DE60021629T2

DE60021629T2 - Dinukleotid-Kristalle

Info

Publication number: DE60021629T2
Application number: DE60021629T
Authority: DE
Inventors: Kenya Kurume-shi Mori; Takanori Choshi-shi Miyashita; Hideaki Choshi-shi Maeda; Hiroshi Choshi-shi Sato; Yutaka Choshi-shi Noda
Original assignee: Yamasa Corp
Current assignee: Inspire Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1999-06-30
Filing date: 2000-06-30
Publication date: 2006-01-05
Anticipated expiration: 2020-07-01
Also published as: DE60006814T2; EP1191032A4; CN1144811C; PL202200B1; CN1359387A; BR0012205A; KR100593723B1; EP1362862A1; EP1191032B1; CZ20014502A3; ZA200110468B; EP1191032A1; US6617444B1; PL202176B1; ES2245431T3; PL352363A1; JP3421666B2; NO20016381D0; AU767136B2; CA2376860A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur effizienten Herstellung von P¹-(2'-Desoxycytidin-5')-P⁴-uridin-5'-)tetraphosphat (dCP4U) oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon (nachfolgend einfach als "dCP4U" bezeichnet), die als therapeutisches Mittel für chronische Bronchitis und Sinusitis brauchbar sind.
Stand der Technik
Das durch die folgende Formel (I) dargestellte dCP4U
oder ein Salz davon ist ein selektiver Agonist für P2Y2-Purin-Rezeptor und/oder P2Y4-Purin-Rezeptor und ist eine Verbindung, von der erwartet wird, dass sie als therapeutisches Mittel für chronische Bronchitis, Sinusitis und dergleichen entwickelt wird (siehe WO 98/34942).
Bis jetzt war es nicht möglich, dCP4U in kristallisierter Form zu erhalten, und dCP4U wurde nur in Form eines weißen Pulvers (weißer Feststoff) durch Gefriertrocknen erhalten. Die konventionell erhaltenen pulverförmigen Produkte von dCP4U besitzen eine Reinheit, die so gering ist wie 82% (gemessen mittels HPLC). Es ist insbesondere schwierig, Uridin-5'-triphosphat (UTP), das als Ausgangsmaterial für dCP4U dient, zu trennen, und hoch gereinigtes dCP4U wurde nur mit großen Schwierigkeiten über eine üblicherweise verwendete Ionen-Austausch-Chromatographie hergestellt (WO 98/34942).
Das vorstehend genannte weiße Pulver geringer Reinheit weist Nachteile, wie z.B. Hygroskopizität, auf. Die Herstellung eines Arzneimittels aus dCP4U muss deshalb in einer speziellen Vorrichtung durchgeführt werden, in der die Feuchtigkeit scharf kontrolliert wird. Auch nach der Herstellung eines Arzneimittels muss das Produkt dicht verpackt sein. Da das Arzneimittel aufgrund schlechter Stabilität des pulverförmigen Produkts eine sehr kurze Nutzungszeit besitzt, war es ein Bedürfnis, hochreine und stabile Kristalle von dCP4U zu erhalten.
dCP4U wird aus 2'-Desoxycytidin-5'-monophosphat (dCMP) und UTP unter Verwendung eines Aktivators, wie z.B. Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), synthetisiert. Die konventionellen Verfahren liefern jedoch eine ziemlich niedrige Synthese-Ausbeute; d.h., so niedrig wie ca. 9 Gew.-% (siehe Beispiel 20 der WO 98/34942), und kommen für ein Verfahren in der Praxis nicht in Frage. Es bestand deshalb ein Bedürfnis für die Entwicklung eines Verfahrens zur Herstellung von dCP4U mit hoher Ausbeute und zur Großproduktion. WO 99/05155 betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Di(uridin-5'-tetraphosphat) und Salzen davon.
Im Hinblick auf die vorhergehenden Ausführungen ist es eine Aufgabenstellung der vorliegenden Erfindung, ein effizientes Verfahren bereitzustellen, das für eine großtechnische Herstellung von dCP4U geeignet ist.
Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Anmeldung beschreibt, dass dCP4U mit einer Reinheit von 95% oder mehr hergestellt werden kann über eine Anionenaustausch-Chromatographie in Kombination mit einer Chromatographie, die Aktivkohle verwendet (Aktivkohle-Chromatographie), und dass aus einem solchen hochgereinigten dCP4U dCP4U-Kristalle hergestellt werden können. Die so erhaltenen dCP4U-Kristalle zeigten eine beträchtlich höhere Reinheit als die von konventionell hergestelltem dCP4U-Pulver, keine Hygroskopizität und eine hohe Stabilität.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben außerdem Untersuchungen an Methoden zur Synthese von dCP4U unter Verwendung von nicht teurem Uridin-5'-monophosphat (UMP) anstelle des teuren UTP durchgeführt und haben festgestellt, dass dCP4U unter Verwendung von Diphenylphosphorchloridat (DPC) und einem Pyrophosphat (PPi) effektiv hergestellt werden kann. Auf der Basis dieser Feststellungen wurde die vorliegende Erfindung erzielt.
