DE2452467C2

DE2452467C2 - Kristallines Dinatriumsalz der Uridin-5'-diphosphat-glukose und Verfahren zu seiner Herstellung

Info

Publication number: DE2452467C2
Application number: DE19742452467
Authority: DE
Inventors: Takashi Nagata; Morio Suzuki; Hiroshi Choshi Chiba Yoshino
Original assignee: Yamasa Shoyu Kk Choshi Chiba Jp
Current assignee: Yamasa Shoyu Kk Choshi Chiba Jp
Priority date: 1973-11-08
Filing date: 1974-11-05
Publication date: 1982-11-04
Also published as: DE2452467A1; FR2250763A1; CH606083A5; JPS5516440B2; JPS5071817A; GB1469577A; FR2250763B1; CA1021326A

Description

Gegenstand der Erfindung ist kristallines Dinatriumsalz der Uridin-5'diphosphat-glukose, im folgenden als UDPG · 2 Na bezeichnet, und ein Verfahren zu dessen Herstellung.

Uridin-5'-diphosphat-gIukose, im folgenden als UDPG abgekürzt, ist ein Coenzym bzw. ein Zwischenprodukt, das eine sehr wichtige Rolle beim Zuckerstoffwechsel im Organismus spielt und ein wertvolles Arzneimittel bei Lebererkrankungen, Icterus neonatorum. Icterus infantum od. dgl. ist UDPG kann durch Extraktion aus Hefe oder aus synthetischem Wege hergestellt werden. Da jedoch UDPG selbst leicht zersetzlich ist wird sie gewöhnlich in Form des Dinatriumsalzes hergestellt

UD?G ■ 2 Na ist bisher noch nicht in kristalliner Form erhalten worden, da es schwierig ist das Salz zu kristallisieren. Vielmehr hat man es als amorphes Pulver gewonnen. Auch bildet sich bei den üblichen Fällungsverfahren unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels nur ein viskoser Niederschlag aus, und es ist deshalb außerordentlich schwierig, ein sogenanntes amorphes Pulver zu erzeugen. Deshalb hat man das amorphe Pulver des UDPG · 2 Na jetzt durch Gefriertrocknen und durch Sprühtrocknen hergestellt. Diese Verfahren erfordern jedoch einen erheblichen Zeitaufwand und kostspielige Apparaturen, was im Hinblick auf die Wirtschaftlichkeit nachteilig ist. Darüber hinaus enthält das nach diesem Verfahren hergestellte amorphe Produkt zahlreiche Verunreinigungen und pyrogene Substanzen, die wahrscheinlich zu einer Herabsetzung der Reinheit beitragen, so daß ein erheblicher Arbeitsaufwand für ein Reinigungsverfahren erforderlich ist. Zudem läßt sich das amorphe Pulver schlecht lagern und handhaben, da es stark hygroskopisch ist.

Aufgabe vorliegender Erfindung war es daher, ein UDPG · 2 Na herzustellen, das die geschilderten Nachteile nicht aufweist Die Erfindung löst diese Aufgabe.

Gegenstand der Erfindung ist daher kristallines Dinatriumsalz der Uridin-5'-diphosphat-glukose.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung dieses kristallinen Dinatriumsalzes der Uridin-5'-diphosphat-glukose.

Es ist nämlich gefunden worden, daß unter bestimmten Voraussetzungen UDPG · 2 Na kristallisiert und daß die Kristalle eine hohe Reinheit und keine Hygroskopizität aufweisen.

Die Erfindung wird nachstehend näher erläutert, und zwar zunächst anhand der Zeichnungen.

F i g. 1 veranschaulicht das Röntgenspektrum des nach dem Verfahren vorliegender Erfindung hergestellten kristallinen Dinatriumsalzes der Uridin-5'-diphosphat-glukose;

F i g. 2 zeigt das Röntgenspektrum eines nach einem üblichen Verfahren hergestellten amorphen Dinatriumsalzes der Uridin-5'-diphosphat-glukose; und

Fig.3 ist eine Mikrophotographie von nach dem Verfahren vorliegender Erfindung hergestellten Kristallen des UDGP - 2 Na.

