MXPA01003377A - Cristal de tetrafosfato de diuridina o una sal del mismo, metodo para prepararlo y metodo para producir dicho compuesto. - Google Patents

Abstract

Se describe un cristal con pureza elevada y estable de P1P4-di (uridin 5'-)tetrafosfato o una sal del mismo, y un metodo para preparar el cristal el cual comprende purificar U2P4 crudo, utilizando la cromatografia de intercambio anionico y cromatografia con carbon activado y cristalizar el cristal utilizando un solvente organico hidrofilico; un metodo para producir U2P4 o una sal del mismo en alto rendimiento que comprende proveer UMP como material de partida y utilizar DPC y PPi, caracterizado porque se practica por lo menos un tratamiento que se selecciona entre (a) en el paso de reaccionar UMP-DDP con sal de PPi-alcali organico agregar UMP-DPP en una pluralidad de porciones, (b) en el paso de hacer reaccionar UMP-DPP con la sal de PPi- alcali organico, realizar una reaccion en presencia de una base (c) despues de la reaccion de sintesis de U2P4 someter el producto de reaccion a un tratamiento con alcali.

Description

CRISTAL DE TETRAFOSFATO DE DIURIDINA O UNA SAL DEL MISMO, MÉTODO PARA PREPARARLO Y MÉTODO PARA PRODUCIR DICHO COMPUESTO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a cristales estables de P1,P4-di(uridin 5'-) tetrafosfato (U2P4) o una sal del mismo los cuales son útiles como un ingrediente activo de un expectorante o un agente terapéutico para neumonía; un procedimiento para producir los cristales; y un procedimiento para producir en forma eficiente U2P o una sal del mismo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Una sal tetrasódica de P1, P4-di(uridin 5'-)tetrafosfato (U2P44Na) representada por la siguiente fórmula (I): tiene una acción que induce expectoración y es un compuesto que se espera se desarrolle como expectorante o como un agente terapéutico para la neumonía (véase por ejemplo, las patentes E.U.A. Nos. 5,789,391 , 5,763,447, y 5,635,160). Hasta ahora, no se ha podido obtener U2P en forma cristalina, y se ha preparado únicamente en forma de un producto liofilizado (véase el ejemplo 1 del documento WO99/05155). El U2P4 típico producido mediante métodos convencionales tiene una pureza tan baja como 90%, y contiene subproductos. Los ejemplos de los subproductos incluyen 5'-(poli) fosfatos de nucleósido tales como uridin 5'-tetrafosfato (UP ), uridin 5'-trifosfato (UTP), uridin 5'-disfosfato (UDP), y uridin 5'-monofosfato (UMP); y polifosfato de dinucleósido tales como P1, P4-di(uridin 5'-)trifosfato (U2P3) y P1, P4-di(uridin 5'-)difosfato (U2P2). En particular, es difícil separar los 5'-(poli) fosfatos de nucleósido tales como UTP de U2P , y el U2P4 altamente purificado se ha producido únicamente con gran dificultad a través de un método de purificación convencional; es decir mediante cromatografía de intercambio iónico (WO 99/05155, Biochimica et Biophysica Acta, 438, (1976) 304-309).. El producto purificado y liofilizado anterior tiene desventajas tales como un carácter higroscópico elevado. Por lo tanto, la preparación de una composición farmacéutica a partir de U2P se debe realizar en un aparato especial en el cual se pueda controlar bien la humedad. Incluso después de preparar una composición farmacéutica, el producto debe ser envuelto herméticamente. Además, debido a que la composición farmacéutica tiene un periodo disponible muy corto debido a la baja estabilidad de la preparación utilizada, se desea obtener cristales de U2P con una pureza elevada y estables. El U2P se sintetiza a partir de uridin d'-monofosfato (UMP) utilizando un agente activante tal como fosfocloridato de difenilo (DPC) y un agente fosforilante tal como pirofosfato (PPi). Sin embargo, un procedimiento convencional brinda un rendimiento de síntesis bajo; es decir tan bajo como aproximadamente 10% en peso (ejemplo 4B del documento WO 99/05155), y no puede servir como un procedimiento práctico. Por consiguiente, también se desea desarrollar un procedimiento para producir U2P con un alto rendimiento y a gran escala. En vista de lo anterior, es un objetivo a la presente invención proveer cristales estables de U2P o una sal del mismo. Otro objetivo de la invención es proveer un procedimiento para producir los cristales. Incluso otro objetivo de la invención es proveer un procedimiento para producir en forma eficiente U2P a gran escala.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los inventores de la presente invención han realizado estudios serios sobre un método para purificar U2P y un procedimiento para sintetizar U2P a partir de UMP. Los inventores han descubierto que se puede cristalizar fácilmente U2P4 purificado mediante cromatografía de intercambio anionico y cromatografía utilizando carbón activado (cromatografía con carbón activado) y que el uso de condiciones de reacción específicas tienen el efecto de incrementar dramáticamente el rendimiento de U2P4 en la síntesis de U2P o una sal del mismo a partir de UMP sirviendo como un material de partida y utilizando DPC y PPi. La presente invención se logró en base a estos hallazgos. Por consiguiente, la presente invención provee cristales de P1, P4-di(uridin 5'-)tetrafosfato o una sal del mismo. La presente invención también provee cristales de la sal tetrasódica de P1,P4-di(uridin 5'-)tetrafosfato que tienen una estructura cristalina que demuestra picos máximos característicos en difracción de rayos X utilizando rayos Cu-Ka en la vecindad de los ángulos de difracción (2T) de 5.9, 11.5, 12.4, 15.4, 17.2, 18.0, 19.8, y 20.5(°). La presente invención provee también cristales de la sal tetrasódica de P1, P4-di(uridin 5'-)tetrafosfato que tiene una estructura cristalina que presenta picos característicos en un espectro de absorción IR en longitudes de onda en la vecindad de 1690, 1277, 1233, 1116 y 890 (cm"1). La presente invención provee también un procedimiento para producir cristales de P1, P4-di(uridin 5'-)tetrafosfato o una sal del mismo, cuyo proceso comprende purificar P1, P4-di(uridin 5'-)tetrafosfato crudo o una sal del mismo mediante cromatografía de intercambio aniónico y cromatografía con carbón activado y agregar un solvente orgánico hidrofílico a una solución de P\ P4-di(uridin 5'-)tetrafosfato purificado o una sal del mismo, con lo cual se precipitan los cristales. La presente invención provee un procedimiento para producir P1, P4-di(uridin 5'-)tetrafosfato o una sal del mismo a partir de uridin 5'-monofosfato (UMP) . que sirve como un material de partida y utilizando fosfocloridato de difenilo (DPC) y un pirofosfato (PPi), cuyo procedimiento comprende por lo menos uno de los siguientes pasos del tratamiento: (a) agregar difenilfosfato de UMP (UMP-DPP) en porciones divididas durante un paso de reacción de UMP-DPP con una sal de PPi-álcali orgánico; (b) realizar un paso de reacción de UMP-DPP con una sal de PPi-álcali orgánico en presencia de una base; y (c) tratar en forma adicional el U2P4 sintetizado con un álcali.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra un espectro de difracción de rayos X del tetrahidrato de U2P4"4Na cristalino cristalizado con una solución de etanol. La figura 2 muestra un espectro de difracción de rayos X de octahidrato de U2P44Na cristalino cristalizado a partir de una solución etanólica. La figura 3 muestra un espectro de difracción de rayos X de U2P 4Na obtenido mediante liofilización.

