CN1144811C - 二核苷酸结晶 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及P1-(2’-脱氧胞苷5’-)P4-(尿苷5’-)-四磷酸酯(dCP4U)或其盐的结晶和制备所述结晶的方法。本发明还提供一种制备dCP4U的方法，该方法包括使尿苷5’-一磷酸酯(UMP)、2’-脱氧胞苷5’-一磷酸酯(dCMP)、二苯基磷酰氯(DPC)和焦磷酸盐(Ppi)反应。通过本发明的方法获得的dCP4U的结晶与冻干产物相比具有高纯度和高稳定性并且没有吸湿性，由此在制备药物中用作有效的原材料。按照本发明的制备dCP4U的方法有效使用低廉的UMP作为原料并且提供高收率。所以，所述方法适合dCP4U的大规模合成。
Description
发明领域
本发明涉及P1-(2’-脱氧胞苷5’-)P4-(尿苷5’-)四磷酸酯(dCP4U)或其药学可接受盐(此后可以简单称为“dCP4U”)，其适于作为慢性支气管炎、鼻窦炎等的治疗剂；本发明涉及制备所述结晶的方法；并且涉及有效制备dCP4U的方法。
背景技术
由下式(I)表示的dCP4U：
或其盐是对P2Y2嘌呤受体和/或P2Y4嘌呤受体的选择性激动剂，而且是一种预期开发为慢性支气管炎、鼻窦炎等的治疗剂的化合物(参见WO 98/34942)。
迄今为止，还无法获得结晶形式的dCP4U，并且dCP4U只能够以白色粉末(白色固体)的形式经过冷冻干燥制得。常规获得的dCP4U的粉状产物具有82％的低纯度(通过HPLC测定)。特别是，难以把dCP4U与作为起始原料的尿苷5’-三磷酸(UTP)分开，而且只有通过惯用的离子交换色谱才能够制备高纯dCP4U，但这非常困难(WO98/34942)。
上述低醇的白色粉末具有如吸湿性的缺点。所以，由dCP4U起始的药物制备必须在其湿度被严格控制的专用设备中进行。甚至在药物的制备之后，产品必须密封包装。此外，由于粉状产物的稳定性差导致药物具有非常短的有效期，人们期望获得高纯度和稳定的dCP4U结晶。
dCP4U是由2’-脱氧胞苷5’-一磷酸(dCMP)和UTP通过活化剂如二环己基碳二亚胺(DCC)的使用来合成。然而，常规方法提供的合成收率非常低；即低达约9％(重量)(参见WO 98/24942的实施例20)，并且可能永远不能作为实用方法。因此，人们还希望开发出可以高收率和大规模制备dCP4U的方法。
鉴于述观点，本发明的目的在于提供稳定的dCP4U结晶，其适合用来制备药物。本发明的另一目的在于提供制备所述结晶的方法。本发明的再一目的是提供适合大规模dCP4U生产的高效方法。
发明内容
本发明人在dCP4U的稳定化方面业已作了大量的研究，并且发现可以通过阴离子交换色谱与使用活性炭的色谱(活性炭色谱)联合可以制备纯度等于或高于95％的dCP4U，并且可以由上述高纯度dCP4U得到dCP4U结晶。已经证实由此制得的dCP4U结晶具有的纯度明显高于常规所制dCP4U粉末的纯度，没有吸湿性并且稳定性高。
本发明人在通过使用低廉的尿苷5’-一磷酸(UMP)代替昂贵的UTP合成dCP4U的方法上也作了大量研究，并且已经发现通过二苯基磷酰氯(DPC)和焦磷酸盐(PPi)的使用可以有效制备dCP4U。本发明在这些发现的基础上完成。
所以，本发明提供dCP4U的结晶。
本发明还提供一种用于制备dCP4U的结晶的方法，该方法包括通过阴离子交换色谱和活性炭色谱来纯化dCP4U粗品，并且在提纯的dCP4U溶液中加入亲水性有机溶剂，由此沉淀出结晶形式的dCP4U。