Das erfindungsgemäße kristalline LIDPG - 2 Na ist durch das Röntgenspektrum nach F i g. 1 sowie die nachstehenden Gitterabstände bei der Röntgenbeugung gekennzeichnet:

10-« cm	Bewertung
1,955	schwach
2,014	sehr schwach
2,058	sehr schwach
2,090	sehr schwach
2,151	schwach
2,216	sehr schwach
2,338	sehr schwach
2,495	schwach
2422	schwach
2,571	schwach
2,637	sehr schwach
2,776	schwach
2,831	schwach
2,931	schwach
2,998	sehr schwach
3,048	schwach
3,079	schwach
3,187	schwach
3,363	weniger schwach
3,414	mittel
3,493	sehr schwach
3,562	weniger schwach
3,708	weniger schwach
3,900	sehr intensiv
4,004	mittel
4,114	mittel
4,230	schwach
4,418	intensiv
4,671	mittel
4,848	sehr schwach
5,068	weniger schwach
5,126	schwach
5,848	weniger schwach
6,125	sehr schwach
6,326	weniger schwach
7,081	schwach
7,865	schwach
8,672	schwach
9,261	schwach

Zeitkonstante Vervielfacher Arbeitsgang Skalenfaktor

Diagramm-Maßstab

2 Sek. 0,6 10 1

7Γ7 1000O.P.S.

Die Kenndaten der Röntgen-Beugungsanalyse sind:

Röntgenstrahlung Röntgen-lntensität

Detektor

Abtastgeschwindigkeit

1. Spalt

2. Spalt

3. Spalt PaDiervorschub

Cu(Ni)

40 kV (Spitzenspannung),

20 mA

Geiger-Müller-Zählrohr

1200 V

Γ/Min.

0,2 mm

10 mm/Min.

Das Verfahren nach der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß man eine trübe Lösung des

ίο Dinatriumsalzes der Uridin-5'-diphospiiat-glukose in einem Gemisch aus Wasser und einem wasserlöslichen organischen Lösungsmittel von einem pH-Wert 1 bis 9 bei konstanter Temperatur oder unter allmählichem Abkühlen ausreichend lange stehen läßt und die ausgefallenen Kristalle isoliert Nach einer besonders bevorzugten Ausführungsform setzt man ein hydrophiles organisches Lösungsmittel einer 3- bis 70prozentigen Lösung des Dinatriumsalzes der UDPG, bezogen auf die wasserfreie Verbindung, bei einem pH-Wert von

M 1 bis 9 bis zur Trübung zu.

Nach einer anderen Ausführungsform kann man kristallines VDPG ■ 2 Na durch Auflösen eines amorphen Pulvers von UDPG · 2 Na in einem Gemisch von Wasser und einem hydrophilen wasserlölichen organi sehen Lösungsmittel, allmähliches Abkühlen der erhal tenen Lösung oder durch Zugabe eines hydrophilen organischen Lösungsmittels zu der erhaltenen Lösung und Einhalten der vorstehend bei der Lösung einzuhaltenden Verfahrensschritte, wenn die Lösung trübe wird, erhalten.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können als hydrophile organische Lösungsmittel beispielsweise verwendet werden niedere Alkenole, wie Methanol, Äthanol, Propanole, Butanole, und Äthylenglykol, ferner Äther, wie Tetrahydrofuran und Dioxan, weiterhin niedere Alkylketone, wie Aceton, und deren Mischungen. Diese hydrophilen organischen Lösungsmittel müssen in Wasser in ausreichender Weise löslich sein, so daß ein homogenes Wasser-Lösungsmittel-System zur

