＣＰ４Ｕ分画２１００Ｌをクロマト用活性炭（太閤顆粒活性炭ＳＧＰ［二村化学工業（株）社製］）を充填したカラムにアプライし、０．０５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液１２００Ｌを用いてｄＣＰ４Ｕを溶出した。
上記ｄＣＰ４Ｕ溶出分画を濃縮し、３０％水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨを７．５に調整し、撹拌しながら９５％エタノールを加えてｄＣＰ４Ｕ・４Ｎａ結晶を晶析させ、これを分離した。得られた結晶を６０℃で４時間乾燥し、目的とするｄＣＰ４Ｕ・４Ｎａ結晶４．２ｋｇ（水分５．９％、収率２２％）を得た。
【００３５】
〔ｄＣＰ４Ｕ・４Ｎａ結晶の物性〕
上記参考例の（１）または（２）で調製したｄＣＰ４Ｕ・４Ｎａ結晶とＷＯ９８／３４９４２の実施例２０記載の方法と同じ方法でｄＣＰ４Ｕ・４Ｎａの白色粉末（凍結乾燥品）との物性を比較した。
【００３６】
（３）機器分析
▲１▼純度検定
上記実施例（１）および（２）で得られたｄＣＰ４Ｕ・４Ｎａ結晶および各クロマトグラフィー処理による精製後のｄＣＰ４Ｕ画分の純度を高速液体クロマトグラフィー法で分析した結果を表１および２に示す。なお、高速液体クロマトグラフィー法は、以下の条件で行った。
カラム：ＨＩＴＡＣＨＩＧＥＬ＃３０１３−Ｎ（日立計測器サービス株式会社製）
溶出液：１０％ＣＨ3ＣＮ、０．１８Ｍ ＮＨ4Ｃｌ、０．０３Ｍ ＫＨ2ＰＯ4、０．０３Ｍ Ｋ2ＨＰＯ4
検出法：ＵＶ２６２ｎｍによる検出
【００３７】
【表１】
【００３８】
【表２】
【００３９】
▲２▼結晶形
ｄＣＰ４Ｕ・４Ｎａ結晶（３．５水和物）の代表的な結晶の写真を図１に示す。
【００４０】
▲３▼水分
カールフィッシャー法により結晶品の水分含量を測定した結果、乾燥の程度により変動するものの、６．９〜１７．４重量％の水分で安定化し、計算によりｄＣＰ４Ｕ１分子に対し３．５〜１０分子の水分子が結合または付着していることが明らかとなった。
【００４１】
▲４▼融点
常法により融点を測定した結果、結晶品の融点は２０２〜２１０℃であった。なお、凍結乾燥品の融点は約１９５〜２１０℃である。
【００４２】
▲５▼Ｘ線回析
理学電機製Ｘ線回折装置ＲＩＮＴ２５００Ｖ型を用い、下記の測定条件でＸ線回折スペクトルを測定した（測定誤差±０．１°）。図２および表３はｄＣＰ４Ｕ・４Ｎａ結晶の３．５水和物のデータであり、図３および表４はｄＣＰ４Ｕ・４Ｎａ結晶の１０水和物のデータである。また、参考として凍結乾燥品のＸ線回折スペクトルを図４に示す。
（測定条件）
Ｘ線管球：Ｃｕ−Ｋα
Ｘ線出力：５０ｋＶ−３００ｍＡ
走査速度：４．０°／分
走査間隔：０．０２°
測角範囲：２〜４０°
スリット：ＤＳ−０．５°，ＲＳ−０．１５ｍｍ，ＳＳ−０．５°
前処理 ：メノウ乳鉢にて粉砕
【００４３】
【表３】
【００４４】
【表４】
【００４５】
▲６▼吸湿性
水分約１７．４％のｄＣＰ４Ｕ・４Ｎａ結晶（１０水和物）を（ア）温度２５℃、相対湿度５７％、（イ）温度２５℃、相対湿度７５％、（ウ）温度２５℃、相対湿度９３％のそれぞれの条件下で２日間保存した場合、分解、重量変化とも観察されず、安定で吸湿性を有しないことが確認された。さらに、（エ）温度４０℃、相対湿度７５％の過酷な条件下で７日間保存しても変化は観察されなかった。
これに対し、凍結乾燥品（初発水分含量：約１％）を（ア）温度２５℃、相対湿度７５％、（イ）温度２５℃、相対湿度９３％のそれぞれの条件下で２日間保存した場合、水分含量が徐々に増加し、２日目には潮解し、どろどろの状態となった。
【００４６】
▲７▼安定性
ｄＣＰ４Ｕ・４Ｎａ結晶（１０水和物）と凍結乾燥品をビンに密封し、６０℃で１３日間保存した（加速試験）。その結果、結晶品の分解は全く観察されなかったが、凍結乾燥品は約２．２％の純度の低下が観察され、一部が分解していることが明らかであった。
【００４７】
▲８▼ＮＭＲ
結晶品または凍結乾燥品をそのままジルコニア製ロータに充填して13Ｃ−ＣＰＭＡＳ−ＮＭＲの測定を行った。測定条件を以下に示す。
13Ｃ−ＣＰＭＡＳ−ＮＭＲ
１）装置 Chemagnetics社製 CMX-300
２）測定方法 CPMAS(sideband suppresion)
３）測定温度 室温
４）観測核 13Ｃ
５）観測周波数 75.502MHz
６）プロトン励起パルス幅 4.5μs
７）コンタクトタイム 0.5msec.