本发明还提供一种制备dCP4U的方法，其包括使UMP、dCMP、DPC和PPi反应。
附图简述
图1是表示结晶dCP4U·4Na(3.5-水合物)的晶形的相片。该相片是在偏光显微镜(放大率：x440)下拍摄，其中图像中的1mm对应于25μm。
图2表示结晶dCP4U·4Na(3.5-水合物)的X射线衍射光谱。
图3表示dCP4U·4Na(十水合物)的X射线衍射光谱。
图4表示白色粉状dCP4U(冷冻干燥产物)的X射线衍射光谱。
图5表示结晶dCP4U·4Na(3.5-水合物)的13C-CPMAS-NMR光谱。
图6表示dCP4U·4Na(十水合物)的13C-CPMAS-NMR光谱。
图7表示白色粉状dCP4U(冷冻干燥产物)的13C-CPMAS-NMR光谱。
实施本发明的最佳方式
通过特定方法的采用经过纯化dCP4U粗品，并且向提纯的dCP4U溶液中加入亲水性有机溶剂，由此沉淀出dCP4U结晶，可以获得本发明的dCP4U的结晶。本发明下面将在(1)dCP4U的纯化和(2)dCP4U的结晶中加以描述。
(1)dCP4U的纯化
dCP4U可以通过与活性炭色谱联用的阴离子交换色谱来纯化。虽然这两种色谱技术可以以任意顺序进行，但优选阴离子交换色谱先于活性炭色谱，这是从提高dCP4U的纯度来考虑。
苯乙烯或丙烯酸树脂可以在实施色谱技术中作为阴离子交换树脂使用。可以使用的树脂的实例包括强碱型阴离子交换树脂如AMBERLITE IRA 402(Rohm & Hass Co.)、DIAION PA-312和DIAIONSA-11A(Mitsubishi Chemical Co.Ltd.)，和弱碱型阴离子交换树脂如AMBERLITE IRA 67(Rohm & Hass Co.)和DIAION WA-30(Mitsubishi Chemical Co.Ltd.)。
活性炭可以是色谱级活性炭，其被压碎或成形为颗粒，并且可以包括市售产品(例如Wako Pure Chemical Industries，Ltd.和Futamura Chemical Industries，Co.，Ltd.的那些产品)。
色谱可以以分批的方式、通过柱的使用等进行。当进行柱色谱时，酸性水溶液或其与具有提高离子强度的盐(如氯化钠)的混合物可以用作阴离子交换色谱的洗脱剂；并且水或碱(如氢氧化钠)的水溶液可以用作活性炭柱色谱的洗脱剂。利用进行小规模的预备试验以便选择各洗脱剂在0.001至10M范围内的适当浓度。(2)dCP4U的结晶
通过在含有由此纯化的dCP4U的溶液中加入亲水性有机溶剂可以结晶出dCP4U。
可以使用的亲水性有机溶剂的实例包括含有等于或小于6个碳原子的醇，如甲醇和乙醇；酮类，如丙酮；醚类，如二噁烷；腈类，如乙腈；和酰胺，如二甲基甲酰胺。其中，特别优选醇类化合物，尤其是乙醇。
更加具体地说，由此纯化的dCP4U的溶液，或经溶液浓缩获得的浆液，可以选择性地处理以调整pH至5-10，优选6-9；并且在60℃或更低温度下，优选在等于或低于20℃的温度下，向上述溶液或浆液中加入亲水性有机溶剂，由此沉淀出溶质，其为dCP4U的稳定结晶。
本发明的由此制得的dCP4U结晶含有等于或高于95％的dCP4U和等于或小于3％的UTP。更加可取地，dCP4U结晶含有等于或高于97％的dCP4U，和等于或小于2％的UTP。更加优选地，dCP4U结晶含有等于或高于98％的dCP4U，和等于或小于1％的UTP。