Kristallisation der UDPG · 2 Na erhalten werden kann. Nach dem erfindungsgernäßen Verfahren wird das

hydrophile organische Lösungsmittel zu einer wäßrigen

Lösung von UDPG · 2 Na gegeben. Wenn jedoch die

wäßrige Lösung der UDGP · 2 Na zu einem hydrophi-

«5 len organischen Lösungsmittel gegeben wird, fällt UDPG · 2 Na als viskoser Niederschlag aus und kann nicht in kristalliner Form erhalten werden. Das gleiche Ergebnis wird beobachtet, wenn das hydrophile organische Lösungsmittel zu einer wäßrigen Lösung

von UDGP · 2 Na auf einmal in einer großen Menge oder in einem starken Überschuß gegeben wird, oder wenn das System plötzlich abgekühlt wird, wodurch UDPG · 2 Na in einer großen Menge ausfällt. Man nimmt an, daß die Kristallisierung auf einer niedrigen Kristallisationsgeschwindigkeit des Dinatriumsalzes der UDPG beruht, obwohl die wissenschaftliche Grundlage hierfür nicht unbedingt einleuchtend ist

Die überraschende Tatsache, daß Kristalle von UDGP · 2 Na, die rein und von hoher Qualität sind, nicht wirksam und in hohen Ausbeuten nach einem Verfahren oder unter Bedingungen gwonnen werden können, bei denen die Löslichkeit der UDPG · 2 Na rasch herabgesetzt wird, sondern lediglich unter milden und besonderen Bedingungen hergestellt werden können, ist — soweit bekannt — zum ersten Mal festgestellt worden.

Bei der praktischen Durchführung vorliegender Erfindung muß man das hydrophile organische Lösungs-

mittel allmählich zu einer wäßrigen Lösung von UDPG · 2 Na derart zusetzen, daß sich das organische Lösungsmittel gleichmäßig im ganzen System verteilt. Ferner muß bei beginnender Trübung der Lösung die Zugabe des hydrophilen organischen Lösungsmittels oder das Kühlen des Systems unterbrochen werden. Man muß das Lösungssystem gegebenenfalls unter Rühren stehenlassen, währenddessen man eine schnelle Änderung hinsichtlich der Löslichkeit des UDPG · 2 Na vermeidet, indem man das Lösungssystem bei einer konstanten Temperatur hält, oder es allmählich auf eine niedrige Temperatur abkühlt, wobei die Abkühlungsgeschwindigkeit 5° C oder weniger je Stunde beträgt.

Die Konzentration der UDPG · 2 Na in der wäßrigen Lösung beträgt Zweckmäßigerweise 3 bis 70%, bezogen auf die wasserfreie Verbindung. Wenn die Konzentration über 70% beträgt, bildet sich gleichzeitig mit der Zugabe des hydrophilen organischen Lösungsmittels ein viskoser Niederschlag. Gleichzeitig wird das Rühren schwieriger, und es können keine reinen Kristalle erhalten werden. Die Bildung von Kristallen aus einer verdünnten Lösung unter 3% ist hinsichtlich der Ausbeute, der Menge an zuzusetzendem und wiederzugewinnendem hydrophilen organischen Lösungsmittel u. dgl. unwirtschaftlich. Der am meisten bevorzugte Konzentrationsbereich beträgt 20 bis 55%.

Obwohl die Menge des zuzusetzenden hydrophilen organischen Lösungsmittels von der Konzentration der wäßrigen Lösung von UDPG · 2 Na, der Art des einzusetzenden hydrophilen organischen Lösungsmittels, der Temperatur und dem pH-Wert des Systems abhängt, ist es doch erwünscht, daß die vorgenannten Bedingungen derart eingestellt werden, daß das Verhältnis von Wasser zu hydrophilem organischem Lösungsmittel im Bereich von 1 :0,5 bis 5 liegt Auf alle Fälle muß die Zugabe des hydrophilen organischen Lösungsmittels dann aufhören, wenn die Lösung trübe wird, und es muß vermieden werden, das hydrophile organische Lösungsmittel in einer großen Menge oder in einem großen Überschuß zuzusetzen. Um ferner die Ausbeute an Kristallen zu erhöhen, ist es erwünscht, daß das hydrophile organische Lösungsmittel in kleinen Anteilen oder allmählich jedesmal zugegeben wird, wenn sich ein Niederschlag bildet, oder daß die Kristallisation in zufriedenstellender Weise durch wiederholte Zugabe des hydrophilen organischen Lösungsmittels in der gleichen Weise wie zuvor beschrieben zu der Lösung erfolgt, aus der die Kristalle ausgefallen sind.

