MXPA02000035A - Cristales dinucleotido. - Google Patents
Cristales dinucleotido.Info
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Abstract
La presente invención esta dirigida a cristales de P1-(2'- desoxicitidin-5'-)P4-(uridin-5'-)-tetrafosfato (dCP4U) o sales del mismo y a un procedimiento para producir los cristales;la presente invención provee también un procedimiento para preparar dCP4U, en donde se hace reaccionar 5-monofosfato de uridina (UMP), 5'-monofosfato de 2'desoxicitina (dCMP), fosforocloridato de difenilo (DPC) y un pirofosfato (PPi);los cristales de dCP4U obtenidos mediante el procedimiento de acuerdo con la presente invención tienen alta pureza y son fácilmente manejables debido a que poseen menor hidroscopicidad y mayor estabilidad en comparación con el producto secado por congelamiento, sirviendo por lo tanto como material de partidaútil para preparar un producto farmacéutico;el procedimiento para producir dCP4U de acuerdo con la presente invención permite el uso de UMP económico como material de partida y alcanza alto rendimiento;así, el procedimiento es adecuado para la síntesis a gran escala de dCP
Description
CRISTALES DE DINUCLE0T1D0
CAMPO DE LA INVENCION
La presente invención se refiere a cristales de P1-(2'-desoxicitidin-5'-)P4-(uridin-5'-)tetrafosfato (Dcp4u) como sal farmacéuticamente aceptable del mismo (se puede hacer referencia al mismo en lo sucesivo en la presente simplemente como "dCP4U") que es útil como agente terapéutico para bronquitis crónica, sinusitis y similares; a un procedimiento para producir los cristales; y a un procedimiento para producir eficientemente dCP4U.
TECNICA ANTERIOR
El dCP4U representado por la siguiente fórmula (I):
o una sal del mismo es un agonista selectivo al receptor de purina P2Y2 y/o al receptor de purina P2Y4 y es un compuesto que se espera que se desarrolle como agente terapéutico para la bronquitis crónica, la sinusitis y similares (véase el documento WO 98/34942). Hasta ahora, no ha sido posible obtener dCP4U en forma de cristal y se ha preparado dCP4U solamente en forma de polvo blanco (sólido blanco) secando por congelamiento. Los productos de dCP4U en polvo obtenidos convencionalmente tienen una pureza tan baja como el 82% (medida por CLAR). Particularmente, es difícil separar 5'-trifosfato de uridina (UTP) que sirve de material de partida de dCP4U y se ha producido dCP4U altamente purificado solamente con más dificultad por cromatografía de intercambio de iones empleada convencionalmente (documento WO 98/24942). El polvo blanco mencionado anteriormente de baja pureza tiene desventajas tales como higroscopicidad. Por lo tanto, se debe llevar a cabo la preparación de un producto farmacéutico de dCP4U en un aparato especial en el cual se controle cuidadosamente la humedad. Incluso después de la preparación de un producto farmacéutico, se debe empacar el producto herméticamente. Además, puesto que el producto farmacéutico tiene un periodo disponible muy corto debido a la estabilidad deficiente del producto en polvo, se ha deseado la obtención de cristales de dCP4U altamente purificados y estables.
