CZ20014502A3

CZ20014502A3 - Krystalická forma p1-(2'-deoxycytidin-5'-)p4-(uridin-5'-)tetrafosfátu

Info

Publication number: CZ20014502A3
Application number: CZ20014502A
Authority: CZ
Inventors: Kenya Mori; Takanori Miyashita; Hideaki Maeda; Hiroshi Sato; Yutaka Noda
Original assignee: Yamasa Corporation
Priority date: 1999-06-30
Filing date: 2000-06-30
Publication date: 2002-05-15
Also published as: DE60006814T2; EP1191032A4; DE60021629T2; CN1144811C; PL202200B1; CN1359387A; BR0012205A; KR100593723B1; EP1362862A1; EP1191032B1; ZA200110468B; EP1191032A1; US6617444B1; PL202176B1; ES2245431T3; PL352363A1; JP3421666B2; NO20016381D0; AU767136B2; CA2376860A1

Description

Krystalická forma P¹-(2'-deoxycytidin-5'~) P⁴-(uridin-5'-) tetrafosfátu

Oblast techniky

Vynález se týká krystalické formy P¹-(2'-deoxycytidin-5'-) P⁴-(uridin-5'-) tetrafosfátu (dCP4U) nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli (dále pro jednoduchost označovaných jako dCP4U) , který je vhodný jako léčivo pro léčbu chronické bronchitidy, sinusitidy a podobně; způsobu přípravy uvedených krystalů; a účinného způsobu přípravy dCP4U.

- Dosavadní stav techniky

Sloučenina dCP4U znázorněná následujícím vzorcem

nebo její sůl, je selektivním agonistou P2Y2 purinového receptoru a/nebo P2Y4 purinového receptoru, a předpokládá se její použití v léčivých prostředcích pro léčbu chronické bronchitidy, sinusitidy a podobně (viz WO 98/34942).

Dosud nebylo možné připravit dCP4U v krystalické formě, a dCP4U bylo možné připravit pouze ve formě bílého prášku (bílé tuhé hmoty) po sušení vymrazením. Obvyklými způsoby připravené práškovité produkty dCP4U mají nízkou čistotu jako je čistota 82 % (při stanovení metodou HPLC). Zejména je obtížné ···· ··· ·· ···· ·· ···· separovat uridin-5'-trifosfát (UTP), který se používá jako výchozí složka syntézy od dCP4U, a vysoce přečištěný dCP4U je možné připravit pouze velmi obtížně s použitím obvykle používané chromatografie na iontoměničich (WO 98/34942).

Výše uvedený bílý práškovitý produkt nízké čistoty má určité nevýhody jako je hygroskopičnost. Proto se musí příprava léčiva obsahujícího dCP4U provádět v zařízení ve ' kterém je důsledně řízená vlhkost. I po přípravě léčiva musí <, být léčivo v nádobě dobře uzavřené. Navíc, protože takto připravené léčivo má velmi krátkou použitelnost diky nízké stabilitě práškovitého produktu, je žádoucí nalézt způsob přípravy vysoce přečištěné a stabilní formy krystalického dCP4U.

Obvykle se dCP4U se připravuje z 2'-deoxycytidin-5'-monofosfátu (dCMP) a z UTP s použitím aktivačního prostředku jako je dicyklohexylkarbodiimid (DCC). Nicméně obvykle používané způsoby poskytují povážlivě nízké výtěžky syntézy, tj. výtěžky tak nízké jako asi 9 % hmotn. (viz příklad 20 WO 98/34942) a nejsou pro praktická provedení použitelné. Z toho vyplývá, že je rovněž žádoucí vývoj způsobu přípravy dCP4U s vysokým výtěžkem a v průmyslovém měřítku.

Na základě výše uvedených poznatků je cílem vynálezu poskytnout stabilní krystaly dCP4U, ve formě vhodné pro přípravu léčiv. Dalším cílem vynálezu je poskytnout způsob přípravy těchto krystalů. Ještě další cílem vynálezu je poskytnout způsob přípravy dCP4U s vysokou účinností vhodný pro průmyslovou přípravu dCP4U.

Autoři vynálezu provedli intenzivní studie s cílem nalézt stabilní formu ÓCP4U a zjistili, že dCP4U o čistotě 95 % nebo

vyšší lze připravit chromatografií na měniči anionů v kombinaci s chromatografií na aktivním uhlí (chromatografie na aktivním uhlí), a že z takto vysoce přečištěného dCP4U je možné připravit krystaly dCP4U. Bylo zjištěno, že takto připravené krystaly dCP4U mají čistotu významně vyšší než dosud vyráběný dCP4U ve formě prášku, nejsou hygroskopické a mají vysokou stabilitu.

