DE2416709C2

DE2416709C2 - Kristallines Mononatriumsalz von cyclischem N↑6↑-2'-O-Dibutyryladenosin-3',5'-monophosphat und Verfahren zu seiner Herstellung

Info

Publication number: DE2416709C2
Application number: DE2416709A
Authority: DE
Inventors: Goro Motoki; Takashi Nagata; Morio Suzuki; Hiroshi Choshi Chiba Yoshino
Original assignee: Yamasa Shoyu Kk Choshi Chiba Jp
Current assignee: Yamasa Shoyu Kk Choshi Chiba Jp
Priority date: 1973-04-06
Filing date: 1974-04-05
Publication date: 1984-08-16
Also published as: CH606086A5; GB1441706A; FR2224463B1; CA1026327A; FR2224463A1; US4015066A; DE2416709A1

Description

Tverfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Alkohol Methanol. Äthanol, Propanole und Butanole verwendet. .. „

5 Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Äther Athyläther, Tetrahydrofuran oder Dioxan, als Keton Aceton, Diäthylketon oder Methylethylketon und als Ester einen Essigsäure-alkyle-

ster mit Ibis 4 Kohlenstoffatomen verwendet

6 Verfahren nach Anspruch 3. dadurch gekennzeichnet, daß man eine wiänge Losung des Mononatnumsalzes von cyclischem N⁶-2'-O-Dibutyryladenosin-3',5'-monophosphat mit Aceton und/oder Dioxan im Gemisch mit Äthyläther oder Tetrahydrofuran. Methylethylketon. Diäthylketon oder einem Essigsäure-alkyle-

ster mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen verwendet

Cyclisches Adenosin-3'.5'-monophosphat isi in der Natur weit verbreitet und spielt im biologischen Geschehen eine wichtige Rolle. Ein wichtiges Derivat das Mononatriumsalz von cyclischem W-2'.O-Dibutyryladenosin-3'.5'-monophosphat. wurde in den letzten Jahren häufig untersucht und als Reagens in der Medizin und der

Biochemie verwendet. . . .,■..,,■

Bisher wurde cyclisches Dibutyryladenosin-moncphosphat-natriumsalz aus seiner Losung als nicntknstaiiines

Pulver gewonnen, z. B. durch Gefriertrocknen oder Trocknen unter vermindertem Druck. Da das Produkt

jedoch sehr instabil ist ist eine zufriedenstellende Reinigung nicht möglich, das Produkt enthält immer Verunreinigungen, wie Salze, Farbstoffe oder andere Nebenprodukte.

Da dieses nichtkristalüne Pulver außerdem noch extrem hygroskopisch ist, sind seiner Herstellung und seiner

Anwendung enge Grenzen gesetzt .

Die Erfindung betrifft ein kristallines Mononatriumsalz von cyclischem N"-2'-O-Dibutyryladenosin-3 5 -mo-

nophosphat mit einem Gitterabstand bei der Röntgenbeugung von

Ängström

1,994 schwach

2,818 schwach

6303 weniger schwach

7,865 schwach

11,787 schwach

17,327 sehr intensiv

Die erfindungsgemäßen Kristalle haben die Form von planaren Rechtecken oder Nadeln und sind weiß oder «ο durchsichtig Oft liegen diese Kristalle als Zwillinge oder lose zusammenhängend vor. (s. Fig.).

Das erfindungsgcmäßc kristalline Mononairiiimsalz von cyclischem N*-2'-O-Dibutyryladenosm-3'.j -monophosphat schmilzt bei 207 bis 2(W"C. Wie ein Vergleich ilcr Rönlgenheiigiingsdiagramme der I" ι g. 2 und 3 zeigt, hat das crfindungsgeinäßc Produkt eine lindere krisiallographisehe Struktur als das herkömmliche amorphe N"-2'-0-DibutyryUidenosin-3'.5'-monophosphat-mononairiumsalz.

h5 F i g. 1 ist eine Mikrophotographie von kristallinem Mononairiiimsalz von cyclischem N"-2'-O-Dibutyryladenosin-3'5'-monophosphat nach der Kristallisation aus seiner Dioxanlösung.

Fig. 2 ist ein Röntgenbcugungsdiagramm des erfindungsgemäßen Produkts nach seiner Kristallisation aus Dioxan.

F i g. 3 ist das Röntgenbeugungsdiagramm eines herkömmlichen amorphen Produkts. Die Kenndaten der Rönigenbeugungsanalyse sind:

Röntgenstrahlung Cu (Ni)

Röntgen-Intensität 35 kV (Spilzenspannung), 15 mA

Detektor Geiger-Müller-Zählrohr. 1200" V

Abtastgeschwindigkeit 1"/Min.