Die vorliegende Anmeldung beschreibt Kristalle von dCP4U.
Die vorliegende Anmeldung beschreibt auch ein Verfahren zur Herstellung von Kristallen von dCP4U, das umfasst: Reinigen von rohem dCP4U über Anionenaustausch-Chromatographie und Aktivkohle-Chromatographie und Zugeben eines hydrophilen organischen Lösungsmittels zu der Lösung von gereinigtem dCP4U, wodurch dCP4U in Form von Kristallen ausfällt.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von dCP4U durch Umsetzen von UMP, dCMP, DPC und PPi, wie im Anspruch 1 definiert, bereit.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Photo, das die Kristallform von kristallinem dCP4U·4Na(3,5-Hydrat) zeigt. Das Photo wurde unter einem Polarisationsmikroskop (Vergrößerung: 440x) gemacht, wobei 1 mm des Bildes 25 μm entspricht.
2 zeigt ein Röntgenbeugungsdiagramm von kristallinem dCP4U·4Na(3,5-Hydrat).
3 zeigt ein Röntgenbeugungsdiagramm von kristallinem dCP4U·4Na(Decahydrat).
4 zeigt ein Röntgenbeugungsdiagramm eines weißen pulverförmigen dCP4U (gefriergetrocknetes Produkt).
5 zeigt ein ¹³C-CPMAS-NMR-Spektrum von kristallinem dCP4U·4Na(3,5-Hydrat).
6 zeigt ein ¹³C-CPMAS-NMR-Spektrum von kristallinem dCP4U·4Na(Decahydrat).
7 zeigt ein ¹³C-CPMAS-NMR-Spektrum von weißem pulverförmigem dCP4U (gefriergetrocknetes Produkt).
Beste Art zur Durchführung der Erfindung
Die dCP4U-Kristalle werden durch Reinigung von rohem dCP4U unter Verwendung spezifischer Mittel und Zusatz eines hydrophilen organischen Lösungsmittels zu einer Lösung von gereinigtem dCP4U, um dadurch dCP4U als Kristalle auszufällen, erhalten. Es werden (1) Reinigung von dCP4U und (2) Kristallisation von dCP4U beschrieben.
(1) Reinigung von dCP4U
dCP4U kann gereinigt werden durch Anionenaustausch-Chromatographie in Kombination mit Aktivkohle-Chromatographie. Obwohl die zwei Chromatographie-Techniken in beliebiger Folge durchgeführ werden können, geht, im Hinblick auf eine Verbesserung der Reinheit von dCP4U, die Anionenaustausch-Chromatographie vorzugsweise der Aktivkohle-Chromatographie voraus.
Als Anionenaustausch-Harz kann in den vorstehend beschriebenen Chromatographie-Verfahren Styrol- oder Acrylharz als Ionen-Austausch-Harz verwendet werden. Beispiele von Harzen, die verwendet werden können, umfassen stark basische Anionenaustausch-Harze, wie z.B. AMBERLITE IRA 402 (Rohm & Haas Co.), DIAION PA-312 und DIAION SA-11A (Mitsubishi Chemical Co. Ltd.), und schwach basisches Anionenaustausch-Harze, wie z.B. AMBERLITE IRA 67 (Rohm & Haas Co.) und DIAION WA-30 (Mitsubishi Chemical Co. Ltd.).
Die Aktivkohle kann in Form einer Aktivkohle von Chromatographie-Qualität vorliegen, die zermahlen oder zu Teilchen geformt ist, und kann im Handel erhältliche Produkte umfassen (z.B. solche von Wako Pure Chemical Industries, Ltd. und Futamura Chemical Industries, Co., Ltd.).
Die Chromatographie kann unter Verwendung einer Säule usw. ansatzweise durchgeführt werden. Wenn die Säulenchromatographie durchgeführt wird, kann als Eluens für die Anionenaustausch-Chromatographie eine wässerige saure Lösung oder eine Mischung davon mit einem Salz mit erhöhter Innenstärke, wie z.B. Natriumchlorid, verwendet werden; und Wasser oder eine wässerige Alkalilösung, wie z.B. von Natriumhydroxid, kann als Eluens für die Aktivkohle-Säulenchromatographie verwendet werden. Ein vorhergehender Test in geringem Maßstab kann durchgeführt werden, um die geeignete Konzentration jedes Eluens innerhalb des Bereichs von 0,001 bis 10 M auszuwählen.