如此高纯度dCP4U结晶可以是盐、水合物或水合物盐的形式。所述盐的实例包括药学可接受盐，例如碱金属盐，如钠盐和钾盐；碱土金属盐，如钙盐和镁盐；和铵盐。所述的dCP4U可以被1-4个金属原子取代形成盐。
上述水合物可以含有1-14个分子的水，这些水键合或附着在dCP4U的一个分子上；并且上述水合物盐可以含有1-14个分子的水，这些水结合或附着于dCP4U的碱金属盐的一个分子上。
此外，按照本发明dCP4U的结晶还可以包括其互变异构体。
由此制得的dCP4U结晶选择性地经过常规方法干燥，如减压下干燥、空气流下干燥，或通过加热干燥，并且随后被置于容器(例如瓶、袋、罐、安瓿)内。完成包装在容器中，容器可以是敞开、封闭、气密或熔封的。从维持结晶的储藏稳定性的角度考虑，敞开在空气中包装是不可取的。
按照本发明制备dCP4U的方法包括UMP、dCMP、DPC和PPi反应。
具体地说，该方法包括UMP与DPC反应，由此合成UMP二苯基磷酸酯(UMP-DPP)；含UMP-DPP的反应混合物进一步用PPi处理，由此在混合物中形成UTP；和，无需从反应混合物中分离，由此生成的UTP与dCMP在DPC的存在下反应，由此生成目标dCP4U。
在由UMP合成UMP-DPP中，可以将常规制得的UMP三烷基胺盐(例如UMP三丁基胺盐)溶于溶剂中。所述溶剂的实例包括酰胺类，如DMF和二甲基乙酰胺(DMAC)；环醚类，如二噁烷和四氢呋喃；酮类，例如丙酮；和二甲基咪唑啉酮、六甲基磷三酰胺；或两种或多种这些溶剂的混合物。所以，将DPC和任选的三烷基胺加入到溶液中，令该混合物在10-50℃下反应约30分钟至5小时。
与UMP-DPP反应的PPi优选是PPi-有机碱盐。所述盐的实例包括己基胺盐、二丁基胺盐、三乙胺盐和三丁基胺盐。
在UMP-DPP与PPi-有机碱盐的反应中，PPi-有机碱盐可以溶于溶剂中。所述溶剂的实例包括酰胺，如DMF、DMAC和甲酰胺；环醚类，如二噁烷和四氢呋喃；酮类，如丙酮；和二甲基咪唑啉酮、六甲基磷三酰胺、二甲基亚砜、乙腈；或两种或多种这些溶剂的混合物。所以，将溶液加入由此合成的UMP-DPP溶液中，并且令该混合物在10-50℃下反应约30分钟至5小时。
UMP-DPP与PPi-有机碱盐之间的反应可以在适当碱的存在下进行。所述碱的实例包括吡啶碱类，如吡啶、2，6-二甲基吡啶、2，4-二甲基吡啶、α-甲基吡啶、β-甲基吡啶、γ-甲基吡啶、2，4-二甲基氨基吡啶、α-可力丁、β-可力丁和γ-可力丁，其中特别优选吡啶。反应的碱性溶剂也属于本发明所用的碱。碱的浓度没有特别规定。优选碱以基于UMP计等于或大于6当量、优选等于或大于18当量的量加入。
经过UMP-FPP和PPi-有机碱盐之间的反应，反应混合物中合成了UTP。由此生成的UTP在DPC的存在下与dCMP反应，由此合成dCP4U。
虽然dCMP本身可以加在反应混合物中，但dCMP可以以和采用UMP情况中的相似方式转化为dCMP二苯基磷酸酯(dCMP-DPP)；而且也可以加入dCMP-DPP。
dCP4U的反应可以通过向上述合成的UTP溶液中加入基于用作起始原料的UMP计等于或大于1.1当量的DPC和0.5-1.5当量的dCMP或dCMP-DPP来进行，并且令混合物在10-50℃下反应约30分钟-5小时。
由此所得的dCP4U按照上述方式纯化和结晶，从而得到本发明的dCP4U结晶。
实施例
本发明下面将通过实施例更加详细地加以说明，但实施例不对本发明构成限定。
实施例1 dCP4U·4Na结晶的制备
(1)使用DCC的方法
经过如WO 98/34942中所述的常规方法、通过UTP、dCMP和DCC的应用制备dCP4U。反应是在20mmol的规模上进行。
