EA004707B1

EA004707B1 - Кристаллы динуклеотида

Info

Publication number: EA004707B1
Application number: EA200200109A
Authority: EA
Inventors: Кенйа Мори; Таканори Миясита; Хидеаки Маеда; Хироси Сато; Ютака Нода
Original assignee: Ямаса Корпорейшн
Priority date: 1999-06-30
Filing date: 2000-06-30
Publication date: 2004-06-24
Also published as: DE60006814T2; EP1191032A4; DE60021629T2; CN1144811C; PL202200B1; CN1359387A; BR0012205A; KR100593723B1; EP1362862A1; EP1191032B1; CZ20014502A3; ZA200110468B; EP1191032A1; US6617444B1; PL202176B1; ES2245431T3; PL352363A1; JP3421666B2; NO20016381D0; AU767136B2

Abstract

Настоящее изобретение относится к кристаллам Р-(2'-дезоксицитидин 5'-)Р-(уридин 5'-)тетрафосфата (dCP4U) или его солей и к способу получения кристаллов. Настоящее изобретение предоставляет также способ получения dCP4U, включающий реакцию уридин 5'-монофосфата (UMP), 2'-дезоксицитидин 5'-монофосфата (dCMP), дифенилфосфохлоридата (DPC) и пирофосфата (PPi). Кристаллы dCP4U по способу настоящего изобретения имеют высокую чистоту и высокую стабильность, а также не гигроскопичны по сравнению с продуктом, высушенным вымораживанием, и поэтому служат в качестве полезного сырьевого материала для получения лекарств. Способ получения dCP4U в соответствии с настоящим изобретением позволяет использовать в качестве сырьевого материала недорогой UMP и обеспечивает высокий выход. Таким образом, процесс является подходящим для крупномасштабного синтеза dCP4U.

Description

Настоящее изобретение относится к кристаллам Р¹-(2'-дезоксицитидин 5'-) Р⁴-(уридин 5'-)тетрафосфата (с1СР4и) или его фармацевтически приемлемых солей (здесь и далее они могут обозначаться просто как с1СР4и). которые полезны в качестве терапевтических агентов от хронических бронхитов, синуситов и т.п.; к способу получения кристаллов; и к способу эффективного получения бСР4и.

Предпосылки изобретения бСР4и, представленный следующей фор-

или его соль, является селективным агонистом Ρ2Υ2 пуринового рецептора и/или Ρ2Υ4 пуринового рецептора, и является соединением, которое, как ожидают, предполагается использовать в качестве терапевтического агента от хронических бронхитов, синуситов и т.п. (См. \¥О 98/34942).

До сих пор не удавалось получить с1С’Р4и в кристаллической форме, и с1С’Р4и получали только в форме белого порошка (белого твердого вещества) в результате сушки вымораживанием. Получаемые обычным способом порошки бСР4и имели столь низкую чистоту как 82% (по данным ВЭЖХ). В частности, трудно отделить уридин 5'-трифосфат (иТР), который служит исходным материалом, от с1С’Р4и и высокочистый с1С Ρ4ϋ получался лишь с большим трудом с помощью обычно используемой ионообменной хроматографии (\¥О 98/34942).

Указанный выше белый порошок низкой чистоты обладает такими недостатками как гигроскопичность. Поэтому получение лекарственного препарата из с1С’Р4и должно осуществляться в специальной аппаратуре, в которой тщательно контролируется содержание влаги. Даже после получения лекарственного препарата продукт должен быть плотно упакован. Кроме того, так как лекарственный препарат имеет очень короткий срок годности из-за плохой стабильности продукта в виде порошка, весьма желательно было получить стабильные кристаллы бСР4и высокой чистоты.

бСР4и получают из 2'-дезоксицитидин 5'монофосфата (с1СМР) и ЦТР, используя активирующий агент, такой как дициклогексилкарбодиимид (ОСС). Однако обычные процессы обеспечивают при синтезе довольно низкий выход: т.е. столь низкий, как 9 вес.% (см. пример 20 \¥О 98/34942), и поэтому никогда не могут служить в качестве практичных способов. Соответственно, весьма желательно было разработать способ получения с1СР4и с высоким выходом и в промышленном масштабе.

Ввиду изложенного выше, целью настоящего изобретения является предоставление стабильных кристаллов с1С’Р4и. которые являются подходящими для получения лекарств. Еще одной целью настоящего изобретения является предоставление способа получения кристаллов. Еще одной целью настоящего изобретения является предоставление эффективного способа, подходящего для получения с1С’Р4и в крупномасштабном производстве.

