ES2245431T3 - Cristales dinucleotidicos. - Google Patents

Cristales dinucleotidicos.

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ES2245431T3
ES2245431T3 ES03018399T ES03018399T ES2245431T3 ES 2245431 T3 ES2245431 T3 ES 2245431T3 ES 03018399 T ES03018399 T ES 03018399T ES 03018399 T ES03018399 T ES 03018399T ES 2245431 T3 ES2245431 T3 ES 2245431T3
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dcp4u
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dcmp
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Kenya Mori
Takanori Miyashita
Hideaki Maeda
Hiroshi Sato
Yutaka Noda
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Yamasa Corp
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Abstract

Un proceso para producir P1-(2''-desoxicitidina 5''- )P4-(uridina 5''-) tetrafosfato (dCP4U), el cual proceso comprende el hacer reaccionar uridina 5¿-monofosfato (UMP), 2¿-desoxicitidina 5¿-monofosfato (dCMP), difenilfosforocloridato (DPC) y un pirofosfato (PPi).

Description

Cristales dinucleotídicos.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un proceso para producir eficientemente P^{1}-(2'-desoxicitidina 5'-)P^{4}-(uridina 5'-)
tetrafosfato (dCP4U) o una sal farmacéuticamente admisible del mismo (de ahora en adelante puede ser mencionada simplemente como "dCP4U"), el cual es útil como agente terapéutico para la bronquitis crónica y la sinusitis.
Antecedentes de la invención
El dCP4U, representado por la fórmula (I) siguiente:
100
o una sal del mismo, es un agonista selectivo del receptor de purinas P2Y2 y/o el receptor de purinas P2Y4, y es un compuesto que se espera sea desarrollado como agente terapéutico para la bronquitis crónica, la sinusitis, y otros por el estilo (ver WO 98/34942).
Hasta ahora, no ha sido posible obtener dCP4U en forma cristalina, y el dCP4U ha sido preparado únicamente en forma de polvo blanco (sólido blanco) mediante liofilización. Los productos de dCP4U en polvo obtenidos convencionalmente tienen una pureza tal baja como el 82% (medida mediante HPLC). Particularmente, es difícil separar la uridina 5'-trifosfato (UTP), que sirve como materia de partida, del dCP4U, y únicamente se ha producido dCP4U muy purificado, con gran dificultad, mediante una cromatografía de intercambio iónico convencionalmente empleada (WO 98/34942).
El anterior polvo blanco de baja pureza tiene inconvenientes tales como la higroscopicidad. Por lo tanto, la preparación de un producto farmacéutico de dCP4U tiene que ser llevada a cabo en un aparato especial en el que la humedad esté controlada exactamente. Incluso después de la preparación de un producto farmacéutico, el producto tiene que ser envasado herméticamente. Además, puesto que el producto farmacéutico tiene un periodo aprovechable muy corto debido a la escasa estabilidad del producto en polvo, se ha deseado obtener cristales de dCP4U sumamente purificados y estables.
El dCP4U es sintetizado a partir de 2'-desoxicitidina 5'-monofosfato (dCMP) y UTP, mediante el empleo de un agente activador tal como diciclohexilcarbodiimida (DCC). Sin embargo, los procesos convencionales proporcionan un rendimiento sintético considerablemente bajo, esto es, tan bajo como aproximadamente el 9% en peso (ver Ejemplo 20 de WO 98/34942), y nunca pueden servir como proceso práctico. Por consiguiente, también se ha deseado el desarrollo de un proceso para producir dCP4U con gran rendimiento y a gran escala.
WO 99/05155 se refiere a un método para producir di(uridina 5'-tetrafosfato) y sales del mismo.
En vista de lo anterior, un objeto de la presente invención es proporcionar un proceso eficiente, adecuado para la producción de dCP4U a gran escala.
Revelación de la invención
La presente especificación describe que se puede prepara dCP4U, teniendo una pureza del 95% o más, mediante cromatografía de intercambio aniónico en combinación con cromatografía que emplea carbón vegetal activado (cromatografía con carbón vegetal activado), y que se pueden producir cristales de dCP4U a partir de tal dCP4U sumamente purificado. Los cristales de dCP4U así obtenidos han demostrado poseer una pureza considerablemente mayor que la del polvo de dCP4U producido convencionalmente, sin higroscopicidad y alta estabilidad.