将由此所得的dCP4U溶液用水稀释，从而调至1000ml的总体积，并且将稀释溶液上样在中等碱性阴离子交换树脂(AMBERLITEIRA-67，Rohm & Hass Co.的产品)的柱子中。顺序用水、0.18M盐酸水溶液和含有0.5M氯化钠的0.005M盐酸水溶液进行洗脱，由此收集含有dCP4U的馏分。
将由此得到的dCP4U馏分(4000ml)上样在带有色谱级活性炭(Taiko Granular Activated Charcoal SGP，Futamura ChemicalIndustries，Co.，Ltd.的产品)的柱子中。通过用0.05M氢氧化钠水溶液(8000ml)洗脱dCP4U。
将由此得到的dCP4U馏分合并且浓缩，从而制得一个浆液。把该浆液的pH调至6.0。搅拌该浆液同时逐渐向该浆液中加入乙醇，并且在搅拌的同时令所得的浆液进一步冷却至10℃，从而沉淀出dCP4U·4Na结晶。分离结晶由此得到8.9g的dCP4U·4Na。分离的结晶在减压下、在约60℃下干燥约4小时，随后用来仪器分析。(2)使用DPC的方法
将UTP·3Na(12.8kg)溶于水(135L)中，并且将所得的溶液上样在带有阳离子交换树脂(Mitsubishi Chemical Co.Ltd.的产品)的柱子中。令该溶液流经该柱子并且合并用水洗脱的馏分，并且在搅拌的同时向合并的溶液中缓慢加入三丁基胺(TBA；13.6kg)以便中和。浓缩该溶液，向该溶液中加入甲酰胺(10kg)。所得的溶液通过与二噁烷沸腾来除水。随后，经脱水的物质用吡啶(11.6kg)稀释，从而制备UTP的吡啶溶液。
向另一个含有甲醇(181)的罐中加入dCMP(7.5kg)。搅拌的同时向该溶液缓慢加入TBA(4.5kg)，将该溶液加热至60℃。组分溶解之后，使溶液浓缩至干。干燥的物质进一步在75℃的真空中干燥并且压碎。将压碎的物质(10.3kg)悬浮在二甲基乙酰胺(DMAC)(16.7kg)中，并且向该混悬液中加入二苯基磷酰氯(DPC)(4.4kg)，并且将该混合物搅拌10分钟。随后，进一步向该混合物中加入TBA(10.8kg)，并且所得的混合物搅拌30分钟，由此制备dCMP-DPP溶液。
在搅拌下，向由此制备的dCMP-DPP溶液中加入已按照上述方式制备的UTP的吡啶溶液。加料完毕后，室温下将该混合物搅拌过夜，通过加入去离子水中止该反应。
向上述混合物中加入30％氢氧化钠水溶液(31L)。将该混合物搅拌30分钟，并且通过分层除去释放的TBA。向水层加入6mol/L盐酸溶液，从而将溶液的pH调至约7。通过除去溶剂浓缩该溶液，并且向该浓缩溶液内加入等体积的95％乙醇。令所得的混合物放置过夜。混合物的上层，即乙醇层，通过抽吸取出，并且向所得的粘性沉淀加入水以便溶解沉淀。通过浓缩溶剂除去残余的溶剂。
将由此合成的dCP4U溶液的总体积调至2500L，并且将该溶液上样在带有中等碱性阳离子交换树脂(AMBERLITE IRA-67，Rohm &Hass Co.的产品)的柱子中。顺序用水、0.1mol/L盐酸水溶液和含有0.4mol/L氯化钠的0.005mol/L盐酸水溶液进行洗脱，由此收集含有dCP4U的馏分。
将由此得到的dCP4U馏分(2100ml)上样在带有色谱级活性炭(Taiko Granular Activated Charcoal SGP，Futamura ChemicalIndustries，Co.，Ltd.的产品)的柱子中。通过用0.05mol/L氢氧化钠水溶液(12001)洗脱dCP4U。