1. Spalt 1°

2. Spalt 0,2 mm

3. Spalt 1° ,o Papiervorschub 10 mm/Min.

Zeitkonstante 2 Sek.

Vervielfacher 0,8

Arbeitsgang 1

Skalenfaktor 8

Diagramm-Maßstab 1000 o. p. s.

Das erfmdungsgemäße kristalline Mononatriumsalz von cyclischem N"-2'-0-Dibutyryladenosin-3',5'-monophosphat ist viel reiner, viel stabiler und weniger hygroskopisch als das herkömmliche amorphe Produkt Das erfindungsgemäße kristalline Salz kann leicht bis auf einen Feuchtigkeitsgehalt unter 6 Gewichtsprozent, vor- 2C zugsweise 5 bis 4 Gewichtsprozent, getrocknet werden, z. B. in einem Gebläse oder durch Trocknen unter vermindertem Druck.

Der folgende Versuchsbericht zeigt die Sersetzungsgeschwindigkeiten von einem herkömmlichen amorphen Produkt, das durch Gefriertrocknung hergestellt wurde, und einem erfindungsgemäßen kristallinen Salz.

Versuchsbericht
I. Herstellung der zu untersuchenden Verbindungen

1) Kristaüines Natriumsalz des dB-cAMP

Ein gemäß Beispiel 9 durch viermaliges Aussalzen weitgehend von Verunreinigungen befreites Produkt wird in 2 ml Wasser gelöst und mit 60 ml eines Gemisches aus 1 Teil Äthanol und 2 Teilen Dioxan versetzt. Die erhaltene Lösung wird gerührt. Nach der Bildung von Kristallen werden weitere 40 ml Dioxan zugegeben, um die Kristallisation zu vervollständigen. Dann werden die Kristalle abfiliricrt. Zur Umkrisiallisierung löst man die J5 Kristalle in 25 ml eines Gemisches aus 1 Teil Wasser und 5 Teilen Äthanol und versetzt die Lösung mit 80 ml Dioxan. Die ausgeschiedenen Kristalle werden abgetrennt, mit Äther und bei 50⁰C im Luftstrom getrocknet. Man erhält das kristalline Natriumsalz des dB-cAMP mit einem Wassergehalt von 6,94%.

2) Amorphes NatriumsalzdesdB-cAMP

Das gleiche, nach viermaligem Aussalzen erhaltene Ausgangsmaterial wie im vorstehenden Versuch wird in 100 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird in eine Schale gegossen und bildet darin eine 3 mm dicke Schicht. Dann wird die Schalte in einen Kühlschrank gestellt und bei -45°C eingefroren und 5 Stunden bei 20"C unter einem Druck von 0,1 Torr getrocknet. Man erhält amorphes Nalriumsalz des dB-cAMP mit einem Wassergehalt von 6,50%.

II.Stabilitätstest

Jeweils 1 g der vorstehend genannten Substanzen wird in ein 5 ml fassendes Glasgefäß gegeben, das mit einem Polyäthylenstopfen verschlossen und anschließend versiegelt worden ist. Dir Glaskölbchen werden in einem Thermostat bei einer Temperatur von 50° C gelagert.

Die Zersetzung der jeweiligen Substanzen wird wie folgt bestimmt:

Von jeder Probe werden vorsichtig genau 400 mg entnommen und in 10 ml destilliertem Wasser gelöst. Jeweils 0,01 ml joder wäßrigen Lösung wird auf ein Chromatographiepapier getropft und bei konstant gehaltener Temperatur von +10"C in einem Raum mit einem Gemisch von 5 Teilen Äthanol und 2 Teiien 1-m Ammoniumacetatlösung bei einem pH-Wert von 7,5 entwickelt. Jeder gebildete Fleck von dB-cAMP und mB-cAMP wird mit Wasser extrahiert. Dann wird die Ultraviolctt-Absorption jedes Flecks gemessen, woraufhin die Zersetzung jeder Probe nach den folgenden Gleichungen berechnet wird:

„ Qfl26Q/c26Q _m "°

O.D. 260/e 260 + O.D. Tille 273
n-Xo = Grad der Zersetzung in %

In den Gleichungen bedeuten:

X_n = Prozentsatz mB--cAMP,diis in der Probe enthalten ist;

Xo = Prozentsatz mB—cAMP, das anfänglich vorhanden war;

O. D. 260 = UV-Absorption des mB-cAMP;

O.D.273 = UV-Absorption des dB-cAMP;

