KR102504764B1 - 디뉴클레오사이드 폴리포스페이트 화합물의 제조방법 - Google Patents

디뉴클레오사이드 폴리포스페이트 화합물의 제조방법 Download PDF

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    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical

Abstract

본 발명은 고수율 및 고순도로 디뉴클레오사이드 폴리포스페이트, 이의 염 및 이의 수화물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 제조방법은 번거로운 공정 과정 없이 친환경적인 반응 조건이므로, 산업적으로 대량 생산에 유용하게 적용될 수 있다.

Description

디뉴클레오사이드 폴리포스페이트 화합물의 제조방법 {Method for Preparing a Dinucleoside Polyphosphate Compound}
본 발명은 디뉴클레오시드 폴리포스페이트 화합물의 제조 방법에 관한 것으로 뉴클레오사이드 인산 화합물을 할로겐화 금속 존재 하에서 디뉴클레오시드 폴리포스페이트 화합물과 그의 염 또는 그의 수화물의 제조 방법에 관한 것이다.
뉴클레오사이드(Nucleoside)는 핵 염기와 오탄당이 N-글리코사이드 결합을 이룬 배당체 화합물로, 인산화 효소에 의해 뉴클레오사이드에 인산기가 결합되면 DNA 사슬의 기본 구성 성분인 뉴클레오타이드(Nucleotide)가 된다.
이러한 뉴클레오타이드의 일종인 디뉴클레오사이드 폴리포스페이트 또는 이의 염은 생체 내 물질과 유사하여 체내에서 안정하고 그에 따른 질병 치료에 효과를 가진다고 알려져 있다.
특히, 하기 화학식 1a로 표시되는 P1, P4-디(우리딘 5'-)테트라포스페이트(이하, “UP4U”라 표기함) 또는 이의 염은 안구 건조증 또는 눈물 건조증에 수반되는 각결막 상피 장애의 치료제로 이용되고 있으며, 가래 배출 유도 작용을 가지기 때문에, 거담제 또는 폐렴 치료제로서 개발이 기대되는 화합물이다.
[화학식 1a]
Figure 112017059490122-pat00001
종래의 UP4U의 합성법으로는, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 11, (2001), 157-160에는 우리딘 5'-트리인산(이하, UTP라 표기함)의 탈수 축합반응에 의해 제조되는 우리딘 5'-환상 트리인산과 우리딘 5'-모노인산(이하, UMP라 표기함)을 반응시키는 종래의 제조방법에 대해 보고되어 있으며, 국제공개공보 제2008/012949호에는 그의 개량된 제조방법에 대해 보고되어 있다.
국제공개공보 제1999/05155호에는 우리딘, UMP, UDP 또는 UTP 및 이의 염과 우리딘 뉴클레오티드 화합물을 극성, 비양성자성 유기용매 및 소수성 아민에 용해시켜, 모노인산화제 또는 디인산화제를 인산화제로 사용하여 인산화 반응 시키고, 카보디이미드, 활성 카르보닐 또는 활성 인을 활성화제로 사용하여 UP4U를 제조하는 방법에 대해 보고되어 있다.
또한, 국제공개공보 제2014/103704호에는 우리딘 5'-디인산(UDP), UMP 또는 피로인산과, 치환기를 가져도 좋은 이미다졸, 벤즈이미다졸 또는 1,2,4-트리아졸로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물을 축합시킴으로써 합성되는 인산 활성 화합물과 UMP, UDP, UTP 및 피로인산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인산 화합물 또는 그의 염을 금속 이온의 존재 하에, 물 또는 친수성 유기용매 중에서 반응시켜 UP4U를 제조하는 방법에 대해 보고되어 있다.
그러나, 종래의 UP4U의 제조방법은 금속염 교환 공정 반응 등의 번거로운 공정 과정이 다수 필요하며, 그 결과 최종 화합물의 합성 효율 및 순도가 저하되는 문제점이 있다.
구체적으로, 국제공개공보 제1999/05155호 및 국제공개공보 제2008/012949호 등 종래의 UP4U의 제조방법은 반응 직전 인산 화합물의 금속염을 트리부틸아민 또는 트리에틸아민과 같은 아민염의 형태로 반응시켜야 한다. 그 결과, 일반적으로 우리딘 인산 화합물의 나트륨염과 같은 금속염을 이온교환수지 컬럼 크로마토그래피에 의해 유리산 형태의 인산 화합물로 변환한 후, 아민과 염 형성을 수행해하는 번거로운 공정 과정이 필요하다. 이와 같은 공정의 수행으로 인해 최종 화합물의 합성 효율 및 순도의 저하가 발생할 수 있다. 특히, 매우 불안정한 물질로 알려진 UTP을 이용한 상기 합성 반응의 경우, 순도가 쉽게 저하되고, 수분에 민감한 UTP 아민염과 같은 유기염은 높은 흡습성을 가지게 되어 보관과 품질 유지가 매우 까다로운 문제점이 있다.
또한, 국제공개공보 제2014/103704호의 기재된 제조방법은 45 내지 94 %의 고수율로 UP4U를 합성할 수 있으나, 상기 언급된 인산 화합물 유기염을 준비하는 염 교환 공정 반응 및 이에 따른 탈수 공정 과정이 필요로 하며, 유기용매 중 인산 활성 화합물을 합성한 후 감압 농축 공정으로 용매를 제거하고, 물의 존재 하에 pH를 조정하여 반응해야 하는 번거로움으로 인해 화합물의 순도를 저하시키는 문제점이 있다.
따라서 위와 같은 이유로, 번거로운 공정 과정 없이 친환경적인 반응조건 하에 고수율의 디뉴클레오사이드 폴리포스페이트 화합물을 고순도로 제조할 수 있고, 산업적으로 대량 생산에 적합한 디뉴클레오사이드 폴리포스페이트의 제조 방법이 요구되고 있다.
국제공개공보 제1999/05155호 국제공개공보 제2008/012949호 국제공개공보 제2014/103704호
Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2001, 11, 157-160 0rganic Letters, 2006, 8, 10, 2075-2077 Org. Biomol. Chem., 2011, 9, 730-738
본 발명의 목적은 대량 생산에 적합하고 효율적이며 환경에 무해한 디뉴클레오사이드 폴리포스페이트 제조방법, 이의 염 및 수화물을 고순도로 대량생산이 가능한 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 디뉴클레오사이드 폴리포스페이트, 이의 염 및 이의 수화물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, (S-1) 하기 화학식 2로 표시되는 뉴클레오사이드 인산 화합물, 이의 염 또는 이의 수화물; 카르보디이미드류 축합제; 및 금속 이온을 용매의 존재 하에 반응시키는 단계를 포함하는 하기 화학식 1로 표시되는 디뉴클레오사이드 폴리포스페이트, 이의 염 또는 이의 수화물의 제조방법을 제공한다.
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[화학식 1]
Figure 112018074518570-pat00002