Los inventores han conducido intensos estudios en métodos para sintetizar dCP4U mediante el empleo de uridina 5'-monofosfato (UMP) barata en lugar de UTP cara, y han descubierto que se puede producir dCP4U eficazmente mediante el empleo de difenilfosforocloridato (DPC) y un pirofosfato (PPi). La presente invención ha sido llevada a cabo partiendo de la base de este descubrimiento.
De acuerdo con esto, la presente describe cristales de dCP4U.
La presente especificación también describe un proceso para producir cristales de dCP4U, el cual proceso comprende el purificar dCP4U bruto mediante cromatografía de intercambio aniónico y cromatografía con carbón vegetal activado, y añadir un disolvente orgánico hidrófilo a una solución de dCP4U purificado para, de ese modo, precipitar dCP4U en forma de cristales.
La presente invención proporciona un proceso para producir dCP4U, el cual comprende el hacer reaccionar UMP, dCMP, DPC, y PPi como se define en la Reivindicación 1.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 es una fotografía que muestra la forma en cristales de dCP4U\cdot4Na cristalino (3'5 hidrato). La fotografía fue tomada bajo un microscopio polarizante (aumento; x440), en donde 1 mm en la imagen corresponde a 25 \mum.
La Fig. 2 muestra un espectro de difracción por rayos X de dCP4U\cdot4Na cristalino (3'5 hidrato).
La Fig. 3 muestra un espectro de difracción por rayos X de dCP4U\cdot4Na cristalino (decahidrato).
La Fig. 4 muestra un espectro de difracción por rayos X de dCP4U en polvo blanco (producto liofilizado).
La Fig. 5 muestra un espectro de RMN ^{13}C-CPMAS de dCP4U\cdot4Na cristalino (3'5 hidrato).
La Fig. 6 muestra un espectro de RMN ^{13}C-CPMAS de dCP4U\cdot4Na cristalino (decahidrato).
La Fig. 7 muestra un espectro de RMN ^{13}C-CPMAS de dCP4U en polvo blanco (producto liofilizado).
Mejor modo de llevar a cabo la invención
Los cristales de dCP4U se obtienen mediante la purificación de dCP4U bruto por el empleo de un medio específico, y la adición de un disolvente orgánico hidrófilo a una solución de dCP4U purificado para, de ese modo, precipitar dCP4U como cristales. A continuación se describirá la (1) purificación de dCP4U, y la (2) cristalización de dCP4U.
(1) Purificación de dCP4U
Se puede purificar dCP4U mediante cromatografía de intercambio aniónico en combinación con cromatografía con carbón vegetal activado. Aunque las dos técnicas cromatográficas pueden ser ejecutadas en una secuencia arbitraria, la cromatografía de intercambio aniónico precede, preferentemente, a la cromatografía con carbón vegetal activado, en vista de la mejora de la pureza del dCP4U.
Se puede utilizar una resina estirénica o acrílica como resina de intercambio aniónico en las técnicas de cromatografía descritas anteriormente. Ejemplos de resinas que se pueden utilizar incluyen resinas de intercambio aniónico fuertemente básicas tales como AMBERLITE IRA 402 (Rohm & Haas Co.), DIAION PA-312, y DIAION SA-11A (Mitsubishi Chemical Co. Ltd.), y resinas de intercambio aniónico débilmente básicas tales como AMBERLITE IRA 67 (Rohm & Haas Co.) y DIAION WA-30 (Mitsubishi Chemical Co. Ltd.).
El carbón vegetal activado puede estar en forma de carbón vegetal activado de calidad cromatográfica, el cual está prensado o modelado en partículas, y puede abarcar productos disponibles comercialmente (por ejemplo, los de Wako Pure Chemical Industries Ltd., y Futamura Chemical Industries Co. Ltd.).
La cromatografía puede ser realizada por cargas, mediante el empleo de una columna, etc. Cuando se realiza la cromatografía en columna, como eluyente para la cromatografía de intercambio aniónico se puede utilizar una solución acuosa de ácido o una mezcla de la misma con una sal que tenga una fuerza iónica intensificada, tal como cloruro sódico; y se puede utilizar como eluyente agua o una solución acuosa de un álcali, tal como hidróxido sódico, para la cromatografía en columna con carbón vegetal activado. Se puede conducir un ensayo preliminar a pequeña escala para seleccionar la concentración adecuada de cada eluyente, dentro del intervalo de 0'001 M hasta
10 M.
(2) Cristalización de dCP4U
El dCP4U cristaliza mediante la adición de un disolvente orgánico hidrófilo a una solución conteniendo el dCP4U así purificado.