«260 = molare Absorption des mB-cAMP ; 14 800;

«273 = molare Absorption dcsdB-cAMP : 17 400.

to III. Ergebnisse

Tabelle I
Zersetzung in %

Probe l.agcrungsdaucr (Tilge)

0 3 7 10 13 17 20

kristallin 0 0.19 0,55 0.22 0,40 0.50 0.64

amorph ö i.'.7 2.52 3.20 4.01 5.11 5,81

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung des kristallinen Mononatriumsalzes von cyclischem N^b-2'-0-Dibutyryladenosin-3',5-monophosphai. das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine wäßrige, wäßrig-alkoholische Lösung des Mononatriumsalzes von cyclischem N"-2'-0-Dibutyryladenosin-3'.5'-monophosphat mit einem Äther, einem Keton, einem Ester oder deren Gemischen in Berührung bringt, die zumindest

,j teilweise mit der Lösung mischbar sind und in denen das Dibutyryladcnosin-monophosphai-mononatriumsal/. unlöslich ist. Die erfindungsgemäß verwendeten Äther, Ketone und/oder Ester und deren Gemische werden in der Folge als »Fällungsmittel« bezeichnet.

Durch die Zugabe des Fällungsmittels wird die Löslichkeit des fjlzes in der wäßrigen, wäßrig-alkoholischen oder alkoholischen Lösung herabgesetzt. Dadurch ist die Wahl des Lösungsmittels für die Ausgangslösung und des Fällungsmittels begrenzt. Das scheint für die Herstellung des erfindungsgemäßen kristallinen Salzes kritisch zu sein.

Als Ausgangslösung kann man eine wäßrige, wäßrig-alkoholische oder alkoholische Lösung von cyclischem Dibutyryl-adenosin-monophosphat-mononatriumsalz oder die Lösung eines Produkts, das in herkömmlicher Weise aus cyclischer Adenos;r.-3',5'-phosphorsäure hergestellt wurde, verwenden. Das Mononatriumsalz von cyclischem N⁶-2'-O-Dibutyryladenosin-3'5'-monophosphat kann z. B. wie folgt hergestellt werden: 7.5 g cyclische Adenosin-3',5'-phosphorsäure werden in einem Minimum von 0,4 m wäßrigem Triäthylamin gelöst. Die Lösung wird unter verrniridcrtern Druck zur Trockene eingedampft und dann azeotrop mit etwa 50 ml Pyridin unter vermindertem Druck entwässert. Zu diesem getrockneten Triäthylaminsalz von cyclischer Adenosin-3'.5'-phosphorsäure werden 120 ml wasserfreies Pyridin gegeben. Das Gemisch wird erhitzt, um zumindest einen Teil des Triäthylaminsalzes zu lösen. Dann wird das Gemisch oder die Lösung auf etwa 30°C abgekühlt, mit 100 ml wasserfreiem Buttersäureanhydrid [(CH₁CH₂CH₂CO)IO] versetzt und bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wird dann mit Eis gekühlt und mit 20 ml Wasser versetzt, um überschüssiges Buttersäureanhydrid zu hydrolysieren. Das Gemisch enthält 10 g cycüsches Dibutyryl-adenosin-3'3'-monophosphat, das mit einer alkalischen Natriumverbindung zum Natriumsalz neutralisiert wird.

Diese wäßrige Lösung des Mononatriumsalzes von cyclischem N^h-2'-O-Dibutyryladenosin-3'3'-monophosphat kann entweder direkt als solche oder nach einer Reinigung, z. B. über ein lonenaustauscherharz. als Ausgangslösung für das erfindungsgemäßc Verfahren verwendet werden.

Wird als Ausgangslösung eine wäßrig-alkoholische oder alkoholische Lösung verwendet, so sind hydrophile Alkohole, die in Wasser löslich sind oder in denen Wasser gelöst werden kann, geeignet. Beispiele für derartige

_M Alkohole sind Alkohole mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, insbesondere ein-, zwei- oder dreiwertige Alkohole mit I bis 4 Kohlenstoffatomen. Bevorzugt sind einwertige Alkohole mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie Meth.-.nol,

Äthanol. n-Propanol. Isopropanol, n-Butanol. Isobutanol, n-Pentanol. Isopentanol, Hexanol, Heptanol oder Diäthylenglykolmono-Ci_i-alkyläther.