[화학식 2]
Figure 112018074518570-pat00026
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상기 화학식 1 및 2에 있어서,
R1 및 R2는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 피리미딘 염기이고;
R3는 피리미딘 염기이고;
n은 2 내지 6의 정수이며;
m은 1 내지 3의 정수이다.
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본 발명에서 상기 피리미딘 염기는 시토신(cytosine), 우라실(uracil) 또는 티민(thymine)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 염기는 우라실이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 n은 4이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 뉴클레오사이드 폴리포스페이트는 하기 화학식 1a로 표시된다.
[화학식 1a]
Figure 112017059490122-pat00004
본 발명의 제조 방법에 따르면, 시중에서 구매가 가능한 상기 화학식 2, 이의 염 또는 이의 수화물을 별도의 전환 공정 없이 그대로 사용함으로써, 생산에 필요한 설비의 감소, 전환 공정에서 사용되는 시간, 노력, 비용의 단축이 가능하며, 이에 따른 불순물의 발생을 최소화할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 화학식 2로 표시되는 뉴클레오사이드 인산 화합물은 하기 화학식 2a 내지 화학식 2c 중 어느 하나로 표시된다.
[화학식 2a]
Figure 112017059490122-pat00005
[화학식 2b]
Figure 112017059490122-pat00006
[화학식 2c]
Figure 112017059490122-pat00007
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 뉴클레오사이드 인산 화합물의 염은 금속염 또는 아민염이다.
상기 뉴클레오사이드 인산 화합물의 금속염은 리튬, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘, 바륨, 세륨, 철, 니켈, 구리, 아연 및 붕소로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 리튬, 나트륨 또는 칼륨의 알칼리 금속염 및 칼슘 또는 마그네슘의 알칼리 토금속염일 수 있다.
또 하나의 구현예에 있어서, 상기 아민염은 3급 아민류일 수 있으며, 구체적으로 트리메틸아민, 트리에틸아민, 트리부틸아민, 트리펜틸아민, 트리헥실아민, 트리에탄올아민, 피리딘 등의 알킬체인이 C1~C6로 구성된 트리알킬아민 및 사이클릭트리알킬아민으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에서 축합제(condensing agent)는 축합 반응에서 반응 조제로 첨가되는 화합물을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 카르보디이미드류 축합제는 하기 화학식 3으로 표시된다.
[화학식 3]
Figure 112018074518570-pat00008
상기 화학식 3에 있어서,
R4 및 R5는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 탄소수 1 내지 6의 직쇄, 분지쇄 또는 고리쇄의 알킬기이고, 상기 알킬기는 알킬아민기로 선택적으로 치환될 수 있다.
구체적으로 상기 R4 및 R5는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 에틸, 이소프로필, 사이클로헥실 또는 디메틸아미노프로필이다.
상기 카보이미드류 축합제는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC) 또는 그의 염, N,N′-디이소프로필카보디이미드(DIC) 및 N,N′-디사이클로헥실카보디이미드(DCC)로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 또 하나의 구현예에 있어서, 상기 (S-1) 단계는, 트리아졸류 첨가제를 더 포함하여 반응할 수 있다. 상기 트리아졸 첨가제는 구체적으로, 히드록시벤조트리아졸(HOBt) 또는 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt) 일 수 있다. 