Autoři vynálezu provedli rovněž intenzivní studie způsobů syntézy dCP4U s použitím levného uridin-5'-monof osf átu (UMP) místo drahého UTP, a zjistili, že dCP4U lze připravit účinným způsobem s použitím levného difenylchlorfosfátu (DPC) a pyrofosfátu (PPi). Předložený vynález je založený na podkladě výše uvedených zjištění.

Podstata vynálezu

Vynález poskytuje krystalickou formu dCP4U.

Vynález se rovněž vztahuje na způsob přípravy krystalů dCP4U, kde uvedený způsob zahrnuje přečištění surového dCP4U chromatografií na měniči aniontů a chromatografií na aktivním uhlí, a přídavek hydrofilního organického rozpouštědla k roztoku přečištěného dCP4U, čímž se vysráží dCP4U v krystalické formě.

Vynález rovněž zahrnuje způsob přípravy dCP4U, který zahrnuje reakci UMP, dCMP, DPC a PPi.

Popis obrázků na připojených výkresech

Na obr.l je fotografie krystalu krystalického dCP4U-4Na (3,5-hydrátu). Fotografie je pořízena prostřednictvím • · • · • ·

polarizačního mikroskopu (zvětšení: 440x) přičemž 1 mm na fotografii odpovídá 25 pm.

Obr.2 znázorňuje spektrum rentgenové difrakční analýzy krystalického dCP4U-4Na (3,5-hydrát).

Obr.3 znázorňuje spektrum rentgenové difrakční analýzy krystalického dCP4U-4Na (dekahydrát).

Obr.4 znázorňuje spektrum rentgenové difrakční analýzy dCP4U-4Na ve formě bílého prášku (lyofilizovaný produkt).

Obr.5 znázorňuje ¹³C-CPMAS-NMR spektrum krystalického dCP4U-4Na (3,5-hydrát).

Obr.6 znázorňuje ¹³C-CPMAS-NMR spektrum krystalického dCP4U-4Na (dekahydrát).

Obr.7 znázorňuje ¹³C-CPMAS-NMR spektrum dCP4U-4Na ve formě bílého prášku (lyofilizovaný produkt).

Nejvýhodnější způsob provedení vynálezu

Krystalická forma dCP4U podle vynálezu se připraví přečištěním surového dCP4U specifickými prostředky a k roztoku přečištěného produktu se přidá hydrofilní organické rozpouštědlo čímž dojde k vysrážení dCP4U ve formě krystalů. Vynález je níže popsaný z hlediska přečištění dCP4U (1) a z hlediska krystalizace dCP4U (2).

1) Přečištění dCP4U • ·

0 4000

Přečištění dCP4U lze provést chromatografii na měniči anionů ve spojení s chromatografii na aktivním uhlí. I když uvedené dva způsoby chromatografie lze provést v libovolném pořadí, výhodné je z hlediska zlepšení čistoty dCP4U předřadit chromatografii na měniči anionů -před chromatografii na aktivním uhlí.

Jako pryskyřici pro výměnu anionů ve výše uvedených chromatografických způsobech je možné použít styrenovou nebo akrylovou pryskyřici. Příklady pryskyřic které je možné použít zahrnují silně bazické pryskyřicové měniče anionů jako je AMBERLITE IRA 402 (Rohm & Haas Co.), DIAION PA-312, a DIAION SA-11A (Mitsubishi Chemical Co. Ltd), a slabě bazické pryskyřicové měniče anionů jako je AMBERLITE IRA 67 (Rohm & Haas Co.) a DIAION WA-30 (Mitsubishi Chemical Co. Ltd).

Jako aktivní uhlí je možné použít aktivní uhlí pro chromatografii v rozdrcené formě nebo ve formě tvarovaných částic, přičemž uvedené formy jsou obchodně dostupné (např. produkty firmy Wako Pure Chemical Industries, Ltd., a Futamura Chemical Industries, Co., Ltd.).

Chromatografii je možné provést vsádkovým způsobem s použitím chromatografie na sloupci a podobně. Při chromatografie na sloupci se jako eluční prostředek při chromatografii na měniči anionů může použít vodný roztok kyseliny nebo směsi kyseliny se solí jako je chlorid sodný, která má vyšší iontovou sílu, a vody nebo vodného roztoku alkalického prostředku jako je hydroxid sodný pro sloupcovou chromatografii na aktivním uhlí. K volbě vhodných koncentrací jednotlivých mobilních fází, které jsou v rozmezí 0,001 mol/1 až 10 mol/1 je možné provést předběžnou orientační zkoušku.

2) Krystalizace dCP4U

Krystalizace dCP4U se vyvolá přídavkem hydrofilního organického rozpouštědla k roztoku dCP4U přečištěného výše uvedeným způsobem.

