WO2001002416A1 - Cristaux dinucleotidiques - Google Patents

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WO2001002416A1
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crystal
dcp
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Kenya Mori
Takanori Miyashita
Hideaki Maeda
Hiroshi Sato
Yutaka Noda
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Yamasa Corporation
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/06—Separation; Purification

Definitions

  • the present invention chronic bronchitis, P useful as therapeutic agents, such as sinusitis 1 - (2 'single Dokishishichijin 5' -) P 4 - (Urijin 5 '-) tetraphosphate (dC P4U) or a pharmaceutically
  • the present invention relates to a crystal of an acceptable salt (hereinafter sometimes simply referred to as “dCP 4U”) or a method for producing the crystal, and an efficient method for producing dCP 4U.
  • D CP 4 U or a salt thereof represented by the following formula [I] is a selective agonist of P2Y2 and / or P2Y4 purine receptor, and is a chronic bronchitis. It is a compound that is expected to be developed as a therapeutic agent for sinusitis and the like (see WO 98/34942).
  • dCP 4U was not obtained as crystals, but was prepared only as a white solid obtained by freeze-drying.
  • conventional powder products have low purity (HPLC purity: 82%), and especially the raw material ⁇ lysine 5'-triphosphate
  • dCP4U was synthesized using 2, -dexoxycytidine 5'-monophosphoric acid (dCMP) and UTP as starting materials and dicyclohexylcarposimid (DCC) as an activator.
  • dCMP 2, -dexoxycytidine 5'-monophosphoric acid
  • DCC dicyclohexylcarposimid
  • the present invention provides a stable crystal of dCP4U suitable for being formulated as a pharmaceutical and a method for producing the crystal, and an efficient production method suitable for mass synthesis of dCP4U.
  • the purpose is to: Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted intensive studies on the stabilization of dCP 4 U.As a result, the purity of 95% or more was obtained by using both the chromatographic treatment using an anion exchange resin and the chromatographic treatment using activated carbon.
  • dCP 4U could be prepared, and the crystallization of dCP 4U was succeeded for the first time by preparing such high-purity dCP 4U. It was confirmed that the obtained dCP 4U crystal was much higher in purity than the conventional product, had no hygroscopicity, and had excellent stability.
  • the present inventors have also conducted intensive studies on a method for synthesizing dCP4U using inexpensive peridine 5'-monophosphate (UMP) instead of expensive UTP. As a result, diphenylphosphochloridate ( DPC) and pyrophosphate (PP i) The present inventors have found that dCP 4U can be efficiently produced by such a method, and have completed the present invention based on these findings.
  • UMP peridine 5'-monophosphate
  • PP i pyrophosphate
  • the present invention provides a crystal of dCP 4U.
  • the present invention also provides a method for purifying crude dCP 4U using anion exchange chromatography and activated carbon chromatography, and adding a hydrophilic organic solvent to the purified dCP 4U solution to precipitate dCP 4U as crystals. It is intended to provide a method for producing a crystal of dCP 4U characterized by the above.
  • the present invention provides a method of reacting UMP, dCMP, DPC and Ppi to form dCP
  • FIG. 1 is a diagram showing the crystal structure (polarized light microscope, ⁇ 440) of dCP4U ⁇ 4Na crystal (3.5 hydrate). Note that 1 mm in the figure corresponds to 25.
  • Figure 2 shows the X-ray diffraction spectrum of dCP4U * 4Na crystal (3.5 hydrate).
  • FIG. 3 shows an X-ray diffraction spectrum of dCP4U * 4Na crystal (decahydrate).
  • Figure 4 shows the X-ray diffraction spectrum of a white powder (freeze-dried product) of dCP4U.
  • FIG. 5 shows the 13 C-CPMAS-NMR spectrum of dCP 4U ⁇ 4Na crystal (3.5 hydrate).
  • Figure 6 shows the '3 C- CPMAS- NMR scan Bae spectrum of dCP4U ⁇ 4Na crystals (decahydrate).
  • Figure 7 shows the 13 C-CPMAS-NMR spectrum of a white powder of dCP4U (lyophilized product).
  • the crystals of dCP4U of the present invention are obtained by purifying crude dCP4U by a specific means, and adding a hydrophilic organic solvent to the purified dCP4U solution to precipitate dCP4U as crystals.
  • a hydrophilic organic solvent to the purified dCP4U solution to precipitate dCP4U as crystals.
  • Purification of dCP 4U can be performed by using both anion exchange chromatography and activated carbon chromatography. Either of the purifications using both types of chromatography may be performed first, but it is preferable to first perform anion exchange chromatography and then perform activated carbon chromatography from the viewpoint of improving the purity of dCP4U.
  • the anion exchange resin used here may be a resin based on a styrene or acryl resin, and may be a strongly basic anion exchange resin (for example, Amber-Light I RA402 [manufactured by Rohm & Haas Co., Ltd.]. ], DIAION PA-312, DIAION SA-11A (Mitsubishi Chemical), or weakly basic anion exchange resin (for example, Amberlite I RA67 [Rohm & Haas], DIAION WA — 30 [Mitsubishi Chemical Corporation]) may be used.
  • a strongly basic anion exchange resin for example, Amber-Light I RA402 [manufactured by Rohm & Haas Co., Ltd.].
  • DIAION PA-312 Mitsubishi Chemical
  • DIAION SA-11A Mitsubishi Chemical
  • weakly basic anion exchange resin for example, Amberlite I RA67 [Rohm & Haas]
  • crushed or granulated activated carbon for chromatography may be used.
  • commercially available products such as those manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. and Nimura Chemical Industries can be used.