８）観測幅 30.03kHz
９）観測ポイント 2048
10）データポイント 16384
11）観測繰り返し時間 15.0sec.(図６、図７),60.0sec.(図５)
12）化学シフト基準 ヘキサメチルベンゼン（外部標準17.35ppm）
13）試料回転速度 5kHz
14）積算回数 256回
【００４８】
図５および表５にｄＣＰ４Ｕ・４Ｎａ結晶の３．５水和物の13Ｃ−ＣＰＭＡＳ−ＮＭＲスペクトルを、図６および表６にｄＣＰ４Ｕ・４Ｎａ結晶の１０水和物の13Ｃ−ＣＰＭＡＳ−ＮＭＲスペクトルを、図７および表７にｄＣＰ４Ｕの白色粉末（凍結乾燥品）の13Ｃ−ＣＰＭＡＳ−ＮＭＲスペクトルを示す。なお、図５〜７のピーク番号は表５〜７のピーク番号である。
【００４９】
【表５】
【００５０】
【表６】
【００５１】
【表７】
【００５２】
【発明の効果】
また、本発明の製造法は、安価な原料であるＵＭＰを使用でき、しかも高収率でｄＣＰ４Ｕを製造することができ、大量合成に好適な製造法である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｄＣＰ４Ｕ・４Ｎａ結晶（３.５水和物）の結晶構造（偏光顕微鏡、４４０倍）を示す図である。なお、図中の１ｍｍは２５μｍに相当する。
【図２】ｄＣＰ４Ｕ・４Ｎａ結晶（３.５水和物）のＸ線回折スペクトルを示したものである。
【図３】ｄＣＰ４Ｕ・４Ｎａ結晶（１０水和物）のＸ線回折スペクトルを示したものである。
【図４】ｄＣＰ４Ｕの白色粉末（凍結乾燥品）のＸ線回折スペクトルを示したものである。
【図５】ｄＣＰ４Ｕ・４Ｎａ結晶（３.５水和物）の13Ｃ−ＣＰＭＡＳ−ＮＭＲスペクトルを示したものである。
【図６】ｄＣＰ４Ｕ・４Ｎａ結晶（１０水和物）の13Ｃ−ＣＰＭＡＳ−ＮＭＲスペクトルを示したものである。
【図７】図７は、ｄＣＰ４Ｕの白色粉末（凍結乾燥品）の13Ｃ−ＣＰＭＡＳ−ＮＭＲスペクトルを示したものである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、慢性気管支炎、副鼻腔炎などの治療薬として有用なＰ1−（２’−デオキシシチジン５’−）Ｐ4−（ウリジン５’−）テトラホスフェートの効率的な製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
下記式［Ｉ］で表されるＰ1−（２’−デオキシシチジン５’−）Ｐ4−（ウリジン５’−）テトラホスフェートまたはその塩は、Ｐ２Ｙ２および／またはＰ２Ｙ４プリン受容体（purine receptor）の選択的アゴニスト（agonist）であり、慢性気管支炎（chronic bronchitis）、副鼻腔炎などの治療薬としての開発が期待されている化合物である（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
【化１】
従来、Ｐ1−（２’−デオキシシチジン５’−）Ｐ4−（ウリジン５’−）テトラホスフェートは結晶としては取得されておらず、凍結乾燥させて得た白色粉末（white solid）としてのみ調製されていた。しかし、従来の粉末品は純度が低く（ＨＰＬＣ純度：８２％）、特に原料であるウリジン５’−トリリン酸とＰ1−（２’−デオキシシチジン５’−）Ｐ4−（ウリジン５’−）テトラホスフェートとの分離が難しく、従来精製に使用されていたイオン交換クロマトグラフィー法だけでは高純度のＰ1−（２’−デオキシシチジン５’−）Ｐ4−（ウリジン５’−）テトラホスフェートを調製することは非常に困難なことであった（例えば、特許文献１参照）。
かかる純度の低い白色粉末品は、吸湿しやすい等の欠点を有することから、Ｐ1−（２’−デオキシシチジン５’−）Ｐ4−（ウリジン５’−）テトラホスフェートを医薬品として製剤化する際には湿気に配慮した特別の製造装置を必要としたり、製剤製造後も厳重な包装を必要とした。さらに、従来の粉末品は安定性が悪いため、有効期限の非常に短い薬剤とならざるを得ず、高純度の安定結晶体の取得が望まれていた。
【０００５】