Описание изобретения

Авторы настоящего изобретения провели интенсивные исследования по стабилизации с1СР4и и обнаружили, что можно получить с1СР4и с чистотой 95% или выше, используя анионообменную хроматографию в сочетании с хроматографией с применением активированного древесного угля (хроматография с использованием активированного угля), и что из такого высокоочищенного с1С’Р4и можно получить кристаллы с1СР4и. Было доказано, что полученные таким образом кристаллы с1С’Р4и обладают значительно более высокой чистотой, чем полученный обычным способом порошок с1СР4и. они не гигроскопичны и отличаются высокой стабильностью.

Авторы настоящего изобретения провели также интенсивные исследования по способам синтеза с1СР4и с использованием недорогого уридин 5'-монофосфата (ЕГМР) вместо дорогостоящего иТР и обнаружили, что с1С’Р4и можно эффективно получать, используя дифенилфосфохлоридат (ОРС) и пирофосфат (ΡΡί). Настоящее изобретение было выполнено на основании данных находок.

Соответственно, настоящее изобретение предоставляет кристаллы с1С’Р4и.

Настоящее изобретение предоставляет также способ получения кристаллов с1С’Р4и. который включает очистку сырого с1СР4и с помощью анионообменной хроматографии и хроматографии с активированным древесным углем и добавления гидрофильного органического растворителя к раствору очищенного с1С’Р4и. в результате чего происходит осаждение с1С’Р4и в форме кристаллов.

Настоящее изобретение предоставляет также способ получения с1С’Р4и. который включает взаимодействие ЕГМР, с1СМР. ОРС и ΡΡί.

Краткое описание рисунков

Фиг. 1 представляет фотографию кристаллической формы кристаллического с1СР4и«4№ (3,5-гидрата). Фотография получена с помощью поляризационного микроскопа (увеличение: х 440), где 1 мм на изображении соответствует 25 мкм.

Фиг. 2 демонстрирует дифракционный спектр рентгеновских лучей кристаллического с1СР4и«4№ (3,5-гидрата).

Фиг. 3 демонстрирует дифракционный спектр рентгеновских лучей кристаллического с1СР4и«4№ (декагидрата).

Фиг. 4 демонстрирует дифракционный спектр рентгеновских лучей белого порошкообразного бСР4И (продукт высушен вымораживанием).

Фиг. 5 демонстрирует ¹³С-СРМЛ8-ЯМР спектр кристаллического бСР4и«4Ыа (3,5гидрата).

Фиг. 6 демонстрирует ¹³С-СРМЛ8-ЯМР спектр кристаллического бСР4и«4Ыа (декагидрата).

Фиг. 7 демонстрирует ¹³С-СРМЛ8-ЯМР спектр белого порошкообразного бСР4И (продукт высушен вымораживанием).

Наилучший вариант осуществления изобретения

Кристаллы бСР4И настоящего изобретения получают очисткой сырого бСР4И с использованием специфических средств и добавлением гидрофильного органического растворителя к раствору очищенного 6СР4И, в результате чего бСР4И осаждается в виде кристаллов. Далее настоящее изобретение будет описано в отношении (1) очистки бСР4И и (2) кристаллизации бСР4И.

(1) Очистка бСР4И.

бСР4И можно очистить с помощью анионообменной хроматографии в сочетании с хроматографией с активированным древесным углем. Хотя два приема хроматографии можно использовать в произвольной последовательности, предпочтительно, чтобы обработка с помощью анионообменной хроматографии предшествовала обработке с помощью хроматографии с активированным древесным углем, ввиду улучшения чистоты бСР4И.

Стирольную или акриловую смолу можно использовать в качестве анионообменной смолы в указанных выше приемах хроматографии. Примеры смол, которые можно использовать, включают сильно основные анионообменные смолы, такие как ЛМВЕКЫТЕ ΙΚΑ 402 (Койш & Наак Со.), ΌΙΑΙΘΝ РА-312 и ΌΙΑΙΘΝ 8Л-11Л (МйкиЫкЫ Сйеш1са1 Со. Иб.). и слабоосновные анионообменные смолы, такие как ЛМВЕКЫТЕ ΙΚΑ 67 (Койш & Наак Со.) и ΌΙΑΙΘΝ \Α-30 (МйкиЫкЫ Сйеш1са1 Со. Иб.).

