BRPI9810436B1 - processo para a produção em larga escala de di (5'-tetrafosfato de uridina) e sais do mesmo - Google Patents

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Abstract

"processo para produção em larga escala de di (5'-tetrafosfato de uridina) e sais do mesmo" a presente invenção provê novos processos para síntese de dinucleotídeo terapêutico, p¹, p^ 4^-di (5'-tetrafosfato de uridina), e demonstra aplicabilidade para produção de grandes quantidades. os processos da presente invenção reduzem, substancialmente, o período de tempo necessário para sintetizar tetrafosfato de diuridina, preferivelmente para três dias ou menos. os novos sais de tetramônio e tetrassódio de p¹, p^ 4^-di (5'-tetrafosfato de uridina) da fórmula (i) preparados por estes processos são estáveis, solúveis, não tóxicos e fáceis de manusear durante fabricação. na fórmula, i, x é na, nh~ 4~ ou h, contanto que, todos os grupos x não sejam h.

Description

"PROCESSO PARA PRODUÇÃO EM LARGA ESCALA DE TETRAFOSFATO DE Dl(URIDINA-5') E SAIS DO MESMO" Este pedido reivindica prioridade do Pedido Provisório U.S. 60/054.147, depositado em 25 de julho de 1997.
CAMPO TÉCNICO
Esta invenção refere-se a processos para produção de dinucleotídeos terapêuticos incluindo novos sais dos mesmos. Mais especificamente, ela refere-se aos processos para síntese de P1, P4-tetrafosfato de Dl(uridina-5'), isto é, te-trafosfato de diuridina (U2P4) que possui vantagens em relação aos processos de fabricação da técnica anterior.
HISTÓRICO DA INVENÇÃO P1, P4-tetrafosfato de Dl(uridina-5') é um dinucleo-tídeo da estrutura que se segue: Fórmula I onde : X é Na, NH4 ou H, contanto que todos os grupos X não sejam H. O ácido livre de P^P^-tetrafosfato de Dl (uridina-5'), onde X é hidrogênio, foi descrito anteriormente como uridina 5'-(tetrafosfato de pentaidrogênio), P'''-> 5'-éster com uridina (Número de Registro CAS: 59985-21-6; C. Vallejo e outros, Biochimica et Biophysica Acta 438, 305 (1976) e H. Coste e outros, J. Biol. Chem. 262, 12096 (1987)).
Processos diferentes foram descritos para síntese de dinucleotídeos de purina, tais como, tetrafosfato de diadenosina (A2P4) (E. Rappaport e outros, Proc. Natl. Acad. Sei, 78, 838 (1981); A. Guranowski e outros, Biochemistry, 27, 2959 (1988); C. Lobaton e outros, Eur. J. Biochem, 50, 495, 1975; K. Ng e L. Or-gel, Nucl. Acid Res., 15, 3573 (1987)). Contudo, isto não é verdadeiro para U2P4 que é um nucleotídeo de pirimidina. Embora nu-cleotídeos puros e nucleotídeos de pirimidina pareçam ser análogos, os processos usados para síntese de nucleotídeo puro não trabalham necessariamente para pirimidinas, tais como, uridina.
Tetrafosfato de diuridina mostrou ter propriedades benéficas no tratamento de várias doenças, tais como, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD). Por exemplo, foi demonstrado que eles facilitam a limpeza das secreções da mucosa dos pulmões de um indivíduo, tal como, um mamífero, incluindo humanos, que precisam do tratamento por várias razões, incluindo fibrose cística, bronquite crônica, asma, bronquiectase, retenção de muco pós-operatório, pneumonia, discinesia ciliar primária (M. J. Stutts, III e outros, Patente U.S. número 5.635.160; Publicação Internacional PCT W096/40059) e a prevenção e tratamento de pneumonia em pacientes imobilizados (K.M. Jacobus e H.J. Leighton, Patente U.S. número 5.763.447). Usos terapêuticos adicionais incluem tratamento de fibrose cística, bronquite crônica, asma, bronquiectase, atelectasia pós operatória e síndrome de Kartagener (PCT Publicação Internacional WO 96/40059) sinusite (Publicação Internacional PCT WO98/03177), otite media (Publicação Internacional PCT W097/29756) , olhos secos, descolamento da "rétifta*," óbstrhçáo do duto nasolacrimal, tratamento de infertilidade em mulheres e irritação devido a secura vaginal através de secreções de muco aumentadas e hidratação da superfície epitelial além de melhorar o desempenho dos atletas. U2P4 possui utilidade como produto veterinário em mamíferos, tais como, porém não limitado a cães, gatos e cavalos . A metodologia da técnica anterior descreve apenas um protocolo para produção de tetrafosfato de diuridina. Este processo consome muito tempo, durando cinco dias e produzindo apenas pequenas quantidades de tetrafosfato de diuridina (C. Vallejo e outros, Biochimica et Biphysica Acta 438, 305 (1976), Sillero e outros, Eur J. Biochem 76, 332 (1972)). De acordo com esta técnica, o tetrafosfato de diuridina foi sintetizado através da reação de uridina 5'-monofosfomorfolidato (0,54 mmol) com sal de trietilamina de ácido pirofosfórico (0,35 mmol) em meio de piridina anidra (10 ml). Após 5 dias a 30°C, piridina foi removida da mistura de reação por evaporação e o resíduo resuspenso em água destilada em copo (8 ml) , a suspensão aplicada à coluna de DEAE-celulose (37,5 x 2,6 cm) e fracionada com 3,2 L de gradiente linear (0,06-0,25 M) de bicarbonato de amônio, pH 8,6. 0 pico de eluição entre 0,17-0,19 M de bicarbonato de amônio foi caracterizado parcialmente como U2P4 pelos critérios que se seguem: insensibilidade a fosfatase alcalina, razão de fósforo para base e análise dos produtos de hidró-lise (UTP + UMP), após tratamento com fosfodiesterase I, por eletroforese de tampão de citrato, pH 5,0. Nenhum rendimento ou dado espectroscópico foi fornecido. Assim, o procedimento da técnica anterior para síntese de tetrafosfato de diuridi-na é longo e produziu apenas pequenas quantidades de tetrafosfato de diuridina apenas parcialmente caracterizada. A presente invenção focaliza processos para produzir este composto usado na medicina, que podem ser mais eficaz e convenientemente realizados e que podem ser aplicados em produção em larga escala de tetrafosfato de diuridina e sais do mesmo.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção provê novos processos para síntese de dinucleotídeo terapêutico, P1, P4-tetrafosfato de Dl(uridina-5') (Fórmula I) e demonstra aplicabilidade à produção em grandes quantidades. Os processos da presente invenção reduzem substancialmente o tempo necessário para sintetizar tetrafosfato de diuridina, preferivelmente para três dias ou menos. Os novos sais de amônio e sódio de ΡΧ,Ρ4-tetrafosfato de Dl(uridina-5') preparados por estes processos são estáveis, solúveis, não tóxicos e fáceis de manusear durante fabricação 0 sal de tetramônio é preferido; o sal de tetrassódio é mais preferido.
