JP3824894B2 - Ｐ１，ｐ４−ジ（ウリジン５’−）テトラホスフェート又はその塩の製造法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、去痰剤、肺炎治療薬として有用なＰ1，Ｐ4−ジ（ウリジン５'−）テトラホスフェート（Ｕ2Ｐ4）又はその塩の安定結晶及びその製造法、並びにＵ2Ｐ4又はその塩の効率的製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
下記式（Ｉ）で表されるＰ1，Ｐ4−ジ（ウリジン５'−）テトラホスフェート・４ナトリウム塩（Ｕ2Ｐ4・４Ｎａ）は、痰排出誘導作用を有し、去痰剤、肺炎治療薬としての開発が期待されている化合物である（米国特許５,７８９,３９１号公報、米国特許５,７６３,４４７号公報、米国特許５,６３５,１６０号公報等）。
【０００３】
【化１】
【０００４】
これまでに、Ｕ2Ｐ4は結晶としては取得されておらず、凍結乾燥品としてのみ調製されていた（ＷＯ９９／０５１５５、実施例１参照）。即ち、これまでに得られているＵ2Ｐ4の純度は、通常９０％前後と低く、Ｕ2Ｐ4の合成において生成される副生成物、例えばウリジン５'−テトラリン酸（ＵＰ4）、ウリジン５'−トリリン酸（ＵＴＰ）、ウリジン５'−ジリン酸（ＵＤＰ）、ウリジン５'−モノリン酸（ＵＭＰ）等のヌクレオシド５'−（ポリ）燐酸類、及びＰ1，Ｐ4−ジ（ウリジン５'−）トリホスフェート（Ｕ2Ｐ3）、Ｐ1，Ｐ4−ジ（ウリジン５'−）ジホスフェート（Ｕ2Ｐ2）等のジヌクレオシドポリ燐酸類が混在していた。特に、ＵＴＰ等のヌクレオシド５'−（ポリ）燐酸類とＵ2Ｐ4との分離は難しく、従来精製に使用されていたイオン交換クロマトグラフィーだけでは高純度のＵ2Ｐ4を調製することは非常に困難なことであった（ＷＯ９９／０５１５５、Biochimica et Biophysica Acta,438,(1976)p.304-309 ）。
【０００５】
斯かる純度が低い凍結乾燥品は、吸湿しやすい等の欠点を有することから、Ｕ2Ｐ4を医薬品として製剤化する際には湿気に配慮した特別の製造装置を必要としたり、製剤製造後も厳重な包装を要し、また安定性が悪いため、有効期限の非常に短い薬剤とならざるを得ず、高純度の安定結晶体の取得が望まれていた。
【０００６】
一方、Ｕ2Ｐ4は、ウリジン５'−モノリン酸（ＵＭＰ）を出発原料とし、ジフェニルホスホクロリデート(ＤＰＣ)等の活性化剤とピロホスフェート（ＰＰｉ）等のリン酸化剤を用いて合成されるが、従来法によれば合成収率は約１０％弱と極めて低く（ＷＯ９９／０５１５５、実施例４Ｂ参照）、到底実用的な方法とはなり得なかった。従って、高収率で大量合成に適した製造法の開発が切望されていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、医薬品として製剤化するのに適したＵ2Ｐ4又はその塩の安定結晶及びその製造法を提供すること、並びにＵ2Ｐ4の大量合成に適した効率の良い製造法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、Ｕ2Ｐ4の精製法及びＵＭＰを用いたＵ2Ｐ4の合成法に関し鋭意研究を重ねた結果、陰イオン交換クロマトグラフィーと活性炭を用いたクロマトグラフィー（活性炭クロマトグラフィー）を用いて精製されたＵ2Ｐ4を用いることにより容易にこれを結晶化できること、及びＵＭＰを出発原料とし、ＤＰＣとＰＰｉを用いてＵ2Ｐ4又はその塩を製造する方法において、特定の反応条件を設定することによりＵ2Ｐ4の合成収率が格段に向上することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち本発明は、Ｐ1，Ｐ4−ジ（ウリジン５'−）テトラホスフェート又はその塩の結晶を提供するものである。
【００１０】
さらに本発明は、粗Ｐ1，Ｐ4−ジ（ウリジン５'−）テトラホスフェート又はその塩を陰イオン交換クロマトグラフィーと活性炭クロマトグラフィーとを用いて精製し、精製されたＰ1，Ｐ4−ジ（ウリジン５'−）テトラホスフェート又はその塩溶液に、親水性有機溶媒を加えて結晶を析出させることを特徴とするＰ1，Ｐ4−ジ（ウリジン５'−）テトラホスフェート又はその塩の結晶の製造法を提供するものである。
【００１１】
更にまた本発明は、ウリジン５'−モノリン酸（ＵＭＰ）を出発原料とし、ジフェニルホスホクロリデート（ＤＰＣ）とピロホスフェート（ＰＰｉ）を用いてＰ1，Ｐ4−ジ（ウリジン５'−）テトラホスフェート又はその塩を製造する方法において、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つ以上の処理を行うことを特徴とするＰ1，Ｐ4−ジ（ウリジン５'−）テトラホスフェート又はその塩の製造法を提供するものである。
【００１２】
（ａ）ＵＭＰジフェニルホスフェート（ＵＭＰ−ＤＰＰ）とＰＰｉ−有機アルカリ塩を反応させる工程において、ＵＭＰ−ＤＰＰを複数回に分けて添加すること、
（ｂ）ＵＭＰ−ＤＰＰとＰＰｉ−有機アルカリ塩を反応させる工程において、塩基を共存させること、
（ｃ）Ｕ2Ｐ4合成反応後にアルカリ処理すること。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明のＵ2Ｐ4又はその塩の結晶は、粗Ｕ2Ｐ4又はその塩を特定の手段で精製し、精製されたＵ2Ｐ4又はその塩溶液に、親水性有機溶媒を加えて結晶を析出させることにより得られる。以下、（１）Ｕ2Ｐ4又はその塩の精製と、（２）Ｕ2Ｐ4又はその塩の結晶化に分けて説明する。
【００１４】
（１）Ｕ2Ｐ4又はその塩の精製
Ｕ2Ｐ4又はその塩の精製は、陰イオン交換クロマトグラフィーと活性炭クロマトグラフィーの２つのクロマトグラフィーを併用することにより行うことができる。両クロマトグラフィ−を用いた精製は何れを先に行ってもよいが、最初に陰イオン交換クロマトグラフィーを行い、次いで活性炭クロマトグラフィーを行うことが、Ｕ2Ｐ4の純度向上の点から好ましい。
【００１５】
ここで用いられる陰イオン交換樹脂としては、スチレン系或いはアクリル系樹脂を基材とする樹脂であればよく、強塩基性陰イオン交換樹脂（例えば、アンバーライトＩＲＡ４０２〔ローム＆ハース社製〕、ダイアイオンＰＡ−３１２、ダイアイオンＳＡ−１１Ａ〔三菱化学社製〕）、又は弱塩基性陰イオン交換樹脂（例えば、アンバーライトＩＲＡ６７〔ローム＆ハース社製〕、ダイアイオンＷＡ−３０〔三菱化学社製〕）のいずれを用いてもかまわない。
【００１６】
活性炭としては、破砕状或いは粒状に成形されたクロマト用活性炭を使用すればよく、例えば和光純薬工業社、二村化学工業社製等の市販品を使用できる。