(2) Kristallisation von dCP4U.
dCP4U wird durch Zugabe eines hydrophilen organischen Lösungsmittels zu einer Lösung, die das so gereinigte dCP4U enthält, auskristallisiert.
Beispiele der hydrophilen organischen Lösungsmittel, die verwendet werden können, umfassen Alkohole mit 6 oder weniger Kohlenstoffatomen, wie z.B. Methanol und Ethanol; Ketone, wie z.B. Aceton; Ether, wie z.B. Dioxan; Nitrile, wie z.B. Acetonitril; und Amide, wie z.B. Dimethylformamid. Von diesen sind Alkohole, insbesondere Ethanol, besonders bevorzugt.
Spezifischer ausgedrückt wird eine Lösung des so gereinigten dCP4U oder eine durch Aufkonzentrieren der Lösung erhaltenen Aufschlämmung gegebenenfalls zur Einstellung des pH-Wertes auf 5 bis 10, vorzugsweise 6 bis 9, behandelt, und ein hydrophiles organisches Lösungsmittel wird zur Lösung oder Aufschlämmung bei 60°C oder darunter, vorzugsweise 20°C oder darunter, zugegeben, um dadurch den gelösten Stoff als stabile Kristalle von dCP4U auszufällen.
Die so erhaltenen dCP4U-Kristalle enthalten dCP4U in einer Menge von 95% oder mehr, und UTP in einer Menge von 3% oder weniger. Vorzugsweise enthalten die dCP4U-Kristalle dCP4U in einer Menge von 97% oder mehr und UTP in einer Menge von 2% oder weniger. Insbesondere enthalten die dCP4U-Kristalle dCP4U in einer Menge von 98% oder mehr und UTP in einer Menge von 1 % oder weniger.
Solche dCP4U-Kristalle mit hoher Reinheit können in Form eines Salzes, Hydrats oder eines Hydratsalzes vorliegen. Beispiele für die Salze umfassen pharmazeutisch annehmbare Salze, wie z.B. Alkalimetallsalze, wie z.B. Natriumsalze und Kaliumsalze; Erdalkalimetallsalze, wie z.B. Calciumsalze und Magnesiumsalze; und Ammoniumsalze. Das dCP4U kann mit 1 bis 4 Metallatomen substituiert sein, um ein Salz auszubilden. Das vorstehend genannte Hydrat kann 1 bis 14 Wassermoleküle aufweisen, die an ein dCP4U-Molekül gebanden sind oder daran anhaften, und das vorstehende Hydratsalz kann 1 bis 14 Wassermoleküle aufweisen, die an ein Molekül eines Alkalimetallsalzes von dCP4U gebunden sind oder daran anhaften.
Die dCP4U-Kristalle umfassen außerdem auch Tautomere davon.
Die so erhaltenen dCP4U-Kristalle werden gegebenenfalls nach einer üblichen Methode, wie z.B. Trocknen unter vermindertem Druck, Trocknen unter einem Luftstrom oder Trocknen durch Erwärmen, getrocknet und danach in einen Behälter gegeben (z.B. Flasche, Beutel, Dose, Ampulle). Das Verpacken in dem Behälter kann so durchgeführt werden, dass der Behälter offen, geschlossen, luftdicht oder versiegelt ist. Die gegenüber Luft offene Verpackung ist im Hinblick auf die Erhaltung der Lagerstabilität der Kristalle nicht bevorzugt.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von dCP4U umfasst das Umsetzen von UMP, dCMP, DPC und PPi.
Spezifischer ausgedrückt umfasst das Verfahren das Umsetzen von UMP mit DPC zur Synthese von UMP-Diphenylphosphat (UMP-DPP); das weitere Behandeln der UMP-DPP-enthaltenden Reaktionsmischung mit PPi zur Bildung von UTP in der Mischung; und reagieren lassen des so gebildeten UTP ohne Isolieren aus der Reaktionsmischung mit dCMP in Gegenwart von DPC, um dadurch die Zielverbindung dCP4U zu bilden.
