SK283729B6

SK283729B6 - Kryštály P1, P4-di(uridín-5')-tetrafosfátu alebo kryštály jeho soli, spôsob ich výroby, kryštály tetrasodnej soli P1, P4-di(uridín-5')-tetrafosfátu a kryštály jej hydrátov

Info

Publication number: SK283729B6
Application number: SK440-2001A
Authority: SK
Inventors: Hideaki Maeda; Toshio Yamada; Hiroshi Sato; Yutaka Noda
Original assignee: Yamasa Corporation
Priority date: 1998-10-02
Filing date: 1999-10-01
Publication date: 2003-12-02
Also published as: AU6000899A; BR9914453A; US20020156269A1; ES2183650T3; PL347070A1; EA003167B1; US6780988B2; JP3824894B2; EA004513B1; CA2345624A1; HUP0103754A2; NO317305B1; CN1151166C; AU747096C; IL142181A; CN1502622A; PL199434B1; KR20020013471A; EP1043329A4; US6458946B1

Abstract

Opísané sú kryštály P1, P4-di(uridín-5')-tetrafosfátu alebo kryštály jeho soli, ktoré dosahujú čistotu najmenej 95 % a obsahujú uridín-5'-trifosfát a uridín 5'-difosfát, každý maximálne v množstve 1 % hmotn. alebo menej. Ako aj spôsob výroby kryštálov P1, P4-di(uridín-5')-tetrafosfátu alebo kryštálov jeho soli, pri ktorom sa surový P1, P4-di(uridín-5')-tetrafosfát alebo jeho soľ podrobí čisteniu anexovou chromatografiou a chromatografiou na aktívnom uhlí a k vyčistenému roztoku P1, P4-di(uridín-5')-tetrafosfátu alebo jeho soli sa pridá hydrofilné organické rozpúšťadlo na vyzrážanie kryštálov z roztoku. Opísané sú aj kryštály tetrasodnej soli P1, P4-di(uridín-5')-tetrafosfátu 4Na a jej hydráty. ŕ

Description

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka kryštálov P¹, P⁴-di(uridín-5')-tetrafosfátu (U₂P₄) alebo kryštálov jeho soli, ktoré sa používajú ako aktívne zložky látok, uľahčujúcich vykašliavanie (expektorantov) alebo terapeutického činidla na pneumóniu, spôsobu ich výroby a kryštálov tetrasodnej soli P¹, P⁴-di(uridín-5')-tetrafosfátu a kryštály jej hydrátov.

Doterajší stav techniky

Tetrasodná soľ P¹, P⁴-di(uridín-5')-tetrafosfátu (U₂P₄.4Na) všeobecného vzorca (I):

oo

W I) 0 0 0 0 1«i)

JJ B II II U 1J

H.C-O-P-O-P-0-P-0- P- 0-CH.

L--M> OPI

ΓΊ on oh má účinok uľahčujúci vykašliavanie a je považovaná za zlúčeninu, ktorá bola vyvinutá na uľahčenie vykašliavania alebo ako terapeutické činidlo na pneumóniu (napríklad U. S. Patent Nos. 5 789 391,5 763 447 a 5 635 160).

Do tohto Času nebol U₂P₄ pripravený v kryštalickej forme, bol pripravený len vo forme lyofilizovaného výrobku (pozri príklad 1 vo WO 99/05155). Typický U₂P₄ vyrobený konvenčnými metódami dosahuje čistotu len 90 % a obsahuje vedľajšie produkty. Medzi príklady vedľajších produktov patria nukleozid-5'-(poly)fosfáty ako sú uridín-5'-tetrafosfát (UP₄), uridín-5'-trifosfát (UTP), uridín-5'-difosfát (UDP) a uridín-5'-monofosfát (UMP) a ďalej dinukleozidpolyfosfáty ako je P¹, P⁴-di(uridín-5'-)trifosfát (U2P3) a P¹ ,P⁴-di(uridín-5'-) difosfát (U2P₂).

Mimoriadne obťažné je od U₂P₄ oddeliť nukleozid-5’-(poly)fosfáty ako je UTP a veľmi čistý U₂P₄ možno s veľkými ťažkosťami vyrobiť len pomocou konvenčných čistiacich metód, t. j. iónexovou chromatografiou (W0 99/05155, Biochimica et Biophysica Acta, 438, (1976) 304 - 309).

Nevýhodou uvedeného vyčisteného a lyofilizovaného výrobku je jeho vysoká hygroskopicita. Preto sa musí príprava farmaceutického prípravku, obsahujúceho U₂P₄ vykonávať v špeciálnej aparatúre s dobre kontrolovateľnou vlhkosťou a po ukončení tejto prípravy sa výrobok musí vzduchotesne zabaliť. Farmaceutický prípravok má pre nízku stabilitu lyofilizačnej prípravy veľmi krátku životnosť, preto je potrebné získať veľmi čisté a stabilné kryštály U₂P₄.

U₂P₄ sa syntetizuje z uridín-5'-monofosfátu (UMP), použitím aktivizačného činidla ako je difenyl-chlorfosfát (DPC) a fosforylačného činidla ako je pyrofosfát (difosfát, PPi). Výťažok syntézy pri konvenčnom spôsobe je však malý, t. j. len 10 % hmotnostných (príklad 4B vo WO 99/05155), a nikdy sa nemôže použiť na praktické účely. Vzhľadom na to, je žiaduce vyvinúť spôsob výroby U₂P₄ s vysokým výťažkom a vo veľkom meradle.

Z hľadiska prechádzajúcich skutočností je predmetom tohto vynálezu poskytnúť stabilné kryštály U₂P₄ a/alebo kryštály jeho soli. Ďalším predmetom tohto vynálezu je poskytnúť spôsob výroby týchto kryštálov. Ďalším predmetom tohto vynálezu je poskytnúť spôsob efektívnej výroby U₂P₄ vo veľkom meradle.