Активированный древесный уголь может быть в виде активированного древесного угля хроматографического сорта, который измельчен или имеет форму частиц, и может включать промышленно доступные продукты (например, продукты фирмы \ако Риге Сйеш1са1 Шбийпек, Иб. и Еи1ашига Сйеш1са1 [пбик1г1ек, Со., Ыб.).

Хроматографию осуществляют периодически с использованием колонок и т.д. Когда хроматографию осуществляют на колонке, водный раствор кислоты или ее смеси с солью, обладающей повышенной ионной силой, такой как хлорид натрия, можно использовать в качестве элюента для анионообменной хроматографии; а воду или водный раствор щелочи, такой как гидроксид натрия, можно использовать в каче стве элюента для хроматографии на колонке с активированным древесным углем. Для того, чтобы подобрать соответствующую концентрацию каждого из элюентов из интервала 0,001 М - 10М, можно провести предварительный тест в лабораторном масштабе.

(2) Кристаллизация бСР4И.

бСР4и кристаллизуют, добавляя гидрофильный органический растворитель к раствору, содержащему очищенный таким образом бСР4И.

Примеры гидрофильных органических растворителей, которые можно использовать, включают спирты, имеющие шесть или менее атомов углерода, такие как метанол и этанол; кетоны, такие как ацетон; простые эфиры, такие как диоксан; нитрилы, такие как ацетонитрил; и амиды, такие как диметилформамид. Из них особенно предпочтительны спирты, особенно этанол.

Более конкретно, раствор очищенного таким образом бСР4и или суспензию, полученную в результате концентрирования раствора, необязательно обрабатывают так, чтобы довести рН до 5-10, предпочтительно 6-9, и к раствору суспензии добавляют гидрофильный органический растворитель при 60°С или ниже, предпочтительно при 20°С или ниже, в результате чего осаждается растворенное вещество в виде стабильных кристаллов бСР4И.

Полученные таким образом кристаллы бСР4и настоящего изобретения содержат бСР4и в количестве 95% или более, и ИТР в количестве 3% или менее. Предпочтительно, кристаллы бСР4и содержат бСР4И в количестве 97% или более, а ИТР в количестве 2% или менее. Более предпочтительно, кристаллы бСР4И содержат бСР4И в количестве 98% или более, а ИТР в количестве 1% или менее.

Такие кристаллы бСР4И с высокой чистотой могут быть в форме соли, гидрата или гидратной соли. Примеры солей включают фармацевтически приемлемые соли, такие как соли щелочных металлов, таких как соли натрия и калия; соли щелочноземельных металлов, таких как соли кальция и магния; и аммониевые соли. бСР4и может быть замещен 1-4 атомами металлов с образованием соли.

Указанный выше гидрат может включать 1-14 молекул воды, которые связаны с одной молекулой бСР4и, а указанная выше гидратная соль может включать 1-14 молекул воды, которые связаны с одной молекулой соли щелочного металла бСР4И. Кроме того, кристаллы бСР4И в соответствии с настоящим изобретением включают также их таутомеры.

Полученные таким образом кристаллы бСР4и необязательно сушат обычным способом, таким как сушка при пониженном давлении, сушка в токе воздуха или сушка нагреванием, и затем помещают в контейнер (например, пузырек, пакетик, консервную баночку, ампу5 лу). Упаковка в контейнер должна достигаться таким образом, чтобы контейнер открывался, закрывался, был воздухонепроницаем или запаивался. Для поддержания стабильности кристаллов при хранении упаковка при доступе воздуха не желательна.

Способ получения 6СР4И в соответствии с настоящим изобретением включает взаимодействие иМР, 6СР4И, БРС и Ррг

Более конкретно способ включает взаимодействие ИМР с БРС для синтеза ИМР дифенилфосфата (ИМР-БРР); далее обработку реакционной смеси, содержащей ИМР-БРР, с помощью Рр1 с образованием в смеси ИТР; и взаимодействие полученного таким образом ИТР, без выделения из реакционной смеси, с 6СМР в присутствии БРС, для получения целевого 6СР4И.

При синтезе ИМР-БРР из ИМР обычно полученную триалкиламиновую соль ИМР (например, трибутиламиновую соль ИМР) можно растворять в растворителе. Примеры растворителей включают амиды, такие как ДМФ и диметилацетамид (БМАС); циклические эфиры, такие как диоксан и тетрагидрофуран; кетоны, такие как ацетон; и диметилимидазолидинон, гексаметилфосфортриамид или смеси двух или более из них. Затем к раствору добавляют БРС и необязательно триалкиламин и смесь оставляют реагировать при 10-50°С в течение примерно 30 мин - пяти часов.

