SK284178B6

SK284178B6 - Kryštalická forma P1-(2'-deoxycytidín-5'-)P4-(uridín-5'- )tetrafosfátu a spôsob ich prípravy

Info

Publication number: SK284178B6
Application number: SK1870-2001A
Authority: SK
Inventors: Kenya Mori; Takanori Miyashita; Hideaki Maeda; Hiroshi Sato; Yutaka Noda
Original assignee: Yamasa Corporation
Priority date: 1999-06-30
Filing date: 2000-06-30
Publication date: 2004-10-05
Also published as: DE60006814T2; EP1191032A4; DE60021629T2; CN1144811C; PL202200B1; CN1359387A; BR0012205A; KR100593723B1; EP1362862A1; EP1191032B1; CZ20014502A3; ZA200110468B; EP1191032A1; US6617444B1; PL202176B1; ES2245431T3; PL352363A1; JP3421666B2; NO20016381D0; AU767136B2

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka kryštalických foriem P’-(2'-dcoxycytidín-5'-)P⁴-(uridín-5'-) tetrafosfátu (dCP4U) alebo ich farmaceutický prijateľných solí (ďalej pre jednoduchosť označovaných ako „dCP4U“), ktoré sú vhodné ako liečivo na liečbu chronickej bronchitídy, sinusitídy a podobne a spôsobu prípravy týchto kryštálov.

Doterajší stav techniky

Zlúčenina dCP4U vzorca (I)

alebo jej soľ, jc selektívnym agonistom P2Y2 purínového receptora a/alebo P2Y4 purínového receptora, a predpokladá sa jej použitie v liečivých prostriedkoch na liečbu chronickej bronchitídy, sinusitídy a podobne (pozri WO 98/34942).

Doteraz nebolo možné pripraviť dCP4U v kryštalickej forme, a dCP4U bolo možné pripraviť len vo forme bieleho prášku (bielej pevnej hmoty) po sušení vymrazením. Obvyklými spôsobmi pripravené práškovité produkty dCP4U majú nízku čistotu, ako je čistota 82 % (pri stanovení metódou HPLC). Náročné je predovšetkým separovať uridín-5 ’-trifosfát (UTP), ktorý sa používa ako východisková zložka syntézy od dCP4U, a vysoko prečistený dCP4U je možné pripraviť len veľmi ťažko použitím obvykle používanej chromatografie na ionexoch (WO 98/34942).

Uvedený biely práškovitý produkt nízkej čistoty má určité nevýhody, ako je hygroskopickosť. Preto sa musí príprava liečiva obsahujúceho dCP4U uskutočniť v zariadení, v ktorom je dôsledne riadená vlhkosť. I po príprave liečiva musí byť liečivo v nádobe dobre uzavreté. Navyše, pretože takto pripravené liečivo má veľmi krátku použiteľnosť vďaka nízkej stabilite práškovitého produktu, je žiaduce nájsť spôsob prípravy vysoko prečistenej a stabilnej formy kryštalického dCP4U.

Obvykle sa dCP4U pripravuje z 2'-deoxycytidín-5'-monofosfátu (dCMP) a z UTP použitím aktivačného prostriedku, ako je dicyklohexylkarbodiimid (DCC). Ale obvykle používané spôsoby poskytujú povážlivo nízke výťažky syntézy, t. j. výťažky veľmi nízke, asi 9 % hmotn. (pozri príklad 20 WO 98/34942) a nie sú na praktické uskutočnenia použiteľné. Z toho vyplýva, že je rovnako žiaduci vývoj spôsobu prípravy dCP4U s vysokým výťažkom a v priemyslovom meradle.

Na základe uvedených poznatkov je cieľom vynálezu poskytnúť stabilné kryštály dCP4U vo forme vhodnej na prípravu liečiv. Ďalším cieľom vynálezu je poskytnúť spôsob prípravy týchto kryštálov. Ešte ďalším cieľom vynálezu je poskytnúť spôsob prípravy dCP4U s vysokou účinnosťou vhodný na priemyslovú prípravu dCP4U.

Autori vynálezu uskutočnili intenzívne štúdie s cieľom nájsť stabilnú formu dCP4U a zistili, že dCP4U s čistotou 95 % alebo vyššou je možné pripraviť chromatografiou na meniči aniónov v kombinácii s chromatografiou na aktívnom uhlí (chromatografia na aktívnom uhlí), a že z takto vysoko prečisteného dCP4U je možné pripraviť kryštály dCP4U. Bolo zistené, že takto pripravené kryštály dCP4U majú čistotu významne vyššiu ako doteraz vyrábaný dCP4U vo forme prášku, nie sú hygroskopickc a majú vysokú stabilitu.