Podstata vynálezu

Súčasní vynálezcovia uskutočňovali naliehavé štúdie týkajúce sa spôsobu vyčistenia U₂P₄ a spôsobu syntézy

U₂P₄ z UMP. Vynálezcovia zistili, že vyčistenie U₂P₄ pomocou anexovej chromatografie a chromatografie používajúcej aktívne uhlie (chromatografia na aktívnom uhlí) podlieha ľahko kryštalizácii a že použitím špecifických reakčných podmienok pri jeho syntéze alebo pri syntéze jeho soli z UMP, ktorý slúži ako východisková látka a ktorý sa mieša s DPC a PPi, dochádza k značnému zvýšeniu jeho výťažku. Tento vynález sa dosiahol na základe týchto zistení.

Vzhľadom na to sa tento vynález týka kryštálov P¹, P⁴-di(uridín-5'-)tetraťosfátu alebo kryštálov jeho soli.

Tento vynález sa týka tiež kryštálov tetrasodnej soli P¹, P⁴-di(uridín-5’-)tetrafosfátu s kryštalickou štruktúrou, ktorá pri rontgenovej difrakcii, využívajúcej lúčov Cu-Κα má charakteristické vrcholy v blízkosti difrakčných uhlov (2Θ), 5,9, 11,5, 12,4, 15,4, 17,2, 18,0, 19,8, a 20,5 (°).

Tento vynález sa tiež týka kryštálov tetrasodnej soli P¹, P⁴-di(uridín-5'-)tetrafosfátu s kryštalickou štruktúrou, ktorá v absorpčnom infračervenom (IČ) spektre má charakteristické vrcholy pri vlnových dĺžkach v blízkosti 1690, 1277, 1233, 1146, 1116 a 890 (cm·¹).

Tento vynález sa tiež týka spôsobu výroby kryštálov P¹, P⁴-di(uridín-5'-)tetrafosfátu alebo kryštálov jeho soli. Tento proces pozostáva z vyčistenia surového P¹, P⁴-di(uridín-5'-)tetrafosfátu alebo jeho soli pomocou anexovej chromatografie a chromatografie na aktívnom uhlí a pomocou pridania hydrofilného organického rozpúšťadla do roztoku vyčisteného P¹, P⁴-di(uridín-5'-)tetrafosfátu alebo do roztoku jeho soli, čim sa kryštály vyzrážajú.

Tento vynález sa tiež týka spôsobu výroby kryštálov P¹, P⁴-di(uridín-5'-)tetrafosfátu alebo kryštálov jeho soli z uridín-5'-monofosfátu (UMP) ako východiskovej látky reakciou s difenyl fosťorochloridátu (DCP) a pyrofosfátom (PPi). Tento spôsob sa vyznačuje tým, že jeho časťou je aspoň jeden z nasledujúcich krokov čistenia:

a) v priebehu reakcie UMP-DPP s organickou zásaditou soľou PPi sa po častiach pridáva difenylfosfát UMP (UMP-DPP),

b) reakcia UMP-DPP s organickou zásaditou soľou PPi sa uskutočňuje v prítomnosti zásady,

c) syntetizovaný U₂P₄ sa ďalej čistí s použitím zásady.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Kryštály U₂P₄ alebo kryštály jeho soli sa podľa tohto vynálezu získavajú pomocou vyčistenia surového U₂P₄ alebo jeho soli s použitím špecifických prostriedkov a pridaním hydrofilného organického rozpúšťadla k roztoku vyčisteného U₂P₄ alebo jeho soli, čím dochádza k vyzrážaniu kryštálov z roztoku. Tento vynález bude ďalej vysvetlený pre 1. vyčistenie U₂P₄ alebo jeho soli a 2. kryštalizáciu U₂P₄ alebo jeho soli.

1. Vyčistenie U₂P₄ alebo jeho soli

U₂P₄ alebo jeho soľ sa čistí pomocou anexovej chromatografie a chromatografie na aktívnom uhlí, čo sa uskutočňuje v kombinácii. I keď možno tieto chromatografické techniky uskutočňovať v ľubovoľnej sekvencii, z hľadiska zlepšenia čistoty U₂P₄ je výhodné použiť anexovú chromatografiu pred chromatografiou na aktívnom uhlí.

V uvedených chromatografických technikách možno ako anexovú živicu použiť styrénovú alebo akrylovú živicu. Medzi živice, ktoré možno použiť, patria silno zásadité anexové živice ako sú AMBERLITE IRA 402 (Rohm & Haas Co.), DIAION SA-1 IA (Mitsubishi Chemical Co. Ltd.) a slabo zásadité anexové živice ako sú AMBERLITE IRA 67 (Rohm & Haas Co.) a DIAION WA-30 (Mitsubishi Chemical Co. Ltd.).

Aktívne uhlie je vo forme aktívneho uhlia určené priamo na chromatografiu, ktoré je rozdrvené alebo vytvarované do častíc a patria medzi ne komerčne dostupné výrobky (napr. produkty firmy Wako Pure Chemical Industries, Ltd. a firmy Futamura Kagaku Kogyo).

Chromatografia sa uskutočňuje násadovým spôsobom alebo v stĺpci (kolóne). Pokiaľ sa uskutočňuje stĺpcovou chromatografiou, možno ako eluent pre anexovú chromatografiu použiť vodný roztok kyseliny alebo jej zmesi so soľou, ktorá má zvýšenú iónovú silu, ako je chlorid sodný. Ako eluent pre chromatografiu na aktívnom uhlí možno použiť vodu alebo vodný roztok zásady ako je hydroxid sodný. Aby bolo možné presne stanoviť koncentráciu každého z eluentov v rozmedzí 0,001 až 10 mol/1, možno uskutočniť predbežný test v malej mierke.