Příklady hydrofilních organických rozpouštědel vhodných k výše uvedenému účelu zahrnují alkoholy o šesti nebo méně atomech atomech uhlíku jako je methanol nebo ethanol; ketony jako aceton; ethery jako dioxan; nitrily jako acetonitril; a amidy jako dimethylformamid. Z uvedených rozpouštědel jsou výhodné alkoholy, zejména ethanol.

Specifičtěji se roztok výše uvedeným způsobem přečištěného dCP4U nebo kaše získaná zahuštěním roztoku případně zpracuje k úpravě pH na 5-10, výhodně na 6-9 a hydrofilní organické rozpouštědlo se přidá k roztoku nebo ke kaši při teplotě 60 °C nebo nižší, výhodně při teplotě 20 °C nebo nižší, čímž se docílí vysrážení rozpuštěné složky ve formě stabilních krystalů dCP4U.

Krystaly získané způsobem podle vynálezu obsahují dCP4U v množství 95 % nebo více a obsah UTP je 3 % nebo méně. Výhodně obsahují krystaly dCP4U 97 % dCP4U nebo více a obsahují 2 % nebo méně UTP. Nejvýhodněji obsahují krystaly dCP4U 98 % dCP4U nebo více a obsahují 1 % nebo méně UTP.

Takto připravené krystaly dCP4U mohou být ve formě soli, hydrátu nebo hydrátové soli. Příklady uvedených solí zahrnují farmaceuticky přijatelné soli jako jsou soli alkalických kovů jako sodné a draselné soli; soli kovů alkalických zemin jako jsou soli vápenaté a horečnaté; a soli amonné. Uvedený dCP4U

4444 ·· 44 44 ·· ··· · · · · · · 4 4 • · · · 44 4 · · φ • ·· · 44 4444 může obsahovat jako substituenty 1-4 atomy kovu a tvořit tak soli.

Výše zmiňovaný hydrát může obsahovat 1-14 molekul vody které jsou navázané nebo vykazují jiný způsob adheze k jedné molekule dCP4U, a výše uvedená hydrátová sůl může obsahovat 1 14 molekul vody které jsou navázané nebo mají jiný způsob adheze k jedné molekule dCP4U ve formě soli alkalického kovu.

Dále, krystaly dCP4U podle vynálezu mohou zahrnovat tautomery dCP4U.

Připravené krystaly dCP4U se pak případně vysuší obvyklými způsoby jako je sušení za sníženého tlaku, sušení v proudu vzduchu, nebo sušení zahříváním a pak se plní do vhodných nádob (jako je např. láhev, vak, plechová nádoba, ampule). Obal může být otevřený, uzavřený, vzduchotěsný nebo zatavený. Obal otevřený venkovní atmosféře není výhodný z hlediska zachování stability krystalů.

Způsob přípravy dCP4U podle vynálezu·zahrnuje reakci UMP dCMP, DPC a PPi.

Specifičtěji vynález zahrnuje reakci UMP s DPV čímž se připraví UMP-difenylfosfát (UMP-DPP); další zpracování reakčn směsi obsahující UMP-DPP s PPi čímž ve směsi vznikne UTP; a reakci vzniklého UTP bez jeho izolace z reakční směsi s dCMP v přítomnosti DPC za vzniku požadovaného produktu.

Při syntéze UMP-DPP z UMP je možné běžným způsobem připravenou trialkylaminovou sůl UMP (např. UMP-tributylamin) rozpustit v rozpouštědle. Příklady těchto rozpouštědel zahrnují amidy jako DMF a dimethylacetamid (DMAC); cyklické ·· ···· ·· ·· *· ·· • · · ···· ···· ···· ·· · ·· · • ···· · to · to······ ·· ···· ·· ···· ethery jako dioxan a tetrahydrofuran; ketony jako aceton; a dimethylimidazolidinon, triamid kyseliny hexamethylfosforečné, nebo směs dvou nebo více uvedených rozpouštědel. Pak se k roztoku přidá DPC a případně trialkylamin a směs se nechá reagovat přibližně 30 minut až pět hodin při teplotě 10-50 °C.

PPi reagující s UMP-DPP jsou výhodně ve formě PPiorganických bazických solí. Příklady uvedených solí zahrnují hexalaminovou sůl, dibutylaminovou sůl, triethylaminovou sůl a tributylaminovou sůl.

Pro reakci syntéze UMP-DPP s PPi-organickou bazickou solí je možné PPi-organickou bazickou sůl rozpustit v rozpouštědle. Příklady těchto rozpouštědel zahrnují amidy jako DMF, DMAC, a formamid; cyklické ethery jako dioxan a tetrahydrofuran; ketony jako aceton; a dimethylimidazolidinon, triamid kyseliny hexamethylfosforečné, dimethylsulfoxid, acetonitril, nebo směs dvou nebo více uvedených rozpouštědel. Pak se získaný roztok přidá k připravenému roztoku UMP-DPP a směs se nechá reagovat přibližně 30 minut až pět hodin při teplotě 10-50 °C.