Рр1, которые взаимодействуют с ИМРБРР, предпочтительно являются органическими щелочными солями Ррг Примеры солей включают соль гексиламина, соль дибутиламина, соль триэтиламина и соль трибутиламина.

При взаимодействии ИМР-БРР с органической щелочной солью Рр1, органическую щелочную соль Рр1 можно растворять в растворителе. Примеры таких растворителей включают амиды, такие как БМБ, БМАС и формамид; циклические эфиры, такие как диоксан и тетрагидрофуран; кетоны, такие как ацетон; и диметилимидазолидинон, гексаметилфосфортриамид, диметилсульфоксид, ацетонитрил или смеси двух или более из них. Затем раствор добавляют к раствору синтезированного таким образом ИМР-БРР и смесь оставляют взаимодействовать при 10-50°С в течение примерно 30 мин 5 ч.

Реакцию между ИМР-БРР и органической щелочной солью Рр1 можно осуществлять в присутствии подходящего основания. Примеры оснований включают пиридиновые основания, такие как пиридин, 2,6-лютидин, 2,4-лютидин, α-пиколин, β-пиколин, γ-пиколин, 2,4диметиламинопиридин, α-коллидин, βколлидин и γ-коллидин, причем особенно предпочтителен пиридин. Основной растворитель для реакции также включается в основания, используемые в настоящем изобретении. Концентрация основания конкретно не ограничена. Основание предпочтительно добавляют в количестве 6 эквивалентов или более в расчете на

ИМР, более предпочтительно 18 эквивалентов или более.

ИТР синтезируют в реакционной смеси в результате взаимодействия между ИМР-БРР и органической щелочной солью Ррг Полученные таким образом ИТР и 6СМР вводятся в реакцию в присутствии БРС, синтезируя, таким образом, 6СР4И.

Хотя к реакционной смеси можно добавлять 6СМР сам по себе, 6СМР превращают в 6СМР дифенилфосфат (6СМР-БРР) по способу, аналогичному способу, применяемому в случае ИМР, можно также добавлять 6СМР-БРР.

Реакцию 6СР4И можно осуществлять добавлением к раствору указанного выше синтезированного ИТР БРС, в количестве 1,1 эквивалент или более, и 6СМР или 6СМР-БРР, в количестве 0,5-1,5 эквивалентов в расчете на ИМР, который используют в качестве исходного материала, и смесь оставляют реагировать при 1050°С в течение примерно 30 мин - пяти часов.

Полученный таким образом 6СР4И очищают и кристаллизуют указанным выше способом, получая кристаллы 6СР4И настоящего изобретения.

Примеры

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно с помощью примеров, которые не следует понимать как ограничивающие настоящее изобретение.

Пример 1. Получение кристаллов бСР4Е.4\а.

(1) Способ с использованием БСС.

6СР4И получают обычным способом, как описано в \νϋ 98/34942, используя ИТР, 6СМР и БСС. Реакцию ведут в масштабе 20 ммоль.

Раствор полученного таким образом 6СР4И разбавляют водой, доводя общий объем до 1000 мл, и разбавленный раствор наносят на колонку с анионообменной смолой средней основности (АМВЕВЫТЕ 1ВА-67, продукт Войт & Наак Со.). Элюирование осуществляют, используя последовательно воду, 0,18М водный раствор хлористоводородной кислоты и 0,005М водный раствор хлористоводородной кислоты, содержащий 0,5М хлорида натрия, собирая тем самым фракции, содержащие 6СР4И.

Полученные таким образом фракции 6СР4И (4000 мл) наносят на колонку с активированным древесным углем хроматографического сорта Та1ко Огапи1аг АсОга1сб Сйагсоа1 8ОР, продукт РШаншга С11С1тса1 1пби51пс5. Со., Ь1б.) и 6СР4И элюируют с использованием 0,05 М водного раствора гидроксида натрия (8000 мл).

Полученные таким образом фракции

6СР4И объединяют и концентрируют, получая в результате суспензию. рН суспензии доводят до

6,0. Суспензию перемешивают, при этом постеΊ пенно добавляя к суспензии этанол, и полученную суспензию далее охлаждают до 10°С при перемешивании с осаждением кристаллов кСР4и«4№1. Кристаллы отделяют, получая 8,9 г кристаллов кСР4и«4№1. Выделенные кристаллы сушат при пониженном давлении примерно при 60°С в течение примерно четырех часов, а затем подвергают инструментальному анализу.