Der pH-Wert der wäßrigen Lösung von UDPG • 2 Na liegt im Bereich von 1 bis 9. Wenn der pH-Wert über 9 liegt, ist die Bildung von Kristallen schwierig, und das UDPG - 2 Na wird teilweise zersetzt. Wenn der pH-Wert über 10 liegt, verläuft die Zersetzung von UDPG - 2 Na rasch. Wenn der pH-Wert unter 1 liegt, wird UDPG - 2 Na ebenfalls zersetzt Der am meisten bevorzugte pH-Bereich liegt bei 4 bis 8.

Wenn man als hydrophiles organisches Lösungsmittel Methanol zu 30prozentigen Lösungen von UDPG •2 Na mit den in der Tabelle 1 angegebenen pH-Werten zusetzt, erhält man die nachstehenden analytischen Werte:

Tabelle 1

Reinheit

Wassergehalt

Natriumgehalt
(%)*)

1,5
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0

100,80
100,30
100,41
100,46
100,51
100,90
100,22
100,57

6,70
6,71
6,40
6,50
6,82
6,76
6,65
6,94

7,31
7,36
7,36
7,38
7,36
7,39
7,41
7,40

*) Die Reinheit wird aufgrund der UV-Absorption, der Wassergehalt nach der Karl-Fischer-Methode und der Natriumgehalt nach der atomaren absorptäorrietrischen Methode gemessen.

Wie aus der Tabelle 1 ersichtlich ist, ist das erfindungsgemäße Verfahren von den anderen üblichen Verfahren zu Kristallisieren von Dinatriumsalzen von Nucleinsäuren insofern verschieden, daß sich das Dinatriumsalz der UDGP nach dem Verfahren vorliegender Erfindung sowohl im sauren als auch im alkalischen Gebiet bilden kann. Es ist deshalb ein besonders großer Vorteil beim vorliegenden Verfahren, daß die pH-Bedingungen aus einem weiten Bereich ausgewählt werden können.

Die bevorzugten Temperaturen für die Kristallisation liegen unterhalb etwa 7O⁰C, vorzugsweise bei 60⁰C oder darunter. Es ist dabei zu beachten, daß sich UDPG • 2 Na zersetzt, wenn die Temperatur längere Zeit auf 85° C oder darüber gehalten wird. Es ist deshalb vorteilhaft, daß die Temperatur schließlich auf niedrige Temperaturen von Raumtemperatur oder darunter herabgesetzt wird, um die Ausbeute an Kristallen zu steigern.

Gewöhnlich ist die Kristallisation im wesentlichen 3 bis 40 Stunden nach der beginnenden Kristallbildung beendet, obwohl dies von der Art und der Menge der in der Lösung vorliegenden Verunreinigungen, von der Art des hydrophilen organischen Lösungsmittels, von der Temperatur u.dgl. abhängt. Der Zusatz von Kristallkeimen ist zur Beschleunigung der Kristaiiisation vorteilhaft und zwar besonders dann, wenn Verunreinigungen, wie farbige Produkte u.dgl. in der wäßrigen Lösung enthalten sind.

Wenn das UDGP · 2 Na nach der Erfindung ohne Rühren erzeugt wird, fallen die Kristalle als farblose

so trigonale Prismen an, während man beim Verfahren unter Rühren nicht notwendigerweise diese Kristallform erhält

Obwohl UDGP - 2 Na bei üblicher. Temperaturen nicht unstabil ist kann die Wärmestabilität jedoch durch das Vorliegen der kristallinen Form erhöht werden. In der nachstehenden Tabelle 2 ist die Wärmestabilität eines nach dem Verfahren vorliegender Erfindung hergestellten kristallinen Produkts (A) mit einem Wassergehalt von 6,5% und eines nach dem Sprühtrocknungsverfahren erhaltenen amorphen pulverförmigen Produkts (B) mit einem Wassergehalt von 73% bei einer Temperatur von 85° C verglichen worden.