Reakci mezi UMP-DPP a PPi-organickou bazickou solí je možné provést v přítomnosti vhodně baze. Příklady těchto baží zahrnují pyridinové baze jako je pyridin, 2,6-lutidin, 2,4lutidin, a-pikolin, β-pikolin, y-pikolin,

2,4-dimethylaminopyridin, a-kolidin, β-kolidin, a y-kolidin, přičemž zvláště výhodnou baží je pyridin. Uvedené baze použité pro reakci zahrnují rovněž bazické rozpouštědlo pro uvedenou reakci. Koncentrace baze není konkrétně omezená. Výhodně se baze přidá v množství odpovídající 6 ekvivalentům nebo více vzhledem k UMP, výhodněji v množství 18 ekvivalentů nebo větším.

··«··· ·· ·· ·· ·« • · · ···· ··· ···· ·· · · · • ···· · · · g ·*·· ··· ·· ···· *· ··«·

Při reakci mezi UMP-DPP a PPi-organickou bazickou solí v reakční směsi vzniká UTP. Takto vzniklý UTP a dCMP pak reagují v přítomnosti DPC za tvorby dCP4U.

Ačkoliv dCMP je možné přidat k reakční směsi jako takový, dCMP se převádí na dCMP-difenylfosfát (dCMP-DPP) způsobem podobným jaký je použit v případě UMP, a přidá se jako dCMPDPP.

Reakci vedoucí k dCP4U lze provést přídavkem DPC v množství 1,1 ekvivalentu nebo více k výše připravenému roztoku UTP a rovněž přídavkem dCMP nebo dCMP-DPP v množství asi 0,5-1,5 ekvivalentu vzhledem k výchozí UMP složce a směs se nechá reagovat při 10-50 °C pět hodin.

Takto připravený dCP4U se přečistí a krystalizuje se výše uvedeným způsobem za tvorby krystalů dCP4U podle, vynálezu.

Vynález je níže podrobněji popsaný pomocí příkladů, které však vynález nijak neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava krystalů dCP4U-4Na

1) Způsob s použitím DCC

Příprava dCP4U se provede obvyklým způsobem popsaným ve WO 98/34042 s použitím UTP, dCMP a DCC. Reakce se provede s množstvím 20 mmol.

Β » * » ·VBΒ • Β • ·Ι1

ΒΒ *» • ΒΒΒ Β Β » Β Β • ···· Β *ί ·

Β Β Β Β · «

ΒΒΒ ΒΒΒ ΒΒ ·»··

Β· * » ·Β »

• Β Β · • Β » Β

Připravený roztok dCP4U se zředí vodou přičemž se celkový objem upraví na 1,000 ml a zředěný roztok se nanese na sloupec naplněný středně bazickým pryskyřicovým měničem anionů (AMBERLITE IRA-67, produkt Rohm & Haas Co.). Jako eluční prostředek se postupně použije voda, vodný roztok kyseliny chlorovodíkové 0,18 mol/1, a vodný roztok kyseliny chlorovodíkové 0,005 mol/1 obsahující 0,5 mol/1 chloridu sodného a oddělí se frakce obsahující dCP4U.

Takto získané frakce obsahující dCP4U (4000 ml) se vnesou na kolonu naplněnou aktivním uhlím pro chromatografií (Taiko Granular Activated Charcoal SGP, produkt firmy Futamura Chemical Industries, Co., Ltd.) , a provede se eluce dCP4U s použitím vodného roztoku hydroxidu sodného 0,05 mol/1 (8000 ml) .

Získané frakce dCP4U se spojí a zahustí se na kaši. Hodnota pH kaše se upraví na 6,0. Za míchání se pak ke kaši postupně přidává ethanol a takto zpracovaná kaše se za míchání ochladí na 10 °C čímž dojde k vysrážení krystalů dCP4U-4Na. Krystaly se oddělí a jejich výtěžek jako dCP4U-4Na je 8,9 g. Separované krystaly se vysuší za sníženého tlaku při asi 60 °C po asi čtyřech hodinách a pak se hodnotí metodami instrumentální analýzy.

2) Způsob s použitím DPC

UTP-3Na (12,8 kg) se rozpustí ve vodě (135 1) a získaný roztok se vnese na kolonu plněnou pryskyřicovým měničem kationů (produkt Mitsubishi Chemical Co. Ltd.). Roztok se nechá projít kolonou a frakce eluované vodou se spojí a ke spojeným podílům se za míchání postupně přidá tributylamin (TBA; 13,6 kg) k neutralizaci. Pak se roztok zahustí a přidá • ·

• · · · • · • · · · se k němu formamid (10 kg). Získaný roztok se dehydratuje varem s dioxanem. Potom se takto zpracovaný produkt zředí pyridinem (11,6 kg) a získá se tak roztok UTP v pyridinu.