(2) Способ с использованием ИРС.

иТр ·3Να (12,8 кг) растворяют в воде (135 л) и полученный раствор наносят на колонку с катионообменной смолой (продукт МйкиЫкЫ С11С1шеа1 Со. ЬЙ.). Раствор, который прошел через колонку, и фракции, элюированные водой, объединяют и для нейтрализации к объединенному раствору постепенно добавляют при перемешивании трибутиламин (ТВА; 13,6 кг). Раствор концентрируют и к раствору добавляют формамид (10 кг). Полученный раствор дегидратируют с помощью кипячения с диоксаном. Затем дегидратированное вещество разбавляют пиридином (11,6 кг), получая пиридиновый раствор ИТР.

В еще один реактор, содержащий метанол (18 л), добавляют 6СМР (7,5 кг). К раствору при перемешивании постепенно добавляют ТВА (4,5 кг), раствор нагревают до 60°С. После того, как ингредиенты растворяются, раствор концентрируют досуха.

Высушенный материал сушат далее в вакууме при 75°С и измельчают. Измельченное вещество (10,3 кг) суспендируют в диметилацетамиде (ИМСА) (16,7 кг), к суспензии добавляют дифенилфосфохлоридат (ИРС) (4,4кг) и смесь перемешивают в течение 10 мин. Затем к смеси добавляют ТВА (10,8 кг) и смесь перемешивают в течение 30 мин, приготавливая раствор бСМР-ИРР.

К полученному таким образом раствору бСМР-ИРР при перемешивании добавляют раствор ИТР, который был приготовлен указанным выше способом. После завершения добавления смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи и реакцию останавливают добавлением деионизированной воды.

К указанной выше смеси добавляют 30% водный раствор гидроксида натрия (31 л). Смесь перемешивают в течение 30 мин и высвободившийся ТВА удаляют после распределения. К водному слою добавляют 6 моль/л раствор хлористоводородной кислоты для доведения тем самым рН до примерно 7. Раствор концентрируют удалением растворителя и к концентрированному раствору добавляют равный объем 95% этанола. Полученную смесь оставляют выстаиваться в течение ночи. Верхний слой смеси, т.е. этанольный слой, удаляют отсасыванием и к полученному липкому осадку добавляют воду, чтобы растворить осадок. Оставшийся растворитель удаляют концентрированием.

Общий объем раствора синтезированного таким образом 6СР4И доводят до 2500 л и рас твор наносят на колонку с анионообменной смолой средней основности (АМВЕВЫТЕ 1ВА97, продукт Войт & Наак Со.). Элюирование осуществляют последовательно водой, 0,1 моль/л водным раствором хлористоводородной кислоты и 0,005 моль/л водным раствором хлористоводородной кислоты, содержащим 0,4 моль/л хлорида натрия, собирая фракции, содержащие 6СР4И.

Полученные таким образом фракции кСР4И (2100 л) наносят на колонку с активированным древесным углем хроматографического сорта (Та1ко Отаийат ΛοΙίναΙοά СатЬои 8ОР, продукт Ейатита С11С1шеа1 11йиЧпс5. Со., ЬЙ.) и кСР4И элюируют с использованием 0,05 моль/л водного раствора гидроксида натрия (1200 л).

Полученные таким образом фракции объединяют и концентрируют.

Величину рН полученного раствора доводят до 7,5, используя 30% водный раствор гидроксида натрия. Раствор перемешивают, при этом постепенно добавляя к раствору 95% этанол, осаждая тем самым кристаллы кСР4и«4№1. Кристаллы отделяют и сушат при 60°С в течение четырех часов, получая 4,2 кг кристаллов кСР4и«4№-1 (содержание воды: 5,9%, выход: 22%).

<Физические свойства кристаллов кСР4и«4№1> Кристаллы бСР4и«4№, полученные по способу (1) или (2) примера 1, и белый порошок кСР4и«4№1 (высушенный вымораживанием продукт), который был получен по способу примера 20 ©О 98/34942, подвергают инструментальному анализу. Физические свойства кристаллов сравнивают с физическими свойствами высушенного вымораживанием продукта.

Инструментальный анализ

1) Анализ чистоты.

Кристаллы бСР4и«4№, полученные по способу (1) и (2) примера 1, и фракции 6СР4И после очистки каждой хроматографией подвергают анализу на чистоту с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Результаты представлены в табл. 1 и

2. Условия высокоэффективной жидкостной хроматографии представлены ниже.