2. Kryštalizácia U2P4 alebo jeho soli

Kryštalizácia U2P4 alebo jeho soli sa vykonáva pridaním hydrofilného organického rozpúšťadla do roztoku, ktorý tento vyčistený U2P4 obsahuje.

Medzi príklady hydrofilných organických rozpúšťadiel, ktoré sa používajú na tieto účely patria alkoholy s 1 až 6 atómami uhlíka, ako je metanol a etanol, ketóny ako je acetón, étery ako je dioxán, nitrily ako je acetonitril a amidy ako je dimetylformamid. Z uvedených látok sú zvlášť výhodné alkoholy, predovšetkým etanol.

Roztok takto vyčisteného U₂P₄ alebo jeho soli, alebo kaša získaná skoncentrovaním tohto roztoku sa prípadne upravuje tak, aby bolo dosiahnuté pH v intervale 6 až 9. a pri teplote 60 °C alebo nižšej sa k roztoku alebo kaši pridá hydrofilné organické rozpúšťadlo, čím dochádza k vyzrážaniu stabilných kryštálov U2P4 z roztoku.

Takto získané kryštály U₂P₄ podľa tohto vynálezu obsahujú L U₂P₄ v množstve minimálne 95 % a 2. ostatné homológové zlúčeniny v množstve maximálne 5 %.

Medzi ostatné homológové zlúčeniny tohto vynálezu patrí nukleozid-5'-(poly)-fosfáty ako sú UP₄, UTP, UDP a UMP a dinukleozidpolyfosfáty ako sú U₂P₃ a U₂P₂.

Kryštály U₂P₄ obsahujú výhodnejšie L U₂P₄ v množstve minimálne 97 % a 2. UDP v množstve maximálne 1 % a 3. UTP v množstve maximálne 1 %. Mimoriadne výhodne kryštály U₂P₄ obsahujú 1. U₂P₄ v množstve minimálne 98 % a 2. UDP v množstve maximálne 0,5 % a 3. UTP v množstve maximálne 0,5 %.

Tieto veľmi čisté kryštály U₂P₄ sú vo forme soli, hydrátov alebo hydrátovaných soli. Medzi príklady solí patria farmaceutický prijateľné soli ako sú soli alkalických kovov ako sú sodné a draselné soli, ďalej soli kovov alkalických zemín ako sú soli vápnika a horčíka a ďalej amónne soli. Na vytvorenie soli možno U₂P₄ substituovať 1 až 4 atómami kovov.

Uvedené hydráty obsahujú 3 až 8 molekúl vody, ktoré sú viazané alebo adherované (prilipnuté) na jednej molekule U₂P₄. Uvedené hydrátované soli obsahujú 3 až 8 molekúl vody, ktoré sú viazané alebo adherované na jednej molekule soli alkalického kovu U₂P₄.

Medzi príklady výhodných kryštálov U₂P₄ patria kryštály U₂P₄.4Na a kryštály ich hydrátov. Kryštály U₂P₄.4Na majú pri rontgenovej difrakcii, využívajúcej lúčov Cu-Ka charakteristické vrcholy v blízkosti difrakčných uhlov (2Θ) 5,9, 11,5, 12,4, 15,4, 17,2, 18,0, 19,8 a 20,5 (°) (s odchýlkou ±0,1°) a v absorpčnom IČ spektre charakteristické vrcholy pri vlnových dĺžkach v blízkosti 1690, 1277, 1233, 1146, 1116a 890 (cm¹) (s odchýlkou ±2 cm¹). S kryštálmi U₂P₄.4Na je navyše ľahké disponovať a pri porovnaní s konvenčnými lyofilizovanými výrobkami sú oveľa užitočnejšie, lebo sú stabilné aj pri vysokých teplotách, pri vysokej vlhkosti a obsah vody je v nich stabilizovaný na hodnote 5 až 15 % hmotnostných, čím je potlačená ďalšia hygroskopicita.

Ako je uvedené, takto získané kryštály U₂P₄.4Na tohto vynálezu obsahujú L U₂P₄ v množstve minimálne 95 % a 2. ostatné homológové zlúčeniny v množstve maximálne 5 %. Ako je uvedené, medzi príklady výhodných kryštálov U₂P₄ patria kryštály, ktoré obsahujú L U₂P₄ v množstve minimálne 97 % a 2. UDP v množstve maximálne 1 % a 3. UTP v množstve maximálne 1 %, ďalej zvlášť kryštály U₂P₄, ktoré obsahujú L U₂P₄ v množstve minimálne 98 % a 2. UDP v množstve maximálne 0,5 % a 3. UTP v množstve maximálne 0,5 %.

Medzi kryštály U₂P₄ alebo kryštály jeho soli podľa tohto vynálezu patria navyše tiež kryštály jeho tautomérov.

Kryštály U₂P₄ alebo kryštály jeho soli podľa tohto vynálezu sa sušia pomocou konvenčných metód ako je sušenie pri zníženom tlaku, sušenie v prúde vzduchu alebo sušenie zohrievaním a následne sa umiestnia do skladovacej nádoby (napr. fľaša, vrecko, plechovka, ampula). Skladovanie sa uskutočňuje tak, že skladovacia nádoba je otvorená, uzavretá, vzduchotesne alebo zatavená. Na udržanie stability kryštálov pri skladovaní je otvorená skladovacia nádoba nevýhodná.

Ďalej bude opísaný efektívny spôsob syntézy U₂P₄.

U₂P₄ alebo jeho soľ sa konvenčné prevažne syntetizovala z uridín-5'-monofosfátu (UMP) ako východiskovej látky a s použitím aktivizačného činidla ako je difenyl fosforochloridát (DPC) a fosforylačného činidla ako je pyrofosfát (PPi). K tributylamínovej soli UMP sa špecificky pridá DPC a tributylamín, čim vzniká difenylfosfát UMP (UMP-DPC), ktorý slúži ako reakčný medziprodukt. Ten ďalej reaguje s pyrofosfátom tributylamínu (TBA-PPi), čím vzniká U₂P₄ alebo jeho soľ, pričom výťažok reakcie je 9,6 % (príklad 4B z WO 99/05155).