  • Each type of chromatography may be of a batch type, a column type, or the like.
  • an eluent for anion exchange column chromatography is an acid (eg, hydrochloric acid) aqueous solution or a salt solution.
  • Water or an aqueous solution of an alkali eg, sodium hydroxide
  • the concentration of each eluent may be suitably determined from a range of 0.001 to 10M by a suitable small-scale test.
  • Crystallization of dCP4U The crystallization of dCP 4 U is performed by adding a hydrophilic organic solvent to the obtained purified d CP 4 U solution to precipitate d CP 4 U as crystals.
  • hydrophilic organic solvent examples include alcohols having 6 or less carbon atoms such as methanol and ethanol; ketones such as acetone; ethers such as dioxane; nitriles such as acetonitrile; and amides such as dimethylformamide. Alcohols and ethanol are particularly preferred.
  • the pH of the purified dCP 4U solution or the slurry obtained by concentrating the solution is adjusted to 5 to 10, preferably 6 to 9 if necessary, and then adjusted to 60 or less, preferably 2O :
  • Stable crystals of dCP4U can be obtained by adding a hydrophilic organic solvent under the following temperature conditions to precipitate dCP4U as crystals.
  • the dCP4U crystals of the present invention thus obtained have a purity of at least 95% dCP4U and 3% UTP or less.
  • dCP4U crystals 0? 41; preferably 97% or more and UTP 2% or less, and more than 98% dCP 4U. Is preferably 1% or less.
  • Such a high-purity dCP4U crystal may be in the form of a salt, hydrate or hydrate, and the salt may be an alkali metal salt such as a sodium salt or a potassium salt, or an alkali metal salt such as a calcium salt or a magnesium salt.
  • Pharmaceutically acceptable salts such as earth metal salts and ammonium salts are exemplified. The number of substitution of the salt includes those substituted by 1 to 4 metals.
  • Examples of the hydrate include those in which 1 to 14 molecules of water are bonded or attached to one molecule of dCP4U. Further, examples of the hydrated salt include those in which 1 to 14 water molecules are bonded or attached to one molecule of the alkali metal salt of dCP4U crystal.
  • the dCP4U crystals of the present invention may include tautomers.
  • the crystals of dCP 4U obtained in this way may be dried under reduced pressure, After drying by a usual method such as heating and drying, fill into containers (bottles, bags, cans, ampules, etc.).
  • the sealed state of the container may be any of open, closed, airtight, and sealed, but it is preferable that the container is not open from the viewpoint of maintaining storage stability.
  • the method for producing dCP 4U of the present invention is characterized in that dCP 4U is produced by reacting UMP, dCMP, DPC and PPi.
  • UMP and DPC are reacted to synthesize UMP diphenyl phosphate (UMP-DPP), which is then reacted with PPi to produce UTP in the reaction solution, and the resulting product is obtained.
  • UMP-DPP UMP diphenyl phosphate
  • UTP and dCMP are reacted in the presence of DPC without isolating UTP to produce dCP4U.
  • UMP-DPP from UMP can be performed, for example, by converting a UMP trialkylamine salt (eg, UMP tributylamine salt) prepared by a conventional method into an amide solvent such as DMF, dimethylacetamide (DMAC), or a ring such as dioxane or tetrahydrofuran.
  • Ether solvents, ketone solvents such as acetone, dimethylimidazolidinone, hexanemethylphosphoric acid triamide, etc., alone or in a mixed solvent add DPC and, if necessary, trialkylamine, and 10 to 50 for 30 minutes
  • the reaction can be carried out for about 5 hours.
  • the PP i to be reacted with UMP-DPP is preferably a PP i—organic alkali salt, and specific examples include a hexylamine salt, a dibutylamine salt, a triethylamine salt, and a tributylamine salt of PPI.
  • the reaction between UMP—DPP and PP i—organic alkali salt is performed by converting PP i—organic alkali salt to amide solvents such as DMF, DMAC, and formamide; cyclic ether solvents such as dioxane and tetrahydrofuran; and ketone solvents such as acetone. , Dimethylimidazolidinone, hexamethylphosphoric triamide, dimethylsulfoxide, acetonitrile, etc., alone or in a mixture, and added to the above UMP-DPP synthesis solution. It can be done by doing this.
  • amide solvents such as DMF, DMAC, and formamide
  • cyclic ether solvents such as dioxane and tetrahydrofuran
  • ketone solvents such as acetone.
  • the above-mentioned reaction between the organic alkali salt of PP i and UMP-DPP may be carried out in the presence of an arbitrary base, such as pyridine, 2,6-lutidine, 2,4 Pyridine bases such as —lutidine, hypicolin, / 3-picoline, apicolin, 2-, 4-dimethylaminopyridine, ⁇ -collidine, 3-collidine, and acollidine; and pyridine is particularly preferred.
  • a base may be used also as a reaction solvent.
  • concentration of the base used is not particularly limited, and it is preferable to add 6 equivalents or more, preferably 18 equivalents or more to UMP used as a raw material.
  • UTP is synthesized in the reaction solution by the reaction between the above PP i monoorganic alkali salt and UMP-DPP.
  • UTP and dCMP generated in this reaction solution are reacted in the presence of DCP to synthesize dCP4U.
  • the dCMP used may be dCMP itself, or, like UMP, may be converted to dCMP diphenyl phosphate (dCMP-DPP) and then added to the reaction solution.
  • dCMP-DPP dCMP diphenyl phosphate
  • the above UTP synthesis solution is prepared by adding 1.1 equivalents or more of DPC and 0.5 to 1.5 equivalents of dCMP or dCMP-DPP to UMP used as a raw material. , 10 to 50 for about 30 minutes to 5 hours.