La figura 4 es una fotografía que muestra la forma cristalina del octahidrato de U2P 4Na cristalino cristalizado a partir de una solución etanólica. La fotografía se tomó bajo microscopio polarizante (aumento: 440), en la cual 1 cm en la imagen corresponde a 23 µm. La figura 5 muestra un espectro de absorción IR del octahidrato de U2P4'4Na cristalino cristalizado a partir de una solución de etanólica. La figura 6 muestra un espectro de absorción IR de U2P4 obtenido a través de liofilización. La figura 7 muestra un espectro de difracción de rayos X del octahidrato de U2P '4Na cristalino, cristalizado a partir de solución de metanol.

MEJOR MODO DE REALIZAR LA INVENCIÓN De conformidad con la presente invención se obtienen cristales de U2P4 mediante purificación de U2P4 crudo o una sal del mismo utilizando medios específicos, y a la adición de un solvente orgánico a una solución de U2P o una sal del mismo, con lo cual se precipita el soluto como cristales. La presente invención se describirá a continuación en términos de (1 ) purificación de U2P4 o una sal del mismo y (2) cristalización de U2P o una sal del mismo. ( 1 ) Purificación de U?P o una sal del mismo El compuesto U2P o una sal del mismo se puede purificar mediante cromatografía de intercambio aniónico y cromatografía con carbón activado realizada en combinación. Aunque las dos técnicas cromatográficas se pueden realizar en secuencia arbitraria, de preferencia la cromatografía de intercambio aniónico precede a la cromatografía con carbón activado, en vista de la mejoría en la pureza de U2P4. Se podría utilizar una resina estirénica o acrílica como la resina de intercambio aniónico en las técnicas de cromatografía antes descritas. Los ejemplos de resinas que podrían ser utilizadas incluyen las resinas de intercambio aniónico fuertemente básicas tales como AMBERLITE IRA 402 (Rohm & Haas Co.), DIAION PA-312, y DIAION SA-11A (Mitsubishi Chemical Co. Ltd), y las resinas de intercambio aniónico débilmente básicas tales como AMBERLITE IRA 67 (Rohm & Haas Co.) y DIAION WA-30 (Mitsubishi Chemical Co. Ltd.). El carbón activado puede estar en forma de carbón activado de grado cromatográfico en cual se tritura o se configura como partículas, y podrían incluir los productos comercialmente disponibles (por ejemplo aquellos provenientes de Wako Puré Chemical Industries, Ltd. y Futamura Kagaku Kogyo). La cromatografía se puede realizar por lotes, o utilizando una columna. Cuando se realiza cromatografía en columna se podría utilizar una solución acida acuosa o una mezcla de la misma con una sal que tenga una fuerza iónica incrementada, tal como cloruro de sodio, como un eluyente para cromatografía de intercambio aniónico; y se podría utilizar agua o una solución acuosa de base tal como dióxido sódico como un eluyente para la cromatografía en columna con carbón activado. Se podría realizar una prueba preliminar a pequeña escala con el fin de determinar en forma apropiada la concentración de cada eluyente entre un intervalo de 0.001 M a 10 M. (2) Cristalización de U?P4 o una sal del mismo El compuesto U2P4 o una sal del mismo se cristaliza mediante la adición de un solvente orgánico hidrofílico a una solución que contiene a U2P purificado de esta manera o una sal del mismo. Los ejemplos de los solventes orgánicos que podrían utilizarse incluyen alcoholes que tengan 6 o menos átomos de carbono, tales como metanol y etanol; cetonas tales como acetona; éteres tales como dioxano; nitrilos tales como acetonitrilos; y amidas tales como dimetilformamida. De estos se prefiere en forma particular los alcoholes, especialmente etanol. En forma más específica, se trata en forma opcional una solución de U2P purificado de esta manera o una sal de mismo, o una suspensión obtenida mediante concentración de la solución con lo cual se ajusta el pH hasta 6-9, y se agrega un solvente orgánico hidrofílico a la solución o suspensión a 60°C o menos para precipitar con esto el soluto como cristales estables de U2P . Los cristales de U2P de la presente invención obtenidos de esta manera contienen (1) U2P4 en una cantidad de 95% o más y (2) otros compuestos homólogos en una cantidad de 5% o menos.