Bei der Synthese von UMP-DPP aus UMP kann ein routinemäßig hergestelltes UMP-Triialkylaminsalz (z.B. UMP-Tributylaminsalz) in einem Lösungsmittel gelöst werden. Beispiele für die Lösungsmittel umfassen Amide, wie z.B. DMF und Dimethylacetamid (DMAC); cyclische Ether, wie z.B. Dioxan und Tetrahydrofuran; Ketone, wie z.B. Aceton; und Dimethylimidazolidinon, Hexamethylphosphorsäuretriamid, oder eine Mischung von zwei oder mehreren davon. Danach wird DPC und gegebenenfalls Trialkylamin zur Lösung zugegeben und die Mischung bei 10 bis 50°C ca. 30 Minuten bis 5 Stunden reagieren gelassen.
Die PPi, die mit UMP-DPP reagieren, sind vorzugsweise PPi-organische Alkalisalze. Beispiele für die Salze umfassen ein Hexylaminsalz, ein Dibutylaminsalz, ein Triethylaminsalz und ein Tributylaminsalz.
Bei der Umsetzung von UMP-DPP mit einem PPi-organischen Alkalisalz kann das PPi-organische Alkalisalz in einem Lösungsmittel gelöst sein. Beispiele für solche Lösungsmittel umfassen Amide, wie z.B. DMF, DMAC und Formamid; cyclische Ether, wie z.B. Dioxan und Tetrahydrofuran; Ketone, wie z.B. Aceton; und Dimethylimidazolidinon, Hexamethylphosphorsäuretriamid, Dimethylsulfoxid, Acetonitril oder eine Mischung von zwei oder mehreren davon. Danach wird die Lösung zur so synthetisierten UMP-DPP-Lösung gegeben und die Mischung bei 10 bis 50°C ca. 30 Minuten bis 5 Stunden reagieren gelassen.
Die Umsetzung zwischen UMP-DPP und PPi-organischem Alkalisalz kann in Gegenwart einer geeigneten Base durchgeführt werden. Beispiele für die Basen umfassen Pyridin-Basen, wie z.B. Pyridin, 2,6-Lutidin, 2,4-Lutidin, α-Picolin, β-Picolin, γ-Picolin, 2,4-Dimethylaminopyridin; α-Collidin, β-Collidin und γ-Collidin, wobei Pyridin besonders bevorzugt ist. Ein basisches Lösungsmittel für die Reaktion wird ebenfalls von den in der vorliegenden Erfindung verwendeten Basen umfasst. Die Konzentration der Base ist nicht besonders beschränkt. Die Base wird vorzugsweise in einer Menge von 6 Äquivalenten oder mehr, bezogen auf UMP, insbesondere von 18 Äquivalenten oder mehr, zugegeben.
Während der Reaktion zwischen UMP-DPP und PPi-organischem Alkalisalz wird das UTP in der Reaktionsmischung synthetisiert. Das so gebildete UTP und dCMP werden in Gegenwart von DPC umgesetzt, wodurch dCP4U synthetisiert wird.
Obwohl dCMP per se zur Reaktionsmischung zugegeben werden kann, wird dCMP in dCMP-biphenylphosphat (dCMP-DDP) auf eine ähnliche Weise überführt, wie sie im Falle von UMP verwendet wird, und das dCMP-DPP kann ebenfalls zugegeben werden.
Die Umsetzung von dCP4U kann durchgeführt werden, indem man zur vorstehend synthetisierten UTP-Lösung DPC in einer Menge von 1,1 Äquivalenten oder mehr und dCMP oder dCMP-DPP in einer Menge von 0,5 bis 1,5 Äquivalenten, bezogen auf das als Ausgangsmaterial verwendete UMP, zugibt, und die Mischung wird bei 10 bis 50°C ca. 30 Minuten bis 5 Stunden reagieren gelassen.
Das so erhaltene dCP4U wird auf die vorstehend angegebene Weise gereinigt und kristallisiert und dabei erfindungsgemäße dCP4U-Kristalle erhalten.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird als nächstes detaillierter durch Beispiele beschrieben, die aber die Erfindung keineswegs darauf beschränken.
Beispiel 1
Herstellung von dCP4U·4Na-Kristallen
(1) Methode unter Verwendung von DCC (Bezugsbeispiel)
dCP4U wurde nach einer Routine-Methode, wie in WO 98/34942 beschrieben, unter Verwendung von UTP, dCMP und DCC hergestellt. Die Reaktion wurde in einem Maßstab von 20 mmol durchgeführt.
Die so erhaltene dCP4U-Lösung wurde mit Wasser verdünnt, um dadurch das Gesamtvolumen auf 1.000 ml einzustellen, und die verdünnte Lösung wurde auf eine Säule aufgebracht, die mit mittel-basischem Anionenaustausch-Harz (AMBERLITE IRA-67, Produkt von Rohm & Haas Co.) beladen war. Die Elution wurde hinter einander unter Verwendung von Wasser, einer 0,18 M wässerigen Chlorwasserstoffsäure-Lösung und einer 0,005 M wässerigen Chlorwasserstoffsäure-Lösung, die 0,5 M Natriumchlorid enthielt, durchgeführt, wodurch dCP4U enthaltende Fraktionen gewonnen wurden.