Se sintetiza el dCP4U a partir de 5'-monofosfato de 2'-desoxicitidina (dCMP) y UTP utilizando un agente activador tal como diciclohexilcarbodiimida (DCC). Sin embargo, los procedimientos convencionales proveen un rendimiento sintético considerablemente bajo; es decir, tan bajo como aproximadamente 9% en peso (véase el ejemplo 20 del documento WO 98/34942), y no pueden servir nunca de procedimiento práctico. Por consiguiente, se ha deseado también el desarrollo de un procedimiento para producir dCP4U en alto rendimiento y a gran escala. En vista de lo anterior, un objeto de la presente invención es proveer cristales estables de dCP4U que sean adecuados para preparar fármacos. Otro objeto de la invención es proveer un procedimiento para producir los cristales. Otro objeto todavía de la invención es proveer un procedimiento eficiente, adecuado para la producción a gran escala de dCP4U.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION
Los presentes inventores han efectuado estudios intensivos sobre la estabilización del dCP4U y han descubierto que se puede preparar dCP4U que tenga una pureza del 95% o más, por cromatografía de intercambio aniónico en combinación con cromatografía que emplea carbón activado (cromatografía de carbón activado) y que se puede producir cristales de dCP4U a partir de tal dCP4U altamente purificado. Los cristales de dCP4U así obtenidos han demostrado que poseen una pureza considerablemente más alta que la del polvo de dCP4U convencionalmente producido, ninguna higroscopicidad y alta estabilidad. Los inventores han efectuado también estudios intensivos sobre los métodos para sintetizar dCP4U con el uso de 5'-monofosfato de urina (UMP) económico en lugar del UTP caro y han descubierto que se puede producir efectivamente dCP4U con el uso de fosfocloridrato de difenilo (DPC) y un pirofosfato (PPi). Se ha efectuado la presente invención sobre la base de estos hallazgos. Por consiguiente, la presente invención provee cristales de dCP4U. La presente invención provee también un procedimiento para producir cristales de dCP4U, procedimiento que comprende purificar dCP4U crudo por cromatografía de intercambio aniónico y cromatografía de carbón activado, y añadir un solvente inorgánico hidrófilo a una solución de dCP4U purificado, para precipitar así el dCP4U en forma de cristales. La presente invención provee también un procedimiento para producir dCP4U que comprende hacer reaccionar UMP, dCMP, DPC y Ppi.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
La figura 1 es una fotografía que muestra una forma de cristal de dCP4U-4Na (3.5-hidratado) cristalino. Se tomó la fotografía bajo un microscopio de polarización (aumento: x440), en que 1 mm de la imagen corresponde a 25 µ??. La figura 2 muestra un espectro por difracción de rayos X de dCP4U-4Na (3.5-hidratado) cristalino. La figura 3 muestra un espectro por infracción de rayos X de dCP4U-4Na (decahidratado) cristalino. La figura 4 muestra un espectro por difracción de rayos X de dCP4U-4Na en polvo (producto secado por congelamiento). La figura 5 muestra un espectro de 13C-CP AS-RMN de dCP4U-4Na (3.5-hidratado) cristalino. La figura 6 muestra un espectro de 13C-CPMAS-RMN de dCP4U-4Na (decahidratado) cristalino. La figura 7 muestra un espectro de 3C-CPMAS-R N de dCP4U en polvo blanco (producto secado por congelamiento).
MEJOR MODO DE LLEVAR A CABO LA INVENCION
Se obtienen los cristales de dCP4U de la presente invención por purificación de dCP4U crudo usando medios específicos y la adición de un solvente orgánico hidrófilo a una solución de dCP4U purificado, para precipitar así el dCP4U como cristales. Se describirá en seguida la presente invención en relación con (1) la purificación de dCP4U y (2) la cristalización de dCP4U.
) Purificación de dCP4U Se puede purificar el dCP4U por cromatografía de intercambio aniónico en combinación con cromatografía de carbón activado. Aunque se pueden realizar los dos procedimientos de cromatografía en secuencia arbitraria, la cromatografía de intercambio aniónico precede preferiblemente la cromatografía de carbón activado, en vista del mejoramiento de la pureza de dCP4U. Se puede usar resina estirénica o acrílica como resina de intercambio aniónico en los procedimientos de cromatografía descritos anteriormente. Algunos ejemplos de resina que se pueden usar incluyen las resinas de intercambio aniónico fuertemente básicas, tales como AMBERLITE IRA 402 (Rohm & Haas Co.), DIAION PA-312 y DIAION SA-11A (Mitsubishi Chemical Co. Ltd.), y las resinas de intercambio aniónico débilmente básicas, tal como AMBERLITE IRA 67 (Rohm & Haas Co.) y DIAION WA-30 (Mitsubishi Chemical Co. Ltd.). El carbón activado puede estar en forma de carbón activado del tiempo para cromatografía que se tritura o conforma como partículas y puede incluir productos comercialmente obtenibles (por ejemplo los de Wako Puré Chemical Industries, Ltd. y Futamura Chemical Industries, Co. Ltd.). Se puede llevar a cabo la cromatografía de manera intermitente, usando una columna, etc. Cuando se lleva a cabo la cromatografía de columna, se puede usar una solución ácida acuosa o una mezcla de la misma con una sal que tenga intensidad iónica realzada, tal como cloruro de sodio, como eluyente para la cromatografía de intercambio aniónico; y se puede usar agua o una solución acuosa de un álcali, tal como hidróxido de sodio, como eluyente para la cromatografía de columna de carbón activado. Se puede efectuar una prueba preliminar a pequeña escala, a fin de seleccionar la concentración apropiada de cada eluyente de dentro del intervalo de 0.001 M a 10 M.