Spôsob podľa tohto vynálezu je charakteristický tým, že sa uskutočňuje aspoň jeden z nasledujúcich krokov čistenia: a) v priebehu konvenčnej reakcie UMP-DPP s organickou zásaditou soľou PPi sa po čiastkach pridáva difenylfosfát UMP, b) reakcia UMP-DPP s organickou zásaditou soľou PPi sa uskutočňuje v prítomnosti zásady a c) syntetizovaný U₂P₄ sa ďalej čistí s použitím zásady.

Krok ,,a) pridávanie UMP-DPP po čiastkach“ sa týka pridávania UMP-DPP, ktorého sa musí dať aspoň dvakrát viac, ako je moláme množstvo organickej zásaditej soli PPi, a radšej po niekoľkých čiastkach ako naraz. Napríklad sa nechá reagovať organická zásaditá soľ PPi s ekvimolárnym množstvom UMP-DPP a krok sa opakuje. Počet dávok UMP-DPP nie je obmedzený, ale vzhľadom na zvýšenie výťažku sú výhodné 2 až 3 dávky.

Medzi príklady organických zásaditých solí PPi patrí soľ hexylamínu, soľ dibutylamínu, soľ trietylamínu a soľ tributylamínu. Organická zásaditá soľ PPi je pri reakcii s UMP-DPP prípadne rozpustená v rozpúšťadle. Medzi príklady rozpúšťadiel patria amidy ako sú DMF, DMAC a formamid, ďalej cyklické étery ako sú dioxán a tetrahydrofúrán, ďalej ketóny ako je acetón, a ďalej dimetylimidazolidinon, hexametylfosfortriamid (N, N, Ν', N', N, N-hexametyltriamid kyseliny fosforečnej), dimetylsulfoxid, acetonitril alebo zmes dvoch, príp. viacerých z nich. Do tohto roztoku sa pridá UMP-DPP a zmes sa nechá reagovať pri teplote miestnosti 30 minút až 5 hodín.

Krok ,,b) reakcia UMP-DPP s organickou zásaditou soľou PPi sa uskutočňuje v prítomnosti zásady“ sa týka reakcie, ktorá sa uskutočňuje v prítomnosti zásady. Medzi prí klady zásad patria pyridínové zásady ako sú pyridín, 2,6-dimetylpyridín, 2,4-dimetylpyridín, α-, β-, γ-metylpyridín, 2,4-dimetylaminopyridín a α-, β-, γ-trimetylpyridín, pričom zvlášť výhodný je pyridín. Medzi základné (zásadité) rozpúšťadlo pre túto reakciu patria tiež zásady používané v tomto vynáleze. Koncentrácia zásady nie je zvlášť obmedzená. Výhodné je pridať zásadu v množstve 6 a viac molárnych ekvivalentov, vzhľadom na UMP, výhodnejšie 18 a viac ekvivalentov.

Krok ,,c) syntetizovaný U₂P₄ sa ďalej čistí pomocou zásady“ sa týka zakalenia kvapaliny obsahujúcej syntetizovaný U₂P₄ vodou a ďalej čistenia tejto zmesi roztokom organickej a anorganickej zásady ako je hydroxid sodný, amoniak, hydroxid draselný, pyridín, trietylamín alebo uhličitan sodný. Konvenčné sa takáto ochladená/zakalená kvapalina čistí priamo. Oproti konvenčnému spôsobu umožňuje úprava pomocou zásady zlepšenie výťažku izolovania U₂P₄.

V priebehu čistenia pomocou zásady sa kvapalina obsahujúca syntetizovný U₂P₄ ochladí/zakalí vodou a k tejto zmesi sa pridá také množstvo zásady, aby pH zmesi bolo v intervale 8 až 13, výhodne 10 až 12. Zmes sa nechá reagovať pri teplote miestnosti 10 minút až 5 hodín.

UMP-DPP sa prípadne syntetizuje s UMP pomocou konvenčných metód. Napríklad sa trialkylamínová soľ UMP, ako je tributylaminová soľ UMP pripravená pomocou konvenčnej metódy rozpustí v rozpúšťadle. Medzi príklady rozpúšťadiel patria amidy ako sú DMF a dimetylacetamid (DMAC), ďalej cyklické étery ako sú dioxán a tetrahydrofurán, ďalej ketóny ako je acetón, a dimetylimidazolidinon, hexametylfosfortriamid alebo ich zmesi. K roztoku sa pridá DPC, a v prípade potreby trialkylamín a zmes sa nechá reagovať pri teplote miestnosti 30 minút až 5 hodín, pri vzniku UMP-DPP, slúžiaceho ako reakčný medziprodukt.

Na obrázku 1 je rôntgenové difrakčné spektrum kryštalického tetrahydrátu U₂P₄.4Na, ktorý bol vykryštalizovaný z roztoku etanolu.

Na obrázku 2 je rôntgenové difrakčné spektrum kryštalického oktahydrátu U₂P₄.4Na, ktorý bol vykryštalizovaný z roztoku etanolu.

Na obrázku 3 je rôntgenové difrakčné spektrum U₂P₄, získané lyofilizáciou.

Na obrázku 4 je fotografia, na ktorej je kryštalická forma kryštalického oktahydrátu U₂P₄.4Na, ktorý bol vykryštalizovaný z roztoku etanolu. Fotografia bola urobená s použitím polarizačného mikroskopu (zväčšenie: 440), pričom 1 cm na fotografii zodpovedá 23 pm.

Na obrázku 5 je IČ absorpčné spektrum kryštalického oktahydrátu U₂P₄.4Na, ktorý' bol vykryštalizovaný z roztoku etanolu.