  • the dCP4U crystal of the present invention can be obtained by purifying and crystallizing the dCP4U thus obtained by the method described above.
  • the solution was applied to a column filled with a medium-basic anion exchange resin (Amberlite IRA-67 [manufactured by Rohm & Haas Company]). Elution was carried out in the order of an 18M aqueous hydrochloric acid solution and a 0.05M aqueous hydrochloric acid solution containing 0.5M salt, to obtain a fraction containing dCP4U.
  • a medium-basic anion exchange resin Amberlite IRA-67 [manufactured by Rohm & Haas Company]
  • dCP4U / 4Na crystals were crystallized and separated to obtain 8.9 g of dCP4U / 4Na crystal.
  • the obtained crystals were dried under reduced pressure at about 6 Ot: for about 4 hours and then subjected to instrumental analysis.
  • the obtained dCMP-DPP solution was added to the previously prepared UTP pyridine solution with stirring. After the addition, the mixture was stirred at room temperature overnight, and the reaction was stopped by adding deionized water.
  • the volume of the obtained dCP 4U synthetic solution was adjusted to 2500 L, and applied to a column packed with a medium-basic anion exchange resin (Amberlite IRA-97 [manufactured by Kichimu & Haas]).
  • the elution was carried out in the order of water, a 0.1 mol aqueous solution of ZL hydrochloric acid, and a 0.005 mol aqueous solution of ZL hydrochloric acid containing 0.4 mol ZL salt, thereby obtaining a dCP4U-containing fraction.
  • the resulting dCP4U fraction 2 (100 L) was applied to a column packed with activated carbon for chromatography (Taiko Granule Activated Carbon SGP [manufactured by Nimura Chemical Industry Co., Ltd.]), and 1200 L of 0.05 mol aqueous sodium hydroxide solution was used. Eluted dCP 4U.
  • the melting point of the crystal product was 202 to 210.
  • the melting point of the freeze-dried product is about 195-210.
  • FIG. 2 and Table 3 show data of 3.5 pentahydrate of the dCP 4 U′4Na crystal
  • FIGS. 3 and 4 show data of 10 hydrate of the dCP 4 U ⁇ 4Na crystal
  • Fig. 4 shows the X-ray diffraction spectrum of the freeze-dried product for reference.
  • the freeze-dried product (initial moisture content: about 1%) was used under the following conditions: (a) temperature 25 ° C, relative humidity 75%, (ii) temperature 25 ° C, relative humidity 93%.
  • the water content gradually increased, and on the second day it deliquesced and became muddy.
  • the crystalline product or the freeze-dried product was directly filled in a zirconia raw material, and ' 3 C-CP MAS-NMR was measured. The measurement conditions are shown below.
  • the NMR spectrum is shown in Figure 6 and Table 6 for the 10 hydrate of the dCP4U'4a crystal.