Ejemplos de disolventes orgánicos hidrófilos que se pueden utilizar incluyen alcoholes que tengan seis o menos átomos de carbono, tales como metanol y etanol; cetonas tales como acetona; éteres tales como dioxano; nitrilos tales como acetonitrilo; y amidas tales como dimetilformamida. De estos, son particularmente preferidos los alcoholes, especialmente el etanol.
Más específicamente, una solución del dCP4U así purificado, o un lodo líquido obtenido mediante la concentración de la solución, es tratada opcionalmente para, de ese modo, ajustar el pH a 5-10, preferentemente 6-9, y se añade un disolvente orgánico hidrófilo a la solución o lodo líquido a 60ºC o inferior, preferentemente 20ºC o inferior, para precipitar de ese modo el soluto como cristales estables de dCP4U.
Los cristales de dCP4U así obtenidos contienen dCP4U en una cantidad del 95% o más, y UTP en una cantidad del 3% o menos. Preferentemente, los cristales de dCP4U contienen dCP4U en una cantidad del 97% o más, y UTP en una cantidad del 2% o inferior. Más preferentemente, los cristales de dCP4U contienen dCP4U en una cantidad del 98% o más, y UTP en una cantidad del 1% o menos.
Tales cristales de dCP4U de alta pureza pueden estar en forma de sal, hidrato, o sal hidrato. Ejemplos de las sales incluyen sales farmacéuticamente admisibles tales como sales de metales alcalinos, tales como las sales sódicas y las sales potásicas; sales de metales alcalinotérreos tales como las sales cálcicas y las sales potásicas; y sales amónicas. El dCP4U puede estar sustituido con 1-4 átomos de metal para formar una sal.
El hidrato anterior puede comprender 1-14 moléculas de agua que están unidas o se adhieren a una molécula de dCP4U, y la anterior sal hidrato puede comprender 1-14 moléculas de agua que están unidas o se adhieren a una molécula de una sal de metal alcalino de dCP4U.
Además, los cristales de dCP4U también abarcan tautómeros del mismo.
Los cristales de dCP4U así obtenidos son opcionalmente desecados mediante un método acostumbrado tal como desecar a presión reducida, desecar con flujo de aire, o desecar por calentamiento, y son posteriormente puestos en un recipiente (por ejemplo, botella, petaca, bote, ampolla). Se puede conseguir el envasado en el recipiente para que sea abierto, cerrado, hermético, o sellado herméticamente. No se prefiere el envase abierto al aire, en vista del mantenimiento de la estabilidad al almacenamiento de los cristales.
El proceso para producir dCP4U, según la presente invención, comprende el hacer reaccionar UMP, dCMP, DPC y PPi.
Específicamente, el proceso comprende el hacer reaccionar UMP con DPC para, de ese modo, sintetizar UMP difenilfosfato (UMP-DPP); tratar además la mezcla de reacción, conteniendo UMP-DPP, con PPI para, de ese modo, formar UTP en la mezcla; y hacer reaccionar el UTP así formado, sin aislar de la mezcla de reacción, con dCMP en presencia de DPC para, de ese modo, formar el dCP4U objetivo.
En la síntesis de UMP-DPP a partir de UMP, se puede disolver en un disolvente una sal trialquilamina de UMP (por ejemplo, sal tributilamina de UMP), preparada rutinariamente. Ejemplos de los disolventes abarcan amidas tales como DMF y dimetilacetamida (DMAC); éteres cíclicos tales como dioxano y tetrahidrofurano; cetonas tales como acetona; y dimetilimidazolidinona, triamida hexametilfosfórica, o una mezcla de dos o más de éstos. Posteriormente, a la solución se añaden DPC y trialquilamina opcional, y se deja que la mezcla reaccione a 10-50ºC durante aproximadamente 30 minutos a cinco horas.
Los PPi que reaccionan con UMP-DPP son, preferentemente, sales alcalinas orgánicas PPi. Ejemplos de las sales incluyen una sal hexilamina, una sal dibutilamina, una sal trietilamina, y una sal tributilamina.