상기 트리아졸 첨가제는 상기 카르보디이미드류 축합제의 효율을 상승시키는 효과가 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 금속이온은 금속의 염화물, 브롬화물, 질산화물, 황산화물 및 아세트산화물로 이루어진 군에서 유래된다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 금속이온은 칼슘, 마그네슘, 세륨, 철, 리튬, 알루미늄, 티타늄 및 나트륨으로 이루어진 군에서 선택되는 금속의 이온일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 금속이온은 하기 화학식 4로 표시되는 금속염 촉매로부터 유래될 수 있다.
[화학식 4]
Figure 112018074518570-pat00009
상기 화학식 4에 있어서,
a는 M의 몰수이고,
b는 M의 이온가수(Ionic valency)이며,
M은 칼슘, 마그네슘, 세륨, 철, 리튬, 알루미늄, 티타늄 또는 나트륨이고,
c는 X의 몰수이며,
d는 X의 이온가수이고,
X는 할로겐, 카보네이트, 아세테이트, 니트레이트, 트리플레이트, 설페이트, 카복실레이트 또는 이들의 유도체이며,
a와 b의 곱의 값과 c와 d의 곱의 값은 동일하다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 금속 이온은 염화칼슘, 아세트산칼슘, 탄산칼슘, 황산칼슘, 인산칼슘 등의 칼슘염, 염화마그네슘, 탄산마그네슘, 황산마그네슘, 브롬화마그네슘 등의 마그네슘염, 염화세륨 불소세륨, 요오드화세륨, 질산세륨 트리플루오르아세트산세륨 등의 세륨염에서 유래되는 금속 이온일 수 있으며, 구체적으로 염화칼슘, 염화세륨, 요오드화리튬, 염화마그네슘, 염화철로부터 유래되는 금속이온일 수 있으나, 이에 제한되지 않고 무수물형태이거나, 수화물 형태 모두를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 제조 방법에 있어서, 가격이 저렴하고, 인체에 무해한 촉매류를 사용함으로써, 반응 시간의 획기적인 단축과 높은 수율의 디뉴클레오사이드 폴리포스페이트를 제공할 수 있어 의약품 원료의 생산에 매우 적합하게 적용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 용매는 물, 유기용매 또는 물과 유기용매의 혼합용매이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 용매는 물이 단독으로 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 제조 방법은 물을 단독으로 사용할 수 있어, 친환경적인 반응 조건으로 산업적 대량 생산에 적용하는 경우 환경 오염 문제, 유기 용매를 사용함으로써 발생되는 비용 및 폐 유기 용매의 처리 비용들을 최소화 할 수 있어 경제적, 친환경적이다.
하나의 구현예에 있어서, 상기 용매는 물 및 유기용매의 혼합 용매를 사용할 수 있다.
또 하나의 구현예에 있어서, 상기 유기용매는 C1-C8의 알코올, C3-C10의 케톤, 1,4-디옥산, 아세토니트릴, N,N-디메틸포름아미드 및 디메틸설폭사이드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 (S-1) 단계에서, 상기 축합제의 당량 및 상기 금속이온의 당량은 동일하거나 상이하고, 각각 상기 화학식 2로 표시되는 뉴클레오사이드 인산 화합물 1몰 당량에 대해, 0.1 몰 내지 30.0몰 당량으로 반응한다. 특히, 상기 축합제의 당량 및 상기 금속이온의 당량은 동일하거나 상이하고, 각각 상기 화학식 2로 표시되는 뉴클레오사이드 인산 화합물 1몰 당량에 대해, 1.0 몰 내지 10.0 몰 당량으로 반응한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 (S-1) 단계에서의 반응 온도는 일반적인 의약품 합성이 가능한 반응 온도의 범위에서 무리 없이 수행이 가능하며, 구체적으로 상기 (S-1) 단계에서의 반응 온도는 0 ℃ 내지 50 ℃일 수 있고, 바람직하게는 5 ℃ 내지 35 ℃에서 반응한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, (S-2) 상기 (S-1) 단계로부터 수득된 생성물을 고체화하여 분리 정제하는 단계를 추가로 포함한다.
상기 (S-2) 단계는 상기 (S-1) 단계에서 수행된 반응 용액을 고체화한 후, 다양한 방법을 이용하여 의약품으로 사용될 수 있도록 정제하는 단계이다.