  • FIG. 3 shows a ' 3 C-CPMAS-NMR spectrum of (lyophilized product).
  • Figures 5-7 Are the peak numbers in Tables 5-7.
  • TEA-PPi triethylamine pyrrolic acid salt
  • UMP-TBA dehydrated pyridine 5'-triptylamine monophosphate
  • the crystals of dCP4U obtained by the method of the present invention have high purity, are highly stable without moisture absorption compared to freeze-dried products, are easy to handle, and are useful as pharmaceutical raw materials.
  • UMP which is an inexpensive raw material
  • dCP4U can be produced in high yield, which is a method suitable for mass synthesis of dCP4U. .

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Description

明 細 書 ジヌクレオチド結晶 技術分野
本発明は、 慢性気管支炎、 副鼻腔炎などの治療薬として有用な P1— (2 ' 一 デォキシシチジン 5 ' -) P4- (ゥリジン 5 ' -) テトラホスフェート （dC P4U) またはその薬学的に許容される塩 （以下、 単に 「dCP 4U」 と称する こともある） の結晶、 又は当該結晶の製造法、 並びに d CP 4Uの効率的な製造 法に関する。 背景技術
下記式 [ I ] で表される d C P 4 Uまたはその塩は、 P 2Y2および または P 2Y4プリン受容体 （purine receptor) の選択的ァゴニス卜 （agonist) であ り、 慢性気管支炎 （chronic bronchitis), 副鼻腔炎などの治療薬としての開発 が期待されている化合物である （WO 98/34942参照）。
Figure imgf000003_0001
従来、 d CP 4Uは結晶としては取得されておらず、 凍結乾燥させて得た白色 粉末 （white solid) としてのみ調製されていた。 しかし、 従来の粉末品は純度 が低く （H PLC純度： 82 %)、 特に原料であるゥリジン 5 ' —トリリン酸
(UTP) と d CP 4Uとの分離が難しく、 従来精製に使用されていたイオン交 換クロマトグラフィー法だけでは高純度の d CP 4Uを調製することは非常に困 難なことであった （W〇 98Z34942)。
かかる純度の低い白色粉末品は、 吸湿しやすい等の欠点を有することから、 d C P 4 Uを医薬品として製剤化する際には湿気に配慮した特別の製造装置を必要 としたり、 製剤製造後も厳重な包装を必要とした。 さらに、 従来の粉末品は安定 性が悪いため、 有効期限の非常に短い薬剤とならざるを得ず、 高純度の安定結晶 体の取得が望まれていた。
一方、 dCP4Uは、 2、 —デォキシシチジン 5' —モノリン酸 （dCMP) と UTPを出発原料とし、 活性化剤としてジサイクロへキシルカルポジイミ ド (DCC) を用いて合成されていたが、 従来法の合成収率は約 9 %と極めて低く (WO 98734942、 実施例 20参照）、 到底実用的な方法とはなり得なか つた。 従って、 高収率で大量合成に適した製造法の開発も切望されていた。
本発明は、 医薬品として製剤化するのに適した d C P 4 Uの安定結晶及びその 結晶の製造法を提供すること、 並びに d C P 4 Uの大量合成に適した効率の良い 製造法を提供することを目的とする。 発明の開示
本発明者らは d C P 4 Uの安定化に関して鋭意研究を重ねた結果、 陰イオン交 換樹脂を用いたクロマトグラフィー処理と活性炭を用いたクロマトグラフィー処 理を併用することにより純度 95 %以上の d C P 4Uを調製することができ、 こ のような高純度の d CP 4Uを調製することにより初めて d CP 4Uの結晶化に 成功した。 得られた d CP 4U結晶は従来品と比較して格段に純度が高く、 吸湿 性がなく、 優れた安定性を有するものであることを確認した。
また、 本発明者らは、 高価な UTPではなく、 安価なゥリジン 5' —モノリン 酸 （UMP) を用いた d CP 4Uの合成法に関しても鋭意研究を重ねた結果、 ジ フエニルホスホクロリデート （DPC) およびピロホスフェート （PP i) を用 いることにより効率よく dCP 4Uを製造できることを見いだし、 これらの知見 を基に本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、 d CP 4Uの結晶を提供するものである。
また本発明は、 粗 d CP 4Uを陰イオン交換クロマトグラフィーと活性炭クロ マトグラフィ一とを用いて精製し、 精製された d CP 4U溶液に親水性有機溶媒 を加えて d CP 4Uを結晶として析出させることを特徴とする d C P 4Uの結晶 の製造法を提供するものである。
さらに本発明は、 UMP、 d CMP, D P Cおよび P P iを反応させて d C P
4 Uを製造する方法を提供するものである。 図面の簡単な説明
図 1は、 d C P 4 U · 4 N a結晶 （ 3.5水和物） の結晶構造 （偏光顕微鏡、 440倍） を示す図である。 なお、 図中の 1 mmは 25 に相当する。
図 2は、 dCP4U * 4Na結晶 （ 3. 5水和物） の X線回折スペクトルを示 したものである。