【００１７】
各クロマトグラフィーは、バッチ式、カラム式等いずれの形式であってもよく、カラム式で行う場合、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーの溶出剤としては、塩酸等の酸水溶液或いはこれに食塩等を添加してイオン強度を高めたもの、活性炭カラムクロマトグラフィーの溶出剤としては、水又は水酸化ナトリウム等のアルカリ水溶液をそれぞれ使用することができる。各溶出剤の濃度は、０．００１〜１０Ｍの範囲内から好適なものを小規模試験により適宜決定すればよい。
【００１８】
（２）Ｕ2Ｐ4又はその塩の結晶化
Ｕ2Ｐ4又はその塩の結晶化は、得られた精製Ｕ2Ｐ4又はその塩に親水性有機溶媒を加えて結晶を析出させることにより行われる。
【００１９】
ここで使用できる親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール等炭素数６以下のアルコール類、アセトン等のケトン類、ジオキサン等のエーテル類、アセトニトリル等のニトリル類、ジメチルホルムアミド等のアミド類等を例示することができ、特にアルコール類、好ましくはエタノールが挙げられる。
【００２０】
より具体的には、精製Ｕ2Ｐ4又はその塩溶液或いはこれを濃縮して得られるスラリー液に、所望によりｐＨを６〜９に調整後、６０℃以下の温度条件下で親水性有機溶媒を添加し、結晶を析出させることによりＵ2Ｐ4の安定結晶を得ることができる。
【００２１】
かくして得られた本発明のＵ2Ｐ4結晶は少なくとも、▲１▼Ｕ2Ｐ4が９５％以上、▲２▼その他の類縁化合物が５％以下、の純度を有するものである。
【００２２】
ここで、その他の類縁化合物としては、ＵＰ4、ＵＴＰ、ＵＤＰ、ＵＭＰ等のヌクレオシド５'−（ポリ）燐酸類、及びＵ2Ｐ3、Ｕ2Ｐ2等のジヌクレオシドポリ燐酸類を意味する。
【００２３】
このようなＵ2Ｐ4結晶の中でも更に、▲１▼Ｕ2Ｐ4が９７％以上、▲２▼ＵＤＰが１％以下、▲３▼ＵＴＰが１％以下、の純度を有するものが好ましく、特に▲１▼Ｕ2Ｐ4が９８％以上、▲２▼ＵＤＰが０．５％以下、▲３▼ＵＴＰが０．５％以下、の純度を有するものが好ましい。
【００２４】
このような高純度のＵ2Ｐ4結晶は、塩、水和物又は含水塩の形態であってもよく、塩としてはナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の薬学的に許容される塩が例示される。塩の置換数は、１〜４個の金属が置換したものが挙げられる。
【００２５】
また、水和物としてはＵ2Ｐ4１分子に対し３〜８分子の水が結合又は付着したものが例示される。さらに、含水塩としては、例えばＵ2Ｐ4結晶のアルカリ金属塩１分子に３〜８分子の水分子が結合又は付着したものを挙げることができる。
【００２６】
Ｕ2Ｐ4塩結晶の好ましい例としては、例えばＵ2Ｐ4・４Ｎａ結晶又はその水和物が例示される。このＵ2Ｐ4・４Ｎａ結晶は、高温、多湿条件下で安定で、水分含量は５〜１５重量％で安定化し、吸湿性を示さない、という物性を有することから取り扱い易く、従来の凍結乾燥品と比べて極めて有用なものである。
【００２７】
斯かるＵ2Ｐ4・４Ｎａ結晶は、当然のことながら上述したように９５％以上の純度を有し、その他の類縁化合物総量が５％以下である。また、上述と同様に、▲１▼Ｕ2Ｐ4が９７％以上、▲２▼ＵＤＰが１％以下、▲３▼ＵＴＰが１％以下、の純度を有するもの、及び▲１▼Ｕ2Ｐ4が９８％以上、▲２▼ＵＤＰが０．５％以下、▲３▼ＵＴＰが０．５％以下、の純度を有するものを好ましい例として挙げることができる。
【００２８】
尚、本発明のＵ2Ｐ4又はその塩の結晶には互変異性体も包含されうる。
本発明のＵ2Ｐ4又はその塩の結晶は、必要により減圧乾燥、通風乾燥、加熱乾燥等の通常の方法により乾燥後、容器（ビン、袋、カン、アンプル等）に充填する。容器における封入状態は、開放、密閉、気密、密封のいずれの状態であってもよいが、保存安定性を維持する観点から開放状態でない方が好ましい。
【００２９】
次にＵ2Ｐ4の効率的合成法について説明する。
従来、Ｕ2Ｐ4又はその塩の主たる合成は、ウリジン５'−モノリン酸（ＵＭＰ）を出発原料とし、これをジフェニルホスホクロリデート（ＤＰＣ）等の活性化剤を用いて活性体とし、これにピロホスフェート（ＰＰｉ）等のリン酸化剤を反応させることにより行われている。具体的にはＵＭＰのトリブチルアミン塩に、ＤＰＣとトリブチルアミンを加え、活性化体であるＵＭＰジフェニルホスフェート（ＵＭＰ−ＤＰＰ）を得、これとトリブチルアミンピロホスフェート（ＴＢＡ−ＰＰｉ）を反応させることにより、約９．６％の収率でＵ2Ｐ4又はその塩を得ていた（ＷＯ９９／０５１５５、実施例４Ｂ参照）。
【００３０】
本発明方法は、斯かる従来法のＵＭＰ−ＤＰＰとＰＰｉ−有機アルカリ塩とを反応させる工程において、（ａ）ＵＭＰ−ＤＰＰを複数回に分けて添加すること、（ｂ）塩基を共存させること、及び（ｃ）Ｕ2Ｐ4合成反応後にアルカリ処理すること、のいずれか或いは二種以上を組み合わせることを特徴とするものである。
【００３１】
ここで、「（ａ）ＵＭＰ−ＤＰＰを複数回に分けて添加する」とは、ＰＰｉ−有機アルカリ塩の２倍モル必要とされるＵＭＰ−ＤＰＰを、必要量を一度に反応させるのではなく、複数回に分けて添加するものである。例えば、最初にＰＰｉ−有機アルカリ塩と等モルのＵＭＰ−ＤＰＰ反応させた後、続けてＰＰｉ−有機アルカリ塩と等モルのＵＭＰ−ＤＰＰを添加して反応させる如きである。ＵＭＰ−ＤＰＰの添加回数は特に限定されるものではないが、２〜３回に分けて行うことが収率向上の点から好ましい。
【００３２】
尚、ここでいうＰＰｉ−有機アルカリ塩としては、ＰＰｉのヘキシルアミン塩、ジブチルアミン塩、トリエチルアミン塩、トリブチルアミン塩等が挙げられ、ＵＭＰ−ＤＰＰとの反応は、斯かるＰＰｉ−有機アルカリ塩をＤＭＦ、ＤＭＡＣ、ホルムアミド等のアミド系溶媒、ジオキサン、テトラヒドロフラン等の環状エーテル系溶媒、アセトン等のケトン系溶媒、ジメチルイミダゾリジノン、ヘキサメチルリン酸トリアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル等の単独又は混合溶媒に溶解し、これにＵＭＰ−ＤＰＰを添加し、室温で３０分〜５時間程度反応させることにより行うことができる。
【００３３】
また、「（ｂ）塩基を共存させる」とは、上記ＰＰｉ−有機アルカリ塩とＵＭＰ−ＤＰＰの反応を任意の塩基を共存させて反応させることをいい、斯かる塩基としては、例えばピリジン、２，６−ルチジン，２，４−ルチジン、２−，４−，または６−ピコリン、２，４−ジメチルアミノピリジン、コリジン等のピリジン系塩基等が挙げられ、特にピリジンが好ましい。尚、斯かる塩基が反応溶媒を兼用している場合も本発明の塩基に包含される。また、塩基の濃度は特に制限されず、ＵＭＰに対して６当量以上、望ましくは１８当量以上を添加するのが好ましい。
