ES2211566T3 - Cristales dinucleotidicos. - Google Patents
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- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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Abstract
Cristales de P1-(2¿-desoxicitidina 5¿-)P4-(uridina 5¿)-tetrafosfato o una sal de los mismos.
Description
Cristales dinucleotídicos.
La presente invención se refiere a cristales de
P^{1}-(2'-desoxicitidina 5'-) P^{4}-(uridina
5'-)tetrafosfato (dCP4U) o a una sal farmacéuticamente aceptable de
los mismos (en adelante se puede denominar simplemente "dCP4U")
que son útiles como agentes terapéuticos contra la bronquitis
crónica, la sinusitis y similares; a un proceso para la producción
de dichos cristales; y a un proceso para producir eficazmente
dCP4U.
dCP4U representado por la siguiente fórmula
(I):
o una sal del mismo, es un agonista selectivo
para el receptor de purina P2Y2 y/o el receptor de purina P2Y4 y es
un compuesto que se podría desarrollar como agente terapéutico
contra la bronquitis crónica, la sinusitis y similares (véase WO
98/34942).
Hasta ahora, no ha sido posible obtener dCP4U en
forma de cristales, y se ha preparado dCP4U únicamente en forma de
un polvo blanco (sólido blanco) por liofilizado. Los productos en
polvo de dCP4U obtenidos convencionalmente tienen una pureza de tan
sólo 82% (medido por HPLC). En particular, es difícil separar
5'-trifosfato de uridina (UTP) que sirve como
material de partida de dCP4U, y se ha podido producir dCP4U
altamente purificado únicamente con gran dificultad por
cromatografia de intercambio de iones convencional (WO
98/34942).
El polvo blanco mencionado de baja pureza
presenta ciertos inconvenientes tales como la higroscopicidad. Como
consecuencia, la preparación de un producto farmacéutico a partir de
dCP4U debe llevarse a cabo en un aparato especial en el que esté
controlada estrechamente la humedad. Incluso después de la
preparación del producto farmacéutico, éste deberá ser envasado
herméticamente. Por otra parte, dado que el producto farmacéutico
tiene un período disponible muy corto debido a la escasa estabilidad
del producto en polvo, es deseable la obtención de cristales
estables y altamente purificados de dCP4U.
Se sintetiza dCP4U a partir de
5'-monofosfato de 2'-desoxicitidina
(dCMP) y UTP mediante el uso de un agente activante como
diciclohexilcarbodiimida (DCC). No obstante, los procesos
convencionales proporcionan un rendimiento de síntesis
considerablemente bajo, es decir, de tan sólo aproximadamente un 9%
en peso (véase el ejemplo 20 de WO 98/34942), y no pueden servir
nunca como procesos prácticos. Por consiguiente, también es deseable
desarrollar un proceso para producir dCP4U en un alto rendimiento y
a gran escala.
Teniendo en cuenta todo esto, uno de los objetos
de la presente invención consiste en proporcionar cristales estables
de dCP4U que son adecuados para la preparación de fármacos. Otro
objeto de la invención consiste en proporcionar un proceso para la
producción de cristales. Otro objeto más de la invención consiste en
proporcionar un proceso eficaz adecuado para la producción a gran
escala de dCP4U.
Los autores de la presente invención han llevado
a cabo un exhaustivo estudio sobre la estabilización de dCP4U, y han
descubierto que se puede preparar dCP4U con una pureza de 95% o más
por cromatografía de intercambio de iones en combinación con
cromatografía en la que se emplea carbón activado (cromatografía de
carbón activado) y que se pueden producir cristales de dCP4U a
partir de dicho dCP4U altamente purificado. Se ha demostrado que los
cristales dCP4U así obtenidos poseen una pureza considerablemente
más alta que la del polvo de dCP4U producido de manera convencional,
además de no presentar higroscopicidad y tener una alta
estabilidad.