図 3は、 dCP4U * 4Na結晶 （ 10水和物） の X線回折スペクトルを示し たものである。
図 4は、 dCP4Uの白色粉末 （凍結乾燥品） の X線回折スペクトルを示した ものである。
図 5は、 d C P 4U · 4N a結晶 （3.5水和物） の 13 C— CPMAS— NMRスぺクトルを示したものである。
図 6は、 dCP4U · 4Na結晶 （10水和物） の '3C— C P M A S— NMR スぺクトルを示したものである。
図 7は、 dCP4Uの白色粉末 （凍結乾燥品） の 13 C— CPMAS— NMRス ぺクトルを示したものである。 発明を実施するための最良の形態
本発明の d C P 4Uの結晶は、 粗 d CP 4Uを特定の手段で精製し、 精製され た d C P 4 U溶液に親水性有機溶媒を加えて d C P 4 Uを結晶として析出させる ことにより得られる。 以下、 ①精製と②結晶化に分けて説明する。
① dCP4Uの精製
dCP 4Uの精製は、 陰イオン交換クロマトグラフィーと活性炭クロマトグラ フィ一の 2つのクロマトグラフィーを併用することにより行うことができる。 両 クロマトグラフィーを用いた精製は何れを先に行ってもよいが、 最初に陰イオン 交換クロマトグラフィーを行い、 次いで活性炭クロマトグラフィーを行うこと力^ d C P 4 Uの純度向上の点から好ましい。
ここで用いられる陰イオン交換樹脂としては、 スチレン系或いはァクリル系樹 脂を基材とする樹脂であればよく、 強塩基性陰イオン交換樹脂 （例えば、 アンバ —ライト I RA402 〔ローム &ハース社製〕、 ダイアイオン P A— 312、 ダ ィァイオン SA— 1 1 A 〔三菱化学社製〕）、 又は弱塩基性陰イオン交換樹脂 （例 えば、 アンバーライト I RA67 〔ローム &ハース社製〕、 ダイアイオン WA— 30 〔三菱化学社製〕） のいずれを用いてもかまわない。
活性炭としては、 破砕状或いは粒状に整形されたクロマ卜用活性炭を使用すれ ばよく、 例えば和光純薬工業社、 二村化学工業社製等の市販品を使用できる。
各クロマトグラフィーは、 バッチ式、 カラム式等いずれの形式であってもよく、 カラムクロマトグラフィーを行う場合、 陰イオン交換カラムクロマトグラフィー の溶出剤としては、 酸 （例：塩酸） 水溶液或いはこれに食塩等を添加してイオン 強度を高めたもの、 活性炭カラムクロマトグラフィーの溶出剤としては、 水又は アルカリ （例：水酸化ナトリウム） 水溶液をそれぞれ使用することができる。 各 溶出剤の濃度は、 0. 001〜10Mの範囲内から好適なものを小規模試験によ り適宜決定すればよい。
② dCP4Uの結晶化 dCP 4 Uの結晶化は、 得られた精製 d C P 4 U溶液に親水性有機溶媒を加え て d CP 4Uを結晶として析出させることにより行われる。
ここで使用できる親水性有機溶媒としては、 メタノール、 エタノール等炭素数 6以下のアルコール類、 アセトン等のケトン類、 ジォキサン等のエーテル類、 ァ セトニ卜リル等の二トリル類、 ジメチルホルムアミド等のアミド類等を例示する ことができ、 特にアルコール類、 エタノールが好ましい。
より具体的には、 精製 d CP 4U溶液或いはこれを濃縮して得られるスラリー 液に、 所望により pHを 5〜 10、 好ましくは 6〜 9に調整後、 60で以下、 好 ましくは 2 O :以下の温度条件下で親水性有機溶媒を添加し、 dCP4Uを結晶 として析出させることにより dCP4Uの安定結晶を得ることができる。
かくして得られた本発明の d C P 4U結晶は少なくとも、 dCP4Uが 95% 以上、 UTPが 3%以下、 の純度を有するものである。 このような dCP4U結 晶の中でも更に、 0 ？41；が97%以上、 UTPが 2%以下、 の純度を有する ものが好ましく、 さらに d C P 4Uが 98 %以上、 1丁？が1 %以下、 の純度を 有するものが特に好ましい。
このような高純度の d C P 4U結晶は、 塩、 水和物又は含水塩の形態であって もよく、 塩としてはナトリウム塩、 カリウム塩等のアルカリ金属塩、 カルシウム 塩、 マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、 アンモニゥム塩等の薬学的に許容 される塩が例示される。 塩の置換数は、 1〜 4個の金属が置換したものが挙げら れる。
また、 水和物としては d C P 4U 1分子に対し 1〜 14分子の水が結合又は付 着したものが例示される。 さらに、 含水塩としては、 例えば d C P 4U結晶のァ ルカリ金属塩 1分子に 1〜 14分子の水分子が結合又は付着したものを挙げるこ とができる。
なお、 本発明の d C P 4 Uの結晶には互変異性体も包含されうる。
このようにして得られた d C P 4Uの結晶は、 必要により減圧乾燥、 通風乾燥、 加熱乾燥等の通常の方法により乾燥後、 容器 （ビン、 袋、 カン、 アンプル等） に 充填する。 容器における封入状態は、 開放、 密閉、 気密、 密封のいずれの状態で あってもよいが、 保存安定性を維持する観点から開放状態でない方が好ましい。 本発明の d CP 4Uの製造法は、 UMP、 d CMP, DPCおよび PP iを反 応させて d CP 4Uを製造することを特徴としている。
より具体的には、 最初に UMPと DP Cを反応させて UMPジフエ二ルホスフ エート （UMP— DPP) を合成し、 これに P P iを反応させて反応液中に UT Pを生成させ、 得られた UTPを単離することなく、 D PC存在下、 UTPと d CMPとを反応させて目的とする d C P 4 Uを製造する方法である。
UMPから UMP— DP Pの合成は、 例えば、 常法により調製した UMPトリ アルキルアミン塩 （例： UMP卜リブチルァミン塩） を DMF、 ジメチルァセト アミド （DMAC) 等のアミド系溶媒、 ジォキサン、 テトラヒドロフラン等の環 状エーテル系溶媒、 アセトン等のケトン系溶媒、 ジメチルイミダゾリジノン、 へ キサメチルリン酸トリアミド等の単独又は混合溶媒に溶解し、 DP Cと必要によ りトリアルキルアミンを加え、 10〜50 で 30分〜 5時間程度反応させるこ とにより実施できる。