En la reacción de UMP-DPP con una sal alcalina orgánica PPi, la sal alcalina orgánica PPi puede ser disuelta en un disolvente. Ejemplos de tales disolventes abarcan amidas tales como DMF, DMAC, y formamida; éteres cíclicos tales como dioxano y tetrahidrofurano; cetonas tales como acetona; y dimetilimidazolidinona, triamida hexametilfosfórica, dimetilsulfóxido, acetonitrilo, o una mezcla de dos o más de éstos. Posteriormente, la solución es añadida a la solución de UMP-DPP así sintetizada, y se deja que la mezcla reaccione a 10-50ºC durante aproximadamente 30 minutos a cinco horas.
La reacción entre UMP-DPP y la sal alcalina orgánica PPi puede ser realizada en presencia de una base adecuada. Ejemplos de las bases incluyen bases piridina tales como piridina, 2,6-lutidina, 2,4-lutidina, \alpha-picolina, \beta-picolina, \gamma-picolina, 2,4-dimetilaminopiridina, \alpha-colidina, \beta-colidina, y \gamma-colidina, siendo particularmente preferida la piridina. En las bases utilizadas en la presente invención también se incluye un disolvente básico para la reacción. La concentración de la base no está particularmente limitada. La base se añade, preferentemente, en una cantidad de 6 equivalentes o más, basada en el UMP, más preferentemente 18 equivalentes o más.
Mediante la reacción entre UMP-DPP y la sal alcalina orgánica PPi, se sintetiza UTP en la mezcla de reacción. El UTP así formado y el dCMP son hechos reaccionar en presencia de DPC para, de ese modo, sintetizar dCP4U.
Aunque el dCMP puede ser añadido per se a la mezcla de reacción, el dCMP es transformado en dCMP difenilfosfato (dCMP-DPP) de una manera similar a la empleada en el caso del UMP, y también se puede añadir el dCMP-DPP.
La reacción de dCP4U se puede realizar añadiendo, a la solución mencionada de UTP sintetizado, DPC en una cantidad de 1'1 equivalentes o más, y dCMP o dCMP-DPP en una cantidad de 0'5-1'5 equivalentes basados en el UMP empleado como materia de partida, y se deja que la mezcla reaccione a 10-50ºC durante aproximadamente 30 minutos a cinco horas.
El dCP4U así obtenido es purificado y cristalizado de la manera mencionada para, de ese modo, obtener los cristales de dCP4U de la presente invención.
Ejemplos
A continuación, la presente invención será descrita detalladamente mediante ejemplos, los cuales no deberían ser interpretados como limitando la invención a ellos.
Ejemplo 1 Producción de cristales de dCP4U\cdot4Na (1) Método utilizando DCC (Ejemplo de Referencia)
Se preparó dCP4U por un método de rutina, como se describe en WO 98/34942, mediante el empleo de UTP, dCMP, y DCC. Se realizó la reacción a una escala de 20 mmol.
La solución de dCP4U así obtenida fue diluida con agua para, de ese modo, ajustar el volumen total a 1'000 ml, y la solución diluida fue aplicada a una columna cargada con resina de intercambio aniónico medio básica (AMBERLITE IRA-67, producto de Rohm & Haas Co.). La elución fue llevada a cabo secuencialmente mediante el uso de agua, una solución acuosa de ácido clorhídrico 0'18 M, y una solución acuosa de ácido clorhídrico 0'005 M conteniendo cloruro sódico 0'5 M, de ese modo recogiendo fracciones conteniendo dCP4U.
Las fracciones con dCP4U así obtenidas (4.000 ml) fueron aplicadas a una columna cargada con carbón vegetal activado de calidad cromatográfica (Taiko Granular Activated Charcoal SGP, producto de Futamura Chemical Industries Co. Ltd.), y se elucionó el dCP4U mediante el uso de una solución acuosa de hidróxido sódico 0'05 M.
Las fracciones de dCP4U así obtenidas fueron combinadas y concentradas para, de ese modo, preparar un lodo líquido. Se ajustó el pH del lodo líquido a 6'0. Se agitó el lodo líquido mientras se añadía etanol gradualmente al lodo líquido, y el lodo líquido resultante fue además enfriado a 10ºC con agitación, precipitando de ese modo cristales de dCP4U\cdot4Na. Se separaron los cristales para, de ese modo, producir 8'9 g de cristales de dCP4U\cdot4Na. Los cristales asilados fueron desecados a presión reducida, a aproximadamente 60ºC durante unas cuatro horas, y fueron sometidos luego a análisis instrumentales.