Ｐ1−（２’−デオキシシチジン５’−）Ｐ4−（ウリジン５’−）テトラホスフェートは、２’−デオキシシチジン５’−モノリン酸とウリジン５’−トリリン酸を出発原料とし、活性化剤としてジサイクロヘキシルカルボジイミドを用いて合成されていたが、従来法の合成収率は約９％と極めて低く（例えば、特許文献１、実施例２０参照）、到底実用的な方法とはなり得なかった。従って、高収率で大量合成に適した製造法の開発も切望されていた。
【０００６】
【特許文献１】
国際公開第９８／３４９４２号
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、医薬品として製剤化するのに適したＰ1−（２’−デオキシシチジン５’−）Ｐ4−（ウリジン５’−）テトラホスフェートの大量合成に適した効率の良い製造法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはＰ1−（２’−デオキシシチジン５’−）Ｐ4−（ウリジン５’−）テトラホスフェートの安定化に関して鋭意研究を重ねた結果、陰イオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィー処理と活性炭を用いたクロマトグラフィー処理を併用することにより純度９５％以上のＰ1−（２’−デオキシシチジン５’−）Ｐ4−（ウリジン５’−）テトラホスフェートを調製することができ、このような高純度のＰ1−（２’−デオキシシチジン５’−）Ｐ4−（ウリジン５’−）テトラホスフェートを調製することにより初めてＰ1−（２’−デオキシシチジン５’−）Ｐ4−（ウリジン５’−）テトラホスフェートの結晶化に成功した。得られたＰ1−（２’−デオキシシチジン５’−）Ｐ4−（ウリジン５’−）テトラホスフェート結晶は従来品と比較して格段に純度が高く、吸湿性がなく、優れた安定性を有するものであることを確認した。
また、本発明者らは、高価なウリジン５’−トリリン酸ではなく、安価なウリジン５’−モノリン酸を用いたＰ1−（２’−デオキシシチジン５’−）Ｐ4−（ウリジン５’−）テトラホスフェートの合成法に関しても鋭意研究を重ねた結果、ジフェニルホスホロクロリデートおよびピロホスフェートを用いることにより効率よくＰ1−（２’−デオキシシチジン５’−）Ｐ4−（ウリジン５’−）テトラホスフェートを製造できることを見いだし、これらの知見を基に本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、ウリジン５’−モノリン酸、２’−デオキシシチジン５’−モノリン酸、ジフェニルホスホロクロリデートおよびピロホスフェートを反応させることを特徴とするＰ1−（２’−デオキシシチジン５’−）Ｐ4−（ウリジン５’−）テトラホスフェートの製造法を提供するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明のＰ1−（２’−デオキシシチジン５’−）Ｐ4−（ウリジン５’−）テトラホスフェート（以下、「ｄＣＰ４Ｕ」と記載することもある）の製造法は、ウリジン５’−モノリン酸（以下、「ＵＭＰ」と記載することもある）、２’−デオキシシチジン５’−モノリン酸（以下、「ｄＣＭＰ」と記載することもある）、ジフェニルホスホロクロリデート（以下、「ＤＰＣ」と記載することもある）およびピロホスフェート（以下、「ＰＰｉ」と記載することもある）を反応させることを特徴とする。
【００１１】
より具体的には、最初にＵＭＰとＤＰＣを反応させてＵＭＰジフェニルホスフェート（ＵＭＰ−ＤＰＰ）を合成し、これにＰＰｉを反応させて反応液中にウリジン５’−トリリン酸（ＵＴＰ）を生成させ、得られたＵＴＰを単離することなく、ＤＰＣ存在下、ＵＴＰとｄＣＭＰとを反応させて目的とするｄＣＰ４Ｕを製造する方法である。
【００１２】