Do další reakční nádoby obsahující methanol (18 1) se přidá dCMP (7,5 kg). Pak se k roztoku za míchání postupně přidá TBA (4,5 kg) a roztok se zahřeje na 60 °C. Po rozpuštění složek se roztok zahustí do sucha. Takto vysušený produkt se dále vysuší ve vakuu při 75 °C a rozdrtí se. Rozdrcený produkt (10,3 kg) se suspenduje v dimethylacetamidu (DMAC) (16,7 kg), k suspenzi se přidá difenylchlorfosfát (DPC) (4,4 kg) a směs se míchá 10 minut. Potom se ke směsi přidá TBA (10,8 kg) a získaná směs se míchá 30 minut za vzniku roztoku dCMP-DPP.

K takto připravenému roztoku dCMP-DPP se za míchání přidá pyridinový roztok UTP připravený způsobem popsaným výše. Po ukončeném přídavku se směs míchá přes noc při teplotě místnosti a reakce se ukončí přídavkem deionizované vody.

K výše uvedené směsi se přidá 30% vodný roztok hydroxidu sodného (31 1). Získaná směs se míchá 30 minut a uvolněný TBA se po oddělení odstraní. K vodné vrstvě se přidá roztok kyseliny chlorovodíkové 6 mol/1 k úpravě pH roztoku na asi 7. Pak se roztok zahustí odstraněním rozpouštědla a k zahuštěnému roztoku se přidá stejný objem 95% ethanolu. Výsledná směs se ponechá přes noc. Horní vrstva směsi, tj. ethanolová vrstva se odstraní odsátím a ke zbylé lepkavé sraženině se přidá voda k rozpuštění uvedené sraženiny. Zbylé rozpouštědlo se odstraní zahuštěním.

Celkový objem takto připraveného dCP4U se zředí vodou na 2500 1 a roztok se nanese na sloupec naplněný středně bazickým pryskyřicovým měničem anionů (AMBERLITE IRA-67, produkt Rohm &

• · · · ··

Haas Co.). Jako eluční prostředek se postupně použije voda, vodný roztok kyseliny chlorovodíkové 0,1 mol/1, a vodný roztok kyseliny chlorovodíkové 0,005 mol/1 obsahující 0,4 mol/1 chloridu sodného a oddělí se frakce obsahující dCP4U.

Takto získané frakce obsahující dCP4U (2100 1) se vnesou na kolonu naplněnou aktivním uhlím pro chromatografií (Taiko Granular Activated Charcoal SGP, produkt firmy Futamura Chemical Industries, Co., Ltd.), a provede se eluce dCP4U s použitím vodného roztoku hydroxidu sodného 0,05 mol/1 (8000 ml) .

Získané frakce dCP4U se spojí a zahustí se. Hodnota pH roztoku se upraví na 7,5 pomocí 30% vodného roztoku hydroxidu sodného. Za míchání se k roztoku postupně přidává 95% ethanol čímž dojde k vysrážení krystalů dCP4U-4Na. Krystaly se oddělí a suší se při 60 °C čtyři hodiny a jejich výtěžek jako dCP4U-4Na je 4,2 kg. (obsah vody: 5,9 %, výtěžek izolace: 22

Fyzikálně chemické vlastnosti krystalů dCP4U-4Na

Krystaly připravené podle příkladu 1 způsobem (1) nebo způsobem (2) a dCP4U-4Na ve formě bílého prášku (lyófilizovaný produkt) který byl připraven způsobem popsaným v příkladu 20 WO 98/34942 byly hodnocené metodami instrumentální analýzy. Připravené krystaly byly porovnané s lyofilizovaným produktem z hlediska jejich fyzikálních vlastností.

3) Instrumentální analýza

1. Analýza čistoty ··· · • · ·

Krystaly dCP4U-4Na připravené způsobem (1) a způsobem (2) podle příkladu 1 a frakce obsahující dCP4U získané v obou chromatografických způsobech čištění byly hodnocené zkouškou na čistotu pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatrogafie. Výsledky jsou uvedené v tabulce 1 a 2. Podmínky provedení vysokoúčinné kapalinové chromatografie jsou popsané níže:

kolona: Hitachigel #3013-N (výrobce Hitachi Keisokuki Service);

mobilní fáze: 10% CH₃CN, NH₄C1 0,18 mol/1, KH₂PO₄ 0,03 mol/1 a K₂HPO₄ 0,03 mol/1;

detekce: UV při 262 nm.