Im allgemeinen nimmt die Löslichkeit des Dibutyryl-adenosin-monophosphat-mononatriumsalzes in Alkohol mit steigender Anzahl an Kohlenstoffatomen des Alkohols ab. So ist die Löslichkeit des Salzes in Octanol stark vermindert. Die Löslichkeit hängt auch stark von der Menge im Alkohol ab. In einigen Fällen, in denen das cyclische Dibutyryl-adenosin-monophosphat-mononatriumsalz in einem höheren Alkohol gelöst wird, ist es günstig, ein System aus Wasser und Alkohol in einem geeigneten Verhältnis zu verwenden.

Obwohl mehrwertige Alkohole, wie Äihylenglykol, Diäthylcnglykol und Glycerin eine hohe Viskosität und einen hohen Siedepunkt haben und dadurch die Trennung und das Trocknen der Kristalle erschweren, können sie auch als Lösungsmittel verwendet werden. Auch verunreinigte wäßrige, wäßrig-alkoholische oder alkoholische Lösungen des Natriumsalzes von cyclischem Dibutyryladcnosin-monophosphat, die als Verunreinigungen Lösungsmittel. Reagentien, Salze oder Farbstoffe enthalten, können als Ausgangslösungen für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden.

P₅ Dse im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Ausgangslösung enthält das Mononatriumsalz von cyclischem Dibutyryl-adenosin-monophosphiii in einer Konzentration von 20 bis 80 Gewichtsprozent, vorzugsweise von 30 bis 70 Gewichtsprozent.

Die als Fällungsmitte! für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten Äther, Ketone und Ester oder deren

Gemische sind zumindest teilweise mit dem Lösungsmittel der Ausgangslösung, insbesondere mit dem Alkohol, mischbar. Im Hinblick auf die Abtrennung der Kristalle und das anschließende Trocknen werden Lösungsmittel mit niedrigem Siedepunkt bevorzugt.

Spezielle Beispiele für als Fällungsmittcl verwendete Äther sind Äthyliiihcr, Dioxan und Tetrahydrofuran, für Ketone Aceton, Mcthyläthylkcton, Diäthylkcion und Mcthylisobulylkcion. und für Ester niedere Essigsäurealkylesler, vorzugsweise mit I bis 4 Kohlenstoffatomen, wie Meihylacclal, Äthylacctat und n- oder Isopropylacetat. Man kann aber auch Gemische von 2 oder mehreren der genannten Fällungsmittcl im erfindungsgemäßen Verfahren verwenden.

Bei wäßrigen oder wäßrig-alkoholischen Lösungen des Mononairiunisalzes von cyclischen! Dibuiyryl-adenosin-monophosphat hängt die Wahl des Fällungsmittels vom Wassergehall der Lösung ab: Je höher der Wasser- iu gehalt der Lösung, um so hydrophiler sollte das Fällungsmittel sein. Für eine wäßrige oder wäßrig-alkoholische Lösung mit einem Wassergehalt über 70 Gewichtsprozent sind Dioxun oder Aceton geeignet. Nach einer bevorzugten Ausführungsform werden hierbei genügende Mengen von Dioxan oder Aceton im Gemisch mit Äthyläther oder Tetrahydrofuran, mit Methylethylketon oder Diäthylkcion. oder mit einem der vorgenannten Ester verwendet. Man erhält so zwar keine höhere Ausbeute als mit Dioxan und/oder Aceton allein, für die Abtrennung der Kristalle aus dem Gemisch und das Trocknen der Krislalle ist die Mitverwendung eines derartigen »zweiten« Fällungsmittels jedoch günstig. Die genannten Äther, Ketone und Ester zeichnen sich durch einen niedrigen Siedepunkt und eine Löslichkeit in Wasser von höchstens 25% aus.

Da mit steigendem Wassergehalt der Ausgangslösung größere Mengen an Fällungsmitlei notwendig sind, werden wäßrig-alkoholische Lösungen mit einem Minimum an Wasser oder alkoholische Lösungen ohne Wasser, wie niethanolische oder äthanolischc Lösungen, bevorzugt. Tabelle Il und III zeigen die Beziehung zwischen dem Wassergehalt einer 20gewichtsprozentigen wäßrig-alkoholischen Lösung von 3 g Dibutyryl-adenosin-monophosphat-mononatriumsalz(dB—cAMP) und der notwendigen Menge an Dioxin als Fällungsmittel.

Tabelle!!