Tabelle 2

Probe

Lagerzeil
(Stunden)

UDGP

UDP

UMP
(%)*)

0	98,0	0,9	1,1
4	97,8	1,2	1,0
8	97,8	1,1	1,1
0	96,8	0,8	2,3
4	93,1	1,2	5,1
8	92,3	1,1	6,6

*) UDP bedeutet Uridin-5'-diphosphorsäure und UMP bedeutet Uridin-S'-monophosphorsäure. Beide sind Zersetzungsprodukte von UDPG. Die Analysen werden unter Verwendung der Flüssigkeitschromatographie durchgeführt.

Aus der vorstehenden Tabelle 2 ist ersichtlich, daß das übliche amorphe pulvrige Produkt nach 4 bzw. 8 Stunden bei 85° C zu 3,7% bzw. 4,5% zersetzt war, während man bei dem kristallinen Produkt, das nach dem Verfahren vorliegender Erfindung hergestellt worden war, keine Zersetzung beobachtet. Demzufolge zeigt das nach der Erfindung hergestellte Produkt eine bessere Wärmestabilität

Das bekannte amorphe pulverförmige Produkt ist außerdem stark hygroskopisch und wird klebrig, wenn es unter atmosphärischen Bedingungen stehengelassen wird, während das nach dem Verfahren vorliegender Erfindung hergestellte kristalline Produkt keineswegs hygroskopisch ist.

Zusammenfassend wird nach vorliegender Erfindung die Herstellung von kristallinem UDPG · 2 Na ermöglicht, insbesondere ein Verfahren zu einer einfachen Gewinnung dieser Kristalle, die sich gegenüber dem nach bekannten Verfahren hergestellten UDPG · 2 Na durch hohe Reinheit, kein Vorliegen pyrogener Substanzen, hoher Wärmestabilität und durch keine Hygroskopizität auszeichnen.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

100 ml einer 50prozentigen Lösung von UDPG ■ 2 Na in Wasser wird auf einen pH von 6,0 eingestellt und allmählich unter Rühren mit insgesamt 95 ml Methanol in einer solchen Geschwindigkeit versetzt, daß sich keine große Niederschlagsmenge bildet und daß sich die gesamte Lösung nur schwach trübt In diesem Zustand läßt man die Lösung unter Rühren stehen, während man die Temperatur konstant hält um die Kristalle auszufällen. Wenn die UV-Absorption der überstehenden Flüssigkeit 1000 oder weniger beträgt werden aiimähiich 3 Anteile von je i 55 ml Methanol zugegeben. Die Kristalle scheiden sich in ausreichender Menge ab, während das Rühren fortgesetzt wird. Die so erhaltenen Kristalle werden abfiltriert, mit Methanol gewaschen und bei 40⁰C getrocknet Man erhält 51 g Kristalle von UDPG · 2 Na. Die Ausbeute beträgt 95,1%. Die Reinheit der Kristalle ist 100,06% aufgrund

der UV-Absorptionsrressung. Der Wassergehalt beträgt 6,76%.

Beispiel 2

100 ml einer 25prozentigen Lösung von UDPG • 2 Na in Wasser wird auf einen pH von 7,0 eingestellt und in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 mit 100 ml Dioxan versetzt, um Kristalle auszufällen. Dann werden 2 Anteile von je 100 ml Dioxan zugegeben und die Kristalle praktisch vollständig ausgefällt. Man erhält 24 g UDPG-2 Na in kristalliner Form mit einer Reinheit von 100,42% und einem Wassergehalt von 6,49%. Die Ausbeute beträgt 89,8%.

Beispiel 3

!00 m! einer SOprozentigen Lösung γοη UDPG

■ 2 Na in Wasser werden auf einen pH von 6,5 eingestellt und in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 mit 65 ml eines Gemisches von Methanol und Äthanol im Verhältnis 1 :1 versetzt, um Kristalle auszufällen. Danach werden 135 ml des vorgenannten Lösungsmittelgemisches allmählich zugegeben. Dadurch wird die Kristallisation beschleunigt. Wenn in der überstehenden Lösung, die stehengelassen worden ist, keine Trübung mehr beobachtet wird, wird sie allmählich unter Rühren auf 5°C abgekühlt. Man erhält 51 g kristallines UDPG · 2 Na mit einer Reinheit von 100,27% und einem Wassergehalt von 6,7%. Die Ausbeute beträgt 95,2%.