상기 (S-2) 단계는 구체적으로, 상기 (S-1) 단계를 종료한 후, 유기용매를 주입 또는 역주입함으로써, 조품의 고체를 생성하고, 이를 여과하는 제1 단계를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 (S-2) 단계에서의 유기 용매는 친수성 유기용매일 수 있다. 상기 친수성 유기용매는 C1-C8의 알코올, C3-C10의 케톤, 1,4-디옥산, 아세토니트릴, N,N-디메틸포름아미드 및 디메틸설폭사이드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 구체적으로 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올등, 아세톤, 1,4-디옥산, N,N-디메틸포름아미드, 디메틸설폭시드로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 (S-2) 단계는 상기 제1 단계 후, 생성된 조품의 고체를 물에 용해하고, 음이온교환수지에 흡착하여 목적화합물을 용출한 후 나트륨형태로 전환시켜 최종화합물을 수득하는 제2 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 음이온교환수지는 약염기성음이온교환수지(앰버라이트 IRA67, 다이아이온 SA-11A 등), 강염기성음이온교환수지(앰버라이트 IRA402, 다이아이온 PA-312 등), 약산성양이온교환수지 (다이아이온 WK-30 등) 또는 강산성양이온교환수지(다이아이온 PK-216, 다우엑스 50WX2 등)이 사용될 수 있다. 특히, 약염기성음이온교환수지를 통해 목적화합물을 더욱 고순도로 용출할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 화학식 2로 표시되는 뉴클레오사이드 인산 화합물, 이의 염 또는 이의 수화물; 상기 화학식 3으로 표시되는 축합제; 및 상기 화학식 4로 표시되는 금속염 촉매로부터 유래되는 금속 이온;을 용매 존재 하에 반응시키는 단계를 포함하는 상기 화학식 1a로 표시되는 P1, P4-디(우리딘 5'-)테트라포스페이트, 이의 염 또는 이의 수화물의 제조방법을 제공할 수 있다.
상기 언급된 사항은 서로 모순되지 않는 한 동일하게 적용될 수 있다.
본 발명에 따른 제조 방법과 같이, 상기 화학식 2로 표시되는 뉴클레오사이드 인산화합물을 축합제 및 금속 이온과 함께 친환경 용매인 물을 사용하여 반응을 수행함으로써, 비교적 간단한 공정으로 상기 화학식 1로 표시되는 디뉴클레오사이드 폴리포스페이트, 이의 염 또는 이의 수화물을 고효율 및 고순도로 생산할 수 있다.
본 발명에 따르면, 시판되는 형태의 뉴클레오사이드 인산화합물 또는 그의 금속염을 뉴클레오사이드 인산화합물의 유리산 또는 유기염형태로의 복잡하고 번거로운 전환공정 없이 높은 반응 전환률로 디뉴클레오사이드 폴리포스페이트를 합성할 수 있다. 이에 따라 부반응물이 거의 생성되지 않음으로써 정제가 매우 용이하며, 의약품원료로 사용되기 위한 고품질의 화합물을 얻을 수 있다. 또한, 용매로서 물을 단독으로 사용하거나 유기용매와 혼합하여 사용함으로써 공업적인 대량생산 시 환경오염을 최소화 할 수 있는 매우 효율적이며 친환경적인 합성법이다. 더 나아가 다양한 구조의 치환된 인산화합물 유도체의 합성에도 널리 적용가능하다.
도 1은 실시예 1에서 합성된 UP4U (디쿠아포솔)의 핵자기공명 분석(1H NMR) 결과이다.
도 2는 실시예 1에서 반응 종료 후 수득한 1차 UP4U (디쿠아포솔)의 HPLC 데이터이다.
도 3은 실시예 1에서 합성 및 정제 후 최종 수득한 UP4U (디쿠아포솔)의 HPLC 데이터이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
또한, 이하에서 언급된 시약 및 용매는 중국의 원료제조원, Sigma-Aldrich Korea 및 TCI 사로부터 구입한 것이며, HPLC는 Agilent Technologies 사의 1200 Series를 사용하여 측정하였으며, 1H NMR은 Bruker(브루커) 사의 400 ultraShield NMR Spectrometer를 사용하여 측정하였다. 순도는 HPLC의 면적 %로 측정하였다.
본 발명에서 사용된 HPLC 조건은 다음과 같으며, 반응 후 또는 반응 혼합물 중의 UP4U(디쿠아포솔)의 순도를 측정하였다.
검출기 : 자외부흡광광도계 (측정파장 : 260 nm)
칼 럼 : YMC-Pack ODS-AQ (4.6 mm X 250 mm, 5 μm)
이동상 : 0.4 % 인산이수소칼륨 수용액
유 량 : 0.5 mL / min
시 료 : UP4U(디쿠아포솔) 10 mg / 이동상 10 mL
주입량 : 10 ㎕
실시예 1. UDP·2Na로부터 UP 4 U 합성