Zusammensetzung der Lösung (Gew.-%) Dioxan Ausbeute

dB-cAMP-Na Äthanol Wasser (ml) (%)

80 600 94,1

60 350 94,5

40 300 95,7

20 200 96,8

10 150 97,3

Zusammensetzung der Lösung (Gew.-%) Dioxan Ausbeute

dB-cAMP-Na Methanol Wasser (ml) (%)

20 0 80 600 94,1

20 20 60 350 92.1

20 40 40 300 94.4

20 60 20 200 96.0

20 70 10 150 96,4

Wird Wasser allein als Lösungsmittel für das cyclische Dibutyryi-adenosin-monophosphat-mononatriumsalz verwendet, so hängt die Menge an Fällungsmittel, wie Dioxan oder Aceton, stark von der Konzentration des Salzes in der Lösung ab. Im erfindungsgemäßen Verfahren ist es daher wünschenswert, die Kristallisation bei einer relativ hohen Konzentration der Lösung durchzuführen, z. B. von 30 bis 70%. Bei einer Konzentration von weniger als 30% ist der Bedarf an Dioxan oder Aceton besonders hoch, obwohl auch aus dieser Lösung Kristalle von cyclischem Dibutyryl-adenosin-monophosphat-mononatriumsalz erhalten werden können. Bei einer Konzentration der Lösung von über 70%, insbesondere über 85%. ist eine Kristallisation schwierig.

Die Beziehung zwischen der Konzentration einer wäßrigen Lösung von 6 g cyclischem Dibutyryl-adenosinmonophosphat-rnononatriumsalz (dB-cAMP-Na), der zugesetzten Menge an Dioxan oder Aceton und der Ausbeute an Kristallen zeigen die Tabellen IV und V.

20	0
20	20
20	40
20	60
20	70
Tabelle 111

Tabelle IV	Gewicht der Lösung (g)	Dioxan zugesetzte Menge (ml)	mljegdB-cAMP-Na	Ausbeute (%)
dB-cAMP-Na-Lösung Konzentration (Gew.-%)	30,0 20.0 iio 85	1200 500 200 100	200 83 33 17	94,1 94.9 972. 97.0
20 30 50 70

Tabelle V

dB-cAMP-Na-Lösung Aceton Ausbeute Konzentration Gewicht der Lösung zugesetzte Menge ml jegdB-cAMP-Na (°/o) (Gew.-%) (g) (ml)

20 30.0 1200 200 94,6

30 20.0 500 83 95,2

50 12,0 200 33 96,5

70 8,5 100 17 96,1

Die Kristallisation wird im allgemeinen bei einer Temperatur /wischen 15 und 45°C, vorzugsweise zwischen 20 und 40°C, durchgeführt. Man kann aber auch die Temperatur am Anfang der Kristallisation höher halten, z. B. von 40 bis 45"C, und sie dann senken, /.. B. auf 15 bis 20°C. In diesem Fall sollte das Gewichtsverhältnis von Alkohol zu Fällungsmittel etwa 1:1 bis 1:8, vorzugsweise 1:2 bis 1:6, betragen.

Besteht das Fällungsmittcl aus einem Gemisch, so kann man die Zusammensetzung und das Mischverhältnis im Lauf der Kristallisation ändern. Man kann /.. B. der zu kristallisierenden Lösung einen Teil der Fällungsmittel zuerst, den Rest nach Beginn der Kristallisation zugeben und dadurch die Ausbeute verbessern.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Das Reaktionsprodukt von cyclischen! Triäthylammonium-adenosin-3',5'-phosphat und wasserfreiem Buttersäureanhydrid wird mit Wasser versetzt. Die Lösung, die 10 g cyclisches Dibutyryl-adenosin-monophosphat

sowie etwas Buttersäure und Pyridin enthält, wird mit Calciumhydroxid neutralisiert und so weit eingeengt, daß das Calciumbutyrat auskristallisiert. Das Calciumbutyrat wird abfiltriert und mit Äthanol gewaschen. Das Filtrat und das Waschwasser werden vereinigt und mit Calciumhydroxid auf pH 7,0 neutralisiert, wobei weiteres Calciumbutyrat ausfällt, das abfiltriert wird. Das Filtrat wird eingeengt, um das organische Lösungsmittel abzutrennen, mit Wasser versetzt und mit einem lonenaustauschcrharz behandelt, um die Calciumionen zu entfernen. Anschließend wird die Lösung mit Natriumhydroxid neutralisiert, auf einen Gehalt an cyclischem Dibutyryl-adenosin-monophosphat-mononatriumsalz von etwa 50% eingeengt und unter Schütteln mit 350 ml Dioxan versetzt. Die Lösung wird stehengelassen, bis das Salz auskristallisiert. Die Kristalle werden aus dem Lösungsmittel abgetrennt, zuerst mit Dioxan und dann mit Äthylälhcr gewaschen, zuerst bei 50°C in einem Gebläse und anschließend unter vermindertem Druck über Kieselgel in einem Exsiccator getrocknet. Man erhält 8,5 g kristallines Mononatriumsalz von cyclischem N^t>-2'-0-Dibutyryl-adenosin-3'.5'-monophosphat mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 2,8% und einer Reinheit von 98,6%.