Autori vynálezu uskutočnili rovnako intenzívne štúdie spôsobov syntézy dCP4U použitím lacného uridín-5’-monofosfátu (UMP) namiesto drahého UTP, a zistili, že dCP4U je možné pripraviť účinným spôsobom použitím lacného difenylchlorofosfátu (DPC) a pyrofosfátu (PPí). Predložený vynález je založený na podklade uvedených zistení.

Podstata vynálezu

Vynález poskytuje kryštalickú formu dCP4U.

Vynález sa rovnako vzťahuje na spôsob prípravy kryštálov dCP4U, kde uvedený spôsob zahŕňa prečistenie surového dCP4U chromatografiou na meniči aniónov a chromatografiou na aktívnom uhlí, a prídavok hydrofilného organického rozpúšťadla k roztoku prečisteného dCP4U, čím sa vyzráža dCP4U v kryštalickej forme.

Vynález rovnako zahŕňa spôsob prípravy dCP4U, ktorý zahŕňa reakciu UMP, dCMP, DPC a PPi.

Kryštalická forma dCP4U podľa vynálezu sa pripraví prečistením surového dCP4U špecifickými prostriedkami a k roztoku prečisteného produktu sa pridá hydrofilné organické rozpúšťadlo, čím dôjde k vyzrážaniu dCP4U vo forme kryštálov. Vynález je opísaný z hľadiska prečistenia dCP4U (1) a z hľadiska kryštalizácie dCP4U (2).

1. Prečistenie dCP4U

Prečistenie dCP4U je možné uskutočniť chromatografiou na meniči aniónov v spojení na aktívnom uhlí. Aj keď uvedené dva spôsoby chromatografie je možné uskutočniť v ľubovoľnom poradí, výhodné je z hľadiska čistoty dCP4U predradiť chromatografiou na meniči aniónov pred chromatografiou na aktívnom uhlí.

Ako živicu na výmenu aniónov v uvedených chromatografických spôsoboch je možné použiť styrénovú alebo akrylovú živicu. Príklady živíc, ktoré je možné použiť, zahrnujú silne bázické živicové meniče aniónov, ako je AMBERLITE IRA 402 (Rohm & Haas Co.), DIAION PA312, a DIAION SA-11A (Mitsubishi Chemical Co. Ltd), a slabo bázické živicové meniče aniónov, ako je AMBERLITE IRA 67 (Rohm & Haas Co.) a DIAION WA-30 (Mitsubishi Chemical Co. Ltd).

Ako aktívne uhlie je možné použiť aktívne uhlie na chromatografiu v rozdrvenej forme alebo vo forme tvarovaných častíc, pričom uvedené formy sú obchodne dostupné (napr. produkty firmy Wako Pure Chemical Industries, Ltd., a Futamura Chemical Industries, Co., Ltd.).

Chromatografiu je možné uskutočniť vsádkovým spôsobom použitím chromatografie na stĺpci a podobne. Pri chromatografii na stĺpci sa ako elučný prostriedok pri chromatografii na meniči aniónov môže použiť vodný roztok kyseliny alebo zmes kyseliny so soľou, ako je chlorid sodný, ktorá má vyššiu iónovú silu, a vody alebo vodného roztoku alkalického prostriedku, ako je hydroxid sodný na stĺpcovú chromatografiu na aktívnom uhlí. Na voľbu vhodných koncentrácií jednotlivých mobilných fáz, ktoré sú v rozmedzí 0,001 mol/1 až 10 mol/1, je možné uskutočniť predbežnú orientačnú skúšku.

2. Kryštalizácia dCP4U

Kryštalizácia dCP4U sa vyvoláva prídavkom hydrofilného organického rozpúšťadla k roztoku dCP4U prečisteného uvedeným spôsobom.

SK 284178 Β6

Príklady hydrofilných organických rozpúšťadiel vhodných na uvedený cieľ zahŕňajú alkoholy so šesť alebo menej atómami uhlíka, ako je metanol alebo etanol, ketóny ako acetón; étery ako dioxán; nitrily ako acetonitril; a amidy ako dimetylformamid. Z uvedených rozpúšťadiel sú výhodné alkoholy, predovšetkým etanol.

Špecifickejšie sa roztok uvedeným spôsobom prečisteného dCP4U, alebo kaša získaná zahustením roztoku, prípadne spracuje na úpravu pH na 5 až 10, výhodne na 6 až 9 a hydrofilné organické rozpúšťadlo sa pridá k roztoku alebo ku kaši pri teplote 60 °C alebo nižšej, výhodne pri teplote 20 °C alebo nižšej, čím sa docieli vyzrážanie rozpustenej zložky vo forme stabilných kryštálov dCP4U.