En la presente invención, los otros compuestos homólogos incluyen 5'-(poli)fosfatos de nucleósidos tales como UP , UTP, UDP, y UMP; y polifosfatos de dinucleósido tales como U2P3 y U2P2. En forma más preferida, los cristales de U2P4 contienen (1 ) U2P4 en una cantidad de.97% o más, (2) UDP en una cantidad de 1 % o menos, y (3) UTP en una cantidad de 1 % o menos. De manera particularmente preferida, cristales de U2P4 que contienen (1 ) U2P en una cantidad de 98% o más, (2) UDP en una cantidad de 0.5% o menos, y (3) UTP en una cantidad de 0.5% o menos. Tales cristales de U2P de pureza elevada podrían estar en forma de una sal, hidrato, o una sal hidratada. Ejemplos de las sales ¡ncluyen las sales farmacéuticamente aceptables tales como las sales de metal alcalino como por ejemplo sales de sodio o sales de potasio; sales de metal alcalino terreo tales como sales de calcio y sales de magnesio; y sales de amonio. Ei U2P puede estar sustituido con 1-4 átomos metálicos para formar una sal. El hidrato anterior puede comprender 3-8 moléculas de agua las cuales se unen o se adhieren a una molécula de U2P , y la sal hidratada anterior podría comprender 3-8 moléculas de agua que están unidas o adheridas a una molécula de una sal de metal alcalino de U2P . Los ejemplos de cristales U2P preferidos ¡ncluyen cristales de U2P 4Na e hidratos del mismo. Los cristales de U2P44Na muestran picos característicos en la difracción de rayos X empleando rayos Cu-Ka en la vecindad de los ángulos de difracción (2T) de 5.9, 11.5, 12.4, 15.4, 17.2, 18.0, 19.8, y 20.5(°) (intervalo de error ±0.1 °), y muestran picos característicos en un espectro de absorción IR en longitudes de onda en la vecindad de 1690, 1277, 1233, 1146, 1116, y 890 (cm"1) (intervalo de error ±2 cm"1). Además, los cristales de U2P -4Na son de fácil manejo y excepcionalmente útiles en comparación con los productos liofilizados convencionales, debido a que los cristales son estables bajo condiciones de temperatura elevada, humedad elevada y el contenido de agua de los cristales se estabiliza a 5-15% en peso, con lo cual se suprime el carácter higroscópico adicional. Como se describió anteriormente, los cristales de U2P '4Na de la presente invención obtenidos de esta manera contienen (1 ) U2P una cantidad de 95% o más y (2) otros compuestos homólogos en una cantidad de 5% o menos. Además, como se describió anteriormente, los ejemplos de los cristales de U2P preferidos incluyen cristales tales como aquellos que contienen (1 ) U2P en una cantidad de 97% o más, (2) UDP en una cantidad de 1 % o menos, y (3) UTP en una cantidad de 1% o menos en particular cristales que contienen (1 ) U2P4 en una cantidad de 98% o más, (2) UDP de 0.5% o menos y (3) UTP en una cantidad 0.5% o menos. Además los cristales de U2P4 o una sal del mismo de conformidad con la presente invención también incluyen tautómeros del mismo. Los cristales de U2P o una sal del mismo de conformidad con la presente invención se secan opcionalmente mediante un método convencional tal como secado a presión reducida, secado bajo flujo de aire, o secado por calentamiento, y después de esto se coloca en un contenedor (por ejemplo, botella, saco, lata, ampolleta). El empaque en el contenedor se puede realizar de tal manera que el contenedor esté abierto, cerrado, sea hermético al aire o esté sellado. La condición de abierto no se prefiere, en vista del mantenimiento de la estabilidad en almacenamiento de los cristales. A continuación, se describirá un procedimiento eficiente para sintetizar U2P . Convencionalmente, el U2P o una sal del mismo se ha sintetizado principalmente a partir de uridin 5-'monofosfato (UMP) que sirve como un material de partida y utilizando un agente activante tal como fosfocloridato (DPC) y un agente fosforilante tal como pirofosfato (PPi). Específicamente, se agregan DPC y tributilamina a la sal de tributilamina de UMP, para producir con esto difenilfosfato de UMP (UMP-DPP) que sirve como un intermediario reactivo el cual se hace reaccionar con pirofosfato de tributilamina (TBA-PPi), con lo cual se obtiene U2P o una sal del mismo en