UMP— DP Pと反応させる P P iとしては、 PP i—有機アルカリ塩が好ま しく、 具体的には P P iのへキシルァミン塩、 ジブチルァミン塩、 トリェチルァ ミン塩、 卜リブチルァミン塩等が挙げられる。
UMP— DPPと PP i—有機アルカリ塩との反応は、 PP i—有機アルカリ 塩を DMF、 DMAC, ホルムアミド等のアミド系溶媒、 ジォキサン、 テトラヒ ドロフラン等の環状エーテル系溶媒、 アセトン等のケトン系溶媒、 ジメチルイミ ダゾリジノン、 へキサメチルリン酸トリアミド、 ジメチルスルホキシド、 ァセト 二トリル等の単独又は混合溶媒に溶解し、 これを上記の UMP— DP P合成液に 添加し、 10〜50 で 30分〜 5時間程度反応させることにより行うことがで さる。 上記の PP i 一有機アルカリ塩と UMP— DP Pとの反応は、 任意の塩基を共 存させて反応させてもよく、 かかる塩基としては、 例えばピリジン、 2， 6—ル チジン， 2， 4—ルチジン、 ひ一ピコリン， /3—ピコリン、 ァーピコリン、 2—， 4ージメチルァミノピリジン、 α—コリジン、 3—コリジン、 ァ一コリジン等の ピリジン系塩基等が挙げられ、 特にピリジンが好ましい。 なお、 かかる塩基が反 応溶媒を兼用してもかまわない。 使用する塩基の濃度は特に制限されず、 原料と して使用した UMPに対して 6当量以上、 望ましくは 1 8当量以上を添加するの が好ましい。
上記 PP i 一有機アルカリ塩と UMP— DPPとの反応により反応液中には U TPが合成される。 この反応液中に生成した UTPと d CMPを、 DCPの存在 下、 反応させることにより dCP4Uを合成する。
用いる dCMPは、 d CMPそのものであってもよく、 また UMPと同様に、 d CM Pジフエ二ルホスフェート （dCMP— DPP) に変換後、 反応液に添加 してもかまわない。
dCP 4Uの合成反応は、 上記の UTP合成液に、 原料として使用した UMP に対して 1. 1当量以上の DPCと 0. 5~ 1. 5当量の d CMPまたは d CM P— DPPを添加し、 1 0〜50 で 30分〜 5時間程度反応させることにより 行うことができる。
このようにして得られた d CP 4Uは、 前述した方法で精製、 結晶化すること で、 本発明の d C P 4 U結晶を取得することができる。 実施例
以下、 実施例を示し本発明を具体的に説明するが、 本発明がこれに限定されな いのは明らかである。
実施例 1 dCP4U * 4Na結晶の製造
(1) DC Cを用いる方法 UTP、 d CMP、 および DCCを用い、 2 Ommo 1 eの反応スケールで d CP4Uを常法 （W098Z34942) により調製した。
得られた dCP4U合成液を水で 1000m lに液量調整後、 中塩基性ァニォ ン交換樹脂 （アンバーライト I RA— 67 [ローム &ハース社製]) を充填した カラムにアプライし、 水、 0. 18M塩酸水溶液および 0. 5M食塩含有 0. 0 05 M塩酸水溶液の順で溶出し、 d CP4U含有画分を取得した。
得られた d CP4U画分 4000m lをクロマ卜用活性炭 （太閤顆粒活性炭 S GP [二村化学工業 （株） 社製]) を充填したカラムにアプライし、 0. 05M 水酸化ナトリウム水溶液 8000m lを用いて dCP4Uを溶出した。
上記 dCP4U画分を濃縮してスラリーを調製後、 pH6. 0に調整し、 撹拌 しながら徐々にエタノールを添加し、 さらに 1 o :に冷却しながらスラリーを撹 拌して dCP4U · 4 N a結晶を晶析させ、 これを分離して dCP4U · 4Na結 晶 8. 9 gを得た。 得られた結晶は約 6 Ot:で約 4時間減圧乾燥後、 機器分析等 に供した。
(2) DPCを用いる方法
UTP · 3 N a 12. 8 k gを 1 35 Lの水に溶解し、 カチオン交換樹脂 [三 菱化学 （株）] を充填したカラムにアプライし、 通過液と水溶出分画を集め、 撹 拌しながらトリプチルァミン （TBA) 13. 6 k gを徐々に加えて中和した。 得られた液を濃縮し、 フオルムアミド 10 k gを加え、 ジォキサンを用いて共沸 脱水を行つた。 脱水後、 ピリジン 1 1. 6 k gを加えて希釈し、 U T Pのピリジ ン溶液を調製した。
一方で別のタンクにメタノール 18 Lに dCMP 7. 5 k gを加え、 撹拌しな がら TBA4. 5 k gを徐々に加え 60°Cに加温した。 溶解後、 濃縮を行い乾固 させた。 75°Cで真空乾燥し、 割砕した後、 その中の 10. 3 kgをジメチルァ セトアミド （DMAC) 16. 7 kgに懸濁し、 ジフエ二ルホスホクロリデート
(DPC) 4. 4 k gを加えて 10分間撹拌した。 その後、 TBA 10. 8 kg を加えて 30分間撹拌し、 d CMP- DP P溶液とした。
得られた d CMP- DP P溶液を、 先に調製しておいた UTPのピリジン溶液 に撹拌しながら添加した。 添加後、 室温で一晩撹拌し、 脱イオン水を加えて反応 を停止した。
30 %水酸化ナトリウム水溶液 3 1 Lを加えて 30分間撹拌し、 分液により遊 離した TBAを除去した。 その後、 6mo 1 /L塩酸溶液で pHを約 7に調整し た。 濃縮により溶媒を除去し、 95%エタノールを同容量加えてー晚静置した。 上層のエタノール層を吸引除去した後、 水あめ状の沈殿に水を加えて溶解し、 濃 縮により残留した溶媒を除去した。
得られた d CP 4U合成液を 2500 Lに液量調整し、 中塩基性ァニオン交換 樹脂 （アンバーライ ト I RA— 97 [口一ム&ハース社製]) を充填したカラム にアプライした。 水、 0. lmo 1 ZL塩酸水溶液および 0. 4mo l ZL食塩 含有 0. 005mo 1 ZL塩酸水溶液の順で溶出し、 dCP4U含有分画を取得 した。