Колонка: ШТАСНЮЕЬ #3013-Ν (продукт НйасЫ Ке18окик1 8ету1се).

Элюент: 10% СН₃СН 0,18М ΝΗιϋΙ, 0,03М КН₂РО₄ и 0,03М К₂НРО₄.

Способ детектирования: УФ детектирование на 262 нм.

Таблица 1 (способ ЭСС)

	дСР4и содержание (%)	иТР содержание (%)
Реакционная смесь	55,0	28,6
После 1Е* хроматографии	(-)	(-)
После АС* хроматографии	97,4	0,4
После кристаллизации	98,3	0,4

(-): не измерялось, *): 1Е: ионообмен, АС:

активированный древесный уголь

Таблица 2 (способ ЭРС)

	содержание НСР4и (%)	содержание иТР (%)
Реакционная смесь	(-)	(-)
После ΙΕ* хроматографии	68,6	27,2
После АС* хроматографии	92,8	1,5
После кристаллизации	98,3	0,3

(-): не измерялось, *) : ΙΕ: ионообмен, АС: активированный древесный уголь

2) Форма кристаллов.

На фиг. 1 представлена фотография типичной кристаллической формы кристаллов йСР4и«4№1 (3,5-гидрат).

3) Содержание воды.

Содержание воды в кристаллах 0СР4и«4№1 определяют по методу Карла Фишера. Обнаружено, что кристаллы йСР4и«4Ыа стабилизируются при содержании воды от 6,9 до 17,4 вес%, которое варьирует в зависимости от степени сушки. Результаты расчетов показывают, что 3,5-10 молекул воды связаны с одной молекулой ЙСР4И или прилипают к ней.

4) Точка плавления.

Точку плавления кристаллов йСР4и«4Ыа измеряют обычным способом. Найдено, что точка плавления составляет 202-210°С. Точка плавления высушенного вымораживанием продукта составляет около 195-210°С.

5) Дифракция рентгеновских лучей.

Кристаллы йСР4и«4Ыа подвергают дифракции рентгеновских лучей с использованием прибора для изучения дифракции рентгеновских лучей (Модель: ΚΙΝΤ 2500У, продукт Ктдаки ΩοηΚί) в следующих условиях (погрешность измерения: ±0,1°). Полученный таким образом дифракционный спектр рентгеновских лучей и значения для пиков 3,5-гидрата ЙСР4И«4№ представлены на фиг.2 и в табл. 3, соответственно. Аналогично, дифракционный спектр рентгеновских лучей и значения пиков декагидрата 0С.’Р4и«4№-1 представлены на фиг. 3 ив табл. 4, соответственно. Кроме того, для сравнения на фиг. 4 представлен дифракционный спектр рентгеновских лучей продукта, высушенного вымораживанием.

(Условия измерения)

Рентгеновская трубка: Си-Ка;

Напряжение на трубке и сила тока: 50 кУ300 тА;

Скорость сканирования: 4,0° в мин;

Шаг сканирования: 0,02°;

Интервал измерения углов: 2-40°; Щель: Ό8-0,5°, К.8-0,15 мм, 88-0,5°;

Предварительная подготовка: измельчение в агатовой ступке.

Табл. 3 Кристаллический 3,5 гидрат дСР4и*4^

Пик Νο.	2θ (°)	Относительная интенсивность
1	6,18	39
2	8,82	38
3	11,50	27
4	12,32	79
5	13,76	39
6	14,44	83

8	16,34	29
9	16,84	34
10	17,68	100
11	19,02	81
12	19,72	36
13	20,86	35
14	22,28	78
15	23,54	47
16	25,04	43

Табл. 4. Кристаллический декагидрат дСР4и*4^

Пик Νο.	2θ (°)	Относительная интенсивность
1	5,58	28
2	11,34	62
3	11,94	34
4	12,92	27
5	14,08	49
6	14,96	66
7	15,60	49
8	16,62	25
9	17,08	46
10	18,28	27
11	18,90	28
12	20,20	39
13	21,66	72
14	22,02	100
15	23,02	90

6) Гигроскопичность.

Кристаллы декагидрата 0СР4и«№1 с содержанием воды примерно 17,4% оставляют выстаиваться в течение двух дней в следующих условиях: а), Ь) и с): а) 25°С и относительная влажность 57%; Ь) 25°С и относительная влажность 75%; и с) 25°С и относительная влажность 93%. Во всех трех случаях не наблюдалось ни разложения, ни изменения веса. Кристаллы оказались стабильными и не гигроскопичными. Кроме того, те же самые кристаллы оставляли на семь дней в следующих условиях ά) : ά) 40°С и относительная влажность 75%. И в этом случае не наблюдалось никаких изменений.