Kryštály získané spôsobom podľa vynálezu obsahujú dCP4U v množstve 95 % alebo viac a obsah UTP je 3 % alebo menej. Výhodne obsahujú kryštály dCP4U 97 % dCP4U alebo viac a obsahujú 2 % alebo menej UTP. Najvýhodnejšie obsahujú kryštály dCP4U 98 % dCP4U alebo viac a obsahujú 1 % alebo menej UTP.

Takto pripravené kryštály dCP4U môžu byť vo forme soli, hydrátu alebo hydrátovej soli. Príklady uvedených solí zahŕňajú farmaceutický prijateľné soli, ako sú soli alkalických kovov, ako sú sodné a draselné soli; soli kovov alkalických zemín, ako sú soli vápenaté a horečnaté; a soli amónne. Uvedený dCP4U môže obsahovať ako substituenty 1 až 4 atómy kovu a tvoriť tak soli.

Uvedený hydrát môže obsahovať 1 až 14 molekúl vody, ktoré sú naviazané alebo vykazujú iný spôsob adhézie k jednej molekule dCP4U, a uvedená hydrátová soľ môže obsahovať 1 až 14 molekúl vody, ktoré sú naviazané alebo majú iný spôsob adhézie k jednej molekule dCP4U vo forme soli alkalického kovu.

Ďalej, kryštály dCP4U podľa vynálezu môžu zahŕňať tautoméry dCP4U.

Pripravené kryštály dCP4U sa potom prípadne vysušia obvyklými spôsobmi, ako je sušenie pri zníženom tlaku, sušenie v prúde vzduchu, alebo sušenie zahrievaním, a potom sa plnia do vhodných nádob (ako je napr. fľaša, vak, plechová nádoba, ampulka). Obal môže byť otvorený, uzavretý, vzduchotesný alebo zatavený. Obal otvorený vonkajšej atmosfére nie je výhodný z hľadiska zachovania stability kryštálov.

Spôsob prípravy dCP4U podľa vynálezu zahŕňa reakciu UMP, dCMP, DPC a PPi.

Špecifickejšie vynález zahŕňa reakciu UMP s DPV, čím sa pripraví UMP-difenylfosfát (UMP-DPP); ďalším spracovaním reakčnej zmesi obsahujúcej UMP-DPP s PPi v zmesi vznikne UTP; a reakciou vzniknutého UTP bez jeho izolácie z reakčnej zmesi s dCMP v prítomnosti DPC vznikne požadovaný produkt.

Pri syntéze UMP-DPP z UMP je možné bežným spôsobom pripravenú trialkylamínovú soľ UMP (napr. UMPtributylamín) rozpustiť v rozpúšťadle. Príklady týchto rozpúšťadiel zahŕňajú amidy ako DMF a dimetylacetamid (DMAC); cyklické étery ako dioxán a tetrahydrofurán; ketóny ako acetón; a dimetylimidazolidinón; triamid kyseliny hexametylfosforcčnej, alebo zmes dvoch alebo viac uvedených rozpúšťadiel. Potom sa k roztoku pridá DPC a prípadne trialkylamín a zmes sa nechá reagovať približne 30 minút až päť hodín pri teplote 10 až 50 °C.

PPi reagujúce s UMP-DPP sú výhodne vo forme PPi-organických bázických solí. Príklady uvedených solí zahŕňajú hexalamínovú soľ, dibutylamínovú soľ, trietylamínovú soľ a tributylamínovú soľ.

Na reakciu syntézy UMP-DPP s PPi-organickou bázickou soľou je možné PPi-organickú bázickú soľ rozpustiť v rozpúšťadle. Príklady týchto rozpúšťadiel zahŕňajú amidy ako DMF, DMAC, a formamid; cyklické étery ako dioxán a tetrahydrofurán; ketóny ako acetón; a dimetylimidazolidinón, triamid kyseliny hexametylfosforečnej, dimetylsulfoxid, acetonitril, alebo zmes dvoch alebo viac uvedených rozpúšťadiel. Potom sa získaný roztok pridá k pripravenému roztoku UMP-DPP a zmes sa nechá reagovať približne 30 minút až päť hodín pri teplote 10 až 50 “C.

Reakciu medzi UMP-DPP a PPi-organickou bázickou soľou je možné uskutočniť v prítomnosti vhodnej bázy. Príklady týchto báz zahŕňajú pyridínové bázy, ako je pyridín, 2,6-lutidín, 2,4-lutidin, a-pikolín, β-pikolín, γ-pikolín, 2,4-dimetylaminopyridín, a-kolidín, β-kolidín, a γ-kolidín, pričom zvlášť výhodnou bázou je pyridín. Uvedené bázy použité na reakciu zahŕňajú rovnako bázické rozpúšťadlo na uvedenú reakciu. Koncentrácia bázy nie je konkrétne obmedzená. Výhodne sa báza pridá v množstve zodpovedajúcom 6 ekvivalentom alebo viac vzhľadom na UMP, výhodnejšie v množstve 18 ekvivalentov alebo väčšom.