合并由此所得的馏分并且浓缩。所得溶液的pH用30％氢氧化钠水溶液调至7.5。搅拌该溶液的同时向该溶液中缓慢加入95％乙醇，由此沉淀出dCP4U·4Na结晶。分离结晶并且在60℃下干燥4小时，由此生成4.2kg的dCP4U·4Na结晶(水含量：5.9％，分离收率：22％)。
<dCP4U·4Na结晶的物理性质>
实施例1的(1)或(2)中制备的dCP4U·4Na结晶和按照与WO98/34942的实施例20所述方法相同的方式制备的dCP4U·4Na结晶的白色粉末(冷冻干燥产物)进行仪器分析。把结晶和冻干产物在物理性质上进行比较。
(3)仪器分析
1)纯度分析
利用高效液体色谱的方式，实施例1的(1)和(2)中所得的dCP4U·4Na结晶，和经过各色谱纯化的dCP4U馏分进行纯度分析。结果在表1和2中给出。高效液体色谱的条件如下所述。
柱子：HITACHIGEL #3013-N(Hitachi Keisoluli Service的产品)
洗脱剂：10％CH3CN，0.18M NH4Cl，0.03KH2PO4，和0.03M K2HPO4
检测方法：在262nm下UV检测表1(DCC的检测)
| dCP4U含量(％) | UTP含量(％) | |
| 反应混合物IE*色谱后AC*色谱后结晶后 | 55.0(-)97.498.3 | 28.6(-)0.40.4 |
(-)：未测量，*)离子交换，AC：活性炭
表1(DPC的检测)
| dCP4U含量(％) | UTP含量(％) | |
| 反应混合物IE*色谱后AC*色谱后结晶后 | (-)68.692.898.3 | (-)27.21.50.3 |
(-)：未测量，*)离子交换，AC：活性炭
2)晶形
图1表示dCP4U·4Na(3.5水合物)结晶的典型晶形的相片。
3)含水量
通过Karl Fischer法测量dCP4U·4Na结晶的含水量。发现dCP4U·4Na结晶在6.9-17.4％(重量)的含水量下稳定，含水量随干燥的程度而变化。计算结果显然表示出3.5-10个水分子结合或附着在一个dCP4U分子上。
4)熔点
利用常规方法测定dCP4U·4Na结晶的熔点。发现其熔点为202-210℃。冻干产物的熔点为约195-210℃。
5)X射线衍射
在下列条件(测量误差：±0.1°)下，利用X射线衍射仪(型号：RINT2500V，Rigaku Denki的产品)对dCP4U·4Na结晶进行X射线衍射。由此得到dCP4U·4Na 3.5水合物的X射线衍射光谱和峰的数据分别列在图2中和表3中。同样地，dCP4U·4Na 10水合物的X射线衍射光谱和峰的数据分别列在图3中和表4中。此外，冻干产物的X射线衍射光谱在图4中给出作为参比。
(测量的条件)
X射线管：Cu-Kα
X射线输出：50kV-300mA
扫描速率：4.0°/分钟
扫描间隔：0.02°
角度测量范围：2-40°
狭缝：DS-0.5°，RS-0.15mm，SS-0.5°
预处理：用搅拌马达研磨
表3
结晶dCP4U·4Na 3.5水合物
表4
| 峰号 | 2θ(°) | 相对强度 |
| 1234568910111213141516 | 6.188.8211.5012.3213.7614.4416.3416.8417.6819.0219.7220.8622.2823.5425.04 | 3938277939832934100813635784743 |
结晶dCP4U·4Na十水合物
| 峰号 | 2θ(°) | 相对强度 |