ＵＭＰからＵＭＰ−ＤＰＰの合成は、例えば、常法により調製したＵＭＰトリアルキルアミン塩（例：ＵＭＰトリブチルアミン塩）をＤＭＦ、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）等のアミド系溶媒、ジオキサン、テトラヒドロフラン等の環状エーテル系溶媒、アセトン等のケトン系溶媒、ジメチルイミダゾリジノン、ヘキサメチルリン酸トリアミド等の単独または混合溶媒に溶解し、ＤＰＣと必要によりトリアルキルアミンを加え、１０〜５０℃で３０分〜５時間程度反応させることにより実施できる。
【００１３】
ＵＭＰ−ＤＰＰと反応させるＰＰｉとしては、ＰＰｉ−有機アルカリ塩が好ましく、具体的にはＰＰｉのヘキシルアミン塩、ジブチルアミン塩、トリエチルアミン塩、トリブチルアミン塩等が挙げられる。
【００１４】
ＵＭＰ−ＤＰＰとＰＰｉ−有機アルカリ塩との反応は、ＰＰｉ−有機アルカリ塩をＤＭＦ、ＤＭＡＣ、ホルムアミド等のアミド系溶媒、ジオキサン、テトラヒドロフラン等の環状エーテル系溶媒、アセトン等のケトン系溶媒、ジメチルイミダゾリジノン、ヘキサメチルリン酸トリアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル等の単独または混合溶媒に溶解し、これを上記のＵＭＰ−ＤＰＰ合成液に添加し、１０〜５０℃で３０分〜５時間程度反応させることにより行うことができる。
【００１５】
上記のＰＰｉ−有機アルカリ塩とＵＭＰ−ＤＰＰとの反応は、任意の塩基を共存させて反応させてもよく、かかる塩基としては、例えばピリジン、２，６−ルチジン，２，４−ルチジン、α−ピコリン，β−ピコリン、γ−ピコリン、２−，４−ジメチルアミノピリジン、α−コリジン、β−コリジン、γ−コリジン等のピリジン系塩基等が挙げられ、特にピリジンが好ましい。なお、かかる塩基が反応溶媒を兼用してもかまわない。使用する塩基の濃度は特に制限されず、原料として使用したＵＭＰに対して６当量以上、望ましくは１８当量以上を添加するのが好ましい。
【００１６】
上記ＰＰｉ−有機アルカリ塩とＵＭＰ−ＤＰＰとの反応により反応液中にはＵＴＰが合成される。この反応液中に生成したＵＴＰとｄＣＭＰを、ＤＣＰの存在下、反応させることによりｄＣＰ４Ｕを合成する。
用いるｄＣＭＰは、ｄＣＭＰそのものであってもよく、またＵＭＰと同様に、ｄＣＭＰジフェニルホスフェート（ｄＣＭＰ−ＤＰＰ）に変換後、反応液に添加してもかまわない。
【００１７】
ｄＣＰ４Ｕの合成反応は、上記のＵＴＰ合成液に、原料として使用したＵＭＰに対して１．１当量以上のＤＰＣと０．５〜１．５当量のｄＣＭＰまたはｄＣＭＰ−ＤＰＰを添加し、１０〜５０℃で３０分〜５時間程度反応させることにより行うことができる。
【００１８】
このようにして得られたｄＣＰ４Ｕは、以下の方法で精製、結晶化することで、ｄＣＰ４Ｕ結晶を取得することができる。
【００１９】
ｄＣＰ４Ｕの結晶は、粗ｄＣＰ４Ｕを特定の手段で精製し、精製されたｄＣＰ４Ｕ溶液に親水性有機溶媒を加えてｄＣＰ４Ｕを結晶として析出させることにより得られる。以下、▲１▼精製と▲２▼結晶化に分けて説明する。
【００２０】
▲１▼ｄＣＰ４Ｕの精製
ｄＣＰ４Ｕの精製は、陰イオン交換クロマトグラフィーと活性炭クロマトグラフィーの２つのクロマトグラフィーを併用することにより行うことができる。両クロマトグラフィ−を用いた精製は何れを先に行ってもよいが、最初に陰イオン交換クロマトグラフィーを行い、次いで活性炭クロマトグラフィーを行うことが、ｄＣＰ４Ｕの純度向上の点から好ましい。
【００２１】
ここで用いられる陰イオン交換樹脂としては、スチレン系或いはアクリル系樹脂を基材とする樹脂であればよく、強塩基性陰イオン交換樹脂（例えば、アンバーライトＩＲＡ４０２〔ローム＆ハース社製〕、ダイアイオンＰＡ−３１２、ダイアイオンＳＡ−１１Ａ〔三菱化学社製〕）、または弱塩基性陰イオン交換樹脂（例えば、アンバーライトＩＲＡ６７〔ローム＆ハース社製〕、ダイアイオンＷＡ−３０〔三菱化学社製〕）のいずれを用いてもかまわない。
活性炭としては、破砕状或いは粒状に整形されたクロマト用活性炭を使用すればよく、例えば和光純薬工業社、二村化学工業社製等の市販品を使用できる。
【００２２】