Pri reakcii medzi UMP-DPP a PPi-organickou bázickou soľou v reakčnej zmesi vzniká UTP. Takto vzniknutý UTP a dCMP potom reagujú v prítomnosti DPC za tvorby dCP4U.

Aj keď dCMP je možné pridať k reakčnej zmesi samotný, dCMP sa prevádza na dCMP-difenylfosfát (dCMPDPP) spôsobom podobným, aký je použitý v prípade UMP, a pridá sa ako dCMP-DPP.

Reakciu vedúcu k dCP4U je možné uskutočniť prídavkom DPC v množstve 1,1 ekvivalentu alebo viac k pripravenému roztoku UTP a tiež prídavkom dCMP alebo dCMP-DPP v množstve asi 0,5 až 1,5 ekvivalentu vzhľadom na východiskovú UMP zložku a zmes sa nechá reagovať pri 10 až 50 °C päť hodín.

Takto pripravený dCP4U sa prečisti a kryštalizuje uvedeným spôsobom za tvorby kryštálov dCP4U podľa vynálezu.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Na obr. 1 je fotografia kryštálu kryštalického dCP4U· 4Na (3,5-hydrátu). Fotografia je urobená prostredníctvom polarizačného mikroskopu (zväčšenie: 440x) pričom 1 mm na fotografii zodpovedá 25 pm.

Obr. 2 znázorňuje spektrum rôntgcnovej difrakčnej analýzy kryštalického dCP4U- 4Na (3,5-hydrát).

Obr. 3 znázorňuje spektrum rôntgenovej difrakčnej analýzy kryštalického dCP4U- 4Na (dekahydrát).

Obr. 4 znázorňuje spektrum rôntgenovej difrakčnej analýzy dCP4U- 4Na vo forme bieleho prášku (lyofilizovaný produkt).

Obr. 5 znázorňuje ^l3C-CPMAS-NMR spektrum kryštalického dCP4U- 4Na (3,5-hydrát).

Obr. 6 znázorňuje ¹³C-CPMAS-NMR spektrum kryštalického dCP4U· 4Na (dekahydrát).

Obr. 7 znázorňuje ¹³C-CPMAS-NMR spektrum dCP4U· 4Na vo forme bieleho prášku (lyofilizovaný produkt).

Vynález je podrobnejšie opísaný pomocou príkladov, ktoré však vynález nijako neobmedzujú.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Príprava kryštálov dCP4U- 4Na

1. Spôsob s použitím DCC

Príprava dCP4U sa uskutoční obvyklým spôsobom opísaným vo WO 98/34042 s použitím UTP, dCMP a DCC. Reakcia sa uskutoční s množstvom 20 nmol.

Pripravený roztok dCP4U sa zriedi s vodou, pričom sa celkový objem upraví na 1,000 ml a zriedený roztok sa nanesie na stĺpec naplnený stredne bázickým živicovým meničom aniónov (AMBERLITE IRA-67, produkt Rohm & Haas Co.). Ako elučný prostriedok sa postupne použije voda, vodný roztok kyseliny chlorovodíkovej 0,18 mol/1, a vodný roztok kyseliny chlorovodíkovej 0,005 mol/1 obsahujúci 0,5 mol/1 chloridu sodného a oddelí sa frakcia obsahujúca dCP4U.

Takto získané frakcie obsahujúce dCP4U (4000 ml) sa vnesú na kolónu naplnenú aktívnym uhlím na chromatografiu (Taiko Granular Activated Charcoal SGP, produkt firmy Futamura Chemical Industries, Co., Ltd.), a uskutoční sa elúcia dCP4U s použitím vodného roztoku hydroxidu sodného 0,05 mol/1 (8000 ml).

Získané frakcie dCP4U sa spoja a zahustia sa na kašu. Hodnota pH kaše sa upraví na 6,0. Za miešania sa potom ku kaši postupne pridáva etanol a takto spracovaná kaša sa za miešania ochladí na 10 °C, čím dôjde k vyzrážaniu kryštálov dCP4U· 4Na. Kryštály sa oddelia a ich výťažok ako dCP4U· 4Na je 8,9 g. Separované kryštály sa vysušia za zníženého tlaku pri asi 60 °C po asi štyroch hodinách a potom sa hodnotia metódami inštrumentálnej analýzy.