Fórmula I onde: X é Na, NH4 ou H, contanto que todos os grupos X não sejam H. 0 processo de sintetização de compostos da Fórmula I e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, é realizado geralmente pelas etapas que se seguem: 1) dissolução de uridina ou compostos de nucleotídeo de uridina das Fórmulas Ila-d em um solvente orgânico aprótico, polar e uma amina hidrófoba; 2) fosforilação com um agente de fosforilação das Fórmulas IVa-b e/ou ativação com um agente de ativação das Fórmulas Illa-c; e 3) purificação por cromatografia de troca de £on.
Outro aspecto da presente invenção são os processos para tratamento de vários estados de doença, incluindo, porém não limitado a: doenças pulmonares obstrutivas crônicas, sinusite, otite media, obstrução do duto nasolacrimal, doença de olhos secos, descolamento da retina, pneumonia e infertilidade em mulheres ou irritação causada por secura vaginal.
Outro aspecto da presente invenção é uma composição farmacêutica compreendendo um composto da Fórmula I, juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável.
DESCRICÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção provê novos processos para síntese de dinucleotídeo terapêutico, P1, P4-tetrafosfato de Dl(uridina-5') e demonstra aplicabilidade em produção em larga escala. Os processos da presente invenção reduzem, substancialmente, o período de tempo necessário para sintetizar P1,P4-tetrafosfato de Dl(uridina-5'), preferivelmente para três dias ou menos. Os sais de amônio e sódio de ΡΧ,Ρ4-tetrafosfato de Dl(uridina-5') (Fórmula I) preparados por estes processos são estáveis, solúveis, não tóxicos e fáceis de manusear durante a fabricação. A presente invenção provê, adicionalmente, os compostos da Fórmula I: Fórmula I onde: X é Na, NH4 ou H, contanto que, todos os grupos X não sejam H.
Os sais de sódio e amônio de P1,P4-di(5'-tetrafosfato de uridina) possuem muitas vantagens. Os sais de sódio e amônio fornecem perfis de estabilidade a longo prazo, em comparação aqueles cátions divalentes (por exemplo, Ca2+, Mg2+, Mn2+) que catalisam hidrólise de ésteres de fosfato. 0 sal de tetrassódio de P1, P4-tetrafosf ato de Dl (uridina-5') não irrita os pulmões ou olhos. Outros cátions podem irritar os pulmões e olhos e outros epitélios de mucosa ou de outra forma, não são bem tolerados pelo corpo humano. Estes sais de sódio e amônio inorgânicos fornecem excelente solubilidade em água, comparados aos sais de amina hidrófobos, tais como, tri- e tetrabutilamônio e sais similares. Solubilidade em água superior é uma vantagem importante para flexibilidade nas formulações farmacêuticas de concentração variada. Os sais de tetramônio e tetrassódio de P1,P4-tetrafosfato de Dl(uridina-5') são também vantajosos, pelo que eles são prontamente purificados por cromatografia de íon aquoso, onde nenhum solvente orgânico é utilizado. Além disto, estes sais são prontamente manuseados como sólidos brancos, fofos, em comparação a um óleo ou goma como com alguns sais de amina. 0 sal de tetrassódio é preferido.
Os compostos da Fórmula I podem ser usados para facilitar a limpeza das secreções de mucosa dos pulmões de um indivíduo, tal como um mamífero, incluindo humanos, que precise do tratamento por várias razões, incluindo fibrose cística, bronquite crônica, asma, bronquiectase, retenção de muco pós-operatório, pneumonia, discinesia ciliar primária (M.J. Stutts, III e outros, Patente U.á. hüme'rò*;€>53 Publicação Internacional PCT W096/40059) e a prevenção e tratamento de pneumonia em pacientes imobilizados (K.M. Ja-cobus e H.J. Leighton, Patente U.S. número 5.763.447). Usos terapêuticos adicionais incluem tratamento de sinusite (Publicação Internacional PCT W098/03177), otite media (Publicação Internacional PCT W097/29756), olhos secos, descolamento da retina, obstrução do duto nasolacrimal, tratamento de infertilidade em mulheres e irritação devido a secura va-ginal através de secreções de muco aumentadas e hidratação da superfície epitelial além de melhorar o desempenho dos atletas.