UDP·2Na염 (1000 g, 2.23 mol)을 정제수 3.0 L에 용해하여 10 ℃에서 교반한 후, EDC·HCl (428 g, 2.23 mol)과 CaCl2·2H2O (328 g, 2.23 mmol)을 순서대로 적가하여 10 ℃에서 4시간 30분 동안 교반하였다. 반응은 HPLC로 모니터링하였다.
상기 반응 종료 후, 정제수 3.0 L와 EtOH 12.0 L로 수득된 화합물을 고체화시키고 상온에서 약 1시간 동안 교반하였다. 생성된 고체를 여과하고 건조하여 목적으로 하는 UP4U 화합물 1,038 g (순도 94.1 %)을 얻었다.
얻어진 고체를 탈이온수에 녹여 약염기성음이온교환수지(Amberlite IRA 계열)에 흡착시킨 후 탈이온수, 저농도의 염산용액, 염화나트륨 용액으로 순차적으로 용출하여 감압 농축한 후 에탄올로 고체를 석출하였다. 고체를 여과, 건조하여 목적으로 하는 UP4U·4Na을 얻었다. (780 g, 수율 80 %, 순도 99.95 %)
실험예 1. UDP·2Na로부터 UP 4 U 합성 : 금속염에 대한 효과
UDP·2Na염 (500 mg, 1.12 mmol)을 정제수 2 mL에 용해하여 DIC (259 uL, 1.67 mmol)와 각종 금속염 (1.67 mmol)을 순서대로 적가하여 상온에서 반응시켰다.
상기 반응액을 HPLC로 분석하여, UDP·2Na 대비 목적으로 하는 UP4U로의 전환율과 반응 용액중의 UP4U의 순도를 구했다.
[표 1]
Figure 112017059490122-pat00010
상기 [표 1]의 결과로부터, UDP·2Na염으로부터 UP4U의 합성에 있어서, 금속염이 없을 경우의 전환율은 2 %인 것에 비해, 마그네슘염의 경우 79 %, 철염의 경우 25 %의 전환율을 나타내며, 칼슘을 금속염으로 선택한 경우 97 % 내지 98 %의 높은 전환율을 나타내며, 반응액의 순도 또한 83 % 내지 84 %로 현저한 상승효과를 확인하였다.
즉, 상기 결과로부터, 본 발명의 상기 화학식 2로 표시되는 뉴클레오사이드 인산 화합물, 이의 염 또는 이의 수화물; 축합제; 및 금속 이온을 반응시키는 경우, 금속 이온이 없는 경우에 비하여, 고수율 및 고순도의 UP4U를 수득할 수 있음을 확인하였다.
실험예 2. UDP · 2Na로부터 UP 4 U 합성 : 축합제에 대한 효과
UDP·2Na염 (500 mg, 1.12 mmol)을 정제수 2 mL에 용해하여 각종 축합제 (1.67 mmol)와 금속염 CaCl2·2H2O (247 mg, 1.67 mmol)을 순서대로 적가하여 상온에서 반응시켰다.
상기 반응액을 HPLC로 분석하고, UDP 대비 목적으로 하는 UP4U로의 전환율과 UP4U의 순도를 구했다.
[표 2]
Figure 112017059490122-pat00011
상기 [표 2]의 결과로부터, UDP·2Na염으로부터 UP4U의 합성에 있어 축합제로 DIC, EDC·HCl, 또는 DIC와 HOBt를 사용할 경우, 목적으로 하는 UP4U로의 전환율은 98 % 이상을 나타내며, UP4U의 순도 또한 84 % 이상을 나타냄을 확인하였다. 특히, EDC·HCl를 축합제로 사용하는 경우 반응시간이 현저히 감소되며 UP4U로의 높은 전환율과 목적 화합물인 UP4U를 고순도로 합성할 수 있음을 확인하였다.
실험예 3. UDP · 2Na로부터 UP 4 U 합성 : 반응온도, 축합제와 금속염 당량의 효과
UDP·2Na염 (500 mg, 1.12 mmol)을 정제수 2 mL에 용해하여 해당하는 당량의 축합제와 금속염 CaCl2·2H2O을 순서대로 적가하여 반응시켰다.
상기 반응액을 HPLC로 분석하고, UDP 대비 목적으로 하는 UP4U로의 전환율과 UP4U의 순도를 구했다.
[표 3]
Figure 112017059490122-pat00012
상기 [표 3]의 결과로부터, UDP·2Na염으로부터 UP4U 합성에 있어서 40℃ 이상의 높은 반응온도에서는 출발물질 및 목적화합물이 분해되어 반응용액 중 순도가 45 % 내지 72 %로 낮아졌다.
실험예 4. UDP · 유기염으로부터 UP 4 U 합성 : 금속염에 대한 효과
UDP·2TBA염 (1 g, 1.30 mmol)을 DMF 10 mL에 용해하여 DIC (240 uL, 1.55 mmol)와 각종 금속염 (1.55 mmol)을 순서대로 적가하여 상온에서 반응시켰다. 상기 반응액을 HPLC로 분석하고, UDP 대비 목적으로 하는 UP4U로의 전환율과 순도를 구했다.
UDP·2TEA염 (500 mg, 0.82 mmol)을 DMF 5 mL에 용해하여 DIC와 각종 금속염을 아래 당량에 맞춰 적가하여 상온에서 반응시켰다. 상기 반응액을 HPLC로 분석하고, UDP 대비 목적으로 하는 UP4U로의 전환율과 순도를 구했다.