得られた dCP4U分画 2 100 Lをクロマト用活性炭 （太閤顆粒活性炭 SG P [二村化学工業 （株） 社製]) を充填したカラムにアプライし、 0. 05mo 1 水酸化ナトリウム水溶液 1200 Lを用いて d C P 4Uを溶出した。
上記 d C P 4 U溶出分画を濃縮し、 30 %水酸化ナトリゥム水溶液を用いて p Hを 7. 5に調整し、 撹拌しながら 95 %エタノールを加えて d C P 4U · 4N a結晶を晶析させ、 これを分離した。 得られた結晶を 60 で 4時間乾燥し、 目 的とする d C P 4U · 4N a結晶 4. 2 k g (水分 5. 9%、 収率 22%) を得 た。
CdCP4U · 4 N a結晶の物性〕
上記実施例の （1) または （2) で調製した dCP 4U ' 4Na結晶とW〇9
8/34942の実施例 20記載の方法と同じ方法で d C P 4 U · 4Naの白色 粉末 （凍結乾燥品） との物性を比較した。 (3) 機器分析
①純度検定
上記実施例 （1) および （2) で得られた d C P 4U · 4N a結晶及び各クロ マトグラフィ一処理による精製後の d CP 4U画分の純度を高速液体クロマトグ ラフィ一法で分析した結果を表 1および 2に示す。 なお、 高速液体クロマトダラ フィ一法は、 以下の条件で行った。
カラム： H I TACH I GEL# 3013 -N
(日立計測器サービス株式会社製）
溶出液： 10 %CH3CN、 0. 18M NH4Cし 0. 03M KH,P04,
0. 03M K2HP04
検出法： UV 262 nmによる検出
表 1 (DCC法）
Figure imgf000012_0001
(一） は未測定
表 2 (DPC法）
Figure imgf000012_0002
(一） は未測定
②結晶形 dCP4U * 4Na結晶 （3. 5水和物） の代表的な結晶の写真を図 1に示す。
③水分
カールフィッシヤー法により結晶品の水分含量を測定した結果、 乾燥の程度に より変動するものの、 6. 9〜17. 4重量％の水分で安定化し、 計算により d CP 4U 1分子に対し 3. 5〜 10分子の水分子が結合又は付着していることが 明らかとなった。
④融点
常法により融点を測定した結果、 結晶品の融点は 202〜210 であった。 なお、 凍結乾燥品の融点は約 195〜210 である。
⑤ X線回析
理学電機製 X線回折装置 R I NT 2500 V型を用い、 下記の測定条件で X線 回折スペクトルを測定した （測定誤差 ± 0. 1 ° )。 図 2及び表 3は d CP 4 U ' 4Na結晶の 3. 5水和物のデータであり、 図 3及び表 4は d C P 4 U · 4 N a結晶の 10水和物のデータである。 また、 参考として凍結乾燥品の X線回折 スぺクトルを図 4に示す。
(測定条件）
X線管球： C u— Kひ
X線出力： 50 kV— 300 mA
走査速度： 4. 0 ° 分
走査間隔： 0. 02°
測角範囲： 2〜40°
スリット ： DS— 0. 5° ， RS— 0 15 mm, S S— 0. 5 °
前処理 ： メノウ乳鉢にて粉砕 表 3
dCP4U-4N 結晶の 3.5水和物 ピーク番号 2 Θ (° ) 相対強度
1 6. 1 8 39
2 8. 82 38
3 1 1. 50 27
4 12. 32 79
5 13. 76 39
6 14. 44 83
8 16. 34 29
9 16. 84 34
1 0 1 7. 68 100
1 1 19. 02 8 1
1 2 1 9. 72 36
1 3 20. 86 35
1 4 22. 28 78
1 5 23. 54 47
1 6 25. 04 43
表 4
dCP4U'4Na結晶の 10水和物
ピーク番号 2 Θ (° ) 相対強度
1 5. 58 28
2 1 1. 34 62
3 1 1. 94 34
4 1 2. 92 27
5 14. 08 49
6 14. 96 66
7 1 5. 60 49
8 1 6. 62 25
9 1 7. 08 46
1 0 1 8. 28 27
1 1 1 8. 90 28
1 2 20. 20 39
1 3 2 1 - 66 72
1 4 22. 02 100
1 5 23. 02 90
⑥吸湿性
水分約 1 7. 4%の d C P 4U * 4N a結晶 （ 1 0水和物） を （ァ） 温度 2 5 、 相対湿度 57 %、 （ィ） 温度 2 5°C、 相対湿度 75%、 （ゥ） 温度 25° 相対湿度 93 %のそれぞれの条件下で 2日間保存した場合、 分解、 重量変化とも 観察されず、 安定で吸湿性を有しないことが確認された。 さらに、 （ェ） 温度 4 0で、 相対湿度 75 %の過酷な条件下で 7日間保存しても変化は観察されなかつ た。
これに対し、 凍結乾燥品 （初発水分含量：約 1 %) を （ァ） 温度 25°C、 相対 湿度 75%、 （ィ） 温度 2 5°C、 相対湿度 93 %のそれぞれの条件下で 2日間保 存した場合、 水分含量が徐々に増加し、 2日目には潮解し、 どろどろの状態とな つた。
⑦安定性 d C P 4U ' 4N a結晶 （1 0水和物） と凍結乾燥品をビンに密封し、 6 0 で 1 3日間保存した （加速試験）。 その結果、 結晶品の分解は全く観察されなか つたが、 凍結乾燥品は約 2. 2 %の純度の低下が観察され、 一部が分解している ことが明らかであった。
⑧ NMR
結晶品または凍結乾燥品をそのままジルコニァ製ロー夕に充填して '3 C— C P MAS— NMRの測定を行った。 測定条件を以下に示す。
l3C— CPMAS— NMR
1) 装置 Chemagnetics社製 CMX-300
2) 測定方法 CPMAS (s ideband suppresion
3) 測定温度
4) 観測核 ,3C
5) 観測周波数 75.502MHz
6) プロトン励起パルス幅 4.5MS
7) コンタクトタイム 0.5msec.