Os compostos da fórmula I podem ser administrados oral, tópica, parenterallmente, por inalação ou aspersão, intra-operativamente, retal ou vaginalmente em formulações de dosagem unitária contendo veículos não tóxicos, convencionais, aceitáveis farmaceuticamente, coadjuvantes e veículos. 0 termo topicamente, conforme usado aqui, inclui, emplastros, géis, cremes, ungüentos, supositórios, pessários ou gotas para o nariz, ouvido ou olhos. 0 termo parenteral, conforme usado aqui, inclui injeções subcutâneas, intraveno-sas, intramusculares, injeção intraesterna ou técnicas de infusão. Além disto, é provida uma formulação farmacêutica compreendendo um composto da Fórmula geral I e um veículo farmaceuticamente aceitável. Um ou mais compostos da fórmula geral I podem estar presentes em associação a um ou mais veículos não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis ou diluen-tes ou coadjuvantes e, caso desejado, outros ingredientes ativos. Um tal veículo seria açúcar, onde ofe *€ompdebôs *jJ€?d*efn ser intimamente incorporados na matriz, através de vitrifi-cação ou simplesmente misturados ao veículo (por exemplo, lactose, sacarose, trehalose, manitol) ou outros excipientes aceitáveis para alívio do pulmão e vias respiratórias.
Um ou mais compostos da Fórmula geral I podem ser administrados separadamente ou em conjunto com mucolíticos, tais como, DNAse (Pulmozyme®) ou acetilcisteína, antibióticos, incluindo porém não limitados a Tobramycin® inalada; anti-inflamatórios não esteroidais, antiviróticos, vacinas, descongestionantes e corticosteróides.
As composições farmacêuticas contendo os compostos da Fórmula geral I podem estar na forma apropriada para uso oral, por exemplo, como comprimidos, cápsulas, pastilhas, suspensões aquosas ou oleosas, pós dispersáveis ou grânulos, emulsões, cápsulas rígidas ou macias ou xaropes ou elixires. As composições destinadas ao uso oral podem ser preparadas de acordo com qualquer processo conhecido na técnica para fabricação de composições farmacêuticas e tais composições podem conter um ou mais agentes selecionados do grupo consistindo de agentes adoçantes, agentes aromatizantes, agentes corantes e agentes preservantes, a fim de prover preparações farmaceuticamente corretas e de bom paladar. Os comprimidos contém o ingrediente ativo em mistura com excipientes não tóxicos, farmaceuticamente aceitáveis, que são apropriados para fabricação de comprimidos. Estes excipientes podem ser, por exemplo, diluentes inertes, tais como, carbonato de cálcio, carbonato de sódio, lactose, fosfato de cál- cio ou fosfato de sódio; agentes de granulação''e'cleâinlfé^ifa-ção, por exemplo, amido de milho ou ácido algínico; agentes ligantes, por exemplo, amido, gelatina ou acácia e agentes lubrificantes, por exemplo, estearato de magnésio, ácido es-teárico ou talco. Os comprimidos podem ser não revestidos ou revestidos por técnicas conhecidas para retardar a desintegração e absorção no trato gastrointestinal e, pelo que, fornecer uma ação prolongada em um período mais longo. Por exemplo, um material de retardo de tempo, tal como, monoes-tearato de glicerila ou diestearato de glicerila pode ser empregado.
Formulações para uso oral podem também ser apresentadas como cápsulas de gelatina dura, onde o ingrediente ativo é misturado com um diluente sólido inerte, por exemplo, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio ou caulim, ou como cápsulas de gelatina macia, onde o ingrediente ativo é misturado com água ou um meio oleoso, por exemplo, óleo de amendoim, parafina líquida ou óleo de oliva.
Suspensões aquosas contém os materiais ativos em mistura com excipientes apropriados para fabricação de suspensões aquosas. Tais excipientes são agentes de suspensão, por exemplo: carbóximetilcelulose de sódio, metilcelulose e alginato de sódio. Agentes de dispersão ou umectação podem ser produtos de fosfatídio ou condensação que ocorrem naturalmente de óxido de alileno com ácidos graxos ou produtos de condensação de óxido de etileno com álcoois alifáticos de cadeia longa ou produtos de condensação de óxido de etileno com ésteres parciais de ácidos graxos e um hexitol ou produ- tos de condensação de oxido de etileno éom; ésterés derivados de ácidos graxos e anidridos de hexitol. Os versados na técnica reconhecerão os muitos excipientes e agentes de umectação específicos englobados pela descrição geral acima. As suspensões aquosas podem também conter um ou mais preservantes, por exemplo, etila ou n-propil p-hidróxibenzoato, ou um ou mais agentes corantes, um ou mais agentes aromatizantes e um ou mais agentes adoçantes, tais como, sacarose ou sacarina. Pós dispersantes e grânulos apropriados para preparação de uma suspensão aquosa por adição de água fornecem os ingredientes ativos em mistura com um agente de dispersão ou umectação, agente de suspensão e um ou mais preservantes. Agentes de dispersão ou umectantes apropriados e agentes de suspensão são exemplificados pelos já mencionados acima. Excipientes adicionais, por exemplo, agentes adoçantes, aromatizantes e corantes podem também estar presentes.
Compostos da Fórmula I podem ser administrados pa-renteralmente em um meio estéril. 0 medicamento, dependendo do veículo e concentração utilizados, pode ser suspenso ou dissolvido no veículo. Vantajosamente, coadjuvantes tais como, anestésicos locais, preservantes e agentes de tampona-mento podem ser dissolvidos no veículo. A preparação injetável, estéril pode se uma solução injetável estéril ou suspensão em um diluente não tóxico, parenteralmente aceitável ou solvente. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregados encontram-se água estéril, solução de salmoura ou solução de Ringer. Os compostos da Fórmula geral I podem também ser administrados na formá dèVsúpòêíttãxtfos para administração do medicamento por via retal, vaginal ou no ouvido. Estas composições podem ser preparadas por mistura do medicamento com um excipiente não irritante apropriado que é sólido em temperaturas comuns, porém líquido em temperatura do corpo e portanto, fundirá para liberar o medicamento. Tais materiais são manteiga de cacau e polietileno glicóis.