【００３４】
更に「（ｃ）Ｕ2Ｐ4合成反応後にアルカリ処理する」とは、Ｕ2Ｐ4合成液を水でクエンチ後、水酸化ナトリウム、アンモニア、水酸化カリウム、ピリジン、トリエチルアミン、炭酸ナトリウム等の有機又は無機のアルカリ溶液を用いて処理することをいう。斯かる処理を行うことで、クエンチ後そのまま精製していた従来法に比べＵ2Ｐ4の単離収率を一層向上させることが可能となる。
【００３５】
斯かるアルカリ処理は、水でクエンチ後のＵ2Ｐ4合成液にアルカリをｐＨ８〜１３、好ましくは１０〜１２程度になるように添加し、室温で１０分〜５時間程度反応させることにより行われる。
【００３６】
尚、ＵＭＰからＵＭＰ−ＤＰＰの合成は、従来法が適用でき、例えば、常法により調製したＵＭＰトリブチルアミン塩等のＵＭＰトリアルキルアミン塩をＤＭＦ、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）等のアミド系溶媒、ジオキサン、テトラヒドロフラン等の環状エーテル系溶媒、アセトン等のケトン系溶媒、ジメチルイミダゾリジノン、ヘキサメチルリン酸トリアミド等の単独又は混合溶媒に溶解し、ＤＰＣと必要によりトリアルキルアミンを加え、室温で３０分〜５時間程度反応させて活性化体であるＵＭＰ−ＤＰＰを合成することができる。
【００３７】
【実施例】
以下、実施例を示し本発明を具体的に説明する。
【００３８】
実施例１ Ｕ2Ｐ4又はその塩の合成
（１）塩基の効果
脱水したウリジン５'−モノリン酸のトリブチルアミン塩（ＵＭＰ−ＴＢＡ）（６．２ｍｍｏｌ）にＤＭＡＣ８ｍＬを加えて撹拌しながらＤＰＣ１．７ｍＬを滴下した。室温下で１時間反応させてＵＭＰ−ＤＰＰを生成させた後、ＴＢＡ７．６ｍＬを加え、更に１０分間撹拌した。別途、脱水したＴＥＡ−ＰＰｉ（３．０ｍｍｏｌ）をピリジン１．７ｍＬに溶解しておき、ＵＭＰ−ＤＰＰ反応液に添加した。室温下で３時間撹拌した後、水を加えて反応を停止した。得られた液をＨＰＬＣ（２６２ｎｍ）で分析した結果、収率１８．３％で目的とするＵ2Ｐ4を得た。
【００３９】
この結果より、ＵＭＰ−ＤＰＰとＴＥＡ−ＰＰｉとの反応を塩基（ピリジン）共存下で行なうことにより、従来法の約２倍弱の収率でＵ２Ｐ４を合成できることが明らかとなった。
【００４０】
（２）塩基とアルカリ処理の併用効果
脱水したウリジン５'−モノリン酸のトリブチルアミン塩（ＵＭＰ−ＴＢＡ）（６．２ｍｍｏｌ）にＤＭＡＣ８ｍＬを加えて撹拌しながらＤＰＣ１．７ｍＬを滴下した。室温下で１時間反応させてＵＭＰ−ＤＰＰを生成させた後、ＴＢＡ７．６ｍＬを加え、更に１０分間撹拌した。別途、脱水したＴＥＡ−ＰＰｉ（３．０ｍｍｏｌ）をピリジン１．７ｍＬに溶解しておき、ＵＭＰ−ＤＰＰ反応液に添加した。室温下で３時間撹拌した後、水を加えて反応を停止した。反応液に３０％水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨ１１．０に調整し、一晩放置した。得られた液をＨＰＬＣ（２６２ｎｍ）で分析した結果、収率２９．７％で目的とするＵ2Ｐ4を得た。
【００４１】
この結果より、ＵＭＰ−ＤＰＰとＴＥＡ−ＰＰｉとの反応を塩基（ピリジン）共存下で行ない、さらにアルカリ処理を施すことで、従来法の約３倍の収率でＵ2Ｐ4を合成できることが明らかとなった。
【００４２】
（３）塩基とＵＭＰ−ＤＰＰ複数回添加効果
脱水したピロリン酸のトリエチルアミン塩（ＴＥＡ−ＰＰｉ）（６ｍｍｏｌ）、フォルムアミド１．５ｍＬ及びピリジン１．５ｍＬを加えて撹拌した。一方、別の容器に脱水したウリジン５'−モノリン酸のトリブチルアミン塩（ＵＭＰ−ＴＢＡ）（１２ｍｍｏｌ）にＤＭＡＣ４．３ｍＬ、ジオキサン４．８ｍＬ及びトリブチルアミン（ＴＢＡ）５．８ｍＬを加えて撹拌し、その後ＤＰＣ２．５ｍＬを滴下し室温下で更に一時間撹拌してＵＭＰ−ＤＰＰを生成させた。ＴＥＡ−ＰＰｉの入った容器にＵＭＰ−ＤＰＰ溶液の半分量を滴下し、室温下で１時間反応させた。再度、ピリジンを１．５ｍＬ添加した後、残りのＵＭＰ−ＤＰＰ溶液を滴下した。更に室温下で一時間反応させた後、水を加えて反応を停止した。得られた液をＨＰＬＣ（２６２ｎｍ）で分析した結果、収率２９．５％で目的とするＵ2Ｐ4を得た。
【００４３】
この結果より、ＵＭＰ−ＤＰＰの添加を２回に分けて行なうことと、ＵＭＰ−ＤＰＰとＴＥＡ−ＰＰｉとの反応を塩基（ピリジン）共存下で行なうことにより、従来法の約３倍弱の収率でＵ2Ｐ4を合成できることが明らかとなった。また、上記（１）と比較すると、ＵＭＰ−ＤＰＰの添加を２回に分けて行なうことにより、１８．３％の収率が上記のように収率２９．５％になり、収率が約１．６倍向上することが明らかとなった。
【００４４】
（４）アルカリ処理の効果
脱水したピロリン酸のトリエチルアミン塩（ＴＥＡ−ＰＰｉ）（６ｍｍｏｌ）、フォルムアミド１．５ｍＬ及びピリジン１．５ｍＬを加えて撹拌した。一方、別の容器に脱水したウリジン５'−モノリン酸のトリブチルアミン塩（ＵＭＰ−ＴＢＡ）（１２ｍｍｏｌ）にＤＭＡＣ４．３ｍＬ、ジオキサン４．８ｍＬ及びトリブチルアミン（ＴＢＡ）５．８ｍＬを加えて撹拌し、その後ＤＰＣ２．５ｍＬを滴下し室温下で更に一時間撹拌してＵＭＰ−ＤＰＰを生成させた。ＴＥＡ−ＰＰｉの入った容器にＵＭＰ−ＤＰＰ溶液の半分量を滴下し、室温下で１時間反応させた。再度、ピリジンを１．５ｍＬ添加した後、残りのＵＭＰ−ＤＰＰ溶液を滴下した。更に室温下で一時間反応させた後、水を加えて反応を停止した。反応液に３０％水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨ１１．０に調整し、一晩放置した。得られた液をＨＰＬＣ（２６２ｎｍ）で分析した結果、収率３２．２％で目的とするＵ2Ｐ4を得た。
【００４５】
上記（３）と比較すると、アルカリ処理を追加することにより、２９．５％の収率が上記のように収率３２．２％になり、収率が約１割向上することが明らかとなった。
【００４６】
実施例２ Ｕ2Ｐ4・４Ｎａ結晶の製造