un rendimiento de aproximadamente de 9.6% (ejemplo 4B del documento WO 99/05155). El procedimiento de conformidad con la presente invención se caracteriza por que por lo menos uno de los siguientes pasos de tratamiento sean realizados: a) agregar UMP-DPP en porciones divididas durante un paso convencional de reacción de UMP-DPP con una sal de álcali orgánico de PPi; b) realizar la reacción de UMP-DPP con una sal de PPi-álcali orgánico en presencia de una base; c) tratar posteriormente el U2P4 sintetizado con una base. Se pueden combinar dos o más de los pasos de tratamiento anteriores. El paso "(a) agregar UMP-DPP en pociones divididas" se refiere a la adición de UMP-DPP, la cual debe ser provista en una cantidad en moles de por lo menos el doble que el de la sal de PPi-álcali orgánico, en varias porciones más que una sola porción; por ejemplo, se hace reaccionar una sal de PPi-álcali orgánico con una cantidad equimolar de UMP-DPP y el paso se repite. Aunque no se impone una limitación particular en el número de porciones de UMP-DPP, se prefieren 2-3 porciones en vista del incremento de rendimiento. Los ejemplos de las sales de PPi-álcali orgánico incluyen una sal de hexilamina, una sal de dibutilamina, una sal de trietilamina, y una sal de tributilamina. En la reacción con UMP-DPP, la sal de PPi-álcali orgánico pdría disolverse en un solvente. Los ejemplos de solventes incluyen amidas tales como DMF, DMAC y formamida; éteres cíclicos tales como dioxano y tetrahidrofurano; cetonas tales como acetona; y dimetilimidazolidinona, triamida hexametilfosfórica, dimetilsufóxido , acetonitrilo o una mezcla de dos o más de estos. Después de esto, se agrega UMP-DPP a la solución, y la mezcla se deja reaccionar a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos hasta cinco horas. El paso "(b) realizar la reacción de UMP-DPP con una sal de PPi-álcali orgánico en presencia de una base" se refíere a una reacción realizada en presencia de una base. Ejemplos de las bases incluyen base de piridina tales como piridina, 2,6-lutidina 2,4-lutidina, a-, ß-, ?-picolina, 2,4-dimetilaminopiridina y a-, ß-, ?-colidina, siendo particularmente preferida la piridina. También se incluye un solvente básico para la reacción en la base utilizada en la presente invención. La concentración de la base no queda particularmente limitada. De preferencia a la base se agrega una cantidad de 6 equivalentes o más tomando como base a UMP, de manera mas preferida 18 equivalentes o más. Además, el paso "(c) tratar adicionaimente el U2P4 sintetizado con una base" se refiere a la extinción de un líquido que contiene U2P sintetizado con agua y tratar la mezcla con una solución de una base orgánica o inorgánica tal como hidróxido de sodio, amoniaco, hidróxido de potasio, piridina, trietilamina o carbonato de sodio. De manera convencional, el líquido extinguido como tal se purifica en forma directa. Sin embargo, el tratamiento con una base permite mejorar el rendimiento de aislamiento de U2P en comparación con el método convencional. En el tratamiento con una base, un líquido que contiene U2P4 sintetizado se extingue con agua, y se agrega un álcali a la mezcla de tal manera que el pH de la mezcla sea de aproximadamente 8-13, de preferencia 10-12. Se deja que la mezcla reaccione a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos hasta cinco horas. El UMP-DPP se puede sintetizar a partir de UMP mediante un método convencional. Por ejemplo, una sal de trialquilamina de UMP tal como una sal de tributilamina de UMP preparada mediante un método convencional se disuelve en un solvente. Los ejemplos de los solventes incluyen amidas tales como DMF y dimetilacetamida (DMAC); éteres cíclicos tales como dioxano y tetrahidrofurano; cetonas tales como acetonas; y dimetilimidazolidinona, triamidahexametilfosfórica, o una mezcla de los mismos. Después, se agrega DPC y, si es necesario, una trialquilamina a la solución, y la mezcla se deja reaccionar a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos hasta 5 horas, para sintetizar con esto el UMP-DPP que sirve como un intermediario de reacción.