(2) Cristalización de dCP4U Se cristaliza el dCP4U por adhesión de un solvente orgánico hidrófilo a una solución que contiene el dCP4U así purificado. Algunos ejemplos de solventes orgánicos hidrófilos que se pueden usar incluyen alcoholes que tienen seis o menos átomos de carbono, tales como metanol y etanol; cetonas tales como acetona; éteres tales como dioxano; nitritos tales como acetonitrilo; y amidas tales como dimetilformamida. De éstos, se prefieren particularmente los alcoholes, especialmente el etanol. Más específicamente, se trata opcionalmente una solución del dCP4U así purificado o una suspensión espesa obtenida por concentración de la solución, para ajustar así el pH a 5-10, preferiblemente 6-9, y se añade un solvente orgánico hidrófilo a la solución o suspensión espesa a 60°C o menos, preferiblemente 20°C o menos, para precipitar así la sustancia disuelta como cristales estables de dCP4U.
Los cristales de dCP4U así obtenidos de la presente invención contienen dCP4U en una cantidad de 95% o más y UTP en una cantidad de 3% o menos. Preferiblemente los cristales de dCP4U contienen dCP4U en una cantidad de 97% o más y UTP en una cantidad de 2% o menos. Más preferiblemente, los cristales de dCP4U contienen dCP4U en una cantidad de 98% o más y UTP en una cantidad de 1 % o menos. Tales cristales de dCP4U de alta pureza pueden estar en forma de sal, hidrato o sal de hidrato. Algunos ejemplos de las sales incluyen sales farmacéuticamente aceptables tales como sales de metales alcalinos tales como sales de sodio y sales de potasio; sales de metales alcalinotérreos tales como sales de calcio y sales de magnesio; y sales de amonio. Se pueden sustituir el dCP4U con 1-4 átomos de metal para formar una sal. El hidrato mencionado anteriormente puede comprender 1-14 moléculas de agua que estén enlazadas o se adhieran a una molécula de dCP4U y la sal de hidrato mencionada anteriormente puede comprender 1-14 moléculas de agua que estén enlazadas o se adhieran a una molécula de una sal de metal alcalino de dCP4U. Además, los cristales de dCP4U de acuerdo con la presente invención incluyen también tautómeros de los mismos. Se secan opcionalmente los cristales así obtenidos de dCP4U mediante un método habitual, tal como secado bajo presión reducida, secado bajo flujo de aire o secado por calentamiento, y se ponen subsiguientemente en un envase (por ejemplo botella, bolsa, bote, ampolleta). Se puede lograr el empacamiento en el envase, de manera que el envase quede abierto, cerrado, hermético al aire o sellado. No se prefiere el empacamiento en estado abierto al aire, en vista del mantenimiento de la estabilidad en almacenamiento de los cristales. El procedimiento para producir dCP4U de acuerdo con la presente invención comprende hacer reaccionar UMP, dCMP, DPC y PPi. Específicamente, el procedimiento comprende hacer reaccionar
UMP con DPC para sintetizar así fosfato de difenilo de UMP (UMP-DPP); tratando además la mezcla de reacción que contiene UMP-DPP con PPi para formar asi UTP en la mezcla; y hacer reaccionar el UTP así formado, sin aislar de la mezcla de reacción, con dCMP en presencia de DPC, para formar así el dCP4U de objetivo. En la síntesis de UMP-DPP a partir de UMP, se puede disolver en un solvente una sal de trialquilamina de UMP (por ejemplo sal de tributilamina de UMP) preparada de rutina. Algunos ejemplos de los solventes incluyen amidas tales como DMF y dimetilacetamida (DMAC); éteres cíclicos tales como dioxano y tetrahidrofurano; cetonas tales como acetona; y dimetilimidazolidinona, triamida hexametilfosfórica o una mezcla de dos o más de éstos. Subsiguientemente, se añaden DPC y trialquilamina opcional a la solución y se deja reaccionar la mezcla a 10-50°C durante aproximadamente