Напротив, когда продукт, высушенный вымораживанием (начальное содержание воды: примерно 1%), хранился в течение двух дней в следующих условиях Ь) или с) : Ь) 25°С и относительная влажность 75% и с) 25°С и относительная влажность 93%, на второй день хранения продукт имел грязеподобное состояние вследствие постепенного увеличения содержания воды.

7) Стабильность.

Кристаллы 0СР4и«4№-1 (декагидрат) и высушенный вымораживанием продукт помещали по отдельности в пузырьки, которые затем герметизировали и хранили в течение 13 дней при 60°С (ускоренный тест). Никакого разложения кристаллов не наблюдалось. Напротив, было обнаружено, что высушенный вымораживанием продукт частично разлагался, что подтверждалось данными потери чистоты приблизительно на 2,2%.

8) ЯМР.

Каждый из кристаллов ЙСР4И«4№ и высушенный вымораживанием продукт загружают непосредственно в сделанный из двуокиси цир11 кония ротор и измеряют соответствующий ¹³ССРМА8-ЯМР спектр.

Условия измерения представлены ниже: ¹³С-СРМЛ8-ЯМР

1) Прибор: СМХ-300 (продукт Сйетадие!1С8);

2) Способ измерения: СРМЛ8 (с подавлением боковых сигналов);

3) Температура при измерении: комнатная температура;

4) Наблюдаемые ядра: ¹³С;

5) Частота наблюдения: 75,502 МГц;

6) Ширина импульсов возбуждения протонов: 4,5 мкс;

7) Время контакта: 0,5 мс;

8) Диапазон измерений: 30,03 кГц;

9) Точки измерения: 2048;

10) Точки: 16384;

11) Время повторов: 15,0 с (фиг. 6 и 7)

60,0 с (фиг. 5);

12) Стандарт химического сдвига: гексаметилбензол (внешний стандарт 17,35 м.д.)

13) Скорость вращения образца: 5 кГц;

14) Интегрирование: 256 раз;

На фиг. 5 и в табл. 5 представлены ¹³ССРМА8-ЯМР спектр кристаллического 3,5гидрата бСР4и«4Иа и значения пиков, соответственно. На фиг. 6 и в таблице 6 представлены ¹³С-СРМА8-ЯМР спектр кристаллического декагидрата бСР4и«4Иа и значения пиков соответственно. На фиг. 7 и в табл. 7 представлены ¹³С-СРМА8-ЯМР спектр 6СР4И в форме белого порошка (продукт, высушенный вымораживанием) и значения пиков, соответственно. Цифры на фиг. 5-7 относятся к соответствующим номерам пиков в табл. 5-7.

Таблица 5. К	ристаллический 3,5 гидрат дСР4и*4На (м.д.)
(1)166,1	(2)156,2	(3)150,9	(4)141,6
(5)138,4	(6)101,3	(7) 99,2	(8)93,2
(9) 84,9	(10)80,6	(11)76,7	(12)73,1
(13)69,0	(14)67,2	(15)62,2	(16)43,9

Таблица 6. Кристаллический декагидрат дСР4и*4На (м.д.)

(1)167,4	(2)157,8	(3)151,6	(4)139,0
(5)117,9	(6)102,6	(7) 99,3	(8)93,3
(9) 90,1	(10)87,3	(11)80,6	(12)77,2
(13)75,0	(14)73,9	(15)72,0	(16)67,0
(17)63,1	(18)60,4	(19)42,0	(20)40,8

Таблица 7. Белый порошок бСР4и (продукт, высушенный вымораживанием) (м.д.)

(1)166,5	(2)157,4	(3)149,9	(4)140,9
(5)103,0	(6) 99,0	(7) 96,9	(8) 85,9
(9) 73,4	(10)71,7	(11)67,1	(12)42,0
(13)99,3

Пример 2. Синтез 6СР4И из ИМР.