[표 4]
Figure 112017059490122-pat00013
상기 [표 4]의 결과로부터, UDP 유기염(TBA염 또는 TEA염)으로부터 UP4U의 합성에 있어서 칼슘, 철, 마그네슘, 리튬 또는 세륨염 존재 하에서는 83 % 내지 99 %의 높은 전환율을 확인하였다.
상기 전환율이 높은 반응용액 중 칼슘염 또는 마그네슘염 존재 하에 반응하였을 때 UP4U를 71 % 내지 83 %의 고순도로 수득될 수 있음을 확인하였다.
즉, 상기 결과로부터, 본 발명의 상기 화학식 2로 표시되는 뉴클레오사이드 인산 화합물, 이의 염 또는 이의 수화물; 축합제; 및 금속 이온을 반응시키는 경우, 고수율 및 고순도의 UP4U를 수득할 수 있음을 확인하였다.
실험예 5. cUTP로부터 UP 4 U 합성 : 금속염에 대한 효과
UTP·TBA염 (5 g, 9.10 mmol)을 DMF 50 mL에 용해하여 DIC (1.69 mL, 10.92 mmol)로 cUTP 용액을 만들고 HPLC로 정량한 cUTP 용액 1 ml (0.11 mmol)를 취해 UMP·TBA염 용액 (0.13 mmol)과 각종 금속염 (0.132 mmol)을 순서대로 적가하여 상온에서 반응시켰다.
상기 반응액을 HPLC로 분석하고, UTP 대비 목적으로 하는 UP4U로의 전환율과 UP4U의 순도를 구했다.
[표 5]
Figure 112017059490122-pat00014
상기 [표 5]의 결과로부터, UTP·TBA염으로부터 UP4U의 합성에 있어서 칼슘, 철, 마그네슘, 리튬 또는 세륨염 존재 하에서는 83 % 내지 99 %의 높은 전환율을 나타내었지만 금속염이 없을 경우의 전환율은 41 %로 현저히 낮은 것을 확인할 수 있다.
상기 결과로부터, 본 발명의 상기 화학식 2로 표시되는 뉴클레오사이드 인산 화합물, 이의 염 또는 이의 수화물; 축합제; 및 금속 이온을 반응시키는 경우, 금속 이온이 없는 경우에 비하여, 고수율 및 고순도의 UP4U를 수득할 수 있음을 확인하였다.
비교예 1. UDP로부터 UP 4 U 합성 : 국제공개공보 제2014/103704호
UDP·2Na염 (50 g, 0.112 mmol)을 정제수 400 mL에 용해하여 Dowex 50w×2-100 강산성양이온교환수지에 흡착시킨 후 정제수 1200 mL을 30 mL/분의 속도로 통과시켜 Na염이 제거된 UDP 용액을 용출하였다. 용출액에 트리부틸아민 (80 mL, 0.336 mmol)을 주입하여 pH 7이상으로 중화하고 60℃에서 감압농축한 후 1,4-디옥산으로 수차례 공비감압농축하여 물을 제거하였다. 얻어진 잔사를 12시간동안 상온에서 진공건조하여 UDP·2TBA염 75 g (수율 87 %, 수분 1.2 %) 을 얻었다.
상기 단계에서 Na염을 TBA염으로 치환시킨 UDP·2TBA (14.0 g, 18.1 mmol)을 프로피오니트릴 46 mL에 용해하고 카보닐디이미다졸 (8.8 g, 54.3 mmol)을 투입하여 상온에서 약 30분간 교반하고 감압농축하여 용매를 제거하였다. 얻어진 잔사에 정제수 7 mL을 주입하고 약 5℃로 냉각한 후, UDP·2Na (4.1 g, 9.1 mmol)을 투입하였다. 6N 염산수용액을 이용하여 반응용액을 pH 3.9로 적정한 후 60% 염화제2철 수용액 (75 μL, 0.36 mmol)을 가하고 10 ℃에서 27시간 교반하였다. 반응용액을 7.5N 수산화나트륨 수용액으로 pH 10으로 적정하고 5 ℃에서 1시간 교반하였다. 동일온도에서 에탄올 90 mL 을 주입하고 동일온도에서 12시간동안 정치하고 여과하여 고체형태의 UP4U 화합물 13.8 g (순도 86.9 %)을 얻었다.
상기 실험예 1 내지 5의 결과를 바탕으로, 실시예 1에서 확인된 본 발명에 따른 제조 방법과 같이, 상기 화학식 2로 표시되는 뉴클레오사이드 인산 화합물, 이의 염 또는 이의 수화물; 축합제; 및 금속 이온을 반응시키는 경우, 번거로운 전환공정 없이 높은 반응 전환율로 고수율 및 고순도의 디뉴클레오사이드 폴리포스페이트를 합성할 수 있는 것을 확인하였다. 이는 선행기술 중 가장 효과적이었던 실험방법인 비교예 1에 비해서도 번거로운 UDP의 염 치환 공정 없이 시판되는 나트륨염 등의 금속염 형태의 출발물질을 별도의 가공 없이 이용이 가능하며, 매우 간소화된 반응공정을 통해 작업시간 또한 획기적으로 개선하였음을 확인하였다.
상기와 같은 결과로, 본 발명에 따른 디뉴클레오사이드 폴리포스페이트, 이의 염 또는 이의 수화물의 제조방법은 친산업적으로 대량 생산에 유용하게 적용될 수 있는 것을 확인할 수 있다.