| 1234568910111213141516 | 5.5811.3411.9412.9214.0814.9615.6016.6217.0818.2818.9020.2021.6622.0223.02 | 2862342749664925462728397210090 |
6)吸湿性
令具有约17.4％含水量的dCP4U·4Na结晶(十水合物)在下列条件a)、b)和c)下放置2天：a)25℃和57％的相对湿度；b)25℃和75％的相对湿度；和c)25℃和93％的相对湿度。在上述三种情况中观察到没有分解和重量变化。证明这些结晶稳定并且不具有吸湿性。此外，令相同的结晶在下列苛刻条件d)下放置7天：d)40℃和75％的相对湿度。在这种情况中观察到没有变化。
相反，当将冻干产物(起始含水量：约1％)在下列条件b)或c)下储藏2天时：b)25℃和75％的相对湿度与c)25℃和93％的相对湿度，在储藏的第2天，该产物呈泥浆状态，这归因于含水量的逐渐增高。
7)稳定性
将dCP4U·4Na结晶(十水合物)和冻干产物分别置于瓶中，随后将瓶子溶封并且在60℃下保存13天(加速试验)。观察到结晶不分解。相反，发现冻干产物部分分解，这是通过观察到产物的纯度损失为约2.2％来证实的。
8)NMR
将dCP4U·4Na结晶和冻干产物分别直接加入氧化锆制的转鼓中，并且测定相应的13C-CPMAS-NMR波谱。测量条件如下所述：13C-CPMAS-NMR
1)仪器 CMX-300(Chemagnetics的产品)
2)测量的方法 CPMAS
(边带抑制)
3)测量温度 室温
4)观测核 13C
5)观测频率 75.502MHz
6)质子激发的脉冲宽度 4.5μs
7)接触时间 0.5毫秒
8)测量宽度 30.03kHz
9)测量点 2048
10)数据点 16384
11)反复时间 15.0秒(图6和7)
60.0秒(图5)
12)化学位移标准 六甲基苯(外标17.35ppm)
13)样品旋转速度 5kHz
14)整合 256次
图5和表5分别表示结晶dCP4U·4Na 3.5水合物的13C-CPMAS-NMR波谱和峰数据，图6和表6分别表示结晶dCP4U·4Na十水合物的13C-CPMAS-NMR波谱和峰数据。图7和表7分别表示白色粉末形式的dCP4U(冻干产物)的13C-CPMASONMR波谱和峰数据。图5-7中的数字是指表5-7中对于的峰编号。
表5
结晶dCP4U·4Na 3.5水合物(ppm)
(1)166.1 (2)156.2 (3)150.9 (4)141.6
(5)138.4 (6)101.3 (7)99.2 (8)93.2
(9)84.9 (10)80.6 (11)76.7 (12)73.1
(13)69.0 (14)67.2 (15)62.2 (16)43.9
表6
结晶dCP4U·4Na十水合物(ppm)
(1)167.4 (2)157.8 (3)151.6 (4)139.0
(5)117.9 (6)102.6 (7)99.3 (8)93.3
(9)90.1 (10)87.3 (11)80.6 (12)77.2
(13)75.0 (14)73.9 (15)72.0 (16)67.0
(17)63.1 (18)60.4 (19)42.0 (20)40.8
表7
dCP4U的白色粉末(冻干产物)(ppm)
(1)166.5 (2)157.4 (3)149.9 (4)140.9
(5)103.0 (6)99.0 (7)96.9 (8)85.9