Tabulka 1 (DCC způsob)

	obsah dCP4U (%)	obsah UTP (%)
reakční směs	55,0 \ .	28,6
po IE* chromatografií	(-)	(-)
po AC* chromatografií	97,4	0,4
po krystalizaci	98,3	0,4

(-): neprovedeno

*): IE: na měniči iontů; AC: na aktivním uhlí

Tabulka 2 (DPC způsob)

	obsah dCP4U (%)	obsah UTP (%)
reakční směs	(-)	(-)
po IE* chromatografií	68,6	27,2
po AC* chromatografií	92,8	1,5
po krystalizaci	98,3	0, 3

9 9« »·9· 9 9«

9999 (-): neprovedeno

*): ΙΕ: na měniči iontů; AC: na aktivním uhlí

2. Krystalová forma

Typická krystalová forma krystalů dCP4U-4Na (3,5 hydrát) je na fotografii na obr.l.

3. Obsah vody

Obsah vody v krystalech dCP4U-4Na byl stanoven způsobem podle Karl Fischera. Bylo zjištěno, že krystaly dCP4U-4Na jsou stabilní při obsahu vody od 6,9 do 17,4 % hmotn., který je závislý na stupni vysušení. Z výpočtů vyplývá, že na jedné molekule dCP4U je navázaných nebo jiným způsobem adheze připojených 3,5-10 molekul vody.

4. Teplota tání

Teplota tání krystalů dCP4U-4Na byla zjištěna obvyklým způsobem. Byla zjištěná teplota tání 202-210 °C. Teplota tání lyofilizovaného produktu je asi 195-210 °C,

5. Rentgenová difrakce

Rentgenová difrakční analýza krystalů dCP4U-4Na byla provedená na přístroji pro rentgenografickou difrakční analýzu (typ: RINT2500V, firmy Rigaku Denki) za níže uvedených podmínek (chyba měření: ± 0,1°). Získané rentgenové difrakční spektrum a hodnoty píků dCP4U-4Na 3,5 hydrátu jsou znázorněné na obr.2 a v tabulce 3. Podobně rentgenové difrakční spektrum a hodnoty píků dCP4U-4Na dekahydrátu jsou znázorněné na obr.3 • · • · ·<

a v tabulce 4. Navíc je pro srovnání na obr.4 znázorněné rentgenové difrakční spektrum lyofilizovaného produktu.

Podmínky stanovení:

zdroj rentgenové záření: Cu-Ka výstup rentgenového záření: 50 kV-300 mA rychlost snímání: 4,0°/min interval snímání: 0,02° rozmezí měřených úhlů: 2-40° štěrbina: DS-0,5°, RS-0,15 mm, SS-0,5° příprava vzorku k analýze: rozemletí v achátové misce

Tabulka 3

Krystalický dCP4U-4Na 3,5 hydrát

pík č.	2Θ (°)	relativní intenzita
1	6, 18	39
2	8,82	38
3	11,50	27
4	12,32	79
5	13,76	39
6	14,44	⁸³
8	16,34	29
9	16, 84	34
10	17,68	100
11	19,02	81
12	19, 72	36
13	20,86	35

• 9 • · ·· • ·· · · ·* ·· · ·

Tabulka 3 (pokračování)

pík č.	20 (°)	relativní intenzita
14	22,28	78
15	23,54	47
16	25,04	43

Tabulka 4

Krystalický dCP4U-4Na dekahydrát

pík č.	20 (°)	relativní intenzita
1	5,58	28
2	11,34	62
3	11, 94	34
4	12,92	27
5	14,08	49
6	14, 96	66
7	15,60	49
8	16, 62	25
9	17,08	46
10	18,28	27
11	18,90	28
12	20,20	39
13	21, 66	72
14	22,02	100
15	23,02	90

6. Hygroskopičnost ··

4« · · · · · · ♦ · · • · · · · • · 9 · • * * ······ ·*

Krystaly dCP4U-4Na (dekahydrát) o obsahu vody asi 17,4 % se ponechají dva dny za následujících podmínek (a), (b) a (c)

a) 25 °C a relativní vlhkost 57 %; b) 25 °C a relativní vlhkost 75 %; a c) 25 ^QC a relativní vlhkost 93 %. V žádné skupině pokusných podmínek nebyl pozorován rozklad nebo změny hmotnosti. Krystaly se projevily jako stabilní a nevykazující hygroskopičnost. Kromě toho byly uvedené krystaly ponechány několik dní v následujících ztížených podmínkách (d): d) 40 ⁰a relativní vlhkost 75 %. Ani v tomto případě nebyly zjištěné žádné změny.

Na rozdíl od výše uvedeného, lyofilizovaný produkt (počáteční obsah vody : asi 1 %) který byl uchováván dva dny za následujících pdmínek (b) nebo (c); b) 25 °C a relativní vlhkost 93 % a c) 25 °C a relativní vlhkost 93 %, změnil vzhled až na formu kalu postupným zvyšováním obsahu vody.