2. Spôsob s použitím DPC

UTP- 3Na (12,8 kg) sa rozpustí vo vode (135 1) a získaný roztok sa vnesie na kolónu plnenú živicovým meničom katiónu (produkt Mitsubishi Chemical Co. Ltd.). Roztok sa nechá prejsť kolónou a frakcie eluované vodou sa spoja a ku spojeným podielom sa za miešania postupne pridá tributylamín (TBA; 13,6 kg) na neutralizáciu. Potom sa roztok zahustí a pridá sa k nemu formamid (10 kg). Získaný roztok sa dehydratuje varom s dioxánom. Potom sa takto spracovaný produkt zriedi pyridínom (11,6 kg) a získa sa tak roztok UTP v pyridíne.

Do ďalšej reakčnej nádoby obsahujúcej metanol (18 1) sa pridá dCMP (7,5 kg). Potom sa k roztoku za miešania postupne pridá TBA (4,5 kg) a roztok sa zahreje na 60 °C. Po rozpustení zložiek sa roztok zahustí dosucha. Takto vysušený produkt sa ďalej vysuší vo vákuu pri 75 °C a rozdrví sa. Rozdrvený produkt (10,3 kg) sa suspenduje v dimetylacetamide (DMAC) (16,7 kg), k suspenzii sa pridá difenylchlorofosfát (DPC) (4,4 kg) a zmes sa mieša 10 minút. Potom sa k zmesi pridá TBA (10,8 kg) a získaná zmes sa mieša 30 minút za vzniku roztoku dCMP-DPP.

K takto pripravenému roztoku dCMP-DPP sa za miešania pridá pyridínový roztok UTP pripravený spôsobom opísaným skôr. Po ukončení prídavku sa zmes mieša cez noc pri teplote miestnosti a reakcia sa ukončí prídavkom deionizovanej vody.

K uvedenej zmesi sa pridá 30 % vodný roztok hydroxidu sodného (31 1). Získaná zmes sa mieša 30 minút a uvoľnený TBA sa po oddelení odstráni. K vodnej vrstve sa pridá roztok kyseliny chlorovodíkovej 6 mol/1 na úpravu pH roztoku na asi 7. Potom sa roztok zahustí odstránením rozpúšťadla a k zahustenému roztoku sa pridá rovnaký objem 95 % etanolu. Výsledná zmes sa ponechá stáť počas noci. Horná vrstva zmesi, t. j. etanolová vrstva sa odstráni odsatím a ku zvyšnej lepkavej zrazenine sa pridá voda na rozpustenie uvedenej zrazeniny. Zvyšné rozpúšťadlo sa odstráni zahustením.

Celkový objem takto pripraveného dCP4U sa zriedi vodou na 2500 1 a roztok sa nanesie na stĺpce naplnený stredne bázickým živicovým meničom aniónov (AMBER

LITE IRA-67, produkt Rohm & Haas Co.). Ako elučný prostriedok sa postupne použije voda, vodný roztok kyseliny chlorovodíkovej 0,1 mol/1, a vodný roztok kyseliny chlorovodíkovej 0,005 mol/1 obsahujúci 0,4 mol/1 chloridu sodného a oddelí sa frakcia obsahujúca dCP4U.

Takto získané frakcie obsahujúce dCP4U (2100 1) sa vnesú na kolónu naplnenú aktívnym uhlím na chromatografiu (Taiko Granular Activated Charcoal SGP, produkt firmy Futamura Chemical Industries, Co., Ltd.), a uskutoční sa elúcia dCP4U s použitím vodného roztoku hydroxidu sodného 0,05 mol/1 (8000 ml).

Získané frakcie dCP4U sa spoja a zahustia sa. Hodnota pH roztoku sa upraví na 7,5 pomocou 30 % vodného roztoku hydroxidu sodného. Za miešania sa k roztoku postupne pridáva 95 % etanol, čím dôjde k vyzrážaniu kryštálov dCP4U- 4Na. Kryštály sa oddelia a sušia sa pri 60 °C štyri hodiny a ich výťažok ako dCP4U· 4Na je 4,2 kg. (obsah vody: 5,9 %, výťažok izolácie: 22 %).

Fyzikálno-chemické vlastnosti kryštálov dCP4U- 4Na

Kryštály pripravené podľa príkladu 1 spôsobom (1) alebo spôsobom (2) a dCP4U· 4Na vo forme bieleho prášku (lyofilizovaný produkt), ktorý bol pripravený spôsobom opísaným v príklade 20 WO 98/34942 boli hodnotené metódami inštrumentálnej analýzy. Pripravené kryštály boli porovnané s lyofilizovaným produktom z hľadiska ich fyzikálnych vlastnosti.