各クロマトグラフィーは、バッチ式、カラム式等いずれの形式であってもよく、カラムクロマトグラフィーを行う場合、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーの溶出剤としては、酸（例：塩酸）水溶液或いはこれに食塩等を添加してイオン強度を高めたもの、活性炭カラムクロマトグラフィーの溶出剤としては、水またはアルカリ（例：水酸化ナトリウム）水溶液をそれぞれ使用することができる。各溶出剤の濃度は、０．００１〜１０Ｍの範囲内から好適なものを小規模試験により適宜決定すればよい。
【００２３】
▲２▼ｄＣＰ４Ｕの結晶化
ｄＣＰ４Ｕの結晶化は、得られた精製ｄＣＰ４Ｕ溶液に親水性有機溶媒を加えてｄＣＰ４Ｕを結晶として析出させることにより行われる。
【００２４】
ここで使用できる親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール等炭素数６以下のアルコール類、アセトン等のケトン類、ジオキサン等のエーテル類、アセトニトリル等のニトリル類、ジメチルホルムアミド等のアミド類等を例示することができ、特にアルコール類、エタノールが好ましい。
【００２５】
より具体的には、精製ｄＣＰ４Ｕ溶液或いはこれを濃縮して得られるスラリー液に、所望によりｐＨを５〜１０、好ましくは６〜９に調整後、６０℃以下、好ましくは２０℃以下の温度条件下で親水性有機溶媒を添加し、ｄＣＰ４Ｕを結晶として析出させることによりｄＣＰ４Ｕの安定結晶を得ることができる。
【００２６】
かくして得られた本発明のｄＣＰ４Ｕ結晶は少なくとも、ｄＣＰ４Ｕが９５％以上、ＵＴＰが３％以下、の純度を有するものである。このようなｄＣＰ４Ｕ結晶の中でもさらに、ｄＣＰ４Ｕが９７％以上、ＵＴＰが２％以下、の純度を有するものが好ましく、さらにｄＣＰ４Ｕが９８％以上、ＵＴＰが１％以下、の純度を有するものが特に好ましい。
【００２７】
このような高純度のｄＣＰ４Ｕ結晶は、塩、水和物または含水塩の形態であってもよく、塩としてはナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の薬学的に許容される塩が例示される。塩の置換数は、１〜４個の金属が置換したものが挙げられる。
【００２８】
また、水和物としてはｄＣＰ４Ｕ１分子に対し１〜１４分子の水が結合または付着したものが例示される。さらに、含水塩としては、例えばｄＣＰ４Ｕ結晶のアルカリ金属塩１分子に１〜１４分子の水分子が結合または付着したものを挙げることができる。
【００２９】
なお、本発明のｄＣＰ４Ｕの結晶には互変異性体も包含されうる。
【００３０】
このようにして得られたｄＣＰ４Ｕの結晶は、必要により減圧乾燥、通風乾燥、加熱乾燥等の通常の方法により乾燥後、容器（ビン、袋、カン、アンプル等）に充填する。容器における封入状態は、開放、密閉、気密、密封のいずれの状態であってもよいが、保存安定性を維持する観点から開放状態でない方が好ましい。
【００３１】
【実施例】
以下、実施例を示し本発明を具体的に説明するが、本発明がこれに限定されないのは明らかである。
【００３２】
実施例１ ＵＭＰからのｄＣＰ４Ｕの合成
脱水したピロリン酸のトリエチルアミン塩（ＴＥＡ−ＰＰｉ）(１０ｍｍｏｌ)、フォルムアミド２．５ｍｌおよびピリジン７．６ｍｌを加えて撹拌した。一方、別の容器に脱水したウリジン５'−モノリン酸のトリブチルアミン塩（ＵＭＰ−ＴＢＡ）（１０ｍｍｏｌ）にＤＭＡＣ３．６ｍｌ、ジオキサン３．２ｍｌおよびトリブチルアミン３．３ｍｌを加えて撹拌し、ＤＰＣ２．３ｍｌを滴下した。室温で１時間撹拌してＵＭＰ−ＤＰＰを生成させ、先に調製しておいたＴＥＡ−ＰＰｉ脱水液に加えた。室温で１時間撹拌し、ＵＴＰを生成させた。さらに別の容器に２’−デオキシシチジン５'−モノリン酸のトリブチルアミン塩(ＴＢＡ−ｄＣＭＰ)４．９ｇ(１０ｍｍｏｌ)にＤＭＡＣ７．２ｍｌを加えて懸濁し、ＤＰＣ２．２ｍｌ（１．１当量）を加えて４０分間撹拌した。その後、トリブチルアミン（ＴＢＡ）９．５ｍｌを加えてさらに２０分間撹拌し、ｄＣＭＰ-ＤＰＰを調製した。得られたｄＣＭＰ-ＤＰＰ溶液を、先に調製しておいたＵＴＰ合成液に加えて室温で５６時間撹拌した。反応液に水を加えて反応を停止し、３０％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを１１に調整した。濃縮により溶媒を留去した後、６ｍｏｌ／Ｌ塩酸でｐＨを７．０に調整し、酢酸エチルで分液を行った。分液後の水層をＨＰＬＣ（２７２ｎｍ）で分析した結果、ｄＣＰ４Ｕの合成収率は３７．７％であった。