(2) Método utilizando DPC
Se disolvió UTP\cdot3Na (12'8 kg) en agua (135 l), y se aplicó la solución resultante a una columna cargada con resina de intercambio catiónico (producto de Mitsubishi Chemical Co. Ltd.) Se combinaron la solución que había pasado a través de la columna y las fracciones que habían sido elucionadas con agua, y se añadió tributilamina (TBA, 13'6 kg) gradualmente a la solución combinada con agitación, para su neutralización. Se concentró la solución, y se añadió formamida (10 kg) a la solución. La solución resultante fue deshidratada mediante ebullición con dioxano. Posteriormente, la materia deshidratada fue diluida con piridina (11'6 kg) para, de ese modo, preparar una solución de UTP en piridina.
A otro tanque conteniendo metanol (18 l), se añadió dCMP (7'5 kg). Se añadió TBA (4'5 kg) gradualmente a la solución con agitación, y se calentó la solución a 60ºC. Después de que se disolvieran los ingredientes, la solución fue concentrada hasta sequedad. La materia desecada fue además desecada a vacío a 75ºC, y triturada. La materia triturada (10'3 kg) fue suspendida en dimetilacetamida (DMAC) (16'7 kg), y se añadió difenilfosforocloridato (DPC) (4'4 kg) a la suspensión, y se agitó la mezcla durante 10 minutos. Posteriormente, se añadió además TBA (10'8 kg) a la mezcla, y la mezcla resultante fue agitada durante 30 minutos para, de ese modo, preparar una solución de dCMP-DPP.
A la solución de dCMP-DPP así preparada se añadió, con agitación, la solución de UTP en piridina que había sido preparada de la manera mencionada. Después de la terminación de la adición, la mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante la noche, y se terminó la reacción añadiendo agua desionizada.
A la mezcla anterior se añadió una solución acuosa de hidróxido sódico al 30% (31 l). La mezcla fue agitada durante 30 minutos, y se extrajo TBA liberado mediante el fraccionamiento. Se añadió una solución de ácido clorhídrico de 6 moles/l a la capa acuosa para, de ese modo, ajustar el pH de la solución a aproximadamente 7. La solución fue concentrada mediante la eliminación del disolvente, y se añadió un equivolumen de etanol del 95% a la solución concentrada. Se dejó que la mezcla resultante reposara durante la noche. La capa superior de la mezcla, esto es, la capa de etanol, fue extraída mediante succión, y se añadió agua al precipitado pegajoso resultante para, de ese modo, disolver el precipitado. Se eliminó el disolvente residual mediante concentración del disolvente.
El volumen total de la solución de dCP4U así sintetizado fue ajustada a 2'500 l, y la solución fue aplicada a una columna cargada con resina de intercambio aniónico medio básica (AMBERLITE IRA-97, producto de Rohm & Haas Co.) Se realizó la elución secuencialmente con agua, una solución acuosa de ácido clorhídrico de 0'1 moles/l, y una solución acuosa de ácido clorhídrico de 0'005 moles/l conteniendo 0'4 moles/l de cloruro sódico, recogiendo de ese modo las fracciones conteniendo dCP4U.
Las fracciones de dCP4U así obtenidas (2.100 l) fueron aplicadas a una columna cargada con carbón vegetal activado de calidad cromatográfica (Taiko Granular Activated Charcoal SGP, producto de Futamura Chemical Industries Co. Ltd.), y se elucionó el dCP4U mediante el uso de una solución acuosa de hidróxido sódico de 0'05 moles/l (1.200 l).
Las fracciones así obtenidas fueron combinadas y concentradas. Se ajustó el pH de la solución resultante a 7'5, mediante el uso de una solución acuosa de hidróxido sódico al 30%. Se agitó la solución mientras se añadía gradualmente etanol del 95% a la solución, precipitando de ese modo cristales de dCP4U\cdot4Na. Se separaron los cristales y se desecaron a 60ºC durante cuatro horas para, de ese modo, producir 4'2 kg de cristales de dCP4U\cdot4Na (contenido en agua: 5'9%, rendimiento del aislamiento: 22%).