脱水したピロリン酸のトリエチルアミン塩（ＴＥＡ−ＰＰｉ）（４０．５ｍｍｏｌ）、フォルムアミド１０ｍＬ及びピリジン１５ｍＬを加えて撹拌した。一方、別の容器に脱水したウリジン５' −モノリン酸のトリブチルアミン塩（ＵＭＰ−ＴＢＡ）（８０ｍｍｏｌ）にＤＭＡＣ５０ｍＬ、ジオキサン３４ｍＬ及びトリブチルアミン（ＴＢＡ）３０ｍＬを加えて撹拌し、その後、ＤＰＣ１７．８ｍＬを滴下し室温下で更に一時間撹拌してＵＭＰ−ＤＰＰを生成させた。ＴＥＡ−ＰＰｉの入った容器にＵＭＰ−ＤＰＰ溶液の半分量を滴下し、室温下で１時間反応させた。再度、ピリジンを１５ｍＬと４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）５０ｍｇを添加した後、残りのＵＭＰ−ＤＰＰ溶液を滴下した。更に室温下で二時間反応させた後、水を加えて反応を停止した。合成液を７００ｍＬまで水で希釈した後、水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを１０に調整した。２００ｍＬ程度まで濃縮した後、撹拌しながらエタノール２５０ｍＬを添加した。４℃で一晩静置した後、上澄みをデカントにより除去した。得られた液を水で２５０ｍＬまで希釈し、ＨＰＬＣ（２６２ｎｍ）で分析した結果、収率３０．０％でＵ2Ｐ4を得た。
【００４７】
上記反応液１１０ｍＬを水で２０００ｍＬまで希釈し、弱陰イオン交換樹脂（アンバーライトＩＲＡ−６７）（Ｃｌ型）２００ｍＬにかけた。水洗後、副生成物を０．１８Ｍ塩酸で溶出し、０．３５Ｍの食塩を含む０．００５Ｍ塩酸溶液で目的とするＵ2Ｐ4を溶出した（回収率８２．７％）。
【００４８】
得られた溶出液を水酸化ナトリウム溶液でｐＨ２．５に調整した。その後、活性炭カラム（太閤ＳＧＰ）４００ｍＬにかけ、水洗した後、０．０５Ｍ水酸化ナトリウム溶液で溶出した（回収率８４．９％）。
溶出液のｐＨを７．６に調整した後、３８ｍＬまで濃縮した。濃縮液にエタノール５７ｍＬを加えて結晶化し、３．１ｇのＵ2Ｐ4・４Ｎａ結晶（水分７．８％）を得た（単離収率１８．４％）。
【００４９】
〔Ｕ2Ｐ4・４Ｎａ結晶の物性〕
実施例２で調製したＵ2Ｐ4・４Ｎａ結晶を約６０℃で約４時間通風乾燥後、機器分析等に供した。また、ＷＯ９９／０５１５５の実施例１記載の方法と同じ方法でＵ2Ｐ4・４Ｎａの凍結乾燥品を調製し、結晶品との物性を比較した。
【００５０】
（１）機器分析
▲１▼純度検定
実施例２で得られたＵ2Ｐ4・４Ｎａ結晶及び各クロマトグラフィー処理による精製後のＵ2Ｐ4画分の純度を高速液体クロマトグラフィー法で分析した結果を表１に示す。なお、高速液体クロマトグラフィー法は、以下の条件で行った。
カラム：ＨＩＴＡＣＨＩＧＥＬ＃3013−Ｎ（日立計測器サービス株式会社製）
溶出液：10％ＣＨ3ＣＮ、0.18M ＮＨ4Ｃｌ、0.03ＭＫＨ2ＰＯ4、
0.03ＭＫ2ＨＰＯ4
検出法：ＵＶ２６２ｎｍによる検出
【００５１】
【表１】
【００５２】
▲２▼水分
カールフィッシャー法により測定した結果、乾燥の程度により変動するものの、５〜１５重量％の水分で安定化し、計算によりＵ2Ｐ4１分子に対し３〜８分子の水分子が結合又は付着していることが明らかとなった。
【００５３】
▲３▼融点
常法により融点を測定した結果、分解点は約２２３℃であった。なお、凍結乾燥品の分解点は約２２０℃である。
【００５４】
▲４▼Ｘ線回析
理学電機製Ｘ線回折装置ＲＩＮＴ２５００Ｖ型を用い、下記の測定条件で測定したＸ線回折スペクトルを図１に、そのピークデータを表２に示す。
【００５５】
（測定条件）
Ｘ線管球：Ｃｕ−Ｋα
Ｘ線出力：５０ｋＶ−３００ｍＡ
走査速度：４．０°／分
走査間隔：０．０２°
測角範囲：２〜４０°
スリット：ＤＳ−０．５°，ＲＳ−０．１５ｍｍ，ＳＳ−０．５°
前処理 ：メノウ乳鉢にて粉砕
【００５６】
【表２】
【００５７】
なお、図１及び表２はＵ2Ｐ4・４Ｎａ結晶の８水和物のデータである。また、参考として凍結乾燥品のＸ線回折スペクトルを図２に示す。
【００５８】
▲５▼吸湿性
水分約１４％のＵ2Ｐ4・４Ｎａ結晶（８水和物）を（ア）温度２５℃、相対湿度５７％、（イ）温度２５℃、相対湿度７５％、（ウ）温度４０℃、相対湿度７５％のそれぞれの条件下で９日間保存した場合、分解、重量変化とも観察されず、安定で吸湿性を有しないことが確認された。また、水分約８％のＵ2Ｐ4・４Ｎａ結晶（４水和物）を温度４０℃、相対湿度７５％の条件下で９日間保存した場合、水分含量が１４〜１５％まで増加したが、それ以上の増加は観察されず、安定化した。
これに対し、凍結乾燥品（初発水分含量：約１％）を温度４０℃、相対湿度７５％の条件下で９日間保存すると、水分含量が徐々に増加し、７日目には潮解し、どろどろの状態となった。
【００５９】
▲６▼安定性
Ｕ2Ｐ4・４Ｎａ結晶（８水和物）と凍結乾燥品をビンに密封し、６０℃で１３日間保存した（加速試験）。その結果、結晶品の分解は全く観察されなかったが、凍結乾燥品は約１．４％のＵ2Ｐ4・４Ｎａ純度の減少が観察され、一部が分解していることが明らかであった。
【００６０】
▲７▼結晶型
Ｕ2Ｐ4・４Ｎａ結晶（８水和物）の代表的な結晶の写真を図３に示す。
【００６１】
実施例３ Ｕ2Ｐ4・４Ｎａ・８水和物結晶の製造
実施例２のカラム処理で得られたＵ2Ｐ4画分を濃縮してスラリーを調製後、ｐＨ７．０に調整し、攪拌しながら徐々にメタノールを添加し、さらに１０℃に冷却しながらスラリーを攪拌してＵ2Ｐ4・４Ｎａ結晶を晶析させた。
【００６２】
得られたＵ2Ｐ4・４Ｎａ結晶を乾燥後、カールフィッシャ―法で水分を測定した結果、８水和物であることが明らかとなった。この結晶のＸ線回折スペクトルを図４に、そのピークデータを表３に示す。
【００６３】
【表３】
【００６４】
【発明の効果】
本発明方法により得られたＵ2Ｐ4又はその塩の結晶は、高純度であるとともに、凍結乾燥品に比べて吸湿性もなく極めて安定であり、医薬品原料として有用である。
また、本発明のＵ2Ｐ4又はその塩の製造法によれば、高収率でＵ2Ｐ4又はその塩を製造することができ、Ｕ2Ｐ4又はその塩の大量合成を可能とする。
【図面の簡単な説明】
【図１】 エタノールを用いて晶析させたＵ2Ｐ4・４Ｎａ結晶の８水和物のＸ線回折スペクトルを示したものである。
【図２】 Ｕ2Ｐ4の凍結乾燥品のＸ線回折スペクトルを示したものである。
【図３】 エタノールを用いて晶析させたＵ2Ｐ4・４Ｎａ結晶の８水和物の結晶構造を示す写真である。該写真は偏光顕微鏡（倍率４４０倍）を用いて撮影したもので、１ｃｍは２３μｍに相当する。
【図４】 メタノールを用いて晶析させたＵ2Ｐ4・４Ｎａ結晶の８水和物のＸ線回折スペクトルを示したものである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、去痰剤、肺炎治療薬として有用なＰ1，Ｐ4−ジ（ウリジン５'−）テトラホスフェート（Ｕ2Ｐ4）又はその塩の安定結晶及びその製造法、並びにＵ2Ｐ4又はその塩の効率的製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