3. Inštrumentálna analýza

1. Analýza čistoty

Kryštály dCP4U- 4Na pripravené spôsobom (1) a spôsobom (2) podľa príkladu 1 a frakcie obsahujúce dCP4U získané v oboch chromatografických spôsoboch čistenia boli hodnotené skúškou na čistotu pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie. Výsledky sú uvedené v tabuľka 1 a 2. Podmienky uskutočnenia vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie sú opísané neskôr:

kolóna: Hitachigel # 3013-N (výrobca Hitachi Keisokuki Service);

mobilná fáza: 10 % CH₃CN, NH₄C1 0,18 mol/1, KH₂PO₄, 0,03 mol/1 a K₂HPO₄ 0,03 mol/1;

detekcia: UV pri 262 nm.

Tabuľka 1 (DCC spôsob)

	obsah dCP4U (%)	obsah UTP (%)
reakčná zmes	55,0	28,6
po IE* chromatografii	(-)	(-)
po AC* chromatografii	97,4	0,4
po kryštalizácii	98,3	0,4

(-): neuskutočnené

*): IE: na meniči iónov; AC: na aktívnom uhlí

Tabuľka 2 (DPC spôsob)

	Obsah dCP4U (%)	obsah UTP (%)
reakčná zmes	(-)	(-)
po IE* chromatografii	68,6	27,2
po AC* chromatografii	92,8	1,5
po kryštalizácii	98,3	0,3

(-): neuskutočnené

*): IE: na meniči iónov; AC: na aktívnom uhli

Tabuľka 4

Kryštalický dCP4U· 4Na dekahydrát

2. Kryštálová forma

Typická kryštálová forma kryštálov dCP4U· 4Na (3,5 hydrát) je na fotografii na obr. 1.

3. Obsah vody

Obsah vody v kryštáloch dCP4U· 4Na bol stanovený spôsobom podľa Karla Fischera. Bolo zistené, že kryštály dCP4U· 4Na sú stabilné pri obsahu vody od 6,9 do 17,4 % hmotn., ktorý je závislý od stupňa vysušenia. Z výpočtu vyplýva, že na jednej molekule dCP4U je naviazaných alebo iným spôsobom adhézie pripojených 3,5 až 10 molekúl vody.

4. Teplota topenia

Teplota topenia kryštálov dCP4U- 4Na bola zistená obvyklým spôsobom. Bola zistená teplota topenia 202 až 210 °C. Teplota topenia lyofilizovaného produktu je asi 195 až 210 °C.

5. Rôntgenová difrakcia

Rontgenová difrakčná analýza kryštálov dCP4U- 4Na bola uskutočnená na prístroji na rontgenovú difrakčnú analýzu (typ: RINT2500V, firmy Rigaku Denki) pri nižšie uvedených podmienkach (chyba merania: ± 0,1°). Získané rôntgenové difrakčné spektrum a hodnoty píkov dCP4U4Na 3,5 hydrátu sú znázornené na obr. 2 a v tabuľke 3. Podobne rôntgenové difrakčné spektrum a hodnoty píkov dCP4U· 4Na dekahydrátu sú znázornené na obr. 3 a v tabuľke 4. Navyše je na porovnanie na obr. 4 znázornené rôntgenové difrakčné spektrum lyofílizovaného produktu.

Podmienky stanovenia: zdroj rôntgenového žiarenia: Cu-Ka výstup rôntgenového žiarenia: 50 kV-300 mA rýchlosť snímania: 4,0 °/min.

interval snímania: 0,02 ⁰rozmedzie meraných uhlov: 2 - 40 ° štrbina: DS-0,5 RS-0,15 mm, SS-0,5 ° príprava vzorky na analýzu: rozomletie v achátovej miske

Tabuľka 3

Kryštalický dCP4U· 4Na 3,5 hydrát

pík č.	20 (°)	relatívna intenzita
1	6,18	39
2	8,82	38
3	11,50	27
4	12,32	79
5	13,76	39
6	14,44	83
8	16,34	29
9	16,84	34
10	17,68	100
11	19,02	81
12	19,72	36
13	20,86	35
14	22,28	78
15	23,54	47
16	25,04	43

pík č.	20 (°)	relatívna intenzita
1	5,58	28
2	11,34	62
3	11,94	34
4	12,92	27
5	14,08	49
6	14,96	66
7	15,60	49
8	16,62	25
9	17,08	46
10	18,28	27
11	18,90	28
12	20,20	39
13	21,66	72
14	22,02	100
15	23,02	90

6. Hygroskopickosť

Kryštály dCP4U· 4Na (dekahydrát) s obsahom vody asi 17,4 % sa nechajú dva dni pri nasledujúcich podmienkach (a), (b) a (c):

a) 25 °C a relatívna vlhkosť 57 %, (b) 25 °C a relatívna vlhkosť 75 %; a (c) 25 °C a relatívna vlhkosť 93 %. V žiadnej skupine pokusných podmienok nebol pozorovaný rozklad alebo zmeny hmotnosti. Kryštály sa prejavili ako stabilné a nevykazujúce hygroskopickosť. Okrem toho boli uvedené kryštály nechané niekoľko dní v nasledujúcich sťažených podmienkach (d): d) 40 °C a relatívna vlhkosť 75 %. Ani v tomto prípade neboli zistené žiadne zmeny.