(9)73.4 (10)71.7 (11)67.1 (12)42.0
(13)39.3
实施例2：由UMP起始的dCP4U合成
将甲酰胺(2.5ml)和吡啶(7.6ml)加入脱水焦磷酸的三乙胺盐(10mmol)(TEA-PPi)，随后搅拌所得的混合物。向置于另一容器中的脱水尿苷5’-一磷酸的三丁基胺盐(UMP-TBA)(10mmol)加入DMAC(3.6ml)、二噁烷(3.2ml)，并且加入三丁基胺(3.3ml)和搅拌，向其中滴加DPC(2.3ml)。室温下搅拌该混合物1小时，由此形成UMP-DPP，将其加入预先制备的上述脱水TEA-PPi溶液中。室温下将该反应混合物搅拌1小时，生成UTP。向置于另一容器中的2’-脱氧胞苷5’-一磷酸的三丁基胺盐(TBA-dCMP)(4.9g，10mmol)加入DMAC(7.2ml)，由此生成混悬液，并且将DPC(2.2ml，1.1当量)加入该混悬液。将所得混合物搅拌40分钟，并且向该混合物中加入三丁基胺(TBA)(9.5ml)。继续搅拌20分钟，由此制得dCMP-DPP。将由此制备的dCMP-DPP溶液加入预先制备的上述合成UTP溶液中，并且室温下搅拌该混合物56小时。通过加入水中止该反应，加入30％氢氧化钠水溶液调节该反应混合物的pH至11。浓缩除去溶剂之后，通过溶剂6mol/L盐酸调节pH至7.0。该混合物用乙酸乙酯分配。通过分配生成的水层进行HPLC分析(272nm)，显示出dCP4U的合成收率为37.7％。
工业实用性
如上所述，与冻干产物比较，通过本发明的方法获得的dCP4U的结晶具有高纯度和高稳定性并且没有吸湿性，由此在制备药物中成为有效的原材料。
本发明制备dCP4U的方法允许使用低廉的UMP作为原料并且具有高收率。所以，该方法适合dCP4U的大规模合成。
Claims (6)
1.P1-(2’-脱氧胞苷5’-)P4-(尿苷5’-)四磷酸酯·4Na的结晶。
2.一种制备权利要求1所述结晶的方法，该方法包括使P1-(2’-脱氧胞苷5’-)P4-(尿苷5’-)-四磷酸酯粗品进行阳离子交换色谱和活性炭色谱的纯化过程，其中所述纯化过程包括首先进行的阳离子交换色谱和随后进行的活性炭色谱，并且向所得的提纯P1-(2’-脱氧胞苷5’-)P4-(尿苷5’-)-四磷酸酯溶液中加入亲水性有机溶剂，由此引起P1-(2’-脱氧胞苷5’-)P4-(尿苷5’-)-四磷酸酯以结晶的形式沉淀。
3.一种制备P1-(2’-脱氧胞苷5’-)P4-(尿苷5’-)-四磷酸酯dCP4U的方法，该方法包括使尿苷5’-一磷酸酯UMP、2’-脱氧胞苷5’-一磷酸酯dCMP、二苯基磷酰氯DPC和焦磷酸盐Ppi反应，其中第一步中UMP和DPC反应合成UMP二苯基磷酸酯UMP-DPP；进一步用PPi处理含有UMP-DPP的反应混合物，由此在混合物中生成尿苷5’-三磷酸酯UTP；和无需由反应混合物分离，由此生成的UTP与dCMP在DPC的存在下反应，生成dCP4U。
4.按照权利要求1的结晶，其中1-14个水分子结合或附着在P1-(2’-脱氧胞苷5’-)P4-(尿苷5’-)-四磷酸酯·4Na。
5.按照权利要求1的结晶，其中3.5个水分子结合或附着在P1-(2’-脱氧胞苷5’-)P4-(尿苷5’-)-四磷酸酯·4Na。
6.按照权利要求1的结晶，其中10个水分子结合或附着在P1-(2’-脱氧胞苷5’-)P4-(尿苷5’-)-四磷酸酯·4Na。
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