Los autores de la invención han llevado a cabo
también un exhaustivo estudio sobre los métodos de síntesis de dCP4U
mediante el uso de 5'-monofosfato de uridina (UMP)
que resulta económica, en lugar de UTP, que es caro, y han observado
que se puede producir de manera eficaz dCP4U mediante el uso de
fosforocloridato de difenilo (DPC) y un pirofosfato (PPi). La
presente invención a sido llevada a cabo en función de estos
hallazgos.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona cristales de dCP4U.
La presente invención proporciona asimismo un
proceso para producir cristales de dCP4U, incluyendo dicho proceso
la purificación de dCP4U bruto por cromatografía de intercambio de
aniones y cromatografía de carbón activado y la adición de un
disolvente orgánico hidrófilo a una solución de dCP4U purificado
para hacer precipitar así dCP4U en forma de cristales.
La presente invención proporciona también un
proceso para producir dCP4U que incluye la reacción de UMP, dCMP,
DPC y PPi.
La figura 2 es una fotografía en la que se
muestra la forma de cristal de dCP4U.4Na (3.5 hidrato) cristalino.
Se tomó la fotografía en un microscopio polarizante (aumento: x 440)
en el que 1 mm de la imagen corresponde a 25 \mum.
La figura 2 muestra un espectro de difracción de
rayos X de dCP4U.4Na (3.5 hidrato) cristalino.
La figura 3 muestra un espectro de difracción de
rayos X de dCP4U.4Na (decahidrato) cristalino.
La figura 4 muestra un espectro de difracción de
rayos X de dCP4U en polvo blanco (producto liofilizado).
La figura 5 muestra un espectro de
^{13}C-CPMAS-RMN de dCP4U.4Na
(3.5-hidrato) cristalino.
La figura 6 muestra un espectro
^{13}C-CPMAS-RMN de dCP4U.4Na
(decahidrato) cristalino.
La figura 7 muestra un espectro de
^{13}C-CPMAS-RMN de dCP4U en polvo
blanco (producto liofilizado).
Los cristales de dCP4U de la presente invención
se obtienen por purificación de dCP4U en bruto utilizando medios
específicos, y la adición de un disolvente orgánico hidrófilo para
una solución de dCP4U purificado, para hacer precipitar así dCP4U
como cristales. A continuación, se describirá la presente invención
en relación con (1) la purificación de dCP4U y (2) la cristalización
de dCP4U.
Se puede purificar dCP4U por cromatografía de
intercambio de aniones en combinación con cromatografía de carbón
activado. Si bien las dos técnicas de cromatografía se pueden llevar
a cabo siguiendo una secuencia arbitraria, es preferible que la
cromatografía de intercambio de aniones preceda a la cromatografía
de carbón activado, con vistas a mejorar la pureza de dCP4U.
Se puede utilizar una resina estirénica o
acrílica como resina de intercambio de aniones en las técnicas de
cromatografía que se han descrito. Entre los ejemplos de resinas que
se pueden utilizar se incluyen resinas de intercambio de aniones
fuertemente básicas como AMBERLITE IRA 402 (Rohm & Haas Co.),
DIAION PA-312, y DIAION SA-11A
(Mitsubishi Chemical Co. Ltd.) y resinas de intercambio de aniones
débilmente básicas como AMBERLITE IRA 67 (Rohm & Haas Co.) y
DIAION WA-30 (Mitsubishi Chemical Co. Ltd.).
El carbón activado puede presentarse en forma de
carbón activado de tipo cromatografía que está triturado o
configurado en partículas, y puede incluir productos comerciales
(v.g., productos de Wako Pure Chemical Industries, Ltd. y Futamura
Chemical Industries, Co. Ltd.).
La cromatografía se puede llevar a cabo de forma
discontinua, utilizando una columna, etc. Cuando se lleva acabo por
cromatografía de columna, se puede utilizar una solución ácida
acuosa o una mezcla de la misma con una sal con una concentración
iónica potenciada, como por ejemplo cloruro sódico, como eluyente
para la cromatografía de intercambio de aniones; y se puede utilizar
agua o una solución acuosa de un álcali como por ejemplo hidróxido
sódico, como eluyente para la cromatografía de columna de carbón
activado. Se puede llevar a cabo un ensayo preliminar a pequeña
escala con el fin de seleccionar la concentración apropiada de cada
eluyente dentro del intervalo de 0,001 M a 10 M.