7. Stabilita

Krystaly dCP4U-4Na (dekahydrát) a lyofilizovaný produkt byly každý samostatně umístěné do lahví, které se dokonale uzavřely a byly pak uchovávané 13 dní při 60 °C (zrychlený test). U krystalické formy nebyl zjištěn žádný rozklad. Na rozdíl od krystalické formy, u lyofilizovaného produktu byl zjištěn částečný rozklad, prokázaný ztrátou čistoty produktu hodnoty asi 2,2 %.

. NMR

Krystaly dCP4U-4Na a lyofilizovaný produkt se samostatně vnesou do rotující kyvety ze zirkonu a změří se ¹³C-CPMAS-NMR spektra.

a · ¹³c-cpmas-nmr

1)	Přístroj	CMX-300 (firmy
		Chemagnetics)
2)	Způsob měření	CPMAS (s potlačením
		vedlejších signálů)
3)	Teplota měření	teplota místnosti
4)	Pozorované jádro	¹³C
5)	Použitá frekvence	75,502 MHz
6)	Šířka pulzu excitace protonu 4,5 ps
7)	Doba kontaktu	0,5 ms
8)	Šířka měření	30,03 kHz
9)	Počet bodů měření	2048
10)	Soubor bodů	16384
11)	Repetiční čas	15,0 s (obr.6 a 7 )
		60,0 s (obr.5)
12)	Standard pro chemický	hexamethylbenzen (vnější
	posun	standard 17,35 ppm)
13)	Rychlost rotace vzorku	5 kHz
14)	Integrace	256 x
¹³c-	-CPMAS-NMR spektrum krystalického dCP4U-4Na 3,5 hydrátu
a hodnoty týkající se plků jsou	uvedené na obr.5 a v tabulce
5. ¹³C-CPMAS-NMR spektrum krystalického dCP4U-4Na 3,5
dekahydrátu a hodnoty týkající	se píků jsou uvedené na obr.6 a
v tabulce 6. ¹³C-CPMAS-NMR spektrum dCP4U-4Na ve formě bílého
prášku i	I lyofilizovaný produkt)	a hodnoty týkající se píků jsou
uvedené	na obr.7 a v tabulce 7.	Čísla na obr.5 až 7 odpovídají

číslům plků v tabulkách 5 až 7.

·· • · ··· I ·· • · A · · A • A · «

A A · · A

A A · ·

Aa·· ·· ····

Tabulka 5

Krystalický dCP4U-4Na 3,5 hydrát (ppm)

(1) 166,1	(2) 156,2	(3) 150,9	(4) 141,6
(5) 138,4	(6) 101,3	(7) 99,2	(8) 93,2
(9) 84,9	(10) 80,6	(11) 76,7	(12) 73,1
(13) 69,0	(14) 67,2	(15) 62,2	(16) 43,9

Tabulka 6

Krystalický dCP4U-4Na dekahydrát (ppm)

(1) 166,1	(2) 157,8	(3) 151,6	(4) 139,0
(5) 117,9	(6) 102,6	(7) 99,3	(8) 93,3
(9) 90,1	(10) 87,3	(11) 80,6	(12) 77,2
(13) 75,0	(14) 73,9	(15) 72,0	(16) 67,0
(17) 63,1	(18) 60,4	(19) 42,0	(20) 40,8

Tabulka 7 dCP4U'4Na ve formě bílého prášku (lyofilizovaný produkt) (ppm)

(1) 166,5	(2) 157,4	(3) 149,9	(4) 140,9
(5) 103,0	(6) 99,0	(7) 96,9	(8) 85,9
(9) 73,4	(10) 71,7	(11) 67,1	(12) 42,0
(13) 39,3

Příklad 2

Příprava dCP4U z UMP

K dehydratované triethylaminové soli (10 mmol) pyrofosfátu (TEA-PPi) se přidá formamid (2,5 ml) a pyridin (7,6 ml) a získána směs se zpracuje mícháním. V další nádobce se k dehydratované tributylaminové soli uridin-5'-monofosfátu • · • 0 · 4 • « 0 « »·· 4 0·· ·· ···· • · · «44 ·* ···· (UMP-TBA) (10 mmol) přidá DMAC (3,6 ml), dioxan (3,2 ml) a tributylamin (3,3 ml), směs se míchá a po kapkách se k ní přidá DPC (2,3 ml). Směs se pak míchá jednu hodinu při teplotě místnosti čímž vznikne UMP-DPP, a přidá se k výše uvedenému roztoku TEA-PPi připravenému předem. Reakční směs se pak míchá jednu hodinu při teplotě místnosti a připraví se tak UTP.