EJEMPLOS A continuación se describirá la presente invención con mayor detalle utilizando ejemplos.

EJEMPLO 1 Síntesis de U P o una sal del mismo (1 ) Efecto de una base Se agregó DMAC (8 ml) a una sal de tributilamina de uridin 5'-monofosfato deshidratado (UMB.TBA) (6.2 mmoles), y se agregó gota a gota DPC (1.7 ml) a la mezcla con agitación. La mezcla obtenida de esta manera se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora para formar con esto UMP-DPP, después de lo cual se agregó TBA (7.6 ml) a la mezcla de reacción, la cual se agitó durante otros 10 minutos. Mientras tanto, se disolvió TEA-PPi deshidratada (3.0 mmoles) en piridina (1.7 ml), y la solución así preparada se agregó a la mezcla de reacción de UMP-DPP. Posteriormente, la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas, y se agregó agua a la mezcla para detener la reacción. La mezcla de reacción obtenida se analizó mediante HPLC (a 262 nm), la cual mostró que el U2P4 objetivo se obtuvo con un rendimiento de 18.3%. Es evidente a partir del resultado, cuando se hace reaccionar UMP-DPP con TEA-PPi en presencia de una base (piridina), que se podría sintetizar U2P aproximadamente con el doble del rendimiento obtenido mediante el método convencional. (2) Efecto del uso de la combinación de tratamiento de base v álcali Se agregó DMAC (8 ml) a una sal de tributilamina de uridin 5'-monofosfato deshidratado (UMB.TBA) (6.2 mmoles), y se agregó DPC (1.7 ml) gota a gota a la mezcla con agitación. La mezcla así obtenida se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora con lo cual se forma UMP-DPP, después de lo cual, se agrega TBA (7.6 ml) a la mezcla de reacción y la mezcla se agita durante otros 10 minutos. Mientras tanto se disuelve TEA-PPi deshidratada (3.0 mmoles) en piridina (1.7 ml), y la solución preparada de esta manera se agrega a la mezcla de reacción de UMP-DPP. Posteriormente, la mezcla se agita a temperatura ambiente durante 3 horas, y se agrega agua a la mezcla para detener la reacción. Se agrega una solución de hidróxido de sodio al 30% a la mezcla de reacción antes obtenida de modo que se ajusta el pH hasta 11.0, y la mezcla se deja reposar toda la noche. La mezcla de reacción obtenida se analiza mediante HPLC (a 262 nm), la cual muestra que el U2P4 objetivo se obtuvo con un rendimiento de 29.7%. Como es evidente a partir del resultado, cuando se hace reaccionar UMP-DPP con TEA-PPi en presencia de una base (piridina) y además se realiza un tratamiento con álcali, se podría sintetizar U2P4 aproximadamente con el triple de rendimiento que el obtenido a través de un método convencional. (3) Efecto de la base y la adición de UMP-DPP en varias porciones Se agregaron formamida (1.5 ml) y piridina (1.5 ml) a una sal de trietilamina de ácido fosfórico deshidratado (TEA-PPi) (6 mmoles), y la mezcla se agitó en un recipiente. Mientras tanto, en otro recipiente, se agregaron DMAC (4.3 ml), dioxano (4.8 ml), y tributilamina (TBA) (5.8 ml) a una sal de tributilamina de uridin 5'-monofosfato deshidratado (UMB.TBA) (12 mmoles), y se agitó la mezcla. Posteriormente, se agregó gota a gota DPC (2.5 ml) a la mezcla, y la mezcla así obtenida se agitó adicionalmente a temperatura ambiente durante 1 hora, con lo cual se forma UMP-DPP. La mitad de la mezcla de reacción de UMP-DPP se agregó gota a gota al recipiente que contiene TEA-PPi, y se dejó que la reacción procediera a temperatura ambiente durante 1 hora. Posteriormente, se agregó piridina (1.5 ml) a la mezcla, y la mezcla de reacción de UMP-DPP remanente se agregó gota a gota al recipiente. La mezcla de reacción así obtenida se hizo reaccionar también a temperatura ambiente durante 1 hora, y se agregó agua a la mezcla para detener con esto la reacción. La mezcla de reacción obtenida se analizó mediante HPLC (a 262 nm), la cual mostró que el U2P4 objetivo se obtuvo con un rendimiento de 29.5%. Como es evidente a partir del resultado, cuando se agrega UMP-DPP en dos porciones y se hace reaccionar UMP-DPP con TEA-PPi en presencia de una base (piridina), U2P se puede producir aproximadamente con el triple de rendimiento que el obtenido a través de un método convencional. También es evidente a partir del resultado, que la adición de UMP-DPP en dos porciones provee un rendimiento de 29.5%, el cual es aproximadamente 1.6 veces más alto que el rendimiento obtenido en (1 ) anterior (18.3%). (4) Efecto del tratamiento con álcali Se agregó formamida (1.5 ml) y piridina (1.5 ml) a una sal de trietilamina de ácido fosfórico deshidratado (TEA-PPi) (6 mmoles), y la mezcla se agitó en un recipiente. Mientras tanto, en otro recipiente se agregaron DMAC (4.3 ml), dioxano (4.8 ml), y tributilamina (TBA) (5.8 ml) a una sal de tributilamina de uridin 5'-monofosfato deshidratado (UMP - TBA) (12 mmoles), y la mezcla se agitó. Posteriormente, se agregó gota a gota DPC (2.5 ml) a la mezcla, y la mezcla así obtenida se agitó adicionalmente a temperatura ambiente durante una hora, con lo cual se forma UMP-DPP. La mitad de la mezcla de reacción UMP-DPP se agregó gota a gota al recipiente que contiene TEA-PPi, y se dejó que la reacción procediera a temperatura ambiente durante una hora. Posteriormente, se agregó piridina (1.5 ml) a la mezcla y la mezcla de reacción de UMP-DPP remanente se agregó gota a gota al recipiente. La mezcla de reacción así obtenida se hizo reaccionar también a temperatura ambiente durante una hora, y se agregó agua a la mezcla para detener con esto la reacción. Se agregó una solución de hidróxido de sodio al 30% a la mezcla de reacción antes obtenida de modo que se ajusta al pH hasta 11.0, y la mezcla se deja reposar durante toda noche. La mezcla de reacción obtenida se analizó mediante HLPC (a 262 r:m), la cual mostró que se obtuvo el U2P objetivo con un rendimiento de 32.2%. Es evidente a partir del resultado, que cuando se agrega al tratamiento con álcali a (3) antes descrito, el rendimiento se incrementa aproximadamente en un 10%; es decir desde 29.5% hasta 32.2%.