下記式（Ｉ）で表されるＰ1，Ｐ4−ジ（ウリジン５'−）テトラホスフェート・４ナトリウム塩（Ｕ2Ｐ4・４Ｎａ）は、痰排出誘導作用を有し、去痰剤、肺炎治療薬としての開発が期待されている化合物である（米国特許５,７８９,３９１号公報、米国特許５,７６３,４４７号公報、米国特許５,６３５,１６０号公報等）。
【０００３】
【化１】
これまでに、Ｕ2Ｐ4は結晶としては取得されておらず、凍結乾燥品としてのみ調製されていた（ＷＯ９９／０５１５５、実施例１参照）。即ち、これまでに得られているＵ2Ｐ4の純度は、通常９０％前後と低く、Ｕ2Ｐ4の合成において生成される副生成物、例えばウリジン５'−テトラリン酸（ＵＰ4）、ウリジン５'−トリリン酸（ＵＴＰ）、ウリジン５'−ジリン酸（ＵＤＰ）、ウリジン５'−モノリン酸（ＵＭＰ）等のヌクレオシド５'−（ポリ）燐酸類、及びＰ1，Ｐ4−ジ（ウリジン５'−）トリホスフェート（Ｕ2Ｐ3）、Ｐ1，Ｐ4−ジ（ウリジン５'−）ジホスフェート（Ｕ2Ｐ2）等のジヌクレオシドポリ燐酸類が混在していた。特に、ＵＴＰ等のヌクレオシド５'−（ポリ）燐酸類とＵ2Ｐ4との分離は難しく、従来精製に使用されていたイオン交換クロマトグラフィーだけでは高純度のＵ2Ｐ4を調製することは非常に困難なことであった（ＷＯ９９／０５１５５、Biochimica et Biophysica Acta,438,(1976)p.304-309 ）。
【０００５】
斯かる純度が低い凍結乾燥品は、吸湿しやすい等の欠点を有することから、Ｕ2Ｐ4を医薬品として製剤化する際には湿気に配慮した特別の製造装置を必要としたり、製剤製造後も厳重な包装を要し、また安定性が悪いため、有効期限の非常に短い薬剤とならざるを得ず、高純度の安定結晶体の取得が望まれていた。
【０００６】
一方、Ｕ2Ｐ4は、ウリジン５'−モノリン酸（ＵＭＰ）を出発原料とし、ジフェニルホスホクロリデート(ＤＰＣ)等の活性化剤とピロホスフェート（ＰＰｉ）等のリン酸化剤を用いて合成されるが、従来法によれば合成収率は約１０％弱と極めて低く（ＷＯ９９／０５１５５、実施例４Ｂ参照）、到底実用的な方法とはなり得なかった。従って、高収率で大量合成に適した製造法の開発が切望されていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、医薬品として製剤化するのに適したＵ2Ｐ4又はその塩の安定結晶及びその製造法を提供すること、並びにＵ2Ｐ4の大量合成に適した効率の良い製造法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、Ｕ2Ｐ4の精製法及びＵＭＰを用いたＵ2Ｐ4の合成法に関し鋭意研究を重ねた結果、陰イオン交換クロマトグラフィーと活性炭を用いたクロマトグラフィー（活性炭クロマトグラフィー）を用いて精製されたＵ2Ｐ4を用いることにより容易にこれを結晶化できること、及びＵＭＰを出発原料とし、ＤＰＣとＰＰｉを用いてＵ2Ｐ4又はその塩を製造する方法において、特定の反応条件を設定することによりＵ2Ｐ4の合成収率が格段に向上することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち本発明は、Ｐ1，Ｐ4−ジ（ウリジン５'−）テトラホスフェート又はその塩の結晶を提供するものである。
【００１０】
さらに本発明は、粗Ｐ1，Ｐ4−ジ（ウリジン５'−）テトラホスフェート又はその塩を陰イオン交換クロマトグラフィーと活性炭クロマトグラフィーとを用いて精製し、精製されたＰ1，Ｐ4−ジ（ウリジン５'−）テトラホスフェート又はその塩溶液に、親水性有機溶媒を加えて結晶を析出させることを特徴とするＰ1，Ｐ4−ジ（ウリジン５'−）テトラホスフェート又はその塩の結晶の製造法を提供するものである。
【００１１】
更にまた本発明は、ウリジン５'−モノリン酸（ＵＭＰ）を出発原料とし、ジフェニルホスホクロリデート（ＤＰＣ）とピロホスフェート（ＰＰｉ）を用いてＰ1，Ｐ4−ジ（ウリジン５'−）テトラホスフェート又はその塩を製造する方法において、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つ以上の処理を行うことを特徴とするＰ1，Ｐ4−ジ（ウリジン５'−）テトラホスフェート又はその塩の製造法を提供するものである。
【００１２】
（ａ）ＵＭＰジフェニルホスフェート（ＵＭＰ−ＤＰＰ）とＰＰｉ−有機アルカリ塩を反応させる工程において、ＵＭＰ−ＤＰＰを複数回に分けて添加すること、
（ｂ）ＵＭＰ−ＤＰＰとＰＰｉ−有機アルカリ塩を反応させる工程において、塩基を共存させること、
（ｃ）Ｕ2Ｐ4合成反応後にアルカリ処理すること。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明のＵ2Ｐ4又はその塩の結晶は、粗Ｕ2Ｐ4又はその塩を特定の手段で精製し、精製されたＵ2Ｐ4又はその塩溶液に、親水性有機溶媒を加えて結晶を析出させることにより得られる。以下、（１）Ｕ2Ｐ4又はその塩の精製と、（２）Ｕ2Ｐ4又はその塩の結晶化に分けて説明する。
【００１４】
（１）Ｕ2Ｐ4又はその塩の精製
Ｕ2Ｐ4又はその塩の精製は、陰イオン交換クロマトグラフィーと活性炭クロマトグラフィーの２つのクロマトグラフィーを併用することにより行うことができる。両クロマトグラフィ−を用いた精製は何れを先に行ってもよいが、最初に陰イオン交換クロマトグラフィーを行い、次いで活性炭クロマトグラフィーを行うことが、Ｕ2Ｐ4の純度向上の点から好ましい。
【００１５】
ここで用いられる陰イオン交換樹脂としては、スチレン系或いはアクリル系樹脂を基材とする樹脂であればよく、強塩基性陰イオン交換樹脂（例えば、アンバーライトＩＲＡ４０２〔ローム＆ハース社製〕、ダイアイオンＰＡ−３１２、ダイアイオンＳＡ−１１Ａ〔三菱化学社製〕）、又は弱塩基性陰イオン交換樹脂（例えば、アンバーライトＩＲＡ６７〔ローム＆ハース社製〕、ダイアイオンＷＡ−３０〔三菱化学社製〕）のいずれを用いてもかまわない。
【００１６】
活性炭としては、破砕状或いは粒状に成形されたクロマト用活性炭を使用すればよく、例えば和光純薬工業社、二村化学工業社製等の市販品を使用できる。
【００１７】
各クロマトグラフィーは、バッチ式、カラム式等いずれの形式であってもよく、カラム式で行う場合、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーの溶出剤としては、塩酸等の酸水溶液或いはこれに食塩等を添加してイオン強度を高めたもの、活性炭カラムクロマトグラフィーの溶出剤としては、水又は水酸化ナトリウム等のアルカリ水溶液をそれぞれ使用することができる。各溶出剤の濃度は、０．００１〜１０Ｍの範囲内から好適なものを小規模試験により適宜決定すればよい。
【００１８】
（２）Ｕ2Ｐ4又はその塩の結晶化