Soluções dos compostos da Fórmula I podem ser administradas por instalação intra-operativa em qualquer local do corpo. Níveis de dosagem simples da ordem de cerca de 1 a cerca de 400 mg, preferivelmente na faixa de 10 a 300 mg e, mais preferivelmente, na faixa de 25 a 250 mg são úteis no tratamento das condições respiratórias indicadas acima. Níveis de dosagem simples da ordem de cerca de 0,0005 a cerca de 5 mg, preferivelmente na faixa de 0,001 a 3 mg e, mais preferivelmente, na faixa de 0,025 a 1 mg são úteis no tratamento das condições oftálmicas indicadas acima. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com os materiais de veículo para produzir uma forma de dosagem simples variarão, dependendo do hospedeiro tratado e do modo específico de administração. Será entendido, contudo, que o nível de dose específico para qualquer paciente em particular, dependerá de vários fatores incluindo a atividade do composto específico empregado, idade, peso corpóreo, saúde geral, sexo, dieta, tempo de administração, via de adminis- tração e razão de excreção, combinação do medicamento e gravidade da doença específica em terapia.
Os processos sintéticos descritos a seguir englobam várias estratégias sintéticas para produção de P1,?4-tetrafosfato de Dl(uridina-5'). Geralmente, todos os processos utilizam uridina ou compostos nucleotídeos de uridina a partir de materiais da Fórmula Ila-d como materiais de partida, que são dissolvidos em um solvente polar, orgânico aprótico (por exemplo, dimetilformamida, dimetilssulfóxido, dioxano, N-metilpirrolidona, trimetilfosfato) e uma amina hidrofóbica (por exemplo, trietilamina, tributilamina, tri-octilamina, 2,4,6-colidina, tetrabutilamônio, tri- e tetra-alquil aminas, aminas heterocíclicas). 0 produto é obtido por fosforilação com um agente de fosforilação a partir da Fórmula IV (por exemplo, oxicloreto fosforoso, pirofosfato, pirofosforilcloreto) ou ativando um grupo fosfato com um agente de ativação a partir da Fórmula III (por exemplo, carbonildiimidazol uma alquil ou aril carbodiimida, um al-quil ou aril fosfocloridrato), respectivamente, com vários meios de purificação subseqüentes bem conhecidos dos versados na técnica, incluindo, porém não limitado a, cromatogra-fia de íon (por exemplo, DEAE Sephadex, DEAE celulose, Dowex 50, resinas de troca de ânion e cátion).
Os materiais de partida de pirimidina β-D-ribofuranosila, uridina, 5'-monofosfato de uridina (UMP, 5'-difosfato de uridina (UDP) e 5'-trifosfato de uridina (UTP) são mostrados como ácidos livres nas fórmulas Ila-d que se seguem, respectivamente. Estes materiais sâo-tbflds '.óoTíetíct.*-almente disponíveis em larga escala em várias formas de sal. Fórmula lia: Uridina Fórmula Ilb: UMP e seus sais;
Fórmula IIc: UDP e seus sais;
Fórmula Ild: UTP e seus sais.
Os agentes de ativação carbodiimida, carbonila ativada e compostos fosforosos ativados são mostrados nas Fórmulas gerais Illa-c a seguir, respectivamente. Fórmula Illa: Carbodiimida onde Ri e R2 são alquila ou cicloalquila Ci-C8/ alquila Ci-C8 opcionalmente substituída ou cicloalquila (por exemplo, grupos hidróxi e amino); arila ou arila opcionalmente substituída (por exemplo, grupos hidróxi e amino). Compostos preferidos da Fórmula Illa são dicicloexilcarbodiimida e cloreto de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida. Fórmula Illb: Carbonila Ativada onde X é imidazol, tetrazol e/ou halogênio. Compostos preferidos da Fórmula Illb são carbonildiimidazol e carbonildi-triazol. Fórmula IIIc: Fósforo Ativado onde Ri e R2 são alquila ou cicloalquila Ci-Cg, alquila C8 opcionalmente substituída ou cicloalquila (por exemplo, grupos hidróxi e amino); arila, arilóxi, alcóxi ou arila opcionalmente substituída, arilóxi ou alcóxi (por exemplo, grupos hidróxi e amino) e/ou halogênio; e X é halogênio. Compostos preferidos da Fórmula IIIc são difenilfosforocloridrato, fe-nil fosforodicloridrato, dicloreto fenilfosfônico e cloreto difenilfosfínico.
Os agentes mono- e difosforilantes são mostrados a seguir/ nas fórmulas gerais IVa-b. Fórmula IVa: Agentes Monofosforilantes onde X é halogênio. 0 composto preferido da Fórmula IVa é oxicloreto de fósforo. Fórmula IVb: Aaentes Difosforilantes onde X é oxigênio, hidróxi ou halogênio e sais dos mesmos. Compostos preferidos da Fórmula IVb são cloreto pirofosfori-la e pirofosfato.