Die so erhaltenen dCP4U-Fraktionen (4.000 ml) wurden auf eine Säule aufgebracht, die mit Aktivkohle von Chromatographie-Qualität (Taiko Granular Activated Charcoal SGP, Produkt von Futamura Chemical Industries, Co., Ltd.) beladen war, und das dCP4U wurde unter Verwendung einer 0,05 M wässerigen Natriumhydroxidlösung (8.000 ml) eluiert.
Die so erhaltenen Fraktionen von dCP4U wurden vereinigt und aufkonzentriert und dadurch eine Aufschlämmung erhalten. Der pH-Wert der Aufschlämmung wurde auf 6,0 eingestellt. Die Aufschlämmung wurde gerührt, während Ethanol allmählich zur Aufschlämmung zugegeben wurde, und die resultierende Aufschlämmung wurde unter Rühren auf 10°C abgekühlt, wodurch dCP4U·4Na-Kristalle ausgefällt wurden. Die Kristalle wurden abgetrennt und ergaben 8,0 g dCP4U·4Na-Kristalle. Die isolierten Kristalle wurden unter vermindertem Druck bei ca. 60°C ea. 4 Stunden lang getrocknet und wurden dann Instrumentalanalysen unterworfen.
(2) Verfahren unter Verwendung von DPC
UTP·3Na (12,8 kg) wurde in Wasser (135 l) gelöst, und die resultierende Lösung auf eine Säule aufgetragen, die mit Kationenaustauscher-Harz (Produkt von Mitsubishi Chemical Co., Ltd.) beladen war. Die Lösung, die durch die Säule hindurchtrat, und Fraktionen, die mit Wasser eluiert wurden, wurden vereinigt, und Tributylamin (TBS; 13,6 kg) wurde allmählich zur vereinigten Lösung unter Rühren zur Neutralisation zugegeben. Die Lösung wurde aufkonzentriert und Formamid (10 kg) zur Lösung zugegeben. Die resultierende Lösung wurde durch Kochen mit Dioxan dehydratisiert. Die dehydratisierte Substanz wurde dann mit Pyridin (11,6 kg) verdünnt, um eine Pyridinlösung von UTP herzustellen.
Zu einem anderen Methanol (18 l) enthaltenden Gefäß wurde dCMP (7,5 kg) zugegeben. TBA (4,5 kg) wurde zur Lösung allmählich unter Rühren zugegeben und die Lösung auf 60°C erwärmt. Nach Auflösung der Bestandteile wurde die Lösung zur Trockne eingedampft. Die trockene Substanz wurde dann unter Vakuum bei 75°C getrocknet und zerkleinert. Die zerkleinerte Substanz (10,3 kg) wurde in Dimethylacetamid (DMAC) (16,7 kg) suspendiert und Diphenylphosphorchloridat (DPC) (4,4 kg) zur Suspension zugegeben und die Mischung 10 Minuten lang gerührt. Danach wurde TBA (10,8 kg) zur Mischung zugegeben, und die resultierende Mischung 30 Minuten lang gerührt, um eine dCMP-DPP-Lösung herzustellen.
Zu der so hergestellten dCMP-DPP-Lösung wurde die Pyridinlösung von UTP, die auf die vorstehend genannte Weise hergestellt wurde, unter Rühren zugegeben. Nach Vervollständigung der Zugabe wurde die Mischung bei Raumtemperatur über Nacht gerührt, und die Umsetzung durch Zugeben von deionisiertem Wasser beendet.
Zur obigen Mischung wurde eine 30%ige wässerige Natriumhydroxidlösung (31 l) zugegeben. Die Mischung wurde 30 Minuten lang gerührt, und freigesetztes TBA wurde durch Verteilung abgetrennt. Zur wässerigen Schicht wurde eine 6 Mol/l Chlorwasserstoffsäure-Lösung zugegeben, um den pH-Wert der Lösung dadurch auf ea. 7 einzustellen. Die Lösung wurde unter Entfernen des Lösungsmittels eingedampft, und ein gleiches Volumen von 95% Ethanol zur eingedampften Lösung zugegeben. Die resultierende Mischung wurde über Nacht stehen gelassen. Die obere Schicht der Mischung, d.h., eine Ethanolschicht, wurde durch Absaugen entfernt, und zum resultierenden klebrigen Niederschlag Wasser zugegeben, um den Niederschlag zu lösen. Das restliche Lösungsmittel wurde durch Konzentrieren der Lösung entfernt.