Propiedades físicas de los cristales de dCP4U\cdot4Na
Los cristales de dCP4U\cdot4Na preparados en (1) ó (2) del Ejemplo 1, y polvo blanco de dCP4U\cdot4Na (producto liofilizado) que fue preparado de la misma manera que en el método descrito en el Ejemplo 20 de WO 98/34942, fueron sometidos a análisis instrumental. Los cristales fueron comparados con el producto liofilizado, en términos de propiedades físicas.
(3) Análisis instrumental 1) Análisis de la pureza
Los cristales de dCP4U\cdot4Na obtenidos en (1) y (2) del Ejemplo 1, y las fracciones con dCP4U después de purificación mediante cada cromatografía, fueron sometidos a análisis de pureza mediante cromatografía líquida de alta resolución. En las Tablas 1 y 2 se muestran los resultados. Abajo se describen las condiciones para la cromatografía líquida de alta resolución.
Columna: HITACHIGEL nº 3013-N (producto de Hitachi Keisokuki Service).
Eluyente: 10% de CH_{3}CN, ClNH_{4} 0'18 M, PO_{4}H_{2}K 0'03 M, y PO_{4}HK_{2} 0'03 M.
Método de detección: detección UV a 262 nm.
TABLA 1 Método con DCC
Contenido de dCP4U (%) Contenido de UTP (%)
Mezcla de reacción 55'0 28'6
Después de cromatografía de I. I.* (-) (-)
Después de cromatografía con C. A.* 97'4 0'4
Después de cristalización 98'3 0'4
(-) \hskip0.15cm no medido
* \hskip0.3cm I. I: intercambio iónico; C. A.: carbón activado
TABLA 2 Método con DPC
Contenido de dCP4U (%) Contenido de UTP (%)
Mezcla de reacción (-) (-)
Después de cromatografía de I. I.* 68'6 27'2
Después de cromatografía con C. A.* 92'8 1'5
Después de cristalización 98'3 0'3
(-) \hskip0.15cm no medido
* \hskip0.3cm I. I: intercambio iónico; C. A.: carbón activado
2) Forma cristalina
La Fig. 1 muestra una fotografía de una típica forma cristalina de cristales de dCP4U\cdot4Na (3'5 hidrato).
3) Contenido en agua
El contenido en agua de los cristales de dCP4U\cdot4Na se midió mediante el método de Karl Fischer. Se descubrió que los cristales de dCP4U\cdot4Na estaban estabilizados en el contenido en agua, desde el 6'9 hasta el 17'4% en peso, el cual variaba según el grado de secado. Los resultados del cálculo muestran, aparentemente, que las 3'5-10 moléculas de agua se unen o adhieren a una molécula de dCP4U.
4) Punto de fusión
Se midió el punto de fusión de los cristales de dCP4U\cdot4Na mediante un método convencional. Se descubrió que el punto de fusión era de 202-210ºC. El punto de fusión del producto liofilizado fue de aproximadamente 195-210ºC.
5) Difracción por rayos X
Los cristales de dCP4U\cdot4Na fueron sometidos a difracción por rayos X mediante el empleo de un aparato para difracción de rayos X (Modelo: RINT2500V), producto de Rigaku Denki) bajo las siguientes condiciones (error de medición: \pm 0'1º). En la Fig. 2 y Tabla 3, respectivamente, se muestran el espectro de difracción por rayos X y los datos de los picos del dCP4U\cdot4Na 3'5 hidrato así obtenidos. De manera similar, en la Fig. 3 y Tabla 4, respectivamente, se muestran el espectro de difracción por rayos X y los datos de los picos del dCP4U\cdot4Na decahidrato. Además, en la Fig. 4, como referencia, se muestra el espectro de difracción por rayos X del producto liofilizado. Condiciones de la medición:
Tubo de rayos X: Cu-K\alpha
Corriente de salida de los rayos X: 50 kV-300 mA
Velocidad de barrido: 4'0º/minuto
Intervalo de barrido: 0'02º
Intervalo de medición del ángulo: 2-40º
Rendija: \hskip0.3cm DS-0'5º, \hskip0.3cm RS-0'15 mm, \hskip0.3cm SS-0'5º
Pretratamiento: \hskip0.3cm molturación mediante el uso de un mortero de ágata