Ｕ2Ｐ4又はその塩の結晶化は、得られた精製Ｕ2Ｐ4又はその塩に親水性有機溶媒を加えて結晶を析出させることにより行われる。
【００１９】
ここで使用できる親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール等炭素数６以下のアルコール類、アセトン等のケトン類、ジオキサン等のエーテル類、アセトニトリル等のニトリル類、ジメチルホルムアミド等のアミド類等を例示することができ、特にアルコール類、好ましくはエタノールが挙げられる。
【００２０】
より具体的には、精製Ｕ2Ｐ4又はその塩溶液或いはこれを濃縮して得られるスラリー液に、所望によりｐＨを６〜９に調整後、６０℃以下の温度条件下で親水性有機溶媒を添加し、結晶を析出させることによりＵ2Ｐ4の安定結晶を得ることができる。
【００２１】
かくして得られた本発明のＵ2Ｐ4結晶は少なくとも、▲１▼Ｕ2Ｐ4が９５％以上、▲２▼その他の類縁化合物が５％以下、の純度を有するものである。
【００２２】
ここで、その他の類縁化合物としては、ＵＰ4、ＵＴＰ、ＵＤＰ、ＵＭＰ等のヌクレオシド５'−（ポリ）燐酸類、及びＵ2Ｐ3、Ｕ2Ｐ2等のジヌクレオシドポリ燐酸類を意味する。
【００２３】
このようなＵ2Ｐ4結晶の中でも更に、▲１▼Ｕ2Ｐ4が９７％以上、▲２▼ＵＤＰが１％以下、▲３▼ＵＴＰが１％以下、の純度を有するものが好ましく、特に▲１▼Ｕ2Ｐ4が９８％以上、▲２▼ＵＤＰが０．５％以下、▲３▼ＵＴＰが０．５％以下、の純度を有するものが好ましい。
【００２４】
このような高純度のＵ2Ｐ4結晶は、塩、水和物又は含水塩の形態であってもよく、塩としてはナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の薬学的に許容される塩が例示される。塩の置換数は、１〜４個の金属が置換したものが挙げられる。
【００２５】
また、水和物としてはＵ2Ｐ4１分子に対し３〜８分子の水が結合又は付着したものが例示される。さらに、含水塩としては、例えばＵ2Ｐ4結晶のアルカリ金属塩１分子に３〜８分子の水分子が結合又は付着したものを挙げることができる。
【００２６】
Ｕ2Ｐ4塩結晶の好ましい例としては、例えばＵ2Ｐ4・４Ｎａ結晶又はその水和物が例示される。このＵ2Ｐ4・４Ｎａ結晶は、高温、多湿条件下で安定で、水分含量は５〜１５重量％で安定化し、吸湿性を示さない、という物性を有することから取り扱い易く、従来の凍結乾燥品と比べて極めて有用なものである。
【００２７】
斯かるＵ2Ｐ4・４Ｎａ結晶は、当然のことながら上述したように９５％以上の純度を有し、その他の類縁化合物総量が５％以下である。また、上述と同様に、▲１▼Ｕ2Ｐ4が９７％以上、▲２▼ＵＤＰが１％以下、▲３▼ＵＴＰが１％以下、の純度を有するもの、及び▲１▼Ｕ2Ｐ4が９８％以上、▲２▼ＵＤＰが０．５％以下、▲３▼ＵＴＰが０．５％以下、の純度を有するものを好ましい例として挙げることができる。
【００２８】
尚、本発明のＵ2Ｐ4又はその塩の結晶には互変異性体も包含されうる。
本発明のＵ2Ｐ4又はその塩の結晶は、必要により減圧乾燥、通風乾燥、加熱乾燥等の通常の方法により乾燥後、容器（ビン、袋、カン、アンプル等）に充填する。容器における封入状態は、開放、密閉、気密、密封のいずれの状態であってもよいが、保存安定性を維持する観点から開放状態でない方が好ましい。
【００２９】
次にＵ2Ｐ4の効率的合成法について説明する。
従来、Ｕ2Ｐ4又はその塩の主たる合成は、ウリジン５'−モノリン酸（ＵＭＰ）を出発原料とし、これをジフェニルホスホクロリデート（ＤＰＣ）等の活性化剤を用いて活性体とし、これにピロホスフェート（ＰＰｉ）等のリン酸化剤を反応させることにより行われている。具体的にはＵＭＰのトリブチルアミン塩に、ＤＰＣとトリブチルアミンを加え、活性化体であるＵＭＰジフェニルホスフェート（ＵＭＰ−ＤＰＰ）を得、これとトリブチルアミンピロホスフェート（ＴＢＡ−ＰＰｉ）を反応させることにより、約９．６％の収率でＵ2Ｐ4又はその塩を得ていた（ＷＯ９９／０５１５５、実施例４Ｂ参照）。
【００３０】
本発明方法は、斯かる従来法のＵＭＰ−ＤＰＰとＰＰｉ−有機アルカリ塩とを反応させる工程において、（ａ）ＵＭＰ−ＤＰＰを複数回に分けて添加すること、（ｂ）塩基を共存させること、及び（ｃ）Ｕ2Ｐ4合成反応後にアルカリ処理すること、のいずれか或いは二種以上を組み合わせることを特徴とするものである。
【００３１】
ここで、「（ａ）ＵＭＰ−ＤＰＰを複数回に分けて添加する」とは、ＰＰｉ−有機アルカリ塩の２倍モル必要とされるＵＭＰ−ＤＰＰを、必要量を一度に反応させるのではなく、複数回に分けて添加するものである。例えば、最初にＰＰｉ−有機アルカリ塩と等モルのＵＭＰ−ＤＰＰ反応させた後、続けてＰＰｉ−有機アルカリ塩と等モルのＵＭＰ−ＤＰＰを添加して反応させる如きである。ＵＭＰ−ＤＰＰの添加回数は特に限定されるものではないが、２〜３回に分けて行うことが収率向上の点から好ましい。
【００３２】
尚、ここでいうＰＰｉ−有機アルカリ塩としては、ＰＰｉのヘキシルアミン塩、ジブチルアミン塩、トリエチルアミン塩、トリブチルアミン塩等が挙げられ、ＵＭＰ−ＤＰＰとの反応は、斯かるＰＰｉ−有機アルカリ塩をＤＭＦ、ＤＭＡＣ、ホルムアミド等のアミド系溶媒、ジオキサン、テトラヒドロフラン等の環状エーテル系溶媒、アセトン等のケトン系溶媒、ジメチルイミダゾリジノン、ヘキサメチルリン酸トリアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル等の単独又は混合溶媒に溶解し、これにＵＭＰ−ＤＰＰを添加し、室温で３０分〜５時間程度反応させることにより行うことができる。
【００３３】
また、「（ｂ）塩基を共存させる」とは、上記ＰＰｉ−有機アルカリ塩とＵＭＰ−ＤＰＰの反応を任意の塩基を共存させて反応させることをいい、斯かる塩基としては、例えばピリジン、２，６−ルチジン，２，４−ルチジン、２−，４−，または６−ピコリン、２，４−ジメチルアミノピリジン、コリジン等のピリジン系塩基等が挙げられ、特にピリジンが好ましい。尚、斯かる塩基が反応溶媒を兼用している場合も本発明の塩基に包含される。また、塩基の濃度は特に制限されず、ＵＭＰに対して６当量以上、望ましくは１８当量以上を添加するのが好ましい。
【００３４】
更に「（ｃ）Ｕ2Ｐ4合成反応後にアルカリ処理する」とは、Ｕ2Ｐ4合成液を水でクエンチ後、水酸化ナトリウム、アンモニア、水酸化カリウム、ピリジン、トリエチルアミン、炭酸ナトリウム等の有機又は無機のアルカリ溶液を用いて処理することをいう。斯かる処理を行うことで、クエンチ後そのまま精製していた従来法に比べＵ2Ｐ4の単離収率を一層向上させることが可能となる。
【００３５】