Das Gesamtvolumen der so hergestellten dCP4U-Lösung wurde auf 2.500 1 eingestellt, und die Lösung auf eine Säule aufgebracht, die mit mittel-basischem Anionenaustauscher-Harz (AMBERLITE IRA-97, Produkt von Rohm & Haas Co.) beladen war. Die Elution wurde hinter einander mit Wasser, einer 0,1 Mol/l-wässerigen Chlorwasserstoffsäure-Lösung und einer 0,005 Mol/l-wässerigen Chlorwasserstoffsäure-Lösung, die 0,4 Mol/l Natriumchlorid enthielt, durchgeführt, wodurch dCP4U enthaltende Fraktionen erhalten wurden.
Die so erhaltenen dCP4U-Fraktionen (2.100 l) wurden auf eine Säule aufgebracht, die mit Aktivkohle von Chromatographie-Qualität (Taiko Granular Activated Carbon SGP, Produkt von Futamura Chemical Industries, Co., Ltd.) beladen war, und dCP4U wurde unter Verwendung einer 0,05 mol/l-wässerigen Natriumhydroxidlösung (1.200 l) eluiert.
Die so erhaltenen Fraktionen wurden vereinigt und aufkonzentriert. Der pH-Wert der resultierenden Lösung wurde unter Verwendung einer 30%-wässerigen Natriumhydroxidlösung auf pH 7,5 eingestellt. Die Lösung wurde gerührt, während allmählich 95% Ethanol zur Lösung zugegeben wurde, wodurch dCP4U·4Na-Kristalle ausfielen. Die Kristalle wurden abgetrennt und bei 60°C 4 Stunden lang getrocknet und 4,2 kg der dCP4U·4Na-Kristalle erhalten (Wassergehalt: 5,9%, erhaltene Ausbeute: 22%).
< Physikalische Eigenschaften der dCP4U·4Na-Kristalle >
Die nach (1) oder (2) von Beispiel 1 erhaltenen dCP4U·4Na-Kristalle und weißes Pulver von dCP4U·4Na (gefriergetrocknet), das auf gleiche Weise wie im Verfahren von Beispiel 20 der WO 98/34942 hergestellt wurde, wurden einer Instrumentalanalyse unterworfen. Die Kristalle wurden mit dem gefriergetrockneten Produkt im Hinblick auf physikalische Eigenschaften verglichen.
(3) Instrumentalanalyse
1) Reinheitsanalyse
Die nach (1) und in (2) von Beispiel 1 erhaltenen dCP4U·4Na-Kristalle und dCP4U-Fraktionen nach Reinigung über jede Chromatographie wurden einer Reinheitsanalyse mittels einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unterworfen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 und 2 angegeben. Die Bedingungen der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie sind nachstehend beschrieben.
Säule: HITACHIGEL #3013-N (Produkt von Hitachi Keisokuki Service)
Eluens: 10% CH₃CN, 0,18 M NH₄Cl, 0,03 M KH₂PO₄ und 0,03 M K₂HPO₄
Bestimmungsmethode: UV-Bestimmung bei 262 nm
Tabelle 1 (DCC-Methode)
Torhelle 2 (DPC-Methode)
2) Kristallform
1 zeigt ein Photo einer typischen Kristallform von dCP4U·4Na-(3,5-Hydrat)-Kristallen.
3) Wassergehalt
Der Wassergehalt der dCP4U·4Na-Kristalle wurde nach der Karl-Fischer-Methode gemessen. Es wurde gefunden, dass die dCP4U·4Na-Kristalle bei einem Wassergehalt von 6,9 bis 17,4 Gew.-%, der gemäß dem Grad der Trocknung variierte, stabilisiert waren. Die Berechnungsergebnisse zeigten, dass 3,5 bis 10 Wassermoleküle an ein dCP4U-Molekül binden oder daran haften.
4) Schmelzpunkt
Der Schmelzpunkt der dCP4U·4Na-Kristalle wurde mittels einer konventionellen Methode gemessen. Der Schmelzpunkt wurde mit 202 bis 210°C gefunden. Der Schmelzpunkt des gefriergetrockneten Produktes betrug ca. 195 bis 210°C.
5) Röntgenbeugung
Die dCP4U·4Na-Kristalle wurden einer Röntgenbeugung unter Verwendung eines Röntgenbeugungsgeräts (Modell: RINT2500V, Produkt von Rigaku Denki) unter den folgenden Bedingungen unterworfen (Messfehler: + 0,1°). Das so erhaltene Röntgenbeugungsdiagramm und die Peak-Werte von dCP4U·4Na-3,5-Hydrat sind in 2 bzw. Tabelle 3 angegeben.