Se cristaliza dCP4U por adición de un disolvente
orgánico hidrófilo a una solución que contiene dCP4U purificado de
esta forma.
Entre los ejemplos de disolventes orgánicos
hidrófilos que se pueden utilizar se incluyen alcoholes que tienen
seis o menos átomos de carbono, como metanol y etanol; cetonas como
acetona; éteres como dioxano; nitrilos como acetonitrilo; y amidas
como dimetilformamida: Entre ellos, se prefieren en particular los
alcoholes, sobre todo etanol.
Más específicamente, se trata opcionalmente una
solución del dCP4U así purificado, o una suspensión espesa obtenida
por concentración de la solución, para ajustar así el pH en
5-10, preferiblemente 6-9, y se
añade un disolvente orgánico hidrófilo a la solución o suspensión
espesa a 60ºC o menos, preferiblemente 20ºC o menos, para hacer
precipitar así el soluto como cristales estables de dCP4U.
Los cristales de dCP4U así obtenidos de la
presente invención contienen dCP4U en una cantidad de 95% o más y
UTP en una cantidad de 3% o menos. Preferiblemente, los cristales de
dCP4U contienen dCP4U en una cantidad de 97% o más, y UTP en una
cantidad de 2% o menos. Preferiblemente, los cristales de dCP4U
contienen dCP4U en una cantidad de 98% o más y UTP en una cantidad
de 1% o menos.
Dichos cristales de dCP4U de alta pureza pueden
presentarse en forma de una sal, hidrato, o sal de hidrato. Entre
los ejemplos de sales se incluyen sales farmacéuticamente aceptables
como por ejemplo sales de metal alcalino como sales sódicas y sales
potásicas; sales de metal alcalinotérreo como sales cálcicas y sales
de magnesio; y sales de amonio. El dCP4U puede sustituirse con
1-4 átomos metálicos para formar una sal.
Este hidrato puede incluir 1-14
moléculas de agua que están unidas o se adhieren a una molécula de
dCP4U, y la sal de hidrato puede incluir 1-14
moléculas de agua unidas o adheridas a una molécula de una sal de
metal alcalino de dCP4U.
Por otra parte, los cristales de dCP4U según la
presente invención incluyen también sus tautómeros.
Opcionalmente, se secan los cristales así
obtenidos de dCP4U según el método habitual, como por ejemplo por
secado a presión reducida, secado bajo una corriente de aire o
secado por calentamiento, y después se colocan en un contenedor
(v.g., una botella, una bolsa, una lata, una ampolla). El envasado
en el contenedor se puede llevar a cabo de manera que el contenedor
esté abierto, cerrado, herméticamente cerrado, o sellado. El envase
en estado de abierto al aire no es el preferible si se tiene en
cuenta el mantenimiento de la estabilidad en almacenamiento de los
cristales.
El proceso para producir dCP4U según la presente
invención incluye la reacción de UMP, dCMP, DPC y PPi.
Específicamente, el proceso incluye la reacción
de UMP con DPC para sintetizar así difenilfosfato de UMP
(UMP-DPP); el posterior tratamiento de la mezcla de
reacción que contiene UMP-DPP con PPi para formar
así UTP en la mezcla; y la reacción del UTP así formado, sin
aislarlo de la mezcla de reacción, con dCMP en presencia de DPC,
para formar así dCP4U objetivo.
En la síntesis de UMP-DPP a
partir de UMP, se puede disolver una sal de UMP trialquilamina
preparada de forma rutinaria (v.g., sal de UMP tributilamina) en un
disolvente. Entre los ejemplos de disolventes se incluyen amidas
como DMF y dimetilacetamida (DMAC); éteres cícliclos como dioxano y
tetrahidrofurano; cetonas como acetona y dimetilimidazolidinona,
triamida hexametilfosfórica, o una mezcla de dos o más de ellas.
Posteriormente, se añaden DPC y la trialquilamina opcional a la
solución, y se deja reaccionar la mezcla a 10-50ºC
durante aproximadamente 30 minutos a cinco horas.