Os versados na técnica reconhecerão que a presente invenção não está limitada aos exemplos que se seguem e que as etapas nos exemplos que se seguem podem variar. EXEMPLO 1 Processo para Produção de Tetrafosfato de Diuridina, Sal Te-trassódio usando S^Difosfato de Uridina Sal dissódio de 5'-difosfato de uridina (Yama-sa,Choshi, Japão; 600 gramas) foi dissolvido em água desio-nizada (5,4 L) . A solução foi passada através de coluna Dowex 50Wx4H+ (Dow Chemical). As frações contendo 5'-difosfato de uridina foram agrupadas e neutralizadas com tributilamina (Aldrich, St. Louis; 300 ml) . As frações neutralizadas foram concentradas em um óleo por utilização de um evaporador giratório em uma temperatura de banho de 55-60°C. 0 óleo foi dissolvido em dimetilformamida seca (Aldrich, 3L) e então seco por concentração em um óleo usando um evaporador giratório (55-60°C, temperatura do banho). Esta etapa foi repetida duas vezes. 0 óleo foi novamente dissolvido em dimetilformamida (3 L) e 1,1-carbonildiimidazol (Aldrich; 100 g) foi adicionado. A solução foi aquecida a 50°C por 2 horas e meia. Uma quantidade adicional de agente de ativação (33 gramas) foi adicionada e o aquecimento continuou por duas horas e meia. A solução foi novamente concentrada em um óleo em um evaporador giratório (temperatura do banho a 55-60°C). 0 óleo resultante foi dissolvido em água desionizada para uma condutividade igual aquela de 0,2 M NH4HC03. A solução foi então carregada em uma coluna de Sephadex DEAE-A25 (Pharmacia, Upsala, Suécia; pré-intumescimento em 1,0 M NaHC03 e lavada com 2 volumes de coluna de H20 desionizada) . A coluna foi eluída com as soluções que se seguem na seguinte ordem: 60 L de 0,25 M. NH4HC03 120 L de 0,275 M NH4C03, 40 L de 030 M NH4HC03 e 40 L de 0,35 M NH4HC03. As frações possuindo quantidades suficientes de tetrafosfato de diuridina pura foram agrupadas, conforme determinado por análise HPLC e concentradas em um eva-porador giratório (temperatura de banho a 55-60°C). O resíduo resultante foi dissolvido em água desionizada (1,5 L) e concentrado em um evaporador giratório. Esta etapa foi repetida 15 vezes ou até excesso de tampão de bicarbonato ser removido. O óleo resultante foi dissolvido em uma quantidade suficiente de água desionizada para formar uma solução de cerca de 10%, a solução carregada em uma coluna Dowex 50Wx4 Na+ (Down) e eluída com água desionizada. As frações contendo U2P4 foram agrupadas e concentradas para uma solução de cerca de 10-15%, que foi liofilizada para render sal tetras-sódio U2P4 como um sólido branco (150 g aproximadamente 25% de rendimento, com base em 5'-difosfato de uridina).
Elucidação de Estrutura de P1,P4-di (5*-tetrafosfato de uridina). Sal Tetrassódio Devido a falta de dados espectroscópicos adequados de dinucleotídeos não adenilados na literatura, uma elucidação de estrutura plena de P1, P4-tetrafosfato de Dl(uridina-5'), sal tetrassódio foi realizada empregando-se técnicas analíticas modernas. O peso molar foi determinado por espec-troscopia de massa como sendo 878 [m/z 855, (M-Na+)'], confirmando a fórmula molecular C18H22N4023P4.4Na. A massa exata medida para C18H22N4023P4.3Na [ (M-Na+)': calculada 854.9318] foi de 854.9268. A massa medida era diferente da massa teórica em 5,0 unidades de milimassa (5,9 ppm) para um nível de confiança de 99,7%. Análise de umidade Karl Fisher forneceu um valor de 1,73% H20 e confirmação adicional da fórmula molecular foi obtida por análise elementar: calculado para Na = 10,70, encontrado 10,81%; razão C:P calculada 1,74, encontrado 1,80, com base na fórmula molecular C18H22N4O23P4.4,2Na. 1H20 (FW = 902,4 g/mol) . O espectro infravermelho mostrou um sinal amplo em 3422 cm'1 e um sinal em 1702 cm'1, indicando a presença de grupos funcionais hidro-xila (0-H estiramento) e carbonila (C=0 estiramento). Além disto, um estiramento P=0 de fosfato foi observado em 1265 cm'1. 0 espectro infravermelho em água mostrou um Xmax de 262 nm com uma absorção molar (ε) de 17.004. A rotação específica a 25°C (c = 1, H20) foi determinada por polarimetria como sendo de -9,56°.
Os espectros NMR são: ^ NMR (D20, TMS) δ 4,11 (m, 2H), 4,14 (m,lH), 4,25 (m, 1H), 4,27 (m, 1H), 5,84 (d, J=8,l Hz, 1H), 5,86 (d, J=5,4 Hz, 1H), 7,81 (d, J=8,l Hz); 13C NMR (D20, TMS) δ 65,1 (d, J=5,5 Hz), 69,7, 73,5, 83,4 (d, J=9,4 Hz) , 88,1, 102,8, 141,5, 152,9, 167,5; 31P NMR (D20, H3P04 padrão)ô -22,32 (m, -10,75 (m) . 0 espectro 1H acoplado a 31P mostrou um alargamento do múltiplo em δ -10,75 ppm, devido a introdução de acoplamento '''H. Este múltiplo foi portanto confirmado como Pa. Não houve efeito de acoplamento 1H no múltiplo em -22,23 ppm, determinando isto por falha como Pp. Um Efeito de Super Alojamento Nuclear [Nuclear Overhauser Effect] (NOE) foi observado para H6 a prótons de açúcar H2. e H3. Uma vez que não é possível para H5 mostrar um NOE para prótons de açúcar, H6 é confirmado. Adicionalmente, substi- tuição Nx é confirmada, porque nenhum NOE de pirimidina-açúcar é possível para uma estrutura substituída N3.
Experimentos NMR bidimensionais adicionais foram conduzidos para verificar a conectividade. HMQC mostra conectividade para H5 a Cs e H6 a C6, confirmando C5 e C6. Conectividade COSY e NOE foram observadas para Hs a H6, verificando Hs. A conectividade de três ligações HMBC foi observada para H6 a C1(, C6 a Hr, H3, a C2, H6 a C2. Estes dados assim confirmam substituição C2 e Nx. Conectividade COSY de Hr a H2, confirma H2, e conectividade HMQC de a C·^ e H2, a C2, confirma Cr a C2,. Adicionalmente, HMBC mostra conectividade J de ligação dupla de H5 a C4, confirmando C4. Um espectro 13C DEPT com múltiplo =1,5 mostra o carbono em δ 65,1 invertido em relação a todos os outros carbonos. Esta observação confirma que C5, é um metileno. 0 acoplamento de 31P aos carbonos em δ 65,1 e 83,4 confirma C51 e C4,, porque C4, é o único metileno acoplado. Além disto, HMQC mostra conectividade para C5, a H5, e C4, a H4,, confirmando H4, e Hs,. Um NOE foi observado para H3, a H4,( H6 a H2,, e He a H3,, confirmando a configuração β do açúcar anômero.