Claims (19)

  1. (S-1) 하기 화학식 2로 표시되는 뉴클레오사이드 인산 화합물, 이의 염 또는 이의 수화물; 카르보디이미드류 축합제; 및 금속 이온;을 용매 존재 하에 반응시키는 단계를 포함하는 하기 화학식 1로 표시되는 디뉴클레오사이드 폴리포스페이트, 이의 염 또는 이의 수화물의 제조방법:
    [화학식 1]
    Figure 112022056450233-pat00015

    [화학식 2]
    Figure 112022056450233-pat00027

    상기 화학식 1 및 2에 있어서,
    R1, R2 및 R3는 우라실이고;
    n은 2 내지 6의 정수이며;
    m은 1 내지 3의 정수이다.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 1로 표시되는 뉴클레오사이드 폴리포스페이트는 하기 화학식 1a로 표시되는 것인 디뉴클레오사이드 폴리포스페이트, 이의 염 또는 이의 수화물의 제조방법.
    [화학식 1a]
    Figure 112017059490122-pat00017
  4. 제1항에 있어서, 상기 화학식 2로 표시되는 뉴클레오사이드 인산 화합물은 하기 화학식 2a 내지 화학식 2c 중 어느 하나로 표시되는 것인 디뉴클레오사이드 폴리포스페이트, 이의 염 또는 이의 수화물의 제조방법:
    [화학식 2a]
    Figure 112017059490122-pat00018