Формамид (2,5 мл) и пиридин (7,6 мл) добавляют к декагидрату триэтиламиновой соли (10 ммоль) пирофосфата (ТЕА-РР1), с последующим перемешиванием полученной смеси. К декагидрату трибутиламиновой соли уридин 5'монофосфата (ИМР-ТВА) (10 ммоль), помещенному в еще один реактор, добавляют ИМАС (3,6 мл), диоксан (3,2 мл) и трибутиламин (3,3 мл) и перемешивают, а затем туда по каплям добавляют ИРС (2,3 мл). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение одного часа, получая ИМР-ИРР, который добавляют к указанному выше дегидратированному раствору ТЕА-Рр1, полученному заранее. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение одного часа, получая ИТР. ИМАС (7,2 мл) добавляют к трибутиламиновой соли 2'дезоксицитидин 5'-монофосфата (ТВА-бСМР) (4,9 г, 10 ммоль), помещенному в другой реактор, получая суспензию, и к суспензии добавляют ИРС (2,2 мл, 1,1 эквивалент). Полученную смесь перемешивают в течение 40 мин и к смеси добавляют трибутиламин (ТВА) (9,5 мл). Перемешивание продолжают еще 20 мин, получая бСМР-ИРР. Полученный таким образом раствор бСМР-ИРР добавляют к раствору указанного выше синтезированного ИТР, полученного заранее, и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 56 ч. Реакцию останавливают добавлением воды и рН реакционной смеси доводят до 11 добавлением 30% водного раствора гидроксида натрия. После удаления растворителя концентрированием, рН доводят до 7,0 добавлением 6 моль/л хлористо-водородной кислоты. Смесь распределяют этилацетатом. Образовавшийся распределением водный слой подвергают ВЭЖХ анализу (272 нм), обнаруживая, что выход при синтезе 6СР4И составил 37,7%.

Промышленная применимость

Как описывалось выше, кристаллы 6СР4И, полученные по способу настоящего изобретения, имеют высокую чистоту и высокую стабильность, а также не гигроскопичны по сравнению с высушенным вымораживанием продуктом и поэтому служат полезным исходным материалом для получения лекарств.

Способ получения 6СР4И настоящего изобретения позволяет использовать недорогой ИМР в качестве исходного материала и обеспечивает высокий выход. Таким образом, процесс является подходящим для крупномасштабного синтеза 6СР4И.

Claims

1. Кристаллы Р¹-(2'-дезоксицитидин 5'-)Р⁴(уридин 5'-)тетрафосфата или его соли.

2. Кристаллы Р¹-(2'-дезоксицитидин 5'-)Р⁴(уридин 5'-)тетрафосфата-4Иа.

3. Кристаллы по п.1 или 2, имеющие чистоту по крайней мере 95%.

4. Кристаллы по п.1 или 2, имеющие чистоту по крайней мере 97% и содержащие 2% или менее уридин 5'-трифосфата.

5. Кристаллы по п.1 или 2, имеющие чистоту по крайней мере 98% и содержащие 1% или менее уридин 5'-трифосфата.

6. Кристаллы по любому из пп.1-5, в которых одной молекулой Р^З'-дезоксицитидин 5'-) Р⁴-(уридин 5'-)тетрафосфата или его соли удерживается от 1 до 14 молекул воды за счет связывания или адгезии.

7. Кристаллы по любому из пп.1-5, в которых одной молекулой Р^З'-дезоксицитидин 5'-) Р⁴-(уридин 5'-)тетрафосфата или его соли удерживается 3,5 молекулы воды за счет связывания или адгезии.

8. Кристаллы по любому из пп.1-5, в которых одной молекулой Р^З'-дезоксицитидин 5'-) Р⁴-(уридин 5'-)тетрафосфата или его соли удерживается 10 молекул воды за счет связывания или адгезии.

9. Способ получения кристаллов по п.1, который включает очистку сырого Р^З'-дезо ксицитидин 5'-)Р⁴-(уридин 5'-)тетрафосфата с помощью анионообменной хроматографии и хроматографии с активированным древесным углем и добавление к полученному раствору очищенного Р^З'-дезоксицитидин 5'-)Р⁴-(уридин 5'-)тетрафосфата гидрофильного органического растворителя, вызывая тем самым осаждение Р^З'-дезоксицитидин 5'-)Р⁴-(уридин 5'-) тетрафосфата в форме кристаллов.

10. Способ по п.9, в котором Р^З'-дезоксицитидин 5'-)Р⁴-(уридин 5'-)тетрафосфата (с1СР4и)получают взаимодействием уридин 5'монофосфата (Ι3ΜΡ), 2'-дезоксицитидин 5'монофосфата (с1СМР), дифенилфосфорохлоридата (ЭРС) и пирофосфата (ΡΡί).