Na obrázku 6 je IČ absorpčné spektrum U₂P₄, získané lyofilizáciou.

Na obrázku 7 je rôntgenové difrakčné spektrum kryštalického oktahydrátu U₂P₄.4Na, ktorý bol vykryštalizovaný z roztoku metanolu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Tento vynález je ďalej detailnejšie opísaný prostredníctvom príkladov.

Príklad 1

Syntéza U₂P₄ alebo jeho soli

1. Účinok zásady

K dehydrátovanej tributylamínovej soli uridín-5’-monofosfátu (UMP-TBA) (6,2 mol) sa pridá DMAC (8 ml) a k tejto zmesi sa po kvapkách, počas stáleho miešania pridáva DPC (1,7 ml). Takto získaná zmes sa nechá reagovať pri teplote miestnosti 1 hodinu počas vzniku UMP-DPP. Potom sa k reakčnej zmesi pridá TBA (7,6 ml) a mieša sa počas ďalších 10 minút. Medzitým sa v pyridine (1,7 ml) rozpustí dehydrátovaný TEA-PPi (3,0 mol) a takto pripravený roztok sa pridá k reakčnej zmesi UMP-DPP. Následne sa táto zmes mieša pri teplote miestnosti počas 3 hodín a na zastavenie reakcie sa do zmesi pridá voda. Získaná reakčná zmes bola analyzovaná pomocou HPLC (pri 262 nm) a dosiahla výťažok cieleného U₂P₄18,3 %.

Ako je zrejmé z výsledku, ak sa UMP-DPP nechá reagovať s TEA-PPi v prítomnosti zásady (pyridínu), je výťažok syntézy U₂P₄ dvakrát vyšší ako výťažok, dosiahnutý pri konvenčnej metóde.

2. Účinok kombinácie použitia zásady a čistenie s použitím zásady

K dehydrátovanej tributylamínovej soli uridín-5'-monofosfátu (UMP-TBA) (6,2 mol) sa pridá DMAC (8 ml) a k tejto zmesi sa po kvapkách počas stáleho miešania pridáva DPC (1,7 ml). Takto získaná zmes sa nechá reagovať pri teplote miestnosti počas 1 hodiny pri vzniku UMP-DPP. Potom sa k reakčnej zmesi pridá TBA (7,6 ml) a mieša sa počas ďalších 10 minút. Medzitým sa v pyridine (1,7) rozpustí dehydrátovaný TEA-PPi (3,0 mol) a takto pripravený roztok sa pridá k reakčnej zmesi UMP-DPP. Následne sa táto zmes mieša pri teplote miestnosti 3 hodiny a na zastavenie reakcie sa do zmesi pridá voda. K takto získanej reakčnej zmesi sa pridá také množstvo 30 % roztoku hydroxidu sodného, aby výsledné pH bolo 11,0 a zmes sa mohla nechať stáť počas noci. Získaná reakčná zmes sa analyzovala pomocou HPLC (pri 262 nm) a mala výťažok cieleného U₂P₄ 29,7 %.

Ako je zrejmé z výsledku, ak sa nechá UMP-DPP reagovať s TEA-PPi v prítomnosti zásady (pyridínu) a zmes sa ďalej čistí použitím zásady, výťažok syntézy U₂P₄ je trikrát vyšší ako výťažok, dosiahnutý pri konvenčnej metóde.

3. Účinok zásady a pridávanie UMP-DPP po niekoľkých čiastkach

K trietylamínovej soli dehydrátovanej kyseliny pyrofosfátovej (TEA-PPi) (6 mol) sa pridá formamid (1,5 ml) a pyridín (1,5 ml) a zmes sa v nádobe zamieša. Medzitým sa v inej nádobe k dehydrátovanej tributylamínovej soli uridín-5'-monofosfátu (UMP-TBA) (12 mol) pridá DMAC (4,3 ml), dioxán (4,8 ml) a tributylamín (TBA) (5,8 ml) a zmes sa zamieša. Následne sa k tejto zmesi po kvapkách pridá DPC (2,5 ml) a takto získaná zmes sa ďalej mieša pri teplote miestnosti 1 hodinu počas vzniku UMP-DPP. Polovica reakčnej zmesi UMP-DPP sa po kvapkách pridá do nádoby obsahujúcej TEA-PPi, a nechá sa reagovať pri teplote miestnosti 1 hodinu. Následne sa k tejto zmesi pridá pyridín (1,5 ml) a do nádoby sa po kvapkách pridá zvyšná reakčná zmes UMP-DPP. Takto získaná reakčná zmes sa nechá ďalej reagovať pri teplote miestnosti 1 hodinu a na zastavenie reakcie sa k zmesi pridá voda. Získaná reakčná zmes sa analyzovala pomocou HPLC (pri 262 nm) a mala výťažok cieleného U₂P₄ 29,5 %.

Ako je zrejmé z výsledku, ak sa pridá UMP-DPP vo dvoch rozdelených dávkach a ak sa nechá UMP-DPP reagovať s TEA-PPi v prítomnosti zásady (pyridín), je výťažok syntézy U₂P₄ trikrát vyšší ako výťažok, dosiahnutý pri konvenčnej metóde. Ďalej je tiež zrejmé, že ak sa pridá UMP-DPP v dvoch rozdelených dávkach, je výťažok syntézy U₂P₄ 29,5 %, čo je 1,6 výťažku, dosiahnutého v bode L (18,3 %).