Concluindo, P1, P4-tetrafosfato de Dl(uridina-5'), sal tetrassódio foi sintetizado em uma escala de 150 g em rendimento de 25% a partir de materiais de partida disponíveis comercialmente, com um tempo de reação total de 5 horas. 0 produto bruto foi purificado eficazmente por cromato-grafia de troca de íon e a estrutura do produto de reação foi provada sem ambigüidade usando espectroscopia de massa, NMR e outras técnicas analíticas. EXEMPLO 2 Processo para Produção de Tetrafosfato de Diuridina, Sal de Tetramônio usando 5'-Monofosfato de Uridina 5'-Monofosfato de uridina (Sigma, Milwaukee, 3,0 g, 9,26 mmol) foi dissolvido em DMF seco (lOml) e tributila-mina (Aldrich, 2 ml) . A solução foi evaporada in vácuo a 40°C em um óleo. 0 resíduo foi dissolvido em DMF seco (Aldrich, 8 ml) para formar uma solução. Carbonildiimidazol. (Aldrich, 1,65 g, 10,18 mmol) foi adicionado a esta solução. A reação foi aquecida a 50°C por uma hora. 5'-trifosfato de uridina (Yamasa, 5,60 g, 10,18 mmol) preparado como um sal tributilamônio anidro em DMF (5 ml) e tributilamina (2 ml) , conforme descrito no Exemplo 3 a seguir, foram adicionados à solução de reação. A mistura foi agitada a 50°C por três dias , quando a solução foi evaporada in vácuo para dar um óleo, redissolvida em água (5 ml) e purificada por cromato-grafia de coluna (300 x 50 mm) (Sephadex DEAE-A25, 40-120μ, Aldrich, pré-intumescida em 1,0 M NaHC03 e lavada com 2 volumes de coluna de água desionizada (Η20-»Ό,3 M NH4HC03 gradiente) . As frações puras foram concentradas in vácuo a 35°C e H20 adicionado e revigorado 5 vezes para obter sal de tetramônio tetrafosfato de diuridina como um sólido branco (2,37 g, 30% de rendimento) : 92,11% de pureza por HPLC com o mesmo tempo de retenção como padrão. Além disto, o sal de tetramônio foi analisado por FABMS para dar uma massa de [Ci8H25N4023P4 (M-H+)': calculado 788,9860] 788.9857, confir- mando uma fórmula de origem de Ci8H26N4023P4 para o ácido livre] .
EXEMPLO 3A
Processo para Produção de Sal de Tetrafosfato de Diuridina Tetramônio usando 5'-Trifosfato de Uridina ÍUTP) Uma solução de sal trissódio de 5'-trifosfato de uridina (UPT) (ProBioSint, Varese, Itália; 5,86 g,0,01 mol) em água (5 ml) foi passada através de uma coluna de resina trocadora de cátion forte (Aldrich) de BioRad AG-MP 50 em sua forma de tributilamina (50 ml de volume de leito) e elu-ída com água destilada (cerca de 300 ml) . À esta solução foi adicionada tributilamina (Aldrich; 5 ml) e a suspensão agitada até o pH da fração aquosa elevar-se para 8. O resíduo foi dissolvido em dimetilformamida seca (Aldrich; 20 ml) e o solvente evaporado a 0,1 mmHg. O sal de tributilamina seco foi formado até 100 ml com acetona anidra, para render uma solução de estoque (0,1 M em UTP). Dicicloexilcarbodiimida (DCC) (Baker, Phillipsburg; 0,227 g, 1,2 mmol) foi adicionado à uma alíquota da solução de UTP precedente (10 ml, 1,0 mmol) e a solução agitada em temperatura ambiente por 30 minutos. A mistura foi adicionada ao sal de trietilamina de 5'-monofosfato de uridina (2,0 mmol, preparado por adição de trietilamina (0,5 ml) à uma solução de 5'-monofosfato de uridina (UMP) (Sigma; 0,648 g em DMF) e evaporando à secura) . A suspensão foi então evaporada à secura, o resíduo formado até 5,0 ml em DMF seco, e colocada a parte a 40° por 24 horas. A mistura de reação foi separada por cromatografia de troca de íon semi-preparatória (coluna Hamilton PRP X-100), eluindo com um gradiente de 0-1,0 M de bicarbonato de amônio, 5 mL/min, 30 minutos. Tetrafosfato de dinucleotídeo eluiu entre 21 e 23 minutos; o produto (76,7% rendimento com base em UTP) foi quantificado por comparação de sua absorção ultravioleta em 2 63 nm com aquele de uma solução padrão de P1, P4-di(5'-tetrafosfato de uridina).
EXEMPLO 3B
Processo para Produção de Sal de Tetrafosfato de Diuridina tetramonio utilizando 5'-trifosfato de Uridina (UTP) e um Excesso de Agente de Ativação Conversão de UTP em P1, P4-di (5' -tetrafosfato de uridina) pode ser melhorada por ativação do sal de tributi-lamina (0,1 mmol) com um grande excesso de DCC (0,1 g, 5 mmol); neste caso, a dicicloexiluréia depositada foi removida por filtração, a mistura de reação extraída com éter (lOml) e o resíduo dissolvido em DMF seco antes do tratamento com UP tributilamina (0,2 mmol). Mediante separação cro-matográfica da mistura de reação e quantificação por absorção ultravioleta como no Exemplo 3A acima, o produto de tetrafosfato de uridina constituiu 50,7% das espécies de uridi-lato na mistura, correspondendo a uma conversão de UTP de 95,9%.