30 minutos a cinco horas. Los PPi que reaccionan con UMP-DPP son preferiblemente sales alcalinas orgánicas de PPi. Algunos ejemplos de las sales incluyen una sal de hexilamina, una sal de tributilamina, una sal de trietilamina y una sal de tributilamina. En la reacción de UMP-DPP con sal alcalina orgánica de PPi, se puede disolver en un solvente la sal alcalina orgánica de PPi. Algunos ejemplos de tales solventes incluyen amidas tales como DMF, DMAC y formamida; éteres cíclicos tales como dioxano y tetrahidrofurano; cetonas tales como acetona; y dimetilimidazilidona: triamida hexametilfosfórica, dimetilsulfóxido, acetonitrilo o una mezcla de dos o más de éstos. Subsiguientemente, se añade la solución a la solución de UMP-DPP así sintetizada y se deja reaccionar la mezcla a 10-50°C durante aproximadamente 30 minutos a 5 horas. Se puede llevar reacción entre UMP-DPP y la sal alcalina orgánica de PPi, en presencia de una base adecuada. Algunos ejemplos de las bases incluyen bases de piridina tales como piridina, 2,6-lutidina, 2,4-lutidina, a-picolina, ß-picolina, ?-picolina, 2,4-dimetilaminopiridina, a-colidina, ß-colidina y y-colidina, prefiriéndose particularmente la piridina. Se incluye también el solvente básico para la reacción en las bases usadas en la presente invención. La concentración de la base no está particularmente limitada. Se añade preferiblemente la base en una cantidad de 6 equivalentes o más basándose en el UMP, más preferiblemente 18 equivalentes o más. Mediante la reacción entre el UMP-DPP y la sal alcalina orgánica de PPi, se sintetiza el UTP en la mezcla de reacción. Se hacen reaccionar el UTP así formado y el dCMP en presencia de DPC, para sintetizar así el dCP4U. Aunque se puede añadir así dCMP a la mezcla de reacción, se convierte el dCMP a dCMP-(fosfato de difenilo) (dCMP-DPP) de manera similar a la empleada en el caso de UMP y se puede añadir también el dCMP-DPP. Se puede llevar a cabo la reacción de dCP4U añadiendo, a la solución de UTP sintetizada que se menciona anteriormente, DPC en una cantidad de 1.1 equivalentes o más y dCMP o dCMP-DPP en una cantidad de 0.5-1.5 equivalentes con base en el UMP empleado como material de partida, y se deja reaccionar la mezcla a 10-50°C durante aproximadamente 30 minutos a 5 horas. Se purifica y cristaliza de la manera mencionada anteriormente el dCP4U así obtenido, para obtener así los cristales de dCP4U de la presente invención.
EJEMPLOS
Se describirá en seguida la presente invención con más detalle a través de ejemplos, que no se deben interpretar como limitantes de la invención a los mismos.
EJEMPLO 1 Producción de cristales de dCP4U 4Na (1) Método de usar DCC Se preparó dCP4U mediante un método de rutina como se describe en el documento WO 98/34942, usando UTP, dCMP y DCC. Se llevó a cabo una reacción a una escala de 20 mmoles. Se diluyó la solución de dCP4U así obtenida con agua para ajustar así el volumen total a 1 ,000 mi y se aplicó la solución diluida a una columna cargada con resina de intercambio aniónico básica media (AMBERLITE IRA-67, producto de Rhom & Haas Co.). Se llevó cabo la elución secuencialmente usando agua, una solución acuosa de ácido clorhídrico a 0.18 M y una solución acuosa de ácido clorhídrico a 0.005 M que contenía cloruro de sodio a 0.05 M, recogiendo así fracciones que contenían dCP4U. Se aplicaron las fracciones de dCP4U (4000 mi) así obtenidas a una columna cargada con carbón activado del tipo para cromatografía (Taiko Granular Activated Charcoal SGP, producto de Futamura Chemical Industries, Co., Ltd.), y se eluyó dCP4U usando una solución acuosa de hidróxido de sodio a 0.05 M (8000 mi). Se combinaron y concentraron las fracciones de dCP4U así obtenidas, para preparar así una solución espesa. Se ajustó el pH de la suspensión espesa a 6.0. se agitó la suspensión espesa mientras se añadía etanol gradualmente a la suspensión espesa y se enfrió además la suspensión espesa resultante a 10°C con agitación, precipitando así los cristales de dCP4U-4Na. Se separaron los cristales para producir así 8.9 g de cristales de dCP4U-4Na. Se secaron los cristales aislados bajo presión reducida a aproximadamente 60°C durante aproximadamente 4 horas y se sometieron luego a análisis intrumentales.