【００３３】
参考例 ｄＣＰ４Ｕ・４Ｎの結晶の製造
（１）ＤＣＣを用いる方法
ＵＴＰ、ｄＣＭＰ、およびＤＣＣを用い、２０ｍｍｏｌｅの反応スケールでｄＣＰ４Ｕを常法（ＷＯ９８／３４９４２）により調製した。
得られたｄＣＰ４Ｕ合成液を水で１０００ｍｌに液量調整後、中塩基性アニオン交換樹脂（アンバーライトＩＲＡ−６７［ローム＆ハース社製］）を充填したカラムにアプライし、水、０．１８Ｍ塩酸水溶液および０．５Ｍ食塩含有０．００５Ｍ塩酸水溶液の順で溶出し、ｄＣＰ4Ｕ含有画分を取得した。
得られたｄＣＰ４Ｕ画分４０００ｍｌをクロマト用活性炭（太閤顆粒活性炭ＳＧＰ［二村化学工業（株）社製］）を充填したカラムにアプライし、０．０５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液８０００ｍｌを用いてｄＣＰ４Ｕを溶出した。
上記ｄＣＰ４Ｕ画分を濃縮してスラリーを調製後、ｐＨ６．０に調整し、撹拌しながら徐々にエタノールを添加し、さらに１０℃に冷却しながらスラリーを撹拌してｄＣＰ４Ｕ・４Ｎａ結晶を晶析させ、これを分離してｄＣＰ４Ｕ・４Ｎａ結晶８．９ｇを得た。得られた結晶は約６０℃で約４時間減圧乾燥後、機器分析等に供した。
【００３４】
（２）ＤＰＣを用いる方法
ＵＴＰ・３Ｎａ１２．８ｋｇを１３５Ｌの水に溶解し、カチオン交換樹脂［三菱化学（株）］を充填したカラムにアプライし、通過液と水溶出分画を集め、撹拌しながらトリブチルアミン（ＴＢＡ）１３．６ｋｇを徐々に加えて中和した。得られた液を濃縮し、フォルムアミド１０ｋｇを加え、ジオキサンを用いて共沸脱水を行った。脱水後、ピリジン１１．６ｋｇを加えて希釈し、ＵＴＰのピリジン溶液を調製した。
一方で別のタンクにメタノール１８ＬにｄＣＭＰ７．５ｋｇを加え、撹拌しながらＴＢＡ４．５ｋｇを徐々に加え６０℃に加温した。溶解後、濃縮を行い乾固させた。７５℃で真空乾燥し、割砕した後、その中の１０．３ｋｇをジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）１６．７ｋｇに懸濁し、ジフェニルホスホロクロリデート（ＤＰＣ）４．４ｋｇを加えて１０分間撹拌した。その後、ＴＢＡ１０．８ｋｇを加えて３０分間撹拌し、ｄＣＭＰ-ＤＰＰ溶液とした。
得られたｄＣＭＰ-ＤＰＰ溶液を、先に調製しておいたＵＴＰのピリジン溶液に撹拌しながら添加した。添加後、室温で一晩撹拌し、脱イオン水を加えて反応を停止した。
３０％水酸化ナトリウム水溶液３１Ｌを加えて３０分間撹拌し、分液により遊離したＴＢＡを除去した。その後、６ｍｏｌ／Ｌ塩酸溶液でｐＨを約７に調整した。濃縮により溶媒を除去し、９５％エタノールを同容量加えて一晩静置した。上層のエタノール層を吸引除去した後、水あめ状の沈殿に水を加えて溶解し、濃縮により残留した溶媒を除去した。
得られたｄＣＰ４Ｕ合成液を２５００Ｌに液量調整し、中塩基性アニオン交換樹脂（アンバーライトＩＲＡ−９７［ローム＆ハース社製］）を充填したカラムにアプライした。水、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸水溶液および０．４ｍｏｌ／Ｌ食塩含有０．００５ｍｏｌ／Ｌ塩酸水溶液の順で溶出し、ｄＣＰ４Ｕ含有分画を取得した。
得られたｄＣＰ４Ｕ分画２１００Ｌをクロマト用活性炭（太閤顆粒活性炭ＳＧＰ［二村化学工業（株）社製］）を充填したカラムにアプライし、０．０５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液１２００Ｌを用いてｄＣＰ４Ｕを溶出した。