EXEMPLO 4A
Processo para Produção de Sal de Tetrafosfato de Diuridina tetramonio usando 5'-Monofosfato de Uridina Ativado com Car- bonildiimidazol 5'-Monofosfato de uridina (UMP) (0,324 g, 1,0 mmol) foi dissolvido em uma mistura de DMF seco (5 ml) e tributilamina (237 μυ, 1 mmol), a solução foi evaporada a secura, então duas vezes mais com DMF para render o sal de tributilamina anidro. O resíduo foi dissolvido em DMF (5 ml) e carbonildimidazol (CDI) (0,81 g, 5 mmol) foi adicionado. A solução foi então colocada a parte por 3 horas, então foi adicionado metanol 324 μΐ^ 8 mml para destruir o excesso de CDI. A solução foi colocada de lado por uma hora. Pirofosfa-to de tributilamina (Sigma, 0,228 g, 0,5 mmol) foi adicionado e a suspensão agitada sob nitrogênio em temperatura ambiente. Após 3 horas, a reação foi saturada com água e a mistura submetida a HPLC como no Exemplo 3A acima. Rendimento de P1,P4-di (5'-tetrafosfato de uridina), conforme quantificado por sua absorvência a 263 nm foi de 9,3%.
EXEMPLO 4B
Processo para Produção de Sal de Tetrafosfato de Diuridina tetramônio usando 5'-Monofosfato de Uridina Ativado em Dife- nil Fosfocloridrato 0 sal de tributilamina anidro de UMP (1,0 mmol), preparado essencialmente como acima, foi dissolvido em uma mistura de dioxano seco (5 ml) e DMF (1 ml). Fosfocloridrato de difenila (0,3 ml) e tributilamina (0,3 ml) foram adicionados e a solução colocada a parte em temperatura ambiente por 3 horas. O solvente foi evaporado e o resíduo agitado com éter (-10 ml) então colocado de lado a 4°C por 30 minutos . 0 éter foi decantado e o resíduo foi dissolvido em uma solução de pirofosfato de tributilamina (0,228 g, 0,5 mmol) em DMF (3 ml) . A solução foi armazenada sob nitrogênio em temperatura ambiente. Após três horas a reação foi saturada com água e a mistura submetida a HPLC como no Exemplo 3A acima. O rendimento de P1,P4-di (5'-tetrafosfato de uridina), quando quantificado por sua absorvência em 263 nm foi de 9,6%. EXEMPLO 5 Processo para Produção de Sal de Tetrafosfato de Diuridina tetramônio usando Uridina. Oxicloreto Fosforoso e Pirofosfato Uridina (Aldrich, 0,244 g, 1 mmol) foi dissolvida em fosfato de trimetila (Aldrich, 5 ml) e tributilamina (466 μΐ, 2 mmol) foi adicionada. A solução foi agitada a 0o durante a adição de oxicloreto fosforoso (0,153 g, (93,2 μΐ), 1 mmol), e a suspensão resultante agitada a 0°C por 3 horas. Pirofosfato de tributilamina (0,228 g) foi adicionado e a suspensão agitada em temperatura ambiente por 3 horas. A reação foi aturada com 1,0 M de bicarbonato de trietilamina aquosa e a mistura extraída com cloreto de metileno para remover fosfato de trimetila. A solução aquosa foi submetida a HPLC como no Exemplo 3A acima. A conversão de uridina em P1, P4-di (5'-tetrafosfato de uridina) conforme quantificada por absorvência da última em 263 nm foi de 6,83%. EXEMPLO 6 Processo para Produção de Tetrafosfato de Diuridina usando 5'-Monofosfato de Uridina e Cloreto de Pirofosforila 5'-Monofosfato de uridina (UMP) (64,8 mg, 0,2 mmol) foi dissolvido em piridina seca (1 ml) e agitado em gelo durante a adição de cloreto de pirofosforila (13,9 μΐ (25 mg), 0,1 mmol). A solução ficou enevoada quase que imediatamente, sendo formado então um precipitado branco semi-cristalino copioso, o qual tornou-se uma massa pegajosa dentro de 1-2 minutos. A mistura foi armazenada em temperatura ambiente por toda a noite, saturada com água e submetida a HPLC como no Exemplo 3A acima. Rendimento de P1,P4-di(5'- tetrafosfato de uridina) conforme quantificado por sua absorvente em 263 nm foi de 15,8%. Uma quantidade substancial de P1, P4-di(5'-tetrafosfato de uridina) (25,4%) foi obtida como o principal subproduto. EXEMPLO 7 Estabilidade Aquosa e Solubilidade de P1, P4-di (5'-tetrafosfato de uridina), Sal Tetrassódio A solubilidade de P1, P4-di (5'-tetrafosfato de uridina) , sal de tetrassódio em água foi determinada por adição de porções de sólido a um volume conhecido de água desioni-zada, até a solução tornar-se turva. A solubilidade máxima em água foi assim determinada como sendo de cerca de 900 mg/ml. Estudos de estabilidade das soluções sólidas ou aquo-sas incubadas em temperatura baixa (5°C) e elevada (40°C) mostrou que ocorre menos que 1,5% de degradação em um período de três meses, conforme determinado por análise HPLC. 0 sal de tetrassódio de P1,P4-di (5'-tetrafosfato de uridina) foi assim determinado como possuindo excelente perfil de solubilidade e estabilidade apropriado para aplicações farmacêuticas. EXEMPLO 8 Toxicidade de P1,P4-di(5'-tetrafosfato de uridina) Sal de Tetrassódio em Animais O perfil toxicológico, não clínico de P1,P4-di(5'-tetrafosfato de uridina), sal de tetrassódio foi avaliado em uma batería de ensaios de toxicologia que incluem o ensaio de mutação inversa bacteriana, o teste citogenético de mamíferos in vitro, o teste de mutação de gene de célula de ma- mífero in vitro e o ensaio citogenético de micronúcleo em camundongos. Um estudo em coelhos examinou a tolerância ocular local e toxicidade ocular subcrônica após administrações múltiplas diárias por um período de seis semanas. Além disto, P1, P4-di(5'-tetrafosfato de uridina), sal tetrassódio também foi testado em dois estudos de toxicidade aguda por inalação de dose simples em ratos e cães, e um estudo de toxicidade intravenosa aguda de dose simples em cães.