Método con uso de DPC Se disolvió UTP«3Na (12.8 kg) en agua (135 I) y se aplicó la solución resultante a una columna cargada con resina de intercambio catiónico (producto de Mitsubishi Chemical Co. Ltd.). Se combinó la solución que había pasado a través de la columna y las fracciones que se había eluido, y se añadió gradualmente tributilamina (TBA; 13.6 kg) a la solución combinada con agitación para su neutralización. Se concentró la solución y se añadió formamida (10 kg) a la solución. Se deshidrató la solución resultante hirviendo con dioxano. Subsiguientemente, se diluyó la materia deshidratada con piridina (11.6 kg), para preparar así una solución de piridina de UTP. A otro tanque que contenía metanol (18 I), se le añadió dCMP (7.5 kg). Se añadió gradualmente TBA (4.5 kg) a la solución con agitación, se calentó la solución a 60°C. Después de que se hubieron disuelto los ingredientes, se concentró la solución hasta secar. Se continuó secando al vacío a 75°C la materia secada y se trituró. Se suspendió la materia triturada (10.3 kg) a dimetilacetamida (DMAC) (16.7 kg), y se añadió a la suspensión 1
fosfoclorhidrato de difenilo (DPC) (4.4 kg), y se agitó la mezcla durante 10 minutos. Subsiguientemente, se le añadió además TBA (10.8 kg) a la mezcla y se agitó la mezcla resultante durante 30 minutos, para preparar así una solución de dCMP-DPP. A la solución de dCMP-DPP así preparada se le añadió con agitación la solución de piridina de UTP que se había preparado de la manera mencionada anteriormente. Después de completar la adición, se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante la noche y se terminó la reacción añadiendo agua desionizada. A la mezcla mencionada anteriormente, ase le añadió una solución acuosa de hidróxido de sodio a 30% (31 I). Se agitó la mezcla durante 30 minutos y se separó la TBA liberada por segmentación. Se añadió una solución de ácido clorhídrico de 6 mol/l a la capa acuosa, para ajusfar así el pH de la solución a aproximadamente 7. Se concentró la solución por extracción de solvente y se añadió un equivolumen de etanol a 95% a la solución concentrada. Se dejó reposar la mezcla resultante durante la noche. Se extrajo por succión la capa superior de la mezcla, es decir una capa de etanol, y se añadió agua a los precipitados pegajosos resultantes para disolver así los precipitados. Se extrajo el solvente residual por concentración del solvente. Se ajustó el volumen total de la solución de dCP4U así sintetizada a 2,500 1, y se aplicó la solución a una columna cargada con resina de intercambio aniónico básica media (AMBERLITE IRA-97, producto de Rohm & Haas Co.). Se llevó a cabo la elución secuencialmente con agua, una solución acuosa de ácido clorhídrico a 0.1 mol/l y la solución acuosa de ácido clorhídrico a 0.005 mol/l que contenía cloruro de sodio a 0.4 mol/l recogiendo las fracciones que contenían dCP4U. Se aplicaron las fracciones de dCP4U así obtenidas (2100 I) a una columna cargada con carbón activado del tipo para cromatografía (Taiko Granular Activated Carbón SGP, producto de Futamura Chemical Industries, Co., Ltd.). y se eluyó dCP4U usando una solución acuosa (1200 I) de hidróxido de sodio a 0.05 mol/l. Se combinaron y concentraron las fracciones así obtenidas. Se ajustó el pH de la solución resultante a 7.5 usando una solución acuosa de hidróxido de sodio al 30%. Se agitó la solución mientras se añadían gradualmente a la solución etanol a 95%, precipitando así los cristales de dCP4U-4Na. Se separaron y secaron los cristales a 60°C durante cuatro horas, para producir así 4.2 kg de dCP4U 4Na (contenido de agua: 5.9%, rendimiento a aislamiento: 22%).
Propiedades físicas de los cristales de dCP4U-4Na Se sometieron a análisis instrumental los cristales de dCP4U-4Na preparados en (1 ) o (2) del ejemplo 1 y polvo blanco de dCP4U-4Na (producto secado por congelamiento) que se preparó de la misma manera que en el método descrito en el ejemplo 20 del documento WO 98/34942. Se compararon los cristales con el producto secado por congelamiento en términos de propiedades física.