Beispiel 4

100 ml einer 30prozentigen Lösung von UDPG

■ 2 Na in Wasser wird auf einen pH von 5,5 eingestellt und in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 mit 84 ml eines Gemisches von Methanol und Aceton im Verhältnis 1 :2 versetzt, um Kristalle auszufällen. Danach werden allmählich 116 ml des vorgenannten Lösungsmittelgemisches zugesetzt. Danach wird die gleiche Arbeitsweise wie in Beispiel 3 wiederholt Man erhält 30 g kristallines UDPG · 2 Na mit einer Reinheit von 100,18% und einem Wassergehalt von 6,40%. Die Ausbeute beträgt 93,6%.

Beispiel 5

40 g eines amorphen pulverfömrigen UDPG - 2 Na mit einem Wassergehalt von 7,5% werden in 160 ml eines Gemisches aus Wasser und Äthanol im Verhältnis von 5 :3 bei 55° C gelöst. Die erhaltene Lösung wird

so unter Rühren durch allmähliches Abkühlen auf 25° C trübe. Dann läßt man die Lösung unter Rühren stehen, währenddessen man mit einer Geschwindigkeit von 2° C je Stunde weiter abkühlt und dadurch Kristalle zum Ausfällen bringt Danach werden allmählich 130 ml

Äthanol zugegeben. Anschließend wird das gleiche Verfahren wie in Beispiel 3 wiederholt Man erhält 37 g Kristalle von UDPG · 2 Na mit einer Reinheit von 100,46% und einem Wassergehalt von 6,5%. Die Ausbeute beträgt 93,5%.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

230244/167

Claims

Patentansprüche:

1. Kristallines DinatriumsaJz der Uridin-5'-diphosphat-glukose mit dem nachstehenden Gitterabstand bei der Röntgenbeugung:

10-8 cn Bewertung 1,955 schwach 2,014 sehr schwach 2,058 sehr schwach 2,090 sehr schwach 2,151 schwach 2,216 sehr schwach 2,338 sehr schwach 2,495 schwach 2,5.22 schwach 2,571 schwach 2,637 sehr schwach 2,776 schwach 2,831 schwach 2,931 schwach 2,998 sehr schwach 3,048 schwach 3,079 schwach 3,187 schwach 3.363 weniger schwach 3,414 mittel 3,493 sehr schwach 3,562 weniger schwach 3,708 sehr schwach 3,900 sehr intensiv 4,004 mittel 4,114 mittel 4,230 schwach 4,418 intensiv 4,671 mittel 4,848 seht schwach 5,068 weniger schwach 5,126 schwach 5,848 weniger schwach 6,125 sehr schwach 6,326 weniger schwach 7,081 schwach 7,865 schwach 8,672 schwach 9,261 schwach

10

15

20

25

30

35

40

2. Verfahren zur Herstellung des kristallinen so Dinatriumsalzes der Uridin-5'-diphosphat-glukose nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine trübe Lösung des Dinatriumsalzes der Uridin-5'-diphosphat-glukose in einem Gemisch aus Wasser und einem wasserlöslichen hydrophilen organischen Lösungsmittel bei einem pH-Wert von 1 bis 9 bei konstanter Temperatur oder unter allmählichem Abkühlen ausreichend lange stehen läßt und dann die ausgefallenen Kristalle isoliert.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das hydrophile organische Lösungsmittel zu einer 3- bis 70prozentigen Lösung des Dinatriumsalzes der Uridin-5'-diphosphat-glukose, bezogen auf die wasserfreie Verbindung, bis zur Trübung zusetzt.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die trübe Lösung mit einer Geschwindigkeit bis zu 5⁰C je Stunde abkühlt.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet daß man das Dinatriumsalz der Uridin-5'-diphosphat-glukose zu einem Gemisch von Wasser und einem wasserlölichen hydrophilen organischen Lösungsmittel gibt und die erhaltene Lösung bis zur Trübung abkühlt.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als wasserlösliches hydrophiles organisches Lösungsmittel Methanol, Äthanol, Dioxan, Aceton oder deren Mischungen verwendet.