斯かるアルカリ処理は、水でクエンチ後のＵ2Ｐ4合成液にアルカリをｐＨ８〜１３、好ましくは１０〜１２程度になるように添加し、室温で１０分〜５時間程度反応させることにより行われる。
【００３６】
尚、ＵＭＰからＵＭＰ−ＤＰＰの合成は、従来法が適用でき、例えば、常法により調製したＵＭＰトリブチルアミン塩等のＵＭＰトリアルキルアミン塩をＤＭＦ、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）等のアミド系溶媒、ジオキサン、テトラヒドロフラン等の環状エーテル系溶媒、アセトン等のケトン系溶媒、ジメチルイミダゾリジノン、ヘキサメチルリン酸トリアミド等の単独又は混合溶媒に溶解し、ＤＰＣと必要によりトリアルキルアミンを加え、室温で３０分〜５時間程度反応させて活性化体であるＵＭＰ−ＤＰＰを合成することができる。
【００３７】
【実施例】
以下、実施例を示し本発明を具体的に説明する。
【００３８】
実施例１ Ｕ2Ｐ4又はその塩の合成
（１）塩基の効果
脱水したウリジン５'−モノリン酸のトリブチルアミン塩（ＵＭＰ−ＴＢＡ）（６．２ｍｍｏｌ）にＤＭＡＣ８ｍＬを加えて撹拌しながらＤＰＣ１．７ｍＬを滴下した。室温下で１時間反応させてＵＭＰ−ＤＰＰを生成させた後、ＴＢＡ７．６ｍＬを加え、更に１０分間撹拌した。別途、脱水したＴＥＡ−ＰＰｉ（３．０ｍｍｏｌ）をピリジン１．７ｍＬに溶解しておき、ＵＭＰ−ＤＰＰ反応液に添加した。室温下で３時間撹拌した後、水を加えて反応を停止した。得られた液をＨＰＬＣ（２６２ｎｍ）で分析した結果、収率１８．３％で目的とするＵ2Ｐ4を得た。
【００３９】
この結果より、ＵＭＰ−ＤＰＰとＴＥＡ−ＰＰｉとの反応を塩基（ピリジン）共存下で行なうことにより、従来法の約２倍弱の収率でＵ２Ｐ４を合成できることが明らかとなった。
【００４０】
（２）塩基とアルカリ処理の併用効果
脱水したウリジン５'−モノリン酸のトリブチルアミン塩（ＵＭＰ−ＴＢＡ）（６．２ｍｍｏｌ）にＤＭＡＣ８ｍＬを加えて撹拌しながらＤＰＣ１．７ｍＬを滴下した。室温下で１時間反応させてＵＭＰ−ＤＰＰを生成させた後、ＴＢＡ７．６ｍＬを加え、更に１０分間撹拌した。別途、脱水したＴＥＡ−ＰＰｉ（３．０ｍｍｏｌ）をピリジン１．７ｍＬに溶解しておき、ＵＭＰ−ＤＰＰ反応液に添加した。室温下で３時間撹拌した後、水を加えて反応を停止した。反応液に３０％水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨ１１．０に調整し、一晩放置した。得られた液をＨＰＬＣ（２６２ｎｍ）で分析した結果、収率２９．７％で目的とするＵ2Ｐ4を得た。
【００４１】
この結果より、ＵＭＰ−ＤＰＰとＴＥＡ−ＰＰｉとの反応を塩基（ピリジン）共存下で行ない、さらにアルカリ処理を施すことで、従来法の約３倍の収率でＵ2Ｐ4を合成できることが明らかとなった。
【００４２】
（３）塩基とＵＭＰ−ＤＰＰ複数回添加効果
脱水したピロリン酸のトリエチルアミン塩（ＴＥＡ−ＰＰｉ）（６ｍｍｏｌ）、フォルムアミド１．５ｍＬ及びピリジン１．５ｍＬを加えて撹拌した。一方、別の容器に脱水したウリジン５'−モノリン酸のトリブチルアミン塩（ＵＭＰ−ＴＢＡ）（１２ｍｍｏｌ）にＤＭＡＣ４．３ｍＬ、ジオキサン４．８ｍＬ及びトリブチルアミン（ＴＢＡ）５．８ｍＬを加えて撹拌し、その後ＤＰＣ２．５ｍＬを滴下し室温下で更に一時間撹拌してＵＭＰ−ＤＰＰを生成させた。ＴＥＡ−ＰＰｉの入った容器にＵＭＰ−ＤＰＰ溶液の半分量を滴下し、室温下で１時間反応させた。再度、ピリジンを１．５ｍＬ添加した後、残りのＵＭＰ−ＤＰＰ溶液を滴下した。更に室温下で一時間反応させた後、水を加えて反応を停止した。得られた液をＨＰＬＣ（２６２ｎｍ）で分析した結果、収率２９．５％で目的とするＵ2Ｐ4を得た。
【００４３】
この結果より、ＵＭＰ−ＤＰＰの添加を２回に分けて行なうことと、ＵＭＰ−ＤＰＰとＴＥＡ−ＰＰｉとの反応を塩基（ピリジン）共存下で行なうことにより、従来法の約３倍弱の収率でＵ2Ｐ4を合成できることが明らかとなった。また、上記（１）と比較すると、ＵＭＰ−ＤＰＰの添加を２回に分けて行なうことにより、１８．３％の収率が上記のように収率２９．５％になり、収率が約１．６倍向上することが明らかとなった。
【００４４】
（４）アルカリ処理の効果
脱水したピロリン酸のトリエチルアミン塩（ＴＥＡ−ＰＰｉ）（６ｍｍｏｌ）、フォルムアミド１．５ｍＬ及びピリジン１．５ｍＬを加えて撹拌した。一方、別の容器に脱水したウリジン５'−モノリン酸のトリブチルアミン塩（ＵＭＰ−ＴＢＡ）（１２ｍｍｏｌ）にＤＭＡＣ４．３ｍＬ、ジオキサン４．８ｍＬ及びトリブチルアミン（ＴＢＡ）５．８ｍＬを加えて撹拌し、その後ＤＰＣ２．５ｍＬを滴下し室温下で更に一時間撹拌してＵＭＰ−ＤＰＰを生成させた。ＴＥＡ−ＰＰｉの入った容器にＵＭＰ−ＤＰＰ溶液の半分量を滴下し、室温下で１時間反応させた。再度、ピリジンを１．５ｍＬ添加した後、残りのＵＭＰ−ＤＰＰ溶液を滴下した。更に室温下で一時間反応させた後、水を加えて反応を停止した。反応液に３０％水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨ１１．０に調整し、一晩放置した。得られた液をＨＰＬＣ（２６２ｎｍ）で分析した結果、収率３２．２％で目的とするＵ2Ｐ4を得た。
【００４５】
上記（３）と比較すると、アルカリ処理を追加することにより、２９．５％の収率が上記のように収率３２．２％になり、収率が約１割向上することが明らかとなった。
【００４６】
実施例２ Ｕ2Ｐ4・４Ｎａ結晶の製造
脱水したピロリン酸のトリエチルアミン塩（ＴＥＡ−ＰＰｉ）（４０．５ｍｍｏｌ）、フォルムアミド１０ｍＬ及びピリジン１５ｍＬを加えて撹拌した。一方、別の容器に脱水したウリジン５' −モノリン酸のトリブチルアミン塩（ＵＭＰ−ＴＢＡ）（８０ｍｍｏｌ）にＤＭＡＣ５０ｍＬ、ジオキサン３４ｍＬ及びトリブチルアミン（ＴＢＡ）３０ｍＬを加えて撹拌し、その後、ＤＰＣ１７．８ｍＬを滴下し室温下で更に一時間撹拌してＵＭＰ−ＤＰＰを生成させた。ＴＥＡ−ＰＰｉの入った容器にＵＭＰ−ＤＰＰ溶液の半分量を滴下し、室温下で１時間反応させた。再度、ピリジンを１５ｍＬと４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）５０ｍｇを添加した後、残りのＵＭＰ−ＤＰＰ溶液を滴下した。更に室温下で二時間反応させた後、水を加えて反応を停止した。合成液を７００ｍＬまで水で希釈した後、水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを１０に調整した。２００ｍＬ程度まで濃縮した後、撹拌しながらエタノール２５０ｍＬを添加した。４℃で一晩静置した後、上澄みをデカントにより除去した。得られた液を水で２５０ｍＬまで希釈し、ＨＰＬＣ（２６２ｎｍ）で分析した結果、収率３０．０％でＵ2Ｐ4を得た。