上記ｄＣＰ４Ｕ溶出分画を濃縮し、３０％水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨを７．５に調整し、撹拌しながら９５％エタノールを加えてｄＣＰ４Ｕ・４Ｎａ結晶を晶析させ、これを分離した。得られた結晶を６０℃で４時間乾燥し、目的とするｄＣＰ４Ｕ・４Ｎａ結晶４．２ｋｇ（水分５．９％、収率２２％）を得た。
【００３５】
〔ｄＣＰ４Ｕ・４Ｎａ結晶の物性〕
上記参考例の（１）または（２）で調製したｄＣＰ４Ｕ・４Ｎａ結晶とＷＯ９８／３４９４２の実施例２０記載の方法と同じ方法でｄＣＰ４Ｕ・４Ｎａの白色粉末（凍結乾燥品）との物性を比較した。
【００３６】
（３）機器分析
▲１▼純度検定
上記実施例（１）および（２）で得られたｄＣＰ４Ｕ・４Ｎａ結晶および各クロマトグラフィー処理による精製後のｄＣＰ４Ｕ画分の純度を高速液体クロマトグラフィー法で分析した結果を表１および２に示す。なお、高速液体クロマトグラフィー法は、以下の条件で行った。
カラム：ＨＩＴＡＣＨＩＧＥＬ＃３０１３−Ｎ（日立計測器サービス株式会社製）
溶出液：１０％ＣＨ3ＣＮ、０．１８Ｍ ＮＨ4Ｃｌ、０．０３Ｍ ＫＨ2ＰＯ4、０．０３Ｍ Ｋ2ＨＰＯ4
検出法：ＵＶ２６２ｎｍによる検出
【００３７】
【表１】
【表２】
▲２▼結晶形
ｄＣＰ４Ｕ・４Ｎａ結晶（３．５水和物）の代表的な結晶の写真を図１に示す。
【００４０】
▲３▼水分
カールフィッシャー法により結晶品の水分含量を測定した結果、乾燥の程度により変動するものの、６．９〜１７．４重量％の水分で安定化し、計算によりｄＣＰ４Ｕ１分子に対し３．５〜１０分子の水分子が結合または付着していることが明らかとなった。
【００４１】
▲４▼融点
常法により融点を測定した結果、結晶品の融点は２０２〜２１０℃であった。なお、凍結乾燥品の融点は約１９５〜２１０℃である。
【００４２】
▲５▼Ｘ線回析
理学電機製Ｘ線回折装置ＲＩＮＴ２５００Ｖ型を用い、下記の測定条件でＸ線回折スペクトルを測定した（測定誤差±０．１°）。図２および表３はｄＣＰ４Ｕ・４Ｎａ結晶の３．５水和物のデータであり、図３および表４はｄＣＰ４Ｕ・４Ｎａ結晶の１０水和物のデータである。また、参考として凍結乾燥品のＸ線回折スペクトルを図４に示す。
（測定条件）
Ｘ線管球：Ｃｕ−Ｋα
Ｘ線出力：５０ｋＶ−３００ｍＡ
走査速度：４．０°／分
走査間隔：０．０２°
測角範囲：２〜４０°
スリット：ＤＳ−０．５°，ＲＳ−０．１５ｍｍ，ＳＳ−０．５°
前処理 ：メノウ乳鉢にて粉砕
【００４３】
【表３】
【表４】
▲６▼吸湿性
水分約１７．４％のｄＣＰ４Ｕ・４Ｎａ結晶（１０水和物）を（ア）温度２５℃、相対湿度５７％、（イ）温度２５℃、相対湿度７５％、（ウ）温度２５℃、相対湿度９３％のそれぞれの条件下で２日間保存した場合、分解、重量変化とも観察されず、安定で吸湿性を有しないことが確認された。さらに、（エ）温度４０℃、相対湿度７５％の過酷な条件下で７日間保存しても変化は観察されなかった。
これに対し、凍結乾燥品（初発水分含量：約１％）を（ア）温度２５℃、相対湿度７５％、（イ）温度２５℃、相対湿度９３％のそれぞれの条件下で２日間保存した場合、水分含量が徐々に増加し、２日目には潮解し、どろどろの状態となった。
【００４６】
▲７▼安定性
ｄＣＰ４Ｕ・４Ｎａ結晶（１０水和物）と凍結乾燥品をビンに密封し、６０℃で１３日間保存した（加速試験）。その結果、結晶品の分解は全く観察されなかったが、凍結乾燥品は約２．２％の純度の低下が観察され、一部が分解していることが明らかであった。
【００４７】
▲８▼ＮＭＲ
結晶品または凍結乾燥品をそのままジルコニア製ロータに充填して13Ｃ−ＣＰＭＡＳ−ＮＭＲの測定を行った。測定条件を以下に示す。
13Ｃ−ＣＰＭＡＳ−ＮＭＲ
１）装置 Chemagnetics社製 CMX-300
２）測定方法 CPMAS(sideband suppresion)
３）測定温度 室温
４）観測核 13Ｃ
５）観測周波数 75.502MHz
６）プロトン励起パルス幅 4.5μs
７）コンタクトタイム 0.5msec.