Na rozdiel od uvedeného, lyofilizovaný produkt (počiatočný obsah vody: asi 1 %), ktorý bol udržiavaný dva dni pri nasledujúcich podmienkach (b) alebo (c): b) 25 °C a relatívna vlhkosť 93 % a c) 25 °C a relatívna vlhkosť 93 %, zmenil vzhľad až na formu kalu postupným zvyšovaním obsahu vody.

7. Stabilita

Kryštály dCP4U- 4Na (dekahydrát) a lyofilizovaný produkt boli každý samostatne umiestnené do fliaš, ktoré sa dokonale uzatvorili a boli potom udržiavané 13 dní pri teplote 60 °C (zrýchlený test). Pri kryštalickej forme nebo) zistený žiadny rozklad. Na rozdiel od kryštalickej formy, v lyofilizovanom produkte bol zistený čiastočný rozklad, preukázaný stratou čistoty produktu hodnoty asi 2,2 %.

8. NMR

Kryštály dCP4U- 4Na a lyofilizovaný produkt sa samostatne vnesú do rotujúcej kyvety zo zirkónu a zmeria sa ⁿC-CPMAS-NMR spektrum.

'-’C-CPMAS-NMR

1. Prístroj tics)

2. Spôsob merania vedľajších signálov)

3. Teplota merania

4. Pozorované jadro

5. Použitá frekvencia

6. Šírka pulzu excitácie protónu

7. Čas kontaktu

8. Šírka merania

9. Počet bodov merania

CMX-300 (firmy ChemagneCPMAS (s potlačením teplota miestnosti ^,3C

75,502 MHz

4,5 ps

0,5 ms

30,03 kHz

2048

10. Súbor bodov 16384

11. Repetičný čas 15,0 s (obr. 6 a 7)

60,0 s (obr. 5)

12. Štandard na chemický posun hexametylbenzén (vonkajší štandard 17,35 ppm)

13. Rýchlosť rotácie vzorky 5 kHz

14. Integrácia 256 x ^l3C-CPMAS-NMR spektrum kryštalického dCP4U· 4Na 3,5 hydrátu a hodnoty týkajúcej sa píkov sú uvedené na obr. 5 a v tabuľke 5. ^I3C-CPMAS-NMR spektrum kryštalického dCP4U· 4Na 3,5 dekahydrátu a hodnoty týkajúce sa píkov sú uvedené na obr. 6 a v tabuľke 6. ¹³C-CPMASNMR spektrum dCP4U· 4Na vo forme bieleho prášku (lyofilizovaný produkt) a hodnoty týkajúce sa píkov sú uvedené na obr. 7 a v tabuľke 7. Čísla na obr. 5 až 7 zodpovedajú číslam píkov v tabuľkách 5 až 7.

Tabuľka 5

Kryštalický dCP4U- 4Na 3,5 hydrát (ppm)

(1) 166,1	(2) 156,2	(3) 150,9	(4) 141,6
(5) 138,4	(6) 101,3	(7) 99,2	(8) 93,2
(9) 84,9	(10)80,6	(11)76,7	(12)73,1
(13) 69,0	(14)67,2	(15)62,2	(16) 43,9

Tabuľka 6

Kryštalický dCP4U· 4Na3,5 dekahydrát (ppm)

(1) 166,1	(2) 157,8	(3) 151,6	(4) 139,0
(5) 117,9	(6) 102,6	(7) 99,3	(8) 93,3
(9)90,1	(10) 87,3	(11)80,6	(12)77,2
(13) 75,0	(14)73,9	(15)72,0	(16) 67,0
(17) 63,1	(18) 60,4	(19) 42,0	(20) 40,8

Tabuľka 7 dCP4U- 4Na vo forme bieleho prášku (lyofilizovaný produkt) (ppm)

(1) 166,5	(2) 157,4	(3) 149,9	(4) 140,9
(5) 103,0	(6) 99,0	(7) 96,9	(8) 85,9
(9) 73,4	(10)71,7	(11)67,1	(12) 42,0
(13)39,3

Príklad 2

Príprava dCP4U z UMP

K dehydratovanej trietylamínovej soli (10 mmol) pyrofosfátu (TEA-Ppi) sa pridá formamid (2,5 ml) a pyridín (7,6 ml) a získaná zmes sa spracuje miešaním. V ďalšej nádobe sa k dehydratovanej tributylamínovej soli uridín-5'-monofosfátu (UMP-TBA) (10 mmol) pridá DMAC (3,6 ml), dioxán (3,2 ml) a tributylamín (3,3 ml), zmes sa mieša a po kvapkách sa k nej pridá DPC (2,3 ml). Zmes sa potom mieša jednu hodinu pri teplote miestnosti, čím vznikne UMP-DPP, a pridá sa k uvedenému roztoku TEA-PPi pripravenému vopred. Reakčná zmes sa potom mieša jednu hodinu pri teplote miestnosti a pripraví sa tak UTP.