(3) análisis instrumental 1) análisis de pureza Se sometieron a análisis de pureza los cristales de dCP4U-4Na obtenidos en (1) y (2) de ejemplo 1, y fracciones de dCP4U después de la purificación a través de cada cromatografía, por cromatografía de líquidos de alto rendimiento. Se muestran los resultados en los cuadros 1 y 2. Se describen a continuación las condiciones para la cromatografía de líquidos de alto rendimiento. Columna: HITACHIGEL #3013-N (producto de Hitachi Keisokuki
Service). Eluyente: CH3CN al 10%, NH4CI a 0.18 M, KH2P04 a 0.03 M y K2HP04 a 0.03 M. Método de detección: detección por UV a 262 nm.
CUADRO 1 Método para DCC *
5
10 (-): No medido, *): IE: intercambio iónico, AC: carbón activado.
CUADRO 2 Método para DCC
20 (-): No medido, *): IE: intercambio iónico, AC: carbón activado.
2) Forma de cristal La figura 1 muestra una fotografía de una forma típica de cristal de cristales de dCP4U-4Na (3.5-hdratado).
3) Contenido de agua Se midió el contenido de cristales de dCP4U-4Na por el método de KarI Fisher. Se descubrió que los cristales de dCP4U-4Na se estabilizaban en el contenido de agua de 6.9 a 17.4% en peso, lo cual varió de acuerdo con el grado de secado. Los resultados del cálculo muestran evidentemente que 3.5-10 moléculas de agua se enlazan o adhieren a una molécula de dCP4U.
4) Punto de fusión Se midió el punto de fusión de los cristales de dCP4U-4Na por un método convencional. Se descubrió que el punto de fusión era de 202-210°C. el punto de fusión del producto secado por congelamiento fue de aproximadamente 195-210°C.
5) Refacción por rayos X Se sometieron a difracción los rayos X los cristales de dCP4U-4Na usando un aparato de difracción de rayos X (Modelo: RINT2500V, producto de Rigaku Denki) y las siguientes condiciones (error de medición: ±0.1 °). Se muestran en la figura 2 y el cuadro 3, respectivamente, el aspecto de difracción de rayos X y los datos de pico así obtenidos de dCP4U-4Na 3.5- hidratado. Similarmente, se muestran en la figura 3 y el cuadro 4, respectivamente, el espectro de difracción de rayos X y los datos de pico del dCP4U-4Na decahidratado. Además, se muestra en la figura 4, como referencia, el espectro de difracción de rayos X del producto secado por congelamiento.
Condiciones para la medición: Tubo de rayos X: Cu-Ka Salida de rayos X: 50 kV-300 mA. Velocidad de exploración: 4.07minuto. Intervalo de exploración: 0.02°. Intervalo de medición de los ángulos: 2-40°. Hendidura: DS-0.5", RS-0.15 mm, SS-O.50 Pretratamiento: molienda con el uso de un mortero de ágata.
CUADRO 3 dCP4U 4Na cristalino 3.5-hidratado
CUADRO 4 dCP4U-4Na cristalino decahidratado
No. de 2T Intensidad pico O relativa 1 5.58 28 2 11.34 62 3 11.94 34 4 12.92 27 5 14.08 49 6 14.96 66 7 15.60 49 8 16.62 25 9 17.08 46 10 18.28 27 11 18.90 28 12 20.20 39 13 21.66 72 14 22.02 100 15 23.02 90 6) Higroscopicidad Se dejaron reposar los cristales de dCP4U4Na (decahidrato) que tenían un contenido de agua de aproximadamente 17.4%, durante dos días en las siguientes condiciones a), b) y c): a) 25°C y una humedad relativa de 57%; b) 25°C y una humedad relativa de 75%; y c) 25°C y una humedad relativa de 93%. No se observó ninguna descomposición o cambio en los tres casos mencionados anteriormente. Los cristales han comprobado ser estables y no tener hidroscopicidad. Además, se dejaron reposar los mismos cristales durante siete días en las siguientes condiciones severas d): d) 40°C y una humedad relativa de 75%. No se observó ningún cambio en este caso. En contraste, cuando se almacenó un producto secado por congelamiento (contenido inicial de agua: aproximadamente 1%) durante dos días en las siguientes condiciones b) o c): b) 25°C y una humedad relativa de 75% y c) 25°C y una humedad relativa de 93%, en el segundo día de almacenamiento, el producto adoptó un estado similar al lado debido al aumento gradual del contenido de agua.