Los PPi que reaccionan con
UMP-DPP son preferiblemente sales alcalinas
orgánicas de PPi. Entre los ejemplos de sales se incluyen una sal de
hexilamina, una sal de dibutilamina, una sal de trietilamina y una
sal de tributilamina.
En la reacción de UMP-DPP con una
sal alcalina orgánica de PPi, se puede disolver la sal alcalina
orgánica de PPi en un disolvente. Entre los ejemplos de disolventes
se incluyen amidas como DMF, DMAC y formamida; éteres cíclicos como
dioxano y tetrahidrofurano; cetonas como acetona y
dimetilimidazolidinona, triamida hexametilfosfórica,
dimetilsulfóxido, acetonitrilo, o una mezcla de dos o más de ellos.
A continuación, se añade la solución a la solución de
UMP-DPP así sintetizada y se deja reaccionar la
mezcla a 10-50ºC durante aproximadamente 30 minutos
a cinco horas.
La reacción entre UMP-DPP y la
sal alcalina orgánica de PPi se puede llevar a cabo en presencia de
una base adecuada. Entre los ejemplos de bases se incluyen bases de
piridina como piridina, 2,6-lutidina,
2,4-lutidina, \alpha-picolina,
\beta-picolina, \gamma-picolina,
2,4-dimetilaminopiridina,
\alpha-colidina, \beta-colidina
y \gamma-colidina, prefiriéndose en particular
piridina. Asimismo, se incluye también un disolvente básico para la
reacción en las bases utilizadas en la presente invención. La
concentración de la base no está limitada de manera particular.
Preferiblemente, se añade la base en una cantidad de 6 equivalentes
o más en función de UMP, más preferiblemente 18 equivalentes o
más.
A través de la reacción entre
UMP-DPP y la sal alcalina orgánica de PPi, se
sintetiza UTP en la mezcla de reacción. Se hacen reaccionar el UTP
así formado y dCMP en presencia de DPC, para sintetizar así
dCP4U.
Si bien se puede añadir dCMP por sí mismo a la
mezcla de reacción, se convierte dCMP en difenilfosfato de dCMP
(dCMP-DPP) de manera similar a la empleada en el
caso de UMP, y se puede añadir también dCMP-DPP.
La reacción de dCP4U se puede llevar a cabo
añadiendo a la solución de UTP sintetizada que se ha mencionado, DPC
en una cantidad de 1,1 equivalentes o más y dCMP o
dCMP-DPP en una cantidad de 0,5 a 1,5 equivalentes
en función del UMP empleado como material de partida, y se deja
reaccionar la mezcla a 10-50ºC durante
aproximadamente 30 minutos a cinco horas.
Se purifica el dCP4U así obtenido y se cristaliza
tal como se ha mencionado antes para obtener así los cristales de
dCP4U de la presente invención.
La presente invención quedará mejor descrita con
mayor detalle con ejemplos, que no deberán considerarse como
limitativos de la invención en absoluto.
Se preparó dC4U a través del método de rutina tal
como se describe en WO 98/34942 mediante el uso de UTP, dCMP y DCC.
Se llevó a cabo la reacción en una escala de 20 mmoles.
Se diluyó la solución de dCP4U así obtenida con
agua para ajustar así el volumen global a 1.000 ml y se aplicó la
solución diluida a una columna cargada con resina de intercambio de
iones básica intermedia (AMBERLITE IRA-67, producto
de Rohm & Haas Co.). Se llevó a cabo la elución sucesivamente
mediante el uso de agua, una solución 0,18 M acuosa de ácido
clorhídrico, y una solución acuosa 0,005 M de ácido clorhídrico que
contenía cloruro sódico 0,5 M, para recoger así fracciones que
contenían dCP4U.
Se aplicaron las fracciones de dCP4U así
obtenidas (4000 ml) a una columna cargada con carbón activado de
tipo cromatografía (Taiko Granular Activated Charcoal SGP, producto
de Futamura Chemical Industries, Co., Ltd.) y se eluyó dCP4U
mediante el uso de una solución acuosa 0,05 M de hidróxido sódico
(8000 ml).