【００４７】
上記反応液１１０ｍＬを水で２０００ｍＬまで希釈し、弱陰イオン交換樹脂（アンバーライトＩＲＡ−６７）（Ｃｌ型）２００ｍＬにかけた。水洗後、副生成物を０．１８Ｍ塩酸で溶出し、０．３５Ｍの食塩を含む０．００５Ｍ塩酸溶液で目的とするＵ2Ｐ4を溶出した（回収率８２．７％）。
【００４８】
得られた溶出液を水酸化ナトリウム溶液でｐＨ２．５に調整した。その後、活性炭カラム（太閤ＳＧＰ）４００ｍＬにかけ、水洗した後、０．０５Ｍ水酸化ナトリウム溶液で溶出した（回収率８４．９％）。
溶出液のｐＨを７．６に調整した後、３８ｍＬまで濃縮した。濃縮液にエタノール５７ｍＬを加えて結晶化し、３．１ｇのＵ2Ｐ4・４Ｎａ結晶（水分７．８％）を得た（単離収率１８．４％）。
【００４９】
〔Ｕ2Ｐ4・４Ｎａ結晶の物性〕
実施例２で調製したＵ2Ｐ4・４Ｎａ結晶を約６０℃で約４時間通風乾燥後、機器分析等に供した。また、ＷＯ９９／０５１５５の実施例１記載の方法と同じ方法でＵ2Ｐ4・４Ｎａの凍結乾燥品を調製し、結晶品との物性を比較した。
【００５０】
（１）機器分析
▲１▼純度検定
実施例２で得られたＵ2Ｐ4・４Ｎａ結晶及び各クロマトグラフィー処理による精製後のＵ2Ｐ4画分の純度を高速液体クロマトグラフィー法で分析した結果を表１に示す。なお、高速液体クロマトグラフィー法は、以下の条件で行った。
カラム：ＨＩＴＡＣＨＩＧＥＬ＃3013−Ｎ（日立計測器サービス株式会社製）
溶出液：10％ＣＨ3ＣＮ、0.18M ＮＨ4Ｃｌ、0.03ＭＫＨ2ＰＯ4、
0.03ＭＫ2ＨＰＯ4
検出法：ＵＶ２６２ｎｍによる検出
【００５１】
【表１】
▲２▼水分
カールフィッシャー法により測定した結果、乾燥の程度により変動するものの、５〜１５重量％の水分で安定化し、計算によりＵ2Ｐ4１分子に対し３〜８分子の水分子が結合又は付着していることが明らかとなった。
【００５３】
▲３▼融点
常法により融点を測定した結果、分解点は約２２３℃であった。なお、凍結乾燥品の分解点は約２２０℃である。
【００５４】
▲４▼Ｘ線回析
理学電機製Ｘ線回折装置ＲＩＮＴ２５００Ｖ型を用い、下記の測定条件で測定したＸ線回折スペクトルを図１に、そのピークデータを表２に示す。
【００５５】
（測定条件）
Ｘ線管球：Ｃｕ−Ｋα
Ｘ線出力：５０ｋＶ−３００ｍＡ
走査速度：４．０°／分
走査間隔：０．０２°
測角範囲：２〜４０°
スリット：ＤＳ−０．５°，ＲＳ−０．１５ｍｍ，ＳＳ−０．５°
前処理 ：メノウ乳鉢にて粉砕
【００５６】
【表２】
なお、図１及び表２はＵ2Ｐ4・４Ｎａ結晶の８水和物のデータである。また、参考として凍結乾燥品のＸ線回折スペクトルを図２に示す。
【００５８】
▲５▼吸湿性
水分約１４％のＵ2Ｐ4・４Ｎａ結晶（８水和物）を（ア）温度２５℃、相対湿度５７％、（イ）温度２５℃、相対湿度７５％、（ウ）温度４０℃、相対湿度７５％のそれぞれの条件下で９日間保存した場合、分解、重量変化とも観察されず、安定で吸湿性を有しないことが確認された。また、水分約８％のＵ2Ｐ4・４Ｎａ結晶（４水和物）を温度４０℃、相対湿度７５％の条件下で９日間保存した場合、水分含量が１４〜１５％まで増加したが、それ以上の増加は観察されず、安定化した。
これに対し、凍結乾燥品（初発水分含量：約１％）を温度４０℃、相対湿度７５％の条件下で９日間保存すると、水分含量が徐々に増加し、７日目には潮解し、どろどろの状態となった。
【００５９】
▲６▼安定性
Ｕ2Ｐ4・４Ｎａ結晶（８水和物）と凍結乾燥品をビンに密封し、６０℃で１３日間保存した（加速試験）。その結果、結晶品の分解は全く観察されなかったが、凍結乾燥品は約１．４％のＵ2Ｐ4・４Ｎａ純度の減少が観察され、一部が分解していることが明らかであった。
【００６０】
▲７▼結晶型
Ｕ2Ｐ4・４Ｎａ結晶（８水和物）の代表的な結晶の写真を図３に示す。
【００６１】
実施例３ Ｕ2Ｐ4・４Ｎａ・８水和物結晶の製造
実施例２のカラム処理で得られたＵ2Ｐ4画分を濃縮してスラリーを調製後、ｐＨ７．０に調整し、攪拌しながら徐々にメタノールを添加し、さらに１０℃に冷却しながらスラリーを攪拌してＵ2Ｐ4・４Ｎａ結晶を晶析させた。
【００６２】
得られたＵ2Ｐ4・４Ｎａ結晶を乾燥後、カールフィッシャ―法で水分を測定した結果、８水和物であることが明らかとなった。この結晶のＸ線回折スペクトルを図４に、そのピークデータを表３に示す。
【００６３】
【表３】
【発明の効果】
本発明方法により得られたＵ2Ｐ4又はその塩の結晶は、高純度であるとともに、凍結乾燥品に比べて吸湿性もなく極めて安定であり、医薬品原料として有用である。
また、本発明のＵ2Ｐ4又はその塩の製造法によれば、高収率でＵ2Ｐ4又はその塩を製造することができ、Ｕ2Ｐ4又はその塩の大量合成を可能とする。
【図面の簡単な説明】
【図１】 エタノールを用いて晶析させたＵ2Ｐ4・４Ｎａ結晶の８水和物のＸ線回折スペクトルを示したものである。
【図２】 Ｕ2Ｐ4の凍結乾燥品のＸ線回折スペクトルを示したものである。
【図３】 エタノールを用いて晶析させたＵ2Ｐ4・４Ｎａ結晶の８水和物の結晶構造を示す写真である。該写真は偏光顕微鏡（倍率４４０倍）を用いて撮影したもので、１ｃｍは２３μｍに相当する。
【図４】 メタノールを用いて晶析させたＵ2Ｐ4・４Ｎａ結晶の８水和物のＸ線回折スペクトルを示したものである。
Claims (2)
- ウリジン５'−モノリン酸（ＵＭＰ）を出発原料とし、ジフェニルホスホクロリデート（ＤＰＣ）とピロホスフェート（ＰＰｉ）を用いてＰ1，Ｐ4−ジ（ウリジン５'−）テトラホスフェート（Ｕ2Ｐ4）又はその塩を製造する方法において、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つ以上の処理を行うことを特徴とするＰ1，Ｐ4−ジ（ウリジン５'−）テトラホスフェート又はその塩の製造法。
（ａ）ＵＭＰジフェニルホスフェート（ＵＭＰ−ＤＰＰ）とＰＰｉ−有機アルカリ塩を反応させる工程において、ＵＭＰ−ＤＰＰとを複数回に分けて添加すること、
（ｂ）ＵＭＰ−ＤＰＰとＰＰｉ−有機アルカリ塩を反応させる工程において、塩基を共存させること、
（ｃ）Ｕ2Ｐ4合成反応後にアルカリ処理すること。 - 処理（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を組み合わせて行うものである請求項１記載のＰ1，Ｐ4−ジ（ウリジン５'−）テトラホスフェート又はその塩の製造法。
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