7) Estabilidad Se pusieron individualmente cristales de dCP4U-4Na (decahidratados) y un producto secado por congelamiento en botellas, que se sellaron y almacenaron luego durante 13 días a 60°C (prueba de aceleración). No se observó descomposición de los cristales. En contraste, se descubrió que el producto secado por congelamiento se había descompuesto parcialmente como se comprueba por observación de una pérdida de pureza del producto de aproximadamente 2.2%.
8) RMN Se cargó directamente cada uno de los cristales de dCP4U-4Na y el producto secado por congelamiento a un rotor hecho de óxido de circonio y se midió el correspondiente espectro de 13C-CPMAS-RMN. Se describen a continuación las condiciones para la medición.
13, C-CPMAS-RMN
1 ) Aparato CMX-300 (producto de Chemagnetics) 2) Método para la medición CPMAS (supresión de banda lateral) 3) temperatura de medición Temperatura ambiente 4) Núcleo observado 13C 5) Frecuencia de observación 75.502 MHz 6) Ancho de impulso de la excitación 4.5 de protón 7) Tiempo de contacto 0.5 msec 8) Ancho de la medición 30.03 kHz 9) Puntos de medición 2048 10) Puntos de datos 16384 1 ) Tiempo de repetición 15.0 sec. (figuras 6 y 7) 60.0 sec. (figura 5 12) Patrón de cambio químico Hexametilbenceno (patrón exterior de 17.35 ppm) 13) Velocidad de rotación de la 5 kHz muestra 14) Integración 256 veces La figura 5 y el cuadro 5 muestran un espectro de 3C-CPMAS- RMN de dCP4U-4Na cristalino 3.5-hidratado y los datos de pico, respectivamente. La figura 6 y el cuadro 6 muestran un espectro de 13C-CPMAS-RMN de dCP4U-4Na cristalino decahidratado y los datos de pico, respectivamente. La figura 7 y el cuadro 7 muestran el espectro 13C-CPAMS- RMN de dCP4U en forma de polvo blanco (producto secado por
congelamiento) y los datos de pico, respectivamente. Los números de las
figuras 5 a 7 se refieren a los correspondientes números de pico de los
cuadros 5 a 7.
CUADRO 5 dCP4U-4Na cristalino 3.5-hidratado (ppm)
(1 ) 166.1 (2) 156.2 (3) 150.9 (4) 141.6 (5) 138.4 (6) 101.3 (7) 99.2 (8) 93.2 (9) 84.9 (10) 80.6 (1 1 ) 76.7 (12) 73.1 (13) 69.0 (14) 67.2 (15) 62.2 (16) 43.9
CUADRO 6 dCP4U-4Na cristalino decahidratado (ppm)
(1 ) 167.4 (2) 157.8 (3) 151.6 (4) 139.0 (5) 117.9 (6) 102.6 (7) 99.3 (8) 93.3 (9) 90.1 (10) 87.3 (11 ) 80.6 (12) 77.2 (13) 75.0 (14) 73.9 (15) 72.0 (16) 67.0 (17) 63.1 (18) 60.4 (19) 42.0 (20) 40.8 CUADRO 7 Polvo blanco de dCP4U (producto secado por congelamiento) (ppm)
(1) 166.5 (2) 157.4 (3) 149.9 (4) 140.9 (5) 103.0 (6) 99.0 (7) 96.9 (8) 85.9 (9) 73.4 (10) 71.7 (11) 67.1 (12) 42.0 (13) 39.3
EJEMPLO 2 Síntesis de dCP4U a partir de UMP
Se añadieron formamida (2.5 mi) y piridina (7.6 mi) a sal de trietilamina deshidratada (10 mmoles) de pirofosfato (TEA-PPi), seguido por agitación de la mezcla resultante. A una sal de tributilamina deshidratada de 5'-monofosfato de uridina (UMP-TBA) (10 mmoles) puesto en otra vasija, se le añadieron DMAC (3.6 mi), dioxano (3.2 mi) y tributilamina (3.3 mi) y se agitaron, y se le añadió gota a gota a la misma DPC (2.3 mi). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 1 hora, para formar así el UMP-DPP, que se añadió a la solución deshidratada mencionada anteriormente de TEA-PPi preparada de antemano. Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 1 hora, formando UTP. Se añadió DMAC (7.2 mi) a una sal de tributilamina de 5'-monofosfato de 2'-deoxicitidina (TBA-dCMP) (4.9 g, 10 mmoles) puesta en otra vasija, para formar así una suspensión, y se añadió DPC (2.2 mi, 1.1 equivalentes) a la suspensión. Se agitó la mezcla resultante durante 40 minutos y se añadió a la mezcla tributilamina (TBA) (9.5 mi). Se llevaron a cabo otros 20 minutos de agitación, para preparar así dCMP-DPP. Se añadió la solución de dCP-DPP así preparada a la solución de UTP sintetizada mencionada anteriormente, preparada de antemano, y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 56 horas. Se terminó la reacción añadiendo agua y se ajustó el pH de la mezcla de reacción a 11 añadiendo una solución acuosa de hidróxido de sodio al 30%. Después de que se extrajo el solvente por concentración, se ajustó el pH a 7.0 añadiendo un ácido clorhídrico a 6 mol/I. Se segmentó la mezcla con acetato de etilo. Se sometió a análisis CLAR (272 nm) la capa acuosa formada por segmentación, revelando que el rendimiento de síntesis de dCP4U era del 37.7%.