EJEMPLO 2 Producción de cristales de U?P 4Na Se agregaron formamida (10 ml) y piridina (15 ml) a una sal de trietilamina de ácido fosfórico deshidratado (TEA-PPi) (40.5 mmoles), y la mezcla se agitó en un recipiente. Mientras tanto, en otro recipiente, se agregaron DMAC (50 ml), dioxano (34 ml), y tributilamina (TBA) (30 ml) a una sal de tributilamina de uridin 5'-monofosfato deshidratado (UMP-TBA) (80 mmoles), y se agitó la mezcla. Posteriormente, se agregó gota a gota DPC (17.8 ml) a la mezcla, y la mezcla así obtenida se agitó adicionalmente a temperatura ambiente durante 1 hora, con lo cual se formó UMP-DPP. La mitad de la mezcla de reacción de UMP-DPP se agregó gota a gota al recipiente que contiene TEA-PPi, y se dejó que la mezcla procediera a temperatura ambiente durante una hora. Posteriormente, se agregaron 4-d'emetilaminopiridina (DMPA) (50 mg) y piridina (15 ml) a la mezcla, y la mezcla de reacción de UMP-DPP remanente se agregó gota a gota al recipiente. La mezcla de reacción obtenida de esta manera se hizo reaccionar adicionalmente a temperatura ambiente durante dos horas, y se agregó agua a la mezcla para detener con esto la reacción. La mezcla de reacción se diluyó con agua hasta un volumen total de 700 ml, y se agregó una solución de hidróxido de sodio a la solución para ajustar el pH a 10. La solución se concentró a 200 ml, y se agregó etanol (250 ml) con agitación a la solución concentrada. Se dejó que la solución reposara a 4°C durante toda la noche, y el sobrenadante se eliminó por decantación. La solución así obtenida se diluyó con agua hasta un volumen total de 250 ml, y se analizó mediante HPLC (a 262 nm), la cual mostró que se obtuvo el U2P objetivo con un rendimiento de 30.0%.

La solución antes obtenida (110 ml) se diluyó con agua hasta un volumen total de 2000 ml y la solución de diluida se aplicó a una columna de intercambio aniónico débil (AMBERLITE IRA-67) (tipo C1 ) (200ml) Posteriormente, la columna se lavó con agua, y diluyeron los subproductos con ácido clorhídrico 0J8 M, después de lo cual se eluyó el U2P4 objetivo con una solución de ácido clorhídrico 0.005 M que contiene 0.35 M de NaCI (porcentaje de recuperación: 82.7%). Al eluato obtenido de esta manera se agregó una solución de hidróxido de sodio con lo cual se ajusta el pH a 2.5. Posteriormente, el eluato se aplicó a una columna de carbón activado (Taiko SGP): y la columna se lavó con agua y se diluyó con una solución de hidróxido de sodio 0.05 M (por ciento de recuperación: 84.9%). Se ajustó el pH del eluato obtenido de esta manera hasta 7.6, y el eluato se concentro hasta 38 ml. Posteriormente, se agregó etanol (57 ml) a la solución concentrada para obtener de esta manera 3J g de cristales de U2P '4Na (contenido de agua: 7.8%) (rendimiento de aislamiento: 18.4%).