TABLA 3 dCP4U\cdot4Na 3'5 hidrato cristalino
Pico nº 2\theta (º) Intensidad relativa
1 6'18 39
2 8'82 38
3 11'50 27
4 12'32 79
5 13'76 39
6 14'44 83
8 16'34 29
9 16'84 34
10 17'68 100
11 19'02 81
12 19'72 36
13 20'86 35
14 22'28 78
15 23'54 47
16 25'04 43
TABLA 4 dCP4U\cdot4Na decahidrato cristalino 
\vskip1.000000\baselineskip
Pico nº 2\theta (º) Intensidad relativa
1 5'58 28
2 11'34 62
3 11'94 34
4 12'92 27
5 14'08 49
6 14'96 66
7 15'60 49
8 16'62 25
9 17'08 46
10 18'28 27
11 18'90 28
12 20'20 39
13 21'66 72
14 22'02 100
15 23'02 90 
\vskip1.000000\baselineskip
6) Higroscopicidad
Se dejó que cristales de dCP4U\cdot4Na (decahidrato), teniendo un contenido en agua de aproximadamente el 17'4%, estuvieran durante dos días bajo las condiciones a), b) y c) siguientes: a) 25ºC y una humedad relativa del 57%; b) 25ºC y una humedad relativa del 75%; y c) 25ºC y una humedad relativa del 93%. No se observó descomposición o cambio en el peso en los tres casos anteriores. Los cristales han confirmado ser estables y no tener higroscopicidad. Además, los mismos cristales fueron dejados durante siete días, bajo las condiciones severas d) siguientes: d) 40ºC y una humedad relativa del 75%. En este caso, no se observó ningún cambio.
Por contraste, cuando un producto liofilizado (contenido inicial de agua: aproximadamente el 1%) se almacenó durante dos días bajo las siguientes condiciones b) o c): b) 25ºC y una humedad relativa del 75%, y c) 25ºC y una humedad relativa del 93%, en el segundo día de almacenamiento el producto adoptó un estado parecido al barro, debido al aumento gradual del contenido en agua.
7) Estabilidad
Por separado, se pusieron cristales de dCP4U\cdot4Na (decahidrato) y producto liofilizado en botellas, las cuales fueron después cerradas y almacenadas durante 13 días a 60ºC (ensayo de aceleración). No se observó descomposición de los cristales. Por contraste, se descubrió que el producto liofilizado se había descompuesto parcialmente, como se demostró mediante la observación de una pérdida de pureza del producto de aproximadamente el 2'2%.
8) RMN
Cada uno de los cristales de dCP4U\cdot4Na y el producto liofilizado fueron directamente cargados en un rotor fabricado en zirconia, y se midió el correspondiente espectro de RMN ^{13}C-CPMAS. Abajo se describen las condiciones para la medición.
RMN ^{13}C-CPMAS
1) aparato CMX-300 (producto de Chemagnetics)
2) método para medición CPMAS (supresión de la banda lateral)
3) temperatura de medición temperatura ambiente
4) núcleo observado ^{13}C
5) frecuencia de observación 75'502 MHz
6) duración del impulso de la excitación protónica 4'5 \mus
7) tiempo de contacto 0'5 mseg.
8) amplitud de la medición 30'03 Khz.
9) puntos de medición 2.048
10) puntos de datos 16.384
11) tiempo de repetición 15'0 seg. (Figs. 6 y 7); 60'0 seg. (Fig. 5)
12) patrón para el desplazamiento químico hexametilbenceno (17'35 ppm de estándar externo)
13) velocidad de rotación de la muestra 5 Khz.
14) integración 256 veces
La Fig. 5 y la Tabla 5 muestran un espectro de RMN ^{13}C-CPMAS de dCP4U\cdot4Na 3'5 hidrato cristalino y los datos de los picos, respectivamente. La Fig. 6 y la Tabla 6 muestran un espectro de RMN ^{13}C-CPMAS de dCP4U\cdot4Na decahidrato cristalino y los datos de los picos, respectivamente. La Fig. 7 y la Tabla 7 muestran un espectro de RMN ^{13}C-CPMAS de dCP4U en forma de polvo blanco y los datos de los picos, respectivamente. Los números en las Figs. 5 a 7 se refieren a los correspondientes números de los picos en las Tablas 5 a 7.