8) 観測幅 30.03kHz
9) 観測ポイント 2048
10) データポイント 16384
11) 観測繰り返し時間 15.0sec. (図 6、 図 7)，60.0se （図 5)
12) 化学シフト基準 へキサメチルベンゼン （外部標準 17.35ppm)
13) 試料回転速度 5 kHz
14) 積算回数 256回
図 5及び表 5に d C P 4U · 4 N a結晶の 3. 5水和物の l3C— C PMAS—
NMRスぺクトルを、 図 6及び表 6に d C P 4 U ' 4 a結晶の 1 0水和物の
13C— C PMAS— NMRスぺクトルを、 図 7及び表 7に d C P 4 Uの白色粉末
(凍結乾燥品） の '3 C— CPMAS— NMRスペクトルを示す。 なお、 図 5〜7 のピーク番号は表 5〜 7のピーク番号である。
表 5
dCP4U · 4Na結晶の 3.5水和物 (ppm)
(1) 166.1 (2) 156.2 (3) 150.9 (4) 141.6
(5) 138.4 (6) 101.3 (7) 99.2 (8) 93.2
(9) 84.9 (10) 80.6 (11) 76.7 (12) 73.1
(13) 69.0 (14) 67.2 (15) 62.2 (16) 43.9
表 6
dCP4U · 4 a結晶の 10水和物 (ppm)
(1) 167.4 (2) 157.8 (3) 151.6 (4) 139.0
(5) 117.9 (6) 102.6 (7) 99.3 (8) 93.3
(9) 90.1 (10) 87.3 (11) 80.6 (12) 77.2
(13) 75.0 (14) 73.9 (15) 72.0 (16) 67.0
(17) 63.1 (18) 60.4 (19) 42.0 (20) 40.8 表 7
dCP4Uの白色粉末 （凍結乾燥品） （ppm)
(1) 166.5 (2) 157.4 (3) 149.9 (4) 140.9
(5) 103.0 (6) 99.0 (7) 96.9 (8) 85.9
(9) 73.4 (10) 71.7 (11) 67.1 (12) 42.0
— 03)39.3 _ 一 実施例 2 ： UMPからの d C P 4Uの合成
脱水したピロりン酸のトリエチルァミン塩 （TEA— P P i ) (10 mm o 1 ), フオルムアミド 2. 5m l及びピリジン 7. 6m 1を加えて撹拌した。 一方、 別 の容器に脱水したゥリジン 5 ' —モノリン酸のトリプチルァミン塩 （UMP— T BA) ( 10mm o 1 ) に DMAC3. 6m 1、 ジォキサン 3. 2 m 1及びトリブ チルァミン 3. 3m 1を加えて撹拌し、 DPC 2. 3 m 1を滴下した。 室温で 1 時間撹拌して UMP— DP Pを生成させ、 先に調製しておいた TEA— P P i脱 水液に加えた。 室温で 1時間撹拌し、 UTPを生成させた。 更に別の容器に
2 ' —デォキシシチジン 5 ' —モノリン酸のトリプチルァミン塩（TB A— d C M P ) 4. 9 g (lOmmo 1)に DMAC 7. 2 m 1を加えて懸濁し、 D P C 2. 2m l (1. 1当量） を加えて 40分間撹拌した。 その後、 卜リブチルアミ ン （TBA) 9. 5m 1を加えて更に 20分間撹拌し、 d CMP- DPPを調製 した。 得られた d CM P- DP P溶液を、 先に調製しておいた UTP合成液に加 えて室温で 56時間撹拌した。 反応液に水を加えて反応を停止し、 30%水酸化 ナトリウム水溶液で pHを 1 1に調整した。 濃縮により溶媒を留去した後、 6 mo 1 /L塩酸で pH を 7. 0に調整し、 酢酸ェチルで分液を行った。 分液後の 水層を HP L C ( 2 7 2 nm) で分析した結果、 d C P 4 Uの合成収率は
37. 7%であった。 産業上の利用可能性
本発明方法により得られた d CP 4Uの結晶は、 高純度であるとともに、 凍結 乾燥品に比べて吸湿性もなく極めて安定であるため取り扱い易く、 医薬品原料と して有用である。
また、 本発明の d C P 4Uの製造法によれば、 安価な原料である UMPを使用 でき、 しかも高収率で d C P 4Uを製造することができ、 dCP4Uの大量合成 に好適な方法である。

Claims

請求の範囲
1. P1- (2 ' 一デォキシシチジン 5' ―) P4— （ゥリジン 5 ' —） テトラホ スフエー卜又はその塩の結晶。
2. P1— (2 ' 一デォキシシチジン 5 ' -) P4- (ゥリジン 5 ' ―) テトラホ スフェート · 4ナ卜リゥム塩の結晶。
3. 95 %以上の純度を有する請求項 1または 2記載の結晶。
4. 97%以上の純度を有し、 ゥリジン 5' —トリリン酸が 2 %以下である請求 項 1または 2記載の結晶。
5. 98%以上の純度を有し、 ゥリジン 5' —トリリン酸が 1 %以下である請求 項 1または 2記載の結晶。
6. 粗 P'— (2 ' —デォキシシチジン 5' —） P4- (ゥリジン 5 ' ―) テトラ ホスフェートを陰イオン交換ク口マトグラフィ一と活性炭クロマトグラフィーと を用いて精製し、 精製された P1— (2 ' 一デォキシシチジン 5' -) P4- (ゥ リジン 5 ' -) テトラホスフェート溶液に、 親水性有機溶媒を加えて P1—
(2 ' —デォキシシチジン 5 ' —） P4- (ゥリジン 5 ' —） テトラホスフエ一 トを結晶として析出させることを特徴とする請求項 1記載の結晶の製造法。
7. 精製が、 陰イオン交換クロマトグラフィーを行った後、 次いで活性炭クロマ トグラフィ一を行うものである請求項 6記載の製造法。
8. ゥリジン 5' —モノリン酸 （UMP)、 2 ' —デォキシシチジン 5 ' —モノ リン酸 （dCMP)、 ジフエ二ルホスホクロリデ一卜 （DPC) およびピロホス フェート （PP i) を反応させる、 Ρ'— (2 ' 一デォキシシチジン 5 ' -) Ρ4 - (ゥリジン 5' ―) テトラホスフェート （dCP4U) の製造法。
9. 最初に UMPと DPCを反応させて UMPジフエ二ルホスフエ一ト （UMP 一 DPP) を合成し、 これに P P iを反応させて反応液中にゥリジン 5 ' —トリ リン酸 （UTP) を生成させ、 得られた UTPを単離することなく、 DPC存在 下、 d CMPと UTPを反応させて d CP 4Uを製造する、 請求項 8記載の製造 法。
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