Se combinaron las fracciones de dCP4U así
obtenidas y se concentraron para preparar así una suspensión espesa.
Se ajustó el pH de la suspensión espesa a 6,0. Se agitó la
suspensión espesa al mismo tiempo que se añadía gradualmente etanol
a la suspensión espesa y se enfrió posteriormente la suspensión
espesa resultante a 10ºC con agitación, para hacer precipitar así
cristales de dCP4U.4Na. Se separaron los cristales para producir así
8,9 g de cristales de dCP4U.4N. Se secaron los cristales aislados a
presión reducida a aproximadamente 60ºC durante aproximadamente
cuatro horas y después se sometieron a análisis instrumentales.
Se disolvió UTP.3Na (12,8 kg) en agua (135 L) y
se aplicó la solución resultante a una columna cargada con resina de
intercambio de cationes (producto de Mitsubishi Chemical Co., Ltd.).
Se combinaron la solución que había pasado a través de la columna y
las fracciones que habían sido eluidas con agua y se añadió
gradualmente tributilamina (TBA; 13,6 kg) a la solución combinada
con agitación para su neutralización. Se concentró la solución y se
añadió formamida (10 kg) a la solución. Se deshidrató la solución
resultante por ebullición con dioxano. A continuación, se diluyó la
materia deshidratada con piridina (11,6 kg) para preparar así una
solución en piridina de UTP.
Se añadió otro tanque que contenía metanol (18
L), dCMP (7,5 kg). Se añadió gradualmente TBA (4,5 kg) a la solución
con agitación, se calentó la solución a 60ºC. Después de disolver
los ingredientes, se concentró la solución a sequedad. Se secó
posteriormente la materia seca al vacío a 75ºC y se trituró. Se
suspendió la materia triturada (10,3 kg) en dimetilacetamida (DMAC)
(16,7 kg) y se añadió fosforocloridato de difenilo (DPC) (4,4 kg) a
la suspensión, y se agitó la mezcla durante 10 minutos. A
continuación, se añadió TBA (10,8 kg) a la mezcla y se agitó la
mezcla resultante durante 30 minutos para preparar así una solución
de dCMP-DPP.
Se añadieron a la solución de
dCMP-DPP así preparada, la solución de piridina de
UTP que había sido preparada según el procedimiento mencionado con
agitación. Una vez completada la adición, se agitó la mezcla a
temperatura ambiente durante toda la noche, y se terminó la reacción
añadiendo agua desionizada.
Se añadió a la mezcla anterior, una solución de
hidróxido sódico acuosa al 30% (31 L). Se agitó la mezcla durante 30
minutos y se separó el TBA liberado por reparto. Se añadió una
solución de ácido clorhídrico 6 moles/L a la capa acuosa para
ajustar así el pH de la solución a aproximadamente 7. Se concentró
la solución a través de la eliminación del disolvente y se añadió un
volumen equivalente de etanol al 95% a la solución concentrada. Se
dejó en reposo la solución resultante durante toda la noche. Se
eliminó la capa superior de la mezcla, es decir, una capa de etanol,
por succión, y se añadió agua a los precipitados pegajosos
resultantes para disolver así los precipitados. Se eliminó el
disolvente residual por concentración del disolvente.
Se ajustó el volumen global de la solución de
dCP4U así sintetizada en 2.500 L y se aplicó la solución a una
columna cargada con resina de intercambio de aniones básica
intermedia (AMBERLITE IRA-97, producto de Rohm &
Haas Co.) Se llevó a cabo la elución sucesivamente con agua, una
solución 0,1 mol/L acuosa de ácido clorhídrico y una solución acuosa
0,005 moles/L de ácido clorhídrico que contenía cloruro sódico 0,4
moles/litro, para recoger así fracciones que contenían dCP4U.
Se aplicaron las fracciones de dCP4U así
obtenidas (2100 L) a una columna cargada con carbón activado de tipo
cromatografía (Taiko Granular Activated Carbon SGP, producto de
Futamura Chemical Industries, Co., Ltd.) y se eluyó dCP4U mediante
el uso de una solución acuosa 0,05 moles/L de hidróxido sódico (1200
L).