4. Účinok čistenia s použitím zásady

K trietylamínovej soli dehydrátovanej kyseliny pyrofosfátovej (TEA-PPi) (6 mol) sa pridá formamid (1,5 ml) a pyridín (1,5 ml) a zmes sa v nádobe zamieša. Medzitým sa v inej nádobe k dehydrátovanej tributylamínovej soli uridín-5'-monofosfátu (UMP-TBA) (12 mol) pridá DMAC (4,3 ml), dioxán (4,8 ml) a tributylamín (TBA) (5,8 ml) a zmes sa zamieša, Následne sa k tejto zmesi po kvapkách pridá DPC (2,5 ml) a takto získaná zmes sa ďalej mieša pri teplote miestnosti 1 hodinu počas vzniku UMP-DPP. Polovica reakčnej zmesi UMP-DPP sa po kvapkách pridá do nádoby obsahujúcej TEA-PPi, a nechá sa reagovať pri teplote miestnosti 1 hodinu. Následne sa k tejto zmesi pridá pyridín (1,5 ml) a do nádoby sa po kvapkách pridá zvyšná reakčná zmes UMP-DPP. Takto získaná reakčná zmes sa nechá ďalej reagovať pri teplote miestnosti 1 hodinu a na zastavenie reakcie sa k zmesi pridá voda. K takto získanej reakčnej zmesi sa pridá také množstvo 30 % roztoku hydroxidu sodného, aby výsledné pH bolo 11,0 a zmes sa mohla nechať stáť počas noci. Získaná reakčná zmes sa analyzovala pomocou HPLC (pri 262 nm) a mala výťažok cieleného U₂P₄32,2 %.

Ako je zrejmé z výsledku, ak sa čistí uvedená zmes s použitím zásady, zvýši sa výťažok syntézy U₂P₄ o 10 %, t. j. z 29,5% na 32,2%.

Príklad 2

Výroba kryštálov U₂P₄.4Na

K trietylamínovej soli dehydrátovanej kyseliny pyrofosfátovej (TEA-PPi) (40,5 mol) sa pridá formamid (10 ml) a pyridín (15 ml) a zmes sa v nádobe zamieša. Medzitým sa v ďalšej nádobe k dehydrátovanej tributylamínovej soli uridín-5'-monofosfátu (UMP-TBA) (80 mol) pridá DMAC (50 ml), dioxán (34 ml) a tributylamín (TBA) (30 ml) a zmes sa zamieša. Následne sa k tejto zmesi po kvapkách pridá DPC (17,8 ml) a takto získaná zmes sa mieša ďalej pri teplote miestnosti 1 hodinu počas vzniku UMP-DPP. Polovica reakčnej zmesi UMP-DPP sa po kvapkách pridá do nádoby obsahujúcej TEA-PPi, a nechá sa reagovať pri teplote miestnosti 1 hodinu. Následne sa k tejto zmesi pridá 4-dimetylaminopyridín (DMAP) (50 mg) a pyridín (15 ml) a do nádoby sa po kvapkách pridá zvyšná reakčná zmes UMP-DPP. Takto získaná reakčná zmes sa nechá ďalej reagovať pri teplote miestnosti 1 hodinu a na zastavenie reakcie sa k zmesi pridá voda. Reakčná zmes sa rozriedi vodou na celkový objem 700 ml a pridá sa také množstvo 30 % roztoku hydroxidu sodného, aby výsledné pH bolo 10,0. Roztok sa skoncentruje na 200 ml a pri neustálom miešaní sa pridá etanol (250 ml). Roztok sa nechá stáť pri teplote 4 °C počas noci a supematant sa potom odstráni dekantáciou. Takto získaný roztok sa rozriedi vodou na celkový objem 250 ml. Roztok sa analyzoval pomocou HPLC (pri 262 nm), ktorá mala výťažok cieleného U₂P₄ 30,0 %.

Takto získaný roztok (110 ml) sa rozriedi vodou na celkový objem, 2000 ml a preleje sa stĺpcom (kolónou) obsahujúcim slabý anex (AMBERLITE IRA-67) (C) typ) (200 ml). Stĺpec (kolóna) sa následne premyje vodou a vedľajšie produkty sa eluujú roztokom kyseliny chlorovodíkovej s koncentráciou 0,18 mol/1 (0,18 M). Cielený U₂P₄ sa potom eluuje roztokom kyseliny chlorovodíkovej s koncentráciou 0,005 mol/1 (0,005 M) obsahujúcej NaCl v množstve 0,35 mol/1 (percento rekuperácie: 82,7 %).

Do takto získaného eluátu sa pridá také množstvo roztoku hydroxidu sodného, aby výsledné pH bolo 2,5. Eluát sa následne preleje stĺpcom (kolónou), obsahujúcim aktívne uhlie (Taiko SGP) a stĺpec (kolóna) sa premyje vodou a e luuje roztokom hydroxidu sodného s koncentráciou 0,05 mol/1 (0,05 M) (percento rekuperácie: 84,9 %).

Hodnota pH takto získaného eluátu sa upraví na 7,6 a eluát sa skoncentruje na 38 ml. K skoncentrovanému roztoku sa pridá etanol (57 ml), čím vznikne 3,1 g kryštálov U₂P₄.4Na (obsah vody: 7,8 %) (výťažok separácie: 18,4 %).

Fyzikálne vlastnosti kryštálov U₂P₄.4Na

Kryštály U₂P₄.4Na pripravené v príklade 2 sa sušia pri teplote 60 °C počas 4 hodín v sušiarni s núteným obehom vzduchu. Takto upravené kryštály boli podrobené inštrumentálnej analýze. Okrem toho sa pripraví U₂P₄.4Na v lyofilizovanej forme a to rovnakou metódou ako je opísaná v príklade 1 vo W0 99/05155. Takto pripravený výrobok sa porovnal s kryštálmi z hľadiska ich fyzikálnych vlastností.

L Inštrumentálna analýza

1. Analýza čistoty

Kryštály U₂P₄.4Na získané v príklade 2 a frakcie, obsahujúce U₂P₄ po prečistení pomocou obidvoch chromatografií boli podrobené analýzam čistoty použitím vysoko výkonnej kvapalinovej chromatografie (HPLC). Výsledky sú uvedené v tabuľke 1. Podmienky analýzy uskutočnené vysoko výkonnou kvapalinovou chromatografiou sú opísané.