V další nádobce se k tributylaminové soli 2'-deoxycytidin-5'monofosfátu (TBA-dCMP) (4,9 g, 10 mmol) přidá DMAC (7,2 ml) za tvorby suspenze, ke které se pak přidá DPC (2,2 ml, 1,1 ekvivalentu). Získaná suspenze se míchá 40 minut a pak se k ní přidá tributylamin (TBA)(9,5 ml). Po 20 minutách míchání je nosič oddělen a získá se tak dCMP-DPP. K takto připravenému roztoku se přidá výše již předem připravený roztok UTP a směs se míchá při teplotě místností 56 hodin. Reakce se ukončí přídavkem vody a pH reakční směsi se upraví na 11 přídavkem 30% vodného roztoku hydroxidu sodného. Pak se rozpouštědlo odstraní zahuštěním ve vakuu a pH se upraví na 7,0 přídavkem kyseliny chlorovodíkové 6 mol/1. Směs se pracuje rozdělením s ethyl-acetátem. Vodná vrstva vzniklá po rozdělení se pak podrobí analýze metodou HPLC (272 nm), která prokazuje výtěžek syntézy dCP4U 37,7 %.

Průmyslová využitelnost

Jak je popsané výše, krystalická forma dCP4U připravená způsobem podle vynálezu má ve srovnání s lyofilizovaným produktem vysokou čistotu a vysokou stabilitu a není hygroskopická, a je proto vhodná jako surovina pro přípravu léčiva.

Způsob přípravy dCP4U podle vynálezu umožňuje použití levného UMP jako vstupní suroviny s dosažením vysokého * · '· ···· ··· výtěžku. Způsob podle vynálezu je proto vhodný pro přípravu dCP4U v průmyslovém měřítku.

Claims

1. Krystalická forma P¹-(2'-deoxycytidin-5'-) P⁴-(uridin-5'-) tetrafosfátu nebo jeho soli.

2. Krystalická forma P¹-(2'-deoxycytidin-5'-)P⁴-(uridin-5'-) tet raf osf átu · 4Na .

3. Krystalické formy sloučenin podle nároku 1 nebo nároku 2 mající čistotu nejméně 95 %.

4. Krystalické formy sloučenin podle nároku 1 nebo nároku 2 mající čistotu nejméně 97 % a obsahující 2 % nebo méně uridin-5'-trif osf átu .

5. Krystalické formy sloučenin podle nároku 1 nebo nároku 2 mající čistotu nejméně 98 % a obsahující 1 % nebo méně uridin-5'-trif osf átu.

6. Způsob přípravy krystalických forem podle nároku 1 vyznačující se tím, že uvedený způsob zahrnuje přečištění surového P¹-(2'-deoxycytidin-5'-) P⁴-(uridin-5'-)tetrafosfátu chromatografií na měniči anionů a chromatografií na aktivním uhlí, a přídavek hydrofilního organického rozpouštědla k získanému roztoku přečištěného P¹- (2'-deoxycytidin-5'-) P⁴-(uridin-5'-) tetrafosfátu čímž se vyvolá srážení P¹-(2'-deoxycytidin-5'-) P⁴-(uridin-5'-) tetrafosfátu ve formě krystalů.

23 ······· ·· ···· ·· ····

7. Způsob podle nároku 6vyznačující se tím, že v procesu přečištění se nejprve provede chromatografie na měniči anionů a potom chromatografie na aktivním uhlí.

8. Způsob přípravy P¹-(2'-deoxycytidin-5'-)P⁴-(uridin-5'-) tet raf osf átu (dCP4U) vyznačující se tím, že zahrnuje reakci uridin-5'-monof osf átu (UMP) , 2'-deoxycytidin-5'-monofosfátu (dCMP), difenylchlorfosfátu (DPC), a pyrofosfátu' (PPi).

9. Způsob přípravy podle nároku 8vyznačující se tím, že v prvním stupni zahrnuje reakci UMP a DMC kterou se připraví UMP-difenylfosfát; potom další zpracování reakční směsi obsahující UMP-DPP s PPi čímž v reakční směsi vznikne uridin-5'-trifosfát (UTP); a reakci takto připraveného UTP bez jeho izolace z reakční směsi s dCMP v přítomnosti DPC čímž se připraví dCP4U.

10. Krystalické formy sloučenin podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, kde jedna molekula P¹-(2'-deoxycytidin-5'-) P⁴-(uridin-5'-)tetrafosfátu nebo její soli váže nebo adhezně váže 1 až 14 molekul vody.

11. Krystalické formy sloučenin podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, kde jedna molekula P¹-(2'-deoxycytidin-5'-)P⁴-(uridin-5'-) tetrafosfátu nebo její soli váže nebo adhezně váže 3,5 molekuly vody.

12. Krystalické formy sloučenin podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, kde jedna molekula P¹-(2'-deoxycytidin-5'-) P⁴-(uridin9 ·

9 · · ·

99 9999

9 9

9 9 9··9

-5'-) tetraf osfátu nebo její soli váže nebo adhezně váže 10 molekul vody.