Beispiel 2

20 g einer 33prozentigen wäßrigen Lösung von cyclischem Dibutyryl-adenosin-monophosphat-mononatriumsalz werden mii 500 ml Dioxan versetzt. Das Gemisch wird geschüttelt und stehengelassen. Die ausfallenden Kristalle werden abfiltriert und über Kieselgel in einem Exsiccator unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 6,4 g eines kristallinen Produktes mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 3,06% und einer Reinheit von 99,6%.

Beispiel 3

20 g einer 55prozentigen wäßrigen Lösung von cyclischem Dibutyryl-adenosin-monophosphat-mononatriumsalz werden mit 350 ml Dioxan versetzt. Das Gemisch wird geschüttelt und stehengelassen. Die ausfallenden Kristalle werden abfiltriert, mit Äthyläther gewaschen und bei 40°C in einem Gebläse getrocknet. Man erhält 10,4 g kristallines Mononatriumsalz von cyclischem Dibutyryl-adenosin-monophosphat mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 3,81% und einer Reinheit von 993%.

Beispiel 4

20 g einer 50prozentigen wäßrigen Lösung von cyclischem Dibutyryl-adenosin-monophosphat-mononatriumsalz werden mit 400 ml Aceton versetzt. Das Gemisch wird geschüttelt und stehengelassen. Die ausfallenden Kristalle werden abfiltriert, mit Äthyläther gewaschen, in einem Gebläse bei 40° C und anschließend in einem Exsiccator unter vermindertem Druck über Kieselgel getrocknet. Man erhält 93 g eines kristallinen Produkts mit einem Feuchtigkeitsgehall von 255% und einer Reinheit von 99.6%.

Beispiel 5

b5 20 g einer 50prozenligen wäßrigen Lösung von cyclischem Dibutyryl-adenosin-monophosphat-mononatriumsalz werden mit 300 ml Dioxan und 100 ml Aceton versel/.i. Das Gemisch wird geschüttelt und stehengelassen. Die ausfallenden Kristalle werden abfiliriert, mit Äthyläther gewaschen, bei 40⁰C in einem Gebläse und anschließend in einem Exsiccator unter vermindertem Druck über Phosphorpentoxid getrocknet. Man erhält

9,6 g kristallines Mononatriumsalz von cyclischen! Dibutyryl adenosin-monophosphat mit einem Feuchtigkeitsgehalt von !,80% und einer Reinheit von 99,7%.

Beispiel 6

20 g einer 55prozentigen wäßrigen Lösung von cyclischem Dibuiyryl-adenosin-monophosphat-iiiorondtriumsaiz werden mit 280 ml Dioxan und anschließend nach und nach mit 80 ml Äthyläther unter Schütteln versetzt. Die ausgefallenen Krislalle werden aus der Lösung abgetrennt, mit Äthylülher gewaschen, bei 40"'C in einem Gebläse und anschließend über Kieselgel in einem Exsiccator unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 10,8 g kristallines Mononatriumsalz von cyclischem Dibutyryl-adenosin-monophosphat mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 3,51 % und einer Reinheit von 99,7%.

Beispiel 7

20 g einei 55prozentigen wäßrigen Lösung von cyclischem Dibutyryl-adenosin-monophosphat-mononatriumsalz werden mit 300 ml Aceton versetzt. Das Gemisch wird geschüttelt und nach und nach mit 70 ml Äthylacetat versetzt. Das Gemisch wird weiter geschüttelt und dann stehengelassen. Die ausgefallenen Kristalle werden aus der Lösung abgetrennt und über Kieselgel in einem Exsiccator unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 10.8 g kristallines Mononatriumsalz von cyclischem Dibutyryl-adenosin-monophosphat mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 3,66% und einer Reinheit von 98,9%.

Beispiel 8

20 g einer 50prozentigen wäßrigen Lösung von cyclischem Dibutyryl-adenosin-monophosphat-mononatriumsalz werden mit 350 ml Dioxan versetzt. Das Gemisch wird geschüttelt und bei Beginn der Kristallisation mit 50 ml Methyläthylketon versetzt. Das Gemisch wird geschüttelt und stehengelassen. Die ausgefallenen Kristalle werden aus dem Lösungsmittel abgetrennt, mit Äthyläther gewaschen und in einem Exsiccator über Kieselgel getrocknet. Das kristalline Produkt hat einen Feuchtigkeitsgehalt von 3,38% und eine Reinheit von 99,1%.