Stĺpec (kolóna): HITACHIGEL #3013-N (výrobok firmy Hitachi Keisokuki Service).

Eluent: 10 % CH₃CN, NH₄CL s koncentráciou 0,18 mol/1 (0,18 M), KH₂PO₄ s koncentráciou 0,03 mol/1 (0,03 M), K₂HPO₄ s koncentráciou 0,03 mol/1 (0,03 M).

Metóda detekcie: UV detekcia pri 262 nm.

Tabuľka 1

Podiely látok (v % hmotnostných)
U₂P₄ajeho analógy	Reakčná zmes	Po prechode stĺpcom s anexom	Po prechode stĺpcom s aktívnym uhlím	Po kryštalizácii
UMP	7,5	0,5	0,3	(-)
U₂P₂	29,8	0,4	()	(-)
UDP	2,5	OJ	0,2	0,1
U₂P₃	17,6	0,2	(-)	(-)
UTP	13,0	0,8	0,4	0,1
U₂p₄	21,0	97,9	98,6	99,8
UP₄	7,3	0	(-)	(-)

(-): Pod hranicou detekcie

2. Obsah vody

Kryštály U₂P₄.4Na boli podrobené meraniu obsahu vody pomocou metódy Karia Fischera. Tá ukázala, že kryštály obsahujú 5 až 15 % hmotnostných vody, v závislosti od stupňa sušenia. Z výsledkov je zrejmé, že na jednej molekule U₂P₄ je viazaných alebo adherovaných 3 až 8 molekúl vody.

3. Teplota topenia

Kryštály U₂P₄.4Na boli podrobené meraniu teploty topenia pomocou konvenčnej metódy. Tá ukázala, že teplota, ktorá rozkladá kryštály je 223 °C. Teplota rozkladajúca lyofilizovaný výrobok bola 220 °C.

4. Rôntgenová difrakcia

Kryštály U₂P₄.4Na boli podrobené meraniu róntgenovej difrakcie pomocou rôntgenového prístroja (Model: RINT2500V, výrobok firmy Rigaku Denki) pri nasledujúcich podmienkach. Takto získané rontgenové difŕakčné spektrum je zobrazené na obrázku 1 a 2, a údaje opisujúce vrcholy sú uvedené v tabuľke 2 a 3.

Tabuľka 2

Číslo vrcholu	2Θ (°)	Relatívna intenzita (1/1°)
1	5,96	100
5	11,58	38
6	12,42	79
10	15,42	48
13	17,18	45
15	18,04	55
16	19,86	84
17	20,56	73
18	21,18	51
19	21,40	51
25	25,22	42
29	27,52	45
30	27,98	47
35	30,60	40

(Podmienky merania)

Rôntgenka: Cu-Ka

Výkon (výstup) rôntgenu: 50 kV - 300 mA

Rýchlosť skenovania (snímania): 4,0° za minútu Interval skenovania (snímania): 0,02°

Rozmedzie meraných uhlov: 2 až 40° Škára: DS - 0,5°, RS - 0,15 mm, SS - 0,5° Predčistenie: Rozdrvenie v achátovom tíčiku

Tabuľka 3

Číslo vrcholu	20 (°)	Relatívna intenzita (1/1°)
1	5,96	100
5	11,56	41
6	12,42	90
10	15,42	51
12	17,18	48
14	18,04	63
15	19,86	90
16	20,58	90
17	21,20	56
18	21,42	59
24	25,20	50
29	27,54	56
30	27,96	57
35	30,60	48

Na obrázku 1 a v tabuľke 2 sú údaje pre kryštály tetrahydrátu U₂P₄.4Na a na obrázku 2 a v tabuľke 3 sú údaje pre kryštály oktahydrátu U₂P₄.4Na. Na obrázku 3 je zobrazené rôntgenové difrakčné spektrum lyofilizovaného výrobku.

5. Hygroskopicita

Kryštály U₂P₄.4Na (oktahydrátu) obsahujúce 14 % vody sa nechali stáť 9 dní pri nasledujúcich podmienkach: a) 25° C a relatívna vlhkosť 57 %, b) 25 °C a relatívna vlhkosť 75 % a c) 40° C a relatívna vlhkosť 75 %. V žiadnom z troch uvedených prípadov nebol zistený žiadny rozklad ani zmena hmotnosti. Bolo dokázané, že kryštály sú stabilné a nemajú hygroskopicitu. Kryštály U₂P₄.4Na (tetrahydrátu), obsahujúce 8 % vody sa nechali stáť 9 dní pri 40 °C a pri relatívnej vlhkosti 75 %. V tomto prípade sa obsah vody zvýšil na 14 až 15 %. Obsah vody sa potom už nezvýšil a kryštály tak boli stabilizované.

Pokiaľ sa na porovnanie nechal stáť lyofilizovaný výrobok (východiskový obsah vody: 1 %) 9 dní pri 40 °C a pri relatívnej vlhkosti 75 %, obsah vody sa postupne zvyšoval a už po 7 dňoch státia výrobok pripomínal pre delikvescenciu (vlhnutie) blato.

6. Stabilita

Kryštály U₂P₄.4Na (oktahydrátu) a lyofilizovaný výrobok sa umiestnili do samostatných nádob, ktoré sa potom tesne uzatvorili a nechali stáť 13 dní pri teplote 60 °C (akceleračný test). Pri kryštáloch nebol pozorovaný žiadny rozklad, pri lyofilizovanom výrobku bol čiastočný rozklad potvrdený znížením čistoty U₂P₄.4Na o 1,4 %.

7. Kryštalická forma

Na obrázku 4 je fotografia typickej kryštalickej formy kryštálov U₂P₄.4Na (oktahydrátu).