Propiedades físicas de U?P 4Na Los cristales de U2P4'4Na preparados en el ejemplo 2 se secaron a 60 °C durante 4 horas utilizando una secadora con aire forzado, y se sometieron a análisis instrumental. Además, se preparó un producto liofilizado de U2P '4Na en la misma manera que en el método descrito en el ejemplo 1 del documento WO 99/05155, y el producto así preparado se comparó con los cristales en términos de las propiedades físicas. (1 ) Análisis instrumental 1 ) Análisis de pureza Los cristales de U2P4'4Na obtenidos en el ejemplo 2, y las fracciones que contienen U2P después de purificación mediante cada una de las cromatografías se sometieron a análisis de pureza por medio de cromatografía líquida de alto rendimiento. Los resultados se muestran en el cuadro 1. Las condiciones para la cromatografía líquida de alto rendimiento se describen a continuación. Columna 2: HITACHIGEL #301 -N (producto de Hitachi Keisokuki Service) Eluyente: CH3CN al 10%, NH4C1 0.18 M, KH2PO4 0.03 M, y K2HPO4 0.03 m. Método de detección: Detección en UV a 262 nm.

CUADRO 1 (-) Por debajo del límite detectable. 2) Contenido de aqua Los cristales U2P se sometieron a medición de contenido de agua por medio del método Karl Fischer, con lo cual se muestra un contenido de agua de 5-15% en peso, el cual varia de conformidad con el grado de secado. Aparentemente los resultados demuestran que se unen o adquieren de tres a ocho moléculas de agua a una molécula de U2P4. 3) Punto de fusión Los cristales de U2P4'4Na se sometieron a medición de punto de fusión por medio de un método convencional, con el cual se provee un punto de descomposición por encima de 223°C. El punto de descomposición del producto liofilizado fue de alrededor de 220°C. 4) Difracción de rayos X Los cristales de U2P '4Na se sometieron a medición de difracción de rayos X utilizando un aparato de difracción de rayos X (modelo: RINT2500V, producto de Rigaku Denki) bajo las siguientes condiciones. Los espectros de difracción de rayos X obtenidos de ésta manera se muestran en las figuras 1 y 2, y los datos de los picos se muestran en los cuadros 2 y 3.

(Condiciones de medición) Tubo de rayos X: CuKa Salida de rayos X; 50 kV-300 mA Velocidad de barrido: 4.0°/ minuto Intervalo de barrido: 0.02° Intervalo de medición'de ángulo: 2-40° Ranura: DS-O.50, RS-0J5 mm, SS-O.50 Pre-tratamiento: Se muele utilizando un mortero de ágata CUADRO 2 10 CUADRO 3 15 20 La figura 1 y el cuadro 2 muestran los datos para los cristales del tetrahidrato de U2P4'4Na, y la figura 2 y el cuadro 3 muestran los datos para los cristales del octahidrato de U2P4»4Na. Además, el espectro de difracción de rayos X de producto liofilizado se muestra en la figura 3 como una referencia. 5) Carácter higroscópico Se dejó que los cristales de U2P »4Na (octahidrato) que tienen un contenido de agua de aproximadamente 14% reposarán durante nueve días bajo las siguientes condiciones: a) 25°C y una humedad relativa de 57%; b) 25°C y una humedad relativa de 75%; y c) 40°C y una humedad relativa de 75%. No se observó descomposición o cambio en peso en los tres casos anteriores. Los cristales demuestran que son estables y que no presentan carácter higroscópico. Se dejó que los cristales de U2P «4Na (tetrahidrato )que tiene un contenido de agua de aproximadamente 8% reposarán durante nueve días bajo las condiciones de 40°C y una humedad relativa de 75%. En este caso, el contenido de agua se incrementó de 14 hasta 15%. Sin embargo, el contenido de agua no se incrementó adicionalmente, y los cristales se estabilizaron. Por el contrario, cuando se dejó reposar un producto liofilizado (contenido inicial de agua: aproximadamente 1%) durante nueve días bajo condiciones de 40°C y una humedad relativa de 75%, el contenido de agua se incrementó en forma gradual, al séptimo día de almacenamiento el producto tomo un estado tipo lodo debido a la delicuescencia. 6) Estabilidad Se colocaron cristales de (octahidrato) y un producto liofilizado en frascos respectivos, los cuales después se sellaron y se dejaron reposar durante 13 días a 60°C (prueba de estabilidad acelerada). No se observó descomposición de los cristales, aunque se confirmó la descomposición parcial del producto liofilizado mediante observación de una reducción en la pureza de U2P4*4Na de aproximadamente 1.4%. 7) Forma cristalina La figura 4 muestra una fotografía de una forma cristalina típica de los cristales de (octahidrato). 8) Espectro de absorción IR Se midieron los espectros de IR de cristales de U2P4*4Na (octahidrato) y de un producto liofilizado en una forma acostumbrada utilizando un espectrofotómetro JASCO 5000. Los resultados se muestran en las figuras 5 y 6. El producto liofilizado de U2P »4Na exhibe picos a 3416, 1702, 1266, 1116, 1079, y 906 (cm'1) (Fig. 6), mientras que los cristales de U2P4»4Na exhiben picos a 3386, 1690, 1277, 1233, 1146, 1116, y 890 (cm"1) (Fig. 5).