８）観測幅 30.03kHz
９）観測ポイント 2048
10）データポイント 16384
11）観測繰り返し時間 15.0sec.(図６、図７),60.0sec.(図５)
12）化学シフト基準 ヘキサメチルベンゼン（外部標準17.35ppm）
13）試料回転速度 5kHz
14）積算回数 256回
【００４８】
図５および表５にｄＣＰ４Ｕ・４Ｎａ結晶の３．５水和物の13Ｃ−ＣＰＭＡＳ−ＮＭＲスペクトルを、図６および表６にｄＣＰ４Ｕ・４Ｎａ結晶の１０水和物の13Ｃ−ＣＰＭＡＳ−ＮＭＲスペクトルを、図７および表７にｄＣＰ４Ｕの白色粉末（凍結乾燥品）の13Ｃ−ＣＰＭＡＳ−ＮＭＲスペクトルを示す。なお、図５〜７のピーク番号は表５〜７のピーク番号である。
【００４９】
【表５】
【表６】
【表７】
【発明の効果】
また、本発明の製造法は、安価な原料であるＵＭＰを使用でき、しかも高収率でｄＣＰ４Ｕを製造することができ、大量合成に好適な製造法である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｄＣＰ４Ｕ・４Ｎａ結晶（３.５水和物）の結晶構造（偏光顕微鏡、４４０倍）を示す図である。なお、図中の１ｍｍは２５μｍに相当する。
【図２】ｄＣＰ４Ｕ・４Ｎａ結晶（３.５水和物）のＸ線回折スペクトルを示したものである。
【図３】ｄＣＰ４Ｕ・４Ｎａ結晶（１０水和物）のＸ線回折スペクトルを示したものである。
【図４】ｄＣＰ４Ｕの白色粉末（凍結乾燥品）のＸ線回折スペクトルを示したものである。
【図５】ｄＣＰ４Ｕ・４Ｎａ結晶（３.５水和物）の13Ｃ−ＣＰＭＡＳ−ＮＭＲスペクトルを示したものである。
【図６】ｄＣＰ４Ｕ・４Ｎａ結晶（１０水和物）の13Ｃ−ＣＰＭＡＳ−ＮＭＲスペクトルを示したものである。
【図７】図７は、ｄＣＰ４Ｕの白色粉末（凍結乾燥品）の13Ｃ−ＣＰＭＡＳ−ＮＭＲスペクトルを示したものである。
Claims (2)
- ウリジン５’−モノリン酸、２’−デオキシシチジン５’−モノリン酸、ジフェニルホスホロクロリデートおよびピロホスフェートを反応させることを特徴とするＰ1−（２’−デオキシシチジン５’−）Ｐ4−（ウリジン５’−）テトラホスフェートの製造法。
- 最初にウリジン５’−モノリン酸とジフェニルホスホロクロリデートを反応させてウリジン５’−モノリン酸ジフェニルホスフェートを合成し、これにピロホスフェートを反応させて反応液中にウリジン５’−トリリン酸を生成させ、得られたウリジン５’−トリリン酸を単離することなく、ジフェニルホスホロクロリデート存在下、２’−デオキシシチジン５’−モノリン酸とウリジン５’−トリリン酸を反応させてＰ1−（２’−デオキシシチジン５’−）Ｐ4−（ウリジン５’−）テトラホスフェートを製造する請求項１記載の製造法。
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