Aplicabilidad industrial Como se describe anteriormente en la presente, los cristales de dCP4U obtenidos mediante el procedimiento de acuerdo con la presente invención tienen alta pureza y alta estabilidad y ninguna higroscopicidad en comparación con un producto secado por congelamiento, para servir así como material de partida útil para preparar un producto farmacéutico. El procedimiento para producir dCP4U de acuerdo con la presente invención permite el uso del UMP económico como material de partida y alcanza alto rendimiento. Así, el procedimiento es adecuado para la síntesis a grande escala de dCP4U.
Claims (12)
1.- Cristales de P1-(2'-desoxicitidin-5,-)P -(uridin-5'-)-tetrafosfato o una sal del mismo.
2. - Cristales de P1-(2'-desoxicitidin-5,-)P -(uridin-5,-)-tetrafosfato 4Na.
3. - Los cristales de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizados además porque tienen una pureza por lo menos del 95%.
4. - Los cristales de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizados además porque tienen una pureza por lo menos del 97% y contienen el 2% o menos 5'-tr¡fosfato de uridina.
5. - Los cristales de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizados además porque tienen una pureza por lo menos del 98% y contienen el 1% o menos 5 -trifosfato de uridina.
6. - Un procedimiento para producir cristales como se cita en la reivindicación 1 , caracterizado porque comprende someter P1-(2'-desoxicitidin-5'-)P4-(uridin-5'-)tetrafosfato crudo a un procedimiento de purificación de cromatografía de intercambio aniónico y cromatografía de carbón activado, y añadir, a la solución resultante de P1-(2'-desoxicitidin-5'-)P4-(uridin-5'-)-tetrafosfato purificado, un solvente orgánico hidrófilo, para causar así la precipitación de P1-(2'-desoxicitidin-5'-)P4-(uridin-5'-)-tetrafosfato en forma de cristales.
7. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque el procedimiento de purificación comprende cromatografía de intercambio anlónico realizada en primer lugar y la subsiguiente cromatografía de carbón activado.
8. - Un procedimiento para producir P1-(2'-desoxicitidin-5'-)P4-(uridin-5'-)tetrafosfato (dCP4U), caracterizado porque comprende hacer reaccionar 5'-monofosfato de uridina (UMP), 5'-monofofato de 2'-desoxicit¡na (dCMP), fosfocloridato de difenilo (DPC), y un pirofosfato (PPi).
9. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque comprende hacer reaccionar UMP y DPC para sintetizar UMP-fosfato de difenilo (UMP-DPP) en una primera etapa; tratar además la mezcla de reacción que contiene UMP-DPP con PPi para formar así 5'-trifosfato de uridina (UTP) en la mezcla; y hacer reaccionar el UTP así formado sin aislar de la mezcla de reacción, con dCMP en presencia de DPC, para producir así dCP4U.
10. - Los cristales de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizados además porque se enlazan o adhieren 1-14 moléculas de agua a una molécula de P1-(2'-desoxicitidin-5'-)P4-(uridin-5'-)-tetrafosfato o una sal del mismo.
11. - Los cristales de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizados además porque se enlazan o adhieren 3.5 moléculas de agua a una molécula de P^'-desoxicitidin-S'^P^uridin-S'-) -tetrafosfato o una sal del mismo.
12.- Los cristales de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizados además porque se enlazan o adhieren 10 moléculas de agua a una molécula de P1-(2,-desoxicitidin-5'-)P4-(uridin-5'-)-tetrafosfato o una sal del mismo.
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