Beispiel 9

Die gemäß Beispiel 1 erhaltene Lösung von Dibutyryl-adenosin-monophosphat wird nach dem Behandeln mit dem lonenaustauscherharz mit Natriumhydroxid neutralisiert, auf eine Konzentration von etwa 10% eingeengt und mit Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. Die Lösung wird geschüttelt und mit Natriumchlorid versetzt, bis die Lösung gesättigt ist. Dabei wird ein Niederschlag eines rohen cyclischen Dibutyryl-adenosin-monophosphat-mononatriumsalzes ausgesalzen. Der Niederschlag wird mit 100 ml Dioxan/Methanol im Verhältnis 1:1 versetzt, wobei sich das Natriumsalz löst. Unlösliche Feststoffe werden abfiltriert, das Filtrat wird zur Trockene eingedampft, das Produkt wird getrocknet. Das Aussalzen wird 4mal wiederholt. Das erhaltene Produkt wird in 25 ml Äthanol/Dioxan im Verhältnis 1:2 gelöst. Nach Beginn der Kristallisation wird die Lösung mit 100 ml Dioxan versetzt, um dadurch eine vollständigere Kristallisation zu erreichen. Die ausgefallenen Kristalle werden aus dem Lösungsmittel abgetrennt, mit Älhyläther gewaschen, in einem Gebläse bei 6O⁰C und anschließend über Kieselgel in einem Exsiccator unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 8,6 g kristallines Mononatriumsalz von cyclischem Dibutyryl-adenosin-monophosphat mit einem Feuchtigkeitsfehalt von 23% und einer Reinheit von 99,4%.

Bei der Lagerung bei 40⁰C zeigt dieses kristalline Produkt nach 30 und 60 Tagen keinerlei Zersetzung, wogegen ein herkömmliches amorphes Produkt mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 5.87% nach 30 Tagen zu 10,81 % und nach 60 Tagen zu 14,08% zersetzt ist.

Beispiel 10

9 g einer 67prozerstigen wäßrigen Lösung von cyclischem Dibutyryl-üdenosin-monophosphat-mononatriumsalz werden mit 21 ml Äthanol versetzt. Das Gemisch wird geschüttelt und mit 150 ml Dioxan versetzt. Die ausgefallenen Kristalle werden aus der Lösung abgetrennt und getrocknet. Man erhält 6,0 g kristallines Mononatriumsalz von cyclischem Dibutyryl-adenosin-monophosphai mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 3,6% und einer Reinheit von 99,8%. Nach 60 Tagen Lagerung bei 40° C zeigt das Produkt keine Zersetzung.

Beispiel 11

9 g einer 67prozentigen wäßrigen Lösung von cyclischem Dibutyryl-adenosin-monophosphat-mononatriumsalz werden mit 20 ml Methanol versetzt. Das Gemisch wird geschüttelt und mit 150 ml Aceton versetzt Die ausgefallenen Kristalle werden aus der Lösung abgetrennt und getrocknet. Man erhält 5,9 g eines kristallinen Produkts mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 3,5% und einer Reinheit von 995%. Nach 60 Tagen Lagerung bei 40⁰C zeigt das kristalline Produkt keinerlei Zersetzung.

Beispiel 12

6,4 g amorphes gepulvertes Mononatriumsalz von cyclischem Dibutyryl-adenosin-monophosphat mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 5,8% werden mit 10 ml Äthanol und 10 ml Dioxan versetzt Das Gemisch wird eeschüt-

telt, wobei Kristallisation eintritt Um die Kristallisation zu vervollständigen, wird das Gemisch mit weiteren 90 ml Dioxan versetzt Die Kristalle werden abgetrennt und getrocknet Man erhält 5,9 g kristallines Produkt mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 2,8% und einer Reinheit von 99,5%. Nach 60 Tagen Lagerung bei 40°C zeigt das Produkt keinerlei Zersetzung.