Ähnlich sind das Röntgenbeugungsdiagramm und die Peak-Daten von dCP4U·4Na-Decahydrat in 3 bzw. Tabelle 4 angegeben. Zusätzlich wird das Röntgenbeugungsdiagramm des gefriergetrockneten Produktes in 4 als Bezug angegeben.
(Messbedingungen)
Röntgenröhre: Cu-Kα
Röntgenstrahlen-Ausstoß: 50 kV-300 mA
Scanning-Rate: 4,0°/Minute
Scanning-Interval: 0,02°
Winkelmessbereich: 2–40°
Spalt: DS-0,5°, RS-0,15 mm, SS-0,5°
Vorbehandlung: Mahlen unter Verwendung eines Achat-Mörsers
Tabelle 3 Kristallines dCP4U·4Na-3,5-Hydrat
Tabelle 4 Kristallines dCP4U·4Na-3,5-Decahydrat
6) Hygroskopizität
dCP4U·4Na-Kristalle (Decahydrat) mit einem Wassergehalt von ca. 17,4% wurden 2 Tage lang unter den folgenden Bedingungen a), b) und c) stehen gelassen: a) 25°C und relative Luftfeuchtigkeit von 57%; b) 25°C und relative Luftfeuchtigkeit von 75%, und c) 25°C und relative Luftfeuchtigkeit von 93%. Bei den vorstehenden drei Fällen wurde keine Zersetzung oder Veränderung im Gewicht festgestellt. Die Kristalle erwiesen sich als stabil und zeigten keine Hygroskopizität. Zusätzlich wurden die gleichen Kristalle 7 Tage lang unter den folgenden schweren Bedingungen stehen gelassen d): d) 40°C und relative Luftfeuchtigkeit von 75%. Es wurde in diesem Fall keine Veränderung beobachtet.
Wenn im Gegensatz dazu ein gefriergetrocknetes Produkt (anfänglicher Wassergehalt: ca. 1%) 2 Tage lang unter den folgenden Bedingungen b) oder c) gelagert wurden: b): 25°C und relative Luftfeuchtigkeit von 75% und e): 25°C und relative Luftfeuchtigkeit von 93%, nahm das Produkt am zweiten Tag einen schlammartigen Zustand an aufgrund einer allmählichen Erhöhung im Wassergehalt.
7) Stabilität
dCP4U·4Na-Kristalle (Decahydrat) und ein gefriergetrocknetes Produkt wurden einzeln in Flaschen gegeben, die dann versiegelt und 13 Tage bi 60°C (Beschleunigungstest) gelagert wurden. Es wurde keine Zersetzung der Kristalle festgestellt. Im Gegensatz dazu wurde festgestellt, dass das gefriergetrocknete Produkt teilweise zersetzt war, wie dies durch Beobachtung eines Reinheitsverlusts des Produkts von ea. 2,2% festgestellt wurde.
7) NMR

Jede Probe der dCP4U·4Na-Kristalle und das gefriergetrocknete Produkt wurde direkt in einen Rotor aus Zirkonium gegeben, und das entsprechende ¹³C-CPMAS-NMR-Spektrum gemessen. Die Messbedingungen sind nachstehend angegeben.

¹³C-CPMAS-NMR
1) Gerät	CMX-300 (Produkt von Chemagnetics)
2) Methode der Messung	CPMAS (Seitenband-Unterdrückung)
3) Messtemperatur	Raumtemperatur
4) Beobachteter Kern	¹³C
5) Beobachtungsfrequenz	75,502 MHz
6) Pulsbreite der Protonenanregung	4,5 μs
7) Kontaktzeit	0,5 ms
8) Messbreite	30,03 kHz
9) Messpunkte	2048
10) Datenpunkte	16384
11) Wiederholungszeit	15,0 s (Fig. 6 und 7) 60,0 s (Fig. 5)
12) Chemical-Shift-Standard	Hexamethylbenzol (äußerer Standard 17,35 ppm)
13) Probenrotationsgeschwindigkeit	5 kHz
14) Integration	256 x

5 und Tabelle 5 zeigen ein ¹³C-CPMAS-NMR-Spektrum von kristallinem dCP4U·4Na-3,5-Hydrat bzw. die Peak-Daten. 6 und Tabelle 6 zeigen ein ¹³C-CPMAS-NMR-Spektrum von kristallinem dCP4U·4Na-Decahydrat bzw. die Peak-Daten. 7 und Tabelle 7 zeigen ein ¹³C-CPMAS-NMR-Spektrum von dCP4U in Form eines weißen Pulvers (gefriergetrocknetes Produkt) bzw. die Peak-Daten. Die Zahlen in den 5 bis 7 beziehen sich auf die entsprechenden Peak-Zahlen in den Tabellen 5 bis 7.