V ďalšej nádobke sa k tributylamínovej soli 2'-deoxycytidin-5'-monofosfátu (TBA-dCMP) (4,9 g, 10 mmol) pridá DMAC (7,2 ml) za tvorby suspenzie, ku ktorej sa potom pridá DPC (2,2 ml, 1,1 ekvivalentu). Získaná suspenzia sa mieša 40 minút a potom sa k nej pridá tributylamín (TBA) (9,5 ml). Po 20 minútach miešania je nosič oddelený a získa sa tak dCMP-DPP. K takto pripravenému roztoku sa pridá už vopred pripravený roztok UTP a zmes sa mieša pri teplote miestnosti 56 hodín. Reakcia sa ukončí prídavkom vody a pH reakčnej zmesi sa upraví na 11 prí davkom 30 % vodného roztoku hydroxidu sodného. Potom sa rozpúšťadlo odstráni zahustením vo vákuu a pH sa upraví na 7,0 prídavkom kyseliny chlorovodíkovej 6 mol/1. Zmes sa spracuje rozdelením s etylacetátom. Vodná vrstva vzniknutá po rozdelení sa potom podrobí analýze metódou HPLC (272 nm), ktorou sa získa výťažok syntézy dCPU4U 37,7 %.

Priemyselná využiteľnosť

Ako je opísané, kryštalická forma dCP4U pripravená spôsobom podľa vynálezu, má v porovnaní s lyofilizovaným produktom vysokú čistotu a vysokú stabilitu a nie je hygroskopická, a je preto vhodná ako surovina na prípravu liečiva.

Spôsob prípravy dCP4U podľa vynálezu umožňuje použitie lacného UMP ako vstupnej suroviny s dosiahnutím vysokého výťažku. Spôsob podľa vynálezu je preto vhodný na prípravu dCP4U v priemyselnom meradle.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

L Kryštalické formy P¹-(2'-deoxycytidín-5'-)P⁴-(uridín-5 ’-)tetrafosfátu alebo jeho soli.
2. Kryštalické formy P¹-(2'-deoxycytidín-5'-)P⁴-(uridín-5'-)tetrafosfátu · 4Na.
3. Kryštalické formy zlúčenín podľa nároku 1 alebo 2 s čistotou najmenej 95 %.
4. Kryštalické formy zlúčenín podľa nároku 1 alebo 2 s čistotou najmenej 97 % a obsahujúce 2 % alebo menej uridín-5'-trifosfátu.
5. Kryštalické formy zlúčenín podľa nároku 1 alebo 2 s čistotou najmenej 98 % a obsahujúce 1 % alebo menej uridín-5'-trifosfátu.
6. Spôsob prípravy kryštalických foriem podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa prečistenie surového P'-(2'-deoxycytidín-5'-)P⁴-(uridín-5'-)tetrafosfátu chromatografiou na meniči aniónov a chromatografiou na aktívnom uhlí a prídavok hydrofóbneho organického rozpúšťadla k získanému roztoku prečisteného P'-(2’-deoxycytidín-5 '-)P⁴-(uridín-5 '-)tetrafosfátu za vzniku zrážania P^l-(2'-deoxycytidín-5'-)P⁴-(uridín-5'-)tetrafosfátu vo forme kryštálov.
7. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že pri prečistení sa najprv uskutoční chromatografia na meniči aniónov a potom chromatografia na aktívnom uhlí.
8. Kryštalické formy zlúčenín podľa ktoréhokoľvek z nárokov laž 5, vyznačujúce sa tým, že jedna molekula P¹-(2'-deoxycytidín-5'-)P⁴-(uridín-5'-)tetrafosfátu alebo jej soli viaže alebo adhézne viaže 1 až 14 molekúl vody.
9. Kryštalické formy zlúčenín podľa ktoréhokoľvek z nárokov laž 5, vyznačujúce sa tým, že jedna molekula P¹-(2'-deoxycytidín-5'-)P⁴-(uridín-5'-)tetrafosfátu alebo jej soli viaže alebo adhézne viaže 3,5 molekúl vody.
10. Kryštalické formy zlúčenín podľa ktoréhokoľvek z nárokov laž 5, vyznačujúce sa tým, že jedna molekula P¹-(2'-deoxycytidín-5'-)P⁴-(uridín-5'-)tetrafosfátu alebo jej soli viaže alebo adhézne viaže 10 molekúl vody.