Se combinaron las fracciones así obtenidas y se
concentraron. Se ajustó el pH de la solución resultante a 7,5
mediante el uso de una solución acuosa al 30% de hidróxido sódico.
Se agitó la solución al mismo tiempo que se añadió gradualmente
etanol al 95% a la solución, haciendo precipitar así cristales de
dCP4U.4Na. Se separaron los cristales y se secaron a 60ºC durante
cuatro horas para producir así 4,2 kg de cristales dCP4U.4Na
(contenido en agua: 5,9%, rendimiento aislado: 22%).
Se sometieron a análisis instrumental los
cristales dCP4U.4Na preparados en (1) o (2) del ejemplo 1 y polvo
blanco de dCP4U.4Na (producto liofilizado) que se había preparado
siguiendo el mismo método que el descrito en el ejemplo 20 de WO
98/34942. Se compararon los cristales con el producto liofilizado en
lo que se refiere a las propiedades físicas.
Se sometieron a análisis de pureza los cristales
de dCP4U.4Na obtenidos en (1) y (2) del ejemplo 1, y las fracciones
de dCP4U tras la purificación por cromatografía, por cromatografía
de líquidos de alto rendimiento. En las tablas 1 y 2 se muestran los
resultados. Las condiciones para la cromatografía de líquidos de
alto rendimiento son las que se describen a continuación.
Columna: HITACHIGEL #3013-N
(producto de Hitachi Keisokuki Service)
Eluyente: CH_{3}CN 10%, NH_{4}Cl 0,18 M,
KH_{2}PO_{4} 0,03 M y K_{2}HPO_{4} 0,03 M.
Método de detección: detección UV a 262 nm
(-):No medio, *):IE: intermedio de iones,
AC:carbón activado
(-):no medio, *):IE: intermedio de iones,
AC:carbón activado
En la figura 1 se muestra una fotografía de una
forma de cristal típica de cristales dCP4U.4Na (3.5 hidrato).
Se midió el contenido en agua de los cristales de
dCP4U.4Na según el método de Karl Fischer. Se observó que los
cristales de dCP4U.4Na se estabilizaban a un contenido en agua
comprendido entre 6,9 y 17,4% en peso, que varió con arreglo al
grado de secado. Los resultados del cálculo demuestran aparentemente
que 3,5-10 moléculas de agua se unen o adhieren a
una molécula de dCP4U.
Se midió el punto de fusión de los cristales
dCP4U.4Na según un método convencional. Se observó que el punto de
fusión era 202-210ºC. El punto de fusión del
producto liofilizado fue aproximadamente
195-210ºC.
Se sometieron los cristales de dCP4U.4Na a
difracción de rayos X mediante el uso de un aparato de difracción de
rayos X (Modelo: RINT2500V, producto de Rigaku Denki) en las
siguientes condiciones (error de medida: \pm0,1º). El espectro de
difracción de rayos X así obtenido y los datos pico del
3.5-hidrato de dCP4U.4Na se muestran en la figura 2
y en la tabla 3, respectivamente. De manera similar, los datos del
espectro de difracción de rayos X y los datos pico del decahidrato
de dCP4U.4Na se muestran en la figura 3 y en la tabla 4,
respectivamente. Por otra parte, en la figura 4 se muestra el
espectro de difracción de rayos X del producto liofilizado como
referencia.
Tubo de rayos X: Cu-K\alpha
Salida de rayos X: 50 kV-300
mA
Velocidad de exploración: 4,0º/minuto
Intervalo de exploración: 0,02º
Intervalo de medida del ángulo:
2-40º
Inclinación: DS-0,5º,
RS-0,15 mm, SS-0,5º
Pre-tratamiento: Triturado
mediante el uso de un mortero de ágata
Se dejaron en reposo cristales de dCP4U.4Na
(decahidrato) que tenían un contenido en agua de aproximadamente
17,4% durante dos días en las siguientes condiciones: a), b) y c):
a) a 25ºC y una humedad relativa de 57%; b) a 25ºC y una humedad
relativa de 75%; y c) a 25ºC y una humedad relativa de 93%. No se
observó descomposición ni ningún cambio en el peso en los tres casos
mencionados. Se demostró que los cristales eran estables y no
presentaban higroscopicidad. Por otra parte, se dejaron en reposo
los mismos cristales durante siete días en condiciones severas d):
d) 40ºC y una humedad relativa de 75%. No se observó ningún cambio
en este caso.