Os resultados destes estudos mostram que PX,P4-di (5'-tetrafosfato de uridina), sal de tetrassódio é não ge-notóxico em uma bateria de ensaios genéticos de toxicidade. Nenhum achado adverso foi visto nos estudos de toxicologia ocular. Um grau baixo de toxicidade foi visto em estudos de inalação de dose simples (ratos, cães) e intravenosa (cães). P1, P4-Di(5'-tetrafosfato de uridina), sal de tetrassódio foi, portanto, determinado como tendo um excelente perfil toxicológico com uma margem de segurança ampla para dosagem em humanos. EXEMPLO 9 Segurança e Eficácia de P1,P4-di(5'-tetrafosfato de uridina) , Sal de Tetrassódio em Voluntários Humanos Normais P1,P4-di (5'-tetrafosfato de uridina), sal de tetrassódio foi avaliado em um estudo de segurança e tolerabi-lidade de dose progressiva, controlada com placebo, de cegueira dupla, em 75 voluntários homens saudáveis e normais. Quarenta não fumantes e 35 fumantes foram avaliados em 5 grupos de dosagem de 16 voluntários, compreendido de 12 recebendo uma dose aerossol simples de P1,P4-di (5'- tetrafosfato de uridina), sal de tetrassódio (20-400 mg) e 4 recebendo placebo (salmoura normal). Nenhum efeito adverso sério foi reportado. Não houve alteração significante nos resultados de FEVx, FVC, MMEF, laboratório clínico, 12-ECG chumbo, ou análise de urina tanto nos grupos de medicamento ativo ou placebo. Nos fumantes, P1, P4-di (5' -tetrafosfato de uridina), sal de tetrassódio produziu um aumento dependente de dose de 2 vezes a 7 vezes no peso do catarro expectorado, dentro de 5 minutos da dosagem e o estímulo a expectoração de catarro foi prolongado pela próxima hora de coleta de catarro. 0 efeito de P1,P4-di(5'-tetrafosfato de uridina), sal de tetrassódio para induzir a expectoração do catarro em não fumantes, foi também observada. Na conclusão, P1,P4-di(5' -tetrafosfato de uridina), sal de tetrassódio é seguro e bem tolerado em indivíduos machos normais e é eficaz no estímulo da expectoração do catarro, quando comparado ao placebo.

Claims (8)

1. Processo para síntese de um composto da Fórmula I, e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo, o dito processo CARACTERIZADO pelo fato de compreender: a) dissolução de uridina ou de um composto de nucleotídeo de uridina das Fórmulas Ila-d em um solvente orgânico aprótico, polar selecionado do grupo consistindo em dimetilformamida, dimetilsulfóxido, dioxano, e trimetilfosfato e uma amina hidrofóbica selecionada do grupo consistindo em trietilamina, tributilamina, trioctilamina, e tetrabutilamônio; b) fosforilação com um agente de fosforilação selecionado do grupo consistindo em oxicloreto fosforoso, cloreto de pirofosforila e pirofosfato para render um composto da Fórmula I, ou ativação de um grupo fosfato do dito composto de nucleotídeo de uridina com um agente de ativação selecionado do grupo consistindo em diciclohexilcarbodiimida, cloreto de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida, carbonildiimidazol, carbonilditriazol, difenil fosfocloridrato, fenil fosfocloridrato, dicloreto fenilfosfônico e cloreto difenilfosfínico, e reação com um composto apropriado da fórmula Ilb-d para render um composto da Fórmula I; e c) purificação por cromatografia de troca de íon do dito composto da Fórmula I e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo; Fórmula I onde : X é selecionado do grupo consistindo em: Na, NH4 e H, contanto que todos os grupos X não sejam H; Fórmula lia: Uridina Fórmula Ilb: UMP e seus sais; Fórmula IIc: UDP e seus sais; Fórmula Ild: UTP e seus sais.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de compreender a dissolução do composto da Fórmula IIc, conforme descrito na reivindicação 1, no solvente orgânico aprótico, polar e na amina hidrofóbica, tratando com o agente de ativação, e subsequente purificação por cromatografia.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de compreender a dissolução do composto da Fórmula Ilb, conforme descrito na reivindicação 1, no solvente orgânico aprótico, polar e na amina hidrofóbica, tratando com o agente de ativação, seguido por reação com um composto da Fórmula Ild, conforme descrito na reivindicação 1, e subsequente purificação por cromatografia.
4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de compreender a dissolução do composto da Fórmula Ild, conforme descrito na reivindicação 1, no solvente orgânico aprótico, polar e na amina hidrofóbica, tratando com uma quantidade equimolar do agente de ativação, seguido por reação com um composto da Fórmula Ilb, conforme descrito na reivindicação 1, e subsequente purificação por cromatografia.
5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de ser usado um excesso de agente de ativação.
6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de compreender a dissolução do composto da Fórmula Ilb, conforme descrito na reivindicação 1, no solvente orgânico aprótico, polar e na amina hidrofóbica, tratando o dito composto com um agente de ativação, seguido por reação com cloreto de pirofosforila e pirofosfato, e subsequente purificação por cromatografia.
7. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de compreender a dissolução do composto da Fórmula lia, conforme descrito na reivindicação 1, no solvente orgânico aprótico, polar e na amina hidrofóbica, tratando o dito composto com oxicloreto fosforoso, cloreto de pirofosforila ou pirofosfato, e subsequente purificação por cromatografia.
8. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de compreender a dissolução do composto da Fórmula Ilb, conforme descrito na reivindicação 1, no solvente orgânico aprótico, polar e na amina hidrofóbica, tratando com cloreto de pirofosforila ou pirofosfato, e subsequente purificação por cromatografia.
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