EJEMPLO 3 Producción de cristales de U2P4»4Na octahidratado Se concentró la fracción que contiene U2P obtenido mediante tratamiento con una columna en el ejemplo 2 con lo cual se prepara una suspensión, y se ajusta el pH de la misma a 7.0. Se agrega en forma gradual metanol a la suspensión con agitación, y la suspensión se sigue agitando con enfriamiento hasta 10°C, con lo cual se precipitan los cristales de U2P4*4Na. El contenido de agua de estos cristales de U2P »4Na secos obtenidos de esta manera se midió mediante el método de Karl Fischer, con lo cual se determina que los cristales son el octahidrato. El espectro de difracción de rayos X de los cristales se muestra en la figura 7, los datos de los picos de los mismos se muestran en el cuadro 4.

CUADRO 4 APLICABILIDAD INDUSTRIAL Como se describe anteriormente en la presente invención, los cristales de U2P o una sal del mismo obtenidos a través del procedimiento de conformidad con la presente invención tiene una pureza y estabilidad elevadas y son menos higroscópicos en comparación con un producto liofilizado, lo que lo hace útil como materia prima para preparar una composición farmacéutica. El procedimiento para producir U2P4 o una sal del mismo de conformidad con la presente invención permite obtener altos rendimiento y la síntesis a gran escala.

Claims (11)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Los cristales de P1P4-di (uridin 5'-) tetrafosfato o una sal del mismo.

2.- Los cristales de conformidad con la reivindicación 1 , los cuales tienen una pureza de por lo menos 95%.

3.- Los cristales de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizados además porque tienen una pureza de por lo menos 97% y contienen uridin 5- 'trifosfato y uridin 5'-difosfato cada uno en una cantidad de 1 % o menos.

4.- Un procedimiento para producir cristales de P1P4-di(uridin 5'-) tetrafosfato o una sal del mismo, cuyo procedimiento comprende purificar P1P4-di (uridin 5'-)tetrafosfato crudo o una sal del mismo, mediante cromatografía de intercambio aniónico y cromatografía con carbón activado y agregar un solvente orgánico hidrofílico a una solución de P1P4-di (uridin 5'-) tetrafosfato purificado o una sal del mismo, con lo cual se precipita el soluto como cristales.

5.- Un procedimiento para producir P1P4-di (uridin 5'-) tetrafosfato o una sal del mismo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además por que la purificación comprende cromatografía de intercambio aniónico seguido por cromatografía con carbón activado.

6.- Un procedimiento para producir P1P4-d¡ (uridin 5'-)tetrafosfato o una sal del mismo a partir de uridin 5 '-monofosfato (UMP) que sirve como materia prima y utilizando fosfocloridato de difenilo (DPC) y un pirofosfato (PPi), cuyo procedimiento comprende por lo menos uno de los siguientes pasos de tratamiento (a) hasta (c): (a) agregar difenil fosfato de (UMP-DPP) en porciones divididas durante un pasó de reacción de UMP-DPP con una sal de PPi-álcali orgánico; (b) realizar un paso de reacción de UMP-DPP con una sal de PPi-álcali orgánico en presencia de una base; y (c) tratar adicionalmente el U2P4 sintetizado con un álcali.

7.- Un procedimiento para producir P1P4-di (uridin 5'-)tetrafosfato o una sal del mismo. De conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además por que comprende los pasos (a) a (c) tal como se define en la reivindicación 6.

8.- Los cristales de P1P4-di (uridín 5'-)tetrafosfato. 4 Na.

9.- Los cristales de conformidad con la reivindicación 8, caracterizados además porque son las sales hidratadas que comprenden 3-8 moléculas de agua que esta unida o adherida a una molécula de P1P4-di (uridin 5'-)tetrafosfato 4 Na.

10.- Los cristales de conformidad con la reivindicación 8, caracterizados además porque son las sales hidratadas que comprenden 4 moléculas de agua que están unidas o adheridas a una molécula de P1P4-di (uridin 5'-)tetrafosfato 4 Na.

11.- Los cristales de conformidad con la reivindicación 8, los cuales son las sales hidratadas que comprenden 8 moléculas de agua que están unidas o adheridas a una molécula de P1P4-di (uridin 5'-)tetrafosfato 4 Na. 12 - Los cristales de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque tienen una pureza de por lo menos 95%. 13.- Los cristales de conformidad con la reivindicación 8, caracterizados además porque y tienen una pureza de por lo menos 97% y los cuales contienen uridin 5'-trifosfato y uridin 5'-difosfato cada uno en una cantidad de 1% o menos.