Tabelle 5 Kristallines dCP4U·4Na-3,5-Hydrat (ppm)
Tabelle 6 Kristallines dCP4U·4Na-Decahydrat (ppm)
Tabelle 7 Weißes Pulver von dCP4U (gefriergetrocknetes Produkt) (ppm)
Beispiel 2: Synthese von dCP4U aus UMP
Formamid (2,5 ml) und Pyridin (7,6 ml) wurden zu einem dehydratisierten Triethylaminsalz (10 mmol) von Pyrophosphat (TEA-PPi) zugegeben und dann die resultierende Mischung gerührt. Zu einem dehydratisierten Tributylaminsalz von Uridin-5'-monophosphat (UMP-TBA) (10 mmol) in einem anderen Gefäß wurde DMAC (3,6 ml), Dioxan (3,2 ml) und Tributylamin (3,3 ml) zugegeben und gerührt, und DPC (2,3 ml) tropfenweise dazu gegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde lang gerührt, wodurch UMP-DPP gebildet wurde, das zu der im voraus hergestellten vorstehend genannten dehydratisierten Lösung von TEA-PPi gegeben wurde. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde lang gerührt und bildete UTP. DMAC (7,2 ml) wurde zu einem Tributylaminsalz von 2'-Desoxycytidin-5'-monophosphat (TBA-dCMP) (4,9 g, 10 mmol), dass sich in einem anderen Gefäß befand, zugegeben, um eine Suspension auszubilden, und DPC (2,2 ml, 1,1 Äquivalente) wurden zur Suspension zugegeben. Die resultierende Mischung wurde 40 Minuten lang gerührt und Tributylamin (TBA) (9,5 ml) der Mischung zugegeben. Es wurde ein weiteres Rühren während 20 Minuten durchgeführt, um dCMP-DPP-herzustellen. Die so hergestellte dCMP-DPP-Lösung wurde zu der im voraus hergestellten vorstehend genannten synthetisierten UTP-Lösung gegeben und die Mischung bei Raumtemperatur 56 Stunden lang gerührt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Wasser beendet, und der pH-Wert der Reaktionsmischung wurde durch Zugabe einer 30%-wässerigen Natriumhydroxidlösung auf 11 eingestellt. Nach Entfernen des Lösungsmittels durch Eindampfen wurde der pH-Wert durch Zugabe von 6 mol/l Chlorwasserstoffsäure auf 7,0 eingestellt. Die Mischung wurde mit Ethylacetat aufgetrennt. Die beim Auftrennen gebildete wässerige Schicht wurde einer HPLC-Analyse (272 nm) unterworfen und zeigte, dass die Syntheseausbeute von dCP4U 37,7% betrug.
Industrielle Anwendbarkeit
Wie vorstehend beschrieben, weisen die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltenen dCP4U-Kristalle im Vergleich zu einem gefriergetrockneten Produkt eine hohe Reinheit und hohe Stabilität und keine Hygroskopizität auf und können deshalb als brauchbares Ausgangsmaterial zur Herstellung eines Arzneimittels dienen.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von dCP4U erlaubt die Verwendung von nicht teurem UMP als Ausgangsmaterial und ergibt hohe Ausbeuten. Das Verfahren ist deshalb zur großtechnischen Herstellung von dCP4U geeignet.

Claims

Verfahren zur Herstellung von P¹-(2'-Desoxycytidin-5'-)P⁴-(uridin-5'-)tetraphosphat (dCP4U), das umfasst das reagieren lassen von Uridin-5'-monophosphat (UMP), 2'-Desoxycytidin-5'-monophosphat (dCMP), Diphenylphosphorchloridat (DPC) und Pyrophosphat (PPi).
Verfahren nach Anspruch 1, das umfasst das Umsetzen von UMP und DPC zur Synthese von UMP-Diphenylphosphat (UMP-DPP) in einer ersten Stufe; weiteres Behandeln der UMP-DPP-enthaltenden Reaktionsmischaung mit PPi zur Bildung von Uridin-5'-triphosphat (UTP) in der Mischung; und reagieren lassen des so gebildeten UTP, ohne Isolierung aus der Reaktionsmischung, mit dCMP in Gegenwart von DPC unter Erhalt von dCP4U.