En contraposición, cuando se almacenó un producto
liofilizado (contenido en agua inicial: aproximadamente 1%) durante
dos días en las siguientes condiciones b) o c): b) 25ºC y una
humedad relativa de 75% y c) a 25ºC y una humedad relativa de 93%,
en el segundo día de almacenamiento, el producto adoptó un estado de
tipo lodoso debido al aumento gradual de contenido en agua.
Se colocaron por separado los cristales de
dCP4U.4Na (decahidrato) y un producto liofilizado en botellas, que
fueron selladas a continuación y almacenadas durante 13 días a 60ºC
(prueba de aceleración). No se observó ninguna descomposición de los
cristales. En contraste, se observó que el producto liofilizado se
había descompuesto parcialmente tal como se demostró al observar una
pérdida de pureza del producto de aproximadamente 2,2%.
Se introdujeron los cristales de dCP4U.4Na y el
producto liofilizado en un rotor hecho de circonia, y se midió el
espectro ^{13}C-CPMAS-RMN
correspondiente. Las condiciones para la medición fueron las que se
indican a continuación.
^{13}C-CPMAS-RMN
| 1) Aparato | CMX-300 (producto de Chemagnetics) |
| 2) Método para la medida | CPMAS (supresión de banda lateral) |
| 3) Temperatura de medida | temperatura ambiente |
| 4) Núcleo observado | ^{13}C |
| 5) Frecuencia de observación | 75,502 MHz |
| 6) Anchura de pulso de excitación de protón | 4,5 \mus |
| 7) Tiempo de contacto | 0,5 mseg. |
| 8) Ancho de medida | 30,03 kHz |
| 9) Puntos de medida | 2048 |
| 10) Puntos de datos | 16384 |
| 11) Tiempo de repetición | 15,0 seg (Figuras 6 y 7) 60,0 seg (fig. 5) |
| 12) Patrón de desplazamiento químico | hexametilbenceno (patrón externo 17,35 ppm) |
| 13) Velocidad de rotación de muestra | 5 kHz |
| 14) Integración | 256 veces |
La figura 5 y la tabla 5 presentan un espectro de
^{13}C-CPMAS-RMN de 3,5 hidrato de
dCP4U.4Na cristalino y los datos pico respectivamente. La figura 6 y
la tabla 6 presenta el espectro de
^{13}C-CPMAS-RMN de decahidrato de
dCP4U cristalino y los datos pico respectivamente. La figura 7 y la
tabla 7 presentan el espectro de
^{13}C-CPMAS-RMN de dCP4U en forma
de un polvo blanco (producto liofilizado) y los datos pico,
respectivamente. Los numerales en las figuras 5 a 7 se refieren a
los números pico correspondientes en las tablas 5 a 7.