8. IC absorpčné spektrá

Pre kryštály U₂P₄.4Na (oktahydrát) a pre lyofilizovaný výrobok boli bežným spôsobom merané IC spektrá pomocou JASCO 5000 Spektrofotometra. Výsledky sú zobrazené na obrázkoch 5 a 6. Lyofilizovaný výrobok U₂P₄.4Na má vrcholy pri 3416, 1702, 1266, 1116, 1079 a 906 cm'¹(pozri obrázok 6), pričom kryštály U₂P₄.4Na majú vrcholy pri 3386, 1690, 1277, 1233, 1146, 1116 a 890 cm'¹ (pozri obrázok 5).

Príklad 3

Výroba kryštálov oktahydrátu U₂P₄.4Na

Frakcia obsahujúca U₂P₄ získaná úpravou pomocou stĺpca (kolóny) v príklade 2 sa skoncentruje na kašu a jej pH sa potom upraví na 7,0. Ku kaši sa počas stáleho miešania pridá metanol a v priebehu ďalšieho miešania sa kaša ochladí na 10 ⁰ C, čím dochádza k vyzrážaniu kryštálov U₂P₄.4Na.

Takto získané a usušené kryštály U₂P₄.4Na boli podrobené analýze obsahu vody metódou Karla Fischera. Bolo zistené, že ide o oktahydrát. Rôntgenové difrakčné spektrum týchto kryštálov je zobrazené na obrázku 7 a zodpovedajúce údaje vrcholov sú uvedené v tabuľke 4.

Tabuľka 4

Číslo vrcholu	20 (°)	Relatívna intenzita (1/1°)
1	5,96	100
5	11,58	30
6	12,42	77
8	15,40	50
10	17,20	38
11	18,04	38
12	19,84	82
13	20,62	66
14	21,42	48
19	25,38	36
23	27,58	39
24	27,98	37
30	30,64	33

Priemyselná využiteľnosť

Kryštály LI₂P₄.4Na alebo kryštály jeho soli získané spôsobom podľa tohto vynálezu dosahujú vysokú čistotu a stabilitu a v porovnaní s lyofilizovaným výrobkom majú nižšiu hygroskopicitu. Preto slúžia ako užitočný surový materiál na prípravu farmaceutických výrobkov.

Spôsob výroby U₂P₄ alebo jeho soli podľa tohto vynálezu dáva vyšší výťažok a umožňuje syntézy vo veľkej miere.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Kryštály P¹, P⁴-di(uridín-5')-tetrafosfátu alebo kryštály jeho soli.
2. Kryštály podľa nároku 1, ktoré dosahujú čistotu najmenej 95 %.
3. Kryštály podľa nároku 1, ktoré dosahujú čistotu najmenej 97 % a ktoré obsahujú uridín-5'-trifosfát a uridín 5'-difosfát, každý maximálne v množstve 1 % hmotn. alebo menej.
4. Spôsob výroby kryštálov P¹, P⁴-di(uridín-5')-tetrafosfátu alebo kryštálov jeho soli, vyznačujúci sa tým, že sa surový P¹, P⁴-di(uridín-5')-tetrafosfát alebo jeho soľ podrobí čisteniu anexovou chromatografiou a chromatografiou na aktívnom uhlí, a k takto vyčistenému roztoku P¹, P⁴-di(uridín-5')-tetrafosfátu alebo jeho soli sa pridá hydrofilné organické rozpúšťadlo na vyzrážanie kryštálov z roztoku.
5. Spôsob výroby kryštálov P¹, P⁴-di(uridín-5')-tetrafosfátu alebo jeho soli podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že sa čistenie uskutočňuje anexovou chromatografiou nasledovanou chromatografiou na aktívnom uhlí.
6. Spôsob výroby P¹, P⁴-di(uridín-5')-tetrafosfátu alebo jeho soli z východiskového uridín-5'-monofosfátu (UMP) reakciou s difenylchlórfosfátom (DCP) a pyrofosfátom (Ppi), vyznačujúci sa tým, že sa uskutoční aspoň jeden z nasledujúcich krokov čistenia

a) počas reakcie UMP-DPP s organickou zásaditou soľou PPi sa po častiach pridáva difenylfosfát UMP,

b) reakcia UMP-DPP s organickou zásaditou soľou PPi sa uskutočňuje v prítomnosti zásady a c) syntetizovaný U₂P₄sa ďalej čisti s použitím zásady.
7. Kryštály tetrasodnej soli P¹, P⁴-di(uridín-5')-tetrafosfátu 4Na.
8. Kryštály hydrátov tetrasodnej soli P^!, P⁴-di(uridín-5')-tetrafosfátu.4Na.
9. Kryštály podľa nároku 8 s obsahom 3 až 8 molekúl vody, ktoré sú naviazané alebo zadržiavané jednou molekulou tetrasodnej soli P¹, P⁴-di(uridín-5')-tetrafosfátu.4Na.
10. Kryštály podľa nároku 8 s obsahom 4 molekúl vody, ktoré sú naviazané alebo zadržiavané jednou molekulou hydrátu tetrasodnej soli P¹, P⁴-di(uridín-5')-tetrafosfátu.4Na.
11. Kryštály podľa nároku 8 s obsahom 8 molekúl vody, ktoré sú naviazané alebo zadržiavané jednou molekulou tetrasodnej soli P¹, P⁴-di(uridín-5')-tetrafosfátu.4Na.
12. Kryštály podľa hociktorého z nárokov 8 až 11, ktoré dosahujú čistotu najmenej 95 %.
13. Kryštály podľa hociktorého z nárokov 8 až 12, ktoré dosahujú čistotu najmenej 97 % a ktoré obsahujú uridín-5'-trifosfát a uridín-5'-difosfát, každý v množstve 1 hmotn. % alebo menej.

7 výkresov