TABLA 5 dCP4U\cdot4Na 3'5 hidrato cristalino (ppm)
(1) 166'1 (2) 156'2 (3) 150'9 (4) 141'6
(5) 138'4 (6) 101'3 (7) 99'2 (8) 93'2
(9) 84'9 (10) 80'6 (11) 76'7 (12) 73'1
(13) 69'0 (14) 67'2 (15) 62'2 (16) 43'9
TABLA 6 dCP4U\cdot4Na decahidrato cristalino (ppm)
(1) 167'4 (2) 157'8 (3) 151'6 (4) 139'0
(5) 117'9 (6) 102'6 (7) 99'3 (8) 93'3
(9) 90'1 (10) 87'3 (11) 80'6 (12) 77'2
(13) 75'0 (14) 73'9 (15) 72'0 (16) 67'0
(17) 63'1 (18) 60'4 (19) 42'0 (20) 40'8
TABLA 7 Polvo blanco de dCP4U (producto liofilizado) (ppm)
(1) 166'5 (2) 157'4 (3) 149'9 (4) 140'9
(5) 103'0 (6) 99'0 (7) 96'9 (8) 85'9
(9) 73'4 (10) 71'7 (11) 67'1 (12) 42'0
(13) 39'3
Ejemplo 2 Síntesis de dCP4U a partir de UMP
Se añadieron formamida (2'5 ml) y piridina (7'6 ml) a una sal de trietilamina deshidratada (10 mmol) de pirofosfato (TEA-PPi), seguido por agitación de la mezcla resultante. A una sal tributilamina deshidratada de uridina 5'-monofosfato (UMP-TBA) (10 mmol), puesta en otro recipiente, se añadieron DMAC (3'6 ml), dioxano (3'2 ml), y tributilamina (3'3 ml) con agitación, y a eso se añadió DPC (2'3 ml) gota a gota. La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante una hora para, de ese modo, formar UMP-DPP, el cual fue añadido a la solución deshidratada mencionada de TEA-PPi, preparada por adelantado. Se agitó la mezcla de reacción durante una hora a temperatura ambiente, formándose UTP. Se añadió DMAC (7'2 ml) a una sal tributilamina de 2'-desoxicitidina 5'-monofosfato (TBA-dCMP) (4'9 g, 10 mmol) puesta en otro recipiente, para de ese modo formar una suspensión, y se añadió DPC (2'2 ml, 1'1 equivalentes) a la suspensión. Se agitó la mezcla resultante durante 40 minutos, y se añadió tributilamina (TBA) (9'5 ml) a la mezcla. Se llevó a cabo otra agitación de 20 minutos para, de ese modo, preparar dCMP-DPP. La solución de dCMP-DPP así preparada se añadió a la mencionada solución de UTP sintetizado, preparada con anticipación, y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 56 horas. Se terminó la reacción añadiendo agua, y se ajustó el pH de la mezcla de reacción a 11 añadiendo una solución acuosa de hidróxido sódico al 30%. Después de se eliminase el disolvente por concentración, se ajustó el pH a 7'0 añadiendo ácido clorhídrico de 6 moles/l. La mezcla fue fraccionada con acetato de etilo. La capa acuosa formada por el fraccionamiento fue sometida a análisis HPLC (272 nm), revelando que el rendimiento de la síntesis de dCP4U fue el 37'7%.
Aplicabilidad industrial
Como se describió más arriba, los cristales de dCP4U obtenidos mediante el proceso según la presente invención tienen alta pureza, alta estabilidad y ninguna higroscopicidad comparados con un producto liofilizado, para que de ese modo sirvan como materia prima útil para preparar un producto farmacéutico.
El proceso para producir dCP4U según la presente invención permite el uso de UMP barato como materia prima, y se realiza con alto rendimiento. De este modo, el proceso es apropiado para la síntesis de dCP4U a gran escala.

Claims (2)

1. Un proceso para producir P^{1}-(2'-desoxicitidina 5'-)P^{4}-(uridina 5'-) tetrafosfato (dCP4U), el cual proceso comprende el hacer reaccionar uridina 5'-monofosfato (UMP), 2'-desoxicitidina 5'-monofosfato (dCMP), difenilfosforocloridato (DPC) y un pirofosfato (PPi).
2. Un proceso según la Reivindicación 1, el cual comprende el hacer reaccionar UMP y DPC para sintetizar UMP difenilfosfato (UMP-DPP) en una primera fase; tratar además la mezcla de reacción, conteniendo UMP-DPP, con PPi para, de ese modo, formar uridina 5'-trifosfato (UTP) en la mezcla; y hacer reaccionar la UTP así formada, sin aislamiento de la mezcla de reacción, con dCMP en presencia de DPC, para de ese modo producir dCP4U.
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