Se añadieron formamida (2,5 ml) y piridina (7,6
ml) a sal de trietilamina deshidratada (10 mmoles) de pirofosfato
(TEA-PPi), seguido de agitación de la mezcla
resultante. Se añadieron a una sal de tributilamina deshidratada de
5'-monofosfato de uridina (UMP-TBA)
(10 mmoles) colocada en otro recipiente, DMAC (3,6 ml), dioxano (3,2
ml) y tributilamina (3,3 ml) y se agitó, y se añadió DPC (2,3 ml),
gota a gota. Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante una
hora para formar así UMP-DPP, que fue añadido a la
solución deshidratada de TEA-PPi antes mencionada
preparada con antelación. Se agitó la mezcla de reacción a
temperatura ambiente durante una hora para formar UTP. Se añadió
DMAC (7,2 ml) a una sal de tributilamina de
5'-monofosfato de 2'-desoxicitidina
(TBA-dCMP) (4,9 g, 10 mmoles) colocada en otro
recipiente, para formar así una suspensión y se añadió DPC (2,2 ml,
1,1 equivalentes) a la suspensión. Se agitó la mezcla resultante
durante 40 minutos y se añadió tributilamina (TBA) (9,5 ml) a la
mezcla. Se siguió agitando durante otros 20 minutos para preparar
así dCMP-DPP. Se añadió la solución de
dCMP-DPP así preparada a la solución de UTP
sintetizada que se ha mencionado preparada con antelación y se agitó
la mezcla a temperatura ambiente durante 56 horas. Se terminó la
reacción añadiendo agua y se ajustó el pH de la mezcla de reacción a
11 añadiendo una solución acuosa de hidróxido sódico al 30%. Después
de eliminar el disolvente por concentración, se ajustó el pH a 7,0
añadiendo un ácido clorhídrico 6 mol/L. Se repartió la mezcla con
acetato de etilo. Se sometió a análisis de HPLC la capa acuosa
formada por reparto (272 nm), revelando que el rendimiento de
síntesis de dCP4U fue 37,7%.
Tal como se ha descrito anteriormente, los
cristales de dCP4U obtenidos a través del proceso de la presente
invención tienen una alta pureza y una alta estabilidad y no poseen
higroscopicidad en comparación con el producto liofilizado,
sirviendo así como una útil materia prima para la preparación de
sustancias farmacéuticas.
El proceso para producir dCP4U con arreglo a la
presente invención premite el uso de UMP económico como materia
prima y proporciona un alto rendimiento. Por consiguiente, dicho
proceso es adecuado para la síntesis a gran escala de dCP4U.
Claims (10)
1. Cristales de
P^{1}-(2'-desoxicitidina 5'-)P^{4}-(uridina
5')-tetrafosfato o una sal de los mismos.
2. Cristales de
P^{1}-(2'-desoxicitidina 5'-)P^{4}-(uridina
5')-tetrafosfato.4Na.
3. Cristales según la reivindicación 1 ó 2 que
tienen una pureza de al menos 95%.
4. Cristales según la reivindicación 1 ó 2 que
tienen una pureza de al menos 97% y que contienen 2% o menos de
5'-trifosfato de uridina.
5. Cristales con arreglo a la reivindicación 1 ó
2 que tienen una pureza de al menos 98% y que contienen 1% o menos
de 5'-trifosfato de uridina.
6. Un proceso para producir cristales tal como se
ha mencionado en la reivindicación 1, consistiendo dicho proceso en
someter P^{1}-(2'-desoxicitidina 5')
P^{4}-(uridina 5')-tetrafosfato bruto a un proceso
de purificación de cromatografía de intercambio de aniones y
cromatografía de carbón activado y la adición, a la solución
resultante de P^{1}-(2'-desoxicitidina
5'-)P^{4}-(uridina 5')-tetrafosfato purificado, un
disolvente orgánico hidrófilo, para causar así la precipitación de
P^{1}-(2'-desoxicitidina 5'-)P^{4}-(uridina
5')-tetrafosfato en forma de cristales.
7. Un proceso según la reivindicación 6, en el
que el proceso de purificación consiste en cromatografía de
intercambio de aniones realizada antes y después de la cromatografía
de carbón activado.
8. Cristales según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, uniéndose o adheriéndose
1-14 moléculas de agua a una molécula de
P^{1}-(2'-desoxicitidina 5'-)P^{4}-(uridina
5')-tetrafosfato o una sal del mismo.
9. Cristales según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, uniéndose o adheriéndose 3,5 moléculas de
agua a una molécula de P^{1}-(2'-desoxicitidina
5'-)P^{4}-(uridina 5')-tetrafosfato o una sal del
mismo.
10. Cristales según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, uniéndose o adhiriéndose 10 moléculas de
agua a una molécula de P^{1}-(2'-desoxicitidina
5')P^{4}-(uridina 5')-tetrafosfato o una sal del
mismo.
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