Beispiel 13

5 g eines Produkts, das 80% Mononatriumsalz von cyclischem Dibutyryl-adenosin-monophosphat enthält

werden mit 10 ml Methanoi und 20 ml Äthyläther versetzt Das Gemisch wird geschüttelt und bei Beginn der '§

ίο Kristallisation mit weiteren 50 ml Athyläther versetzt Das Gemisch wird weiter geschüttelt Die Kristalle |

werden abgetrennt und getrocknet Man erhält 3,9 g kristallines Produkt mit einem Feuchtigkeitsgehalt von g

3.0% und einer Reinheit von 99,8%. Nach 60 Tagen Lagerung bei 40° C zeigt das Produkt keinerlei Zersetzung. ΐ

Beispiel 14 $

ii 8 g eines Produkts, das 75% Mononatriumsalz von cyclischem Dibutyryl-adenosin-monophosphat enthält

werder. siit 20 ml Methanol versetzt Das Gemisch wird geschüttelt und mit 150 ml ÄthySacetat versetzt Die j£j

Kristalle werden aus der Lösung abgetrennt und getrocknet Man erhält 6 g eines kristallinen Produkts mit Γ;

einem Feuchtigkeitsgehalt von 4.1 % und einer Reinheit von 99,1 %. Nach 60 Tagen Lagerung bei 40° C zeigt das i_:

Produkt keinerlei Zersetzung. ΐ'

Beispiel 15 §.

6,4 g amorphes gepulvertes Mononatriumsalz von cyclischem Dibutyryl-adenosin-monophosphat mit einem *?

Feuchtigkeitsgehalt von 5,8% werden mit 10 ml Äthanol und 10 ml Methyläthylketon versetzt Das Gemisch ■

wird geschüttelt und mit weiteren 80 ml Methyläthylketon versetzt Die Kristalle werden aus der Lösung v;_;

abgetrennt und getrocknet Man erhält 59 g eines kristallinen Produkts mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 3,1 %

und einer Reinheit von 985%. Nach 60Tagen Lagerung bei 40°C zeigt das Produkt keinerlei Zersetzung. %

Beispiel 16 ;

5 g eines Produkts, das 80% Mononatriumsalz von cyclischem Dibutyryl-adenosin-monophosphat enthält, werden mit 10 ml Äthanol und 10 ml Allylacetat versetzt Das Gemisch wird geschüttelt und bei Beginn der Kristallisation mit weiteren 70 ml Methylacetat versetzt Das Gemisch wird weiter geschüttelt bis die Haupt-3S menge an Produkt auskristallisiert ist Die Kristalle werden aus der Lösung abgetrennt und getrocknet Man erhält 33 g eines kristallinen Produkts mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 33% und einer Reinheit von 993%· Nach 60Tagen Lagerung bei40⁰C zeigt das Produkt keinerlei Zersetzung.

Beispiel 17

6,1 g amorphes gepulvertes Natriumsalz von cyclischem Dibutyryl-adenosin-monophosphat mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 1,5% werden in 20 ml n-Propanol und 2 ml Wasser gelöst Die Lösung wird geschüttelt und mit 200 ml Dioxan versetzt Die ausgefallenen Kristalle werden abgetrennt und getrocknet. Man erhält 6,1 g eines kristallinen Produkts mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 3,6% und einer Reinheit von 98,8%. Nach 60 Tagen Lagerung bei 40° C zeigt das Produkt keinerlei Zersetzung.

Beispiel 18

6,1 g amorphes Mononatriumsalz von cyclischem Dibutyryl-adcnosin-monophosphat mil einem Feuchtigkeitsgehalt von 15% werden in 20 ml n-Butanol und 2 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird geschüttelt und mit 200 ml Aceton versetzt. Die Kristalle werden aus der Lösung abgetrennt und getrocknet. Man erhält 6,0 g kristallines Produkt mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 2.2% und einer Reinheit von 98,8%. Nach 60 Tagen Lagerung bei 40°C zeigt das Produkt keinerlei Zersetzung.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

I. Kristallines Mononatriumsalz von cyclischem N^b-2'-ODibutyryladenosin-3',5'-monophosphat mit einem Gitterabstand bei der Röntgenbeugung von

5 Angström schwach 1394 schwach 2,818 weniger schwach 6303 schwach 0 7365 schwach 11,787

17327 sehr intensiv
2. Kristallines Mononatriumsalz von cyclischem N⁶-T-O-Dibutyryladenosin-3 ^'-monophosphat nach Anis Spruch 1 mit einem Feuchtigkeitsgehalt unter 6 Gewichtsprozent.
3 Verfahren zur Herstellung des kristallinen Mononatriumsalzes von cyclischem N"-2'-O-Dibutyryladenosin-3',5'-monophosphat, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige, wäßrig-alkoholische oder alkoholische Lösung des Mononatriumsalzes von cyclischem N*-2'-O-Dibutyryladenosin-3',5'-monophosphat mit einem Äther, einem Keton, einem Ester oder deren Gemischen, die zumindest teilweise mit der Losung mischbar sind und in denen das cyclische Dibutyryladenosin-monophosphat-mononatnumsalz unlöslich ist, in