    [화학식 2b]
    Figure 112017059490122-pat00019

    [화학식 2c]
    Figure 112017059490122-pat00020
  5. 제1항에 있어서, 상기 뉴클레오사이드 인산 화합물의 염은 금속염 또는 아민염인 것인 디뉴클레오사이드 폴리포스페이트, 이의 염 또는 이의 수화물의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 금속염은 리튬, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘, 바륨, 세륨, 철, 니켈, 구리, 아연 및 붕소로 이루어진 군에서 선택된 것인 디뉴클레오사이드 폴리포스페이트, 이의 염 또는 이의 수화물의 제조방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 아민염은 알킬체인이 C1~C6로 구성된 트리알킬아민인 디뉴클레오사이드 폴리포스페이트, 이의 염 또는 이의 수화물의 제조방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 아민염은 트리메틸아민, 트리에틸아민, 트리부틸아민, 트리펜틸아민, 트리헥실아민 및 피리딘으로 이루어진 군에서 선택된 것인 디뉴클레오사이드 폴리포스페이트, 이의 염 또는 이의 수화물의 제조방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 카르보디이미드류 축합제는 하기 화학식 3으로 표시되는 것인 디뉴클레오사이드 폴리포스페이트, 이의 염 또는 이의 수화물의 제조방법:
    [화학식 3]
    Figure 112018074518570-pat00021

    상기 화학식 3에 있어서,
    R4 및 R5는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 탄소수 1 내지 6의 직쇄, 분지쇄 또는 고리쇄의 알킬기이고, 상기 알킬기는 알킬아민기로 선택적으로 치환될 수 있다.
  10. 제9항에 있어서, 상기 R4 및 R5는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 에틸, 이소프로필, 사이클로헥실 또는 디메틸아미노프로필인 것인 디뉴클레오사이드 폴리포스페이트, 이의 염 또는 이의 수화물의 제조방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 카르보디이미드류 축합제는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC) 또는 그의 염, N,N′-디이소프로필카보디이미드(DIC) 및 N,N′-디사이클로헥실카보디이미드(DCC)로 이루어진 군에서 선택되는 것인 디뉴클레오사이드 폴리포스페이트, 이의 염 또는 이의 수화물의 제조방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 금속이온은 금속의 염화물, 브롬화물, 질산화물, 황산화물 및 아세트산화물로 이루어진 군에서 유래되는 것인 디뉴클레오사이드 폴리포스페이트, 이의 염 또는 이의 수화물의 제조방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 금속이온은 칼슘, 마그네슘, 세륨, 철, 리튬, 알루미늄, 티타늄 및 나트륨으로 이루어진 군에서 선택되는 금속인 것인 디뉴클레오사이드 폴리포스페이트, 이의 염 또는 이의 수화물의 제조방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 금속이온은 하기 화학식 4로 표시되는 금속염 촉매로부터 유래되는 것인 디뉴클레오사이드 폴리포스페이트, 이의 염 또는 이의 수화물의 제조방법:
    [화학식 4]
    Figure 112022109173009-pat00022

    상기 화학식 4에 있어서,
    a는 M의 몰수이고,
    b는 M의 이온가수이며,
    M은 칼슘, 마그네슘, 세륨, 철, 리튬, 알루미늄, 티타늄 또는 나트륨이고,
    c는 X의 몰수이며,
    d는 X의 이온가수이고,
    X는 할로겐, 카보네이트, 아세테이트, 니트레이트, 트리플레이트, 설페이트 또는 카복실레이트이며,
    a와 b의 곱의 값과 c와 d의 곱의 값은 동일하다.
  15. 제1항에 있어서, 상기 용매는 물, 유기용매 또는 물과 유기용매의 혼합용매인 것인 디뉴클레오사이드 폴리포스페이트, 이의 염 또는 이의 수화물의 제조방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 유기용매는 C1-C8의 알코올, C3-C10의 케톤, 1,4-디옥산, 아세토니트릴, N,N-디메틸포름아미드 및 디메틸설폭사이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 디뉴클레오사이드 폴리포스페이트, 이의 염 및 이의 수화물의 제조방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 축합제의 당량 및 상기 금속이온의 당량은 동일하거나 상이하고, 각각 상기 화학식 2로 표시되는 뉴클레오사이드 인산 화합물 1몰 당량에 대해, 상기 축합제 및 상기 금속이온을 0.1 몰 내지 30.0 몰 당량으로 반응하는 것인 디뉴클레오사이드 폴리포스페이트, 이의 염 또는 이의 수화물의 제조방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 반응 온도는 0 ℃ 내지 50 ℃인 것인 디뉴클레오사이드 폴리포스페이트, 이의 염 또는 이의 수화물의 제조방법.
  19. 제1항에 있어서, (S-2) 상기 (S-1) 단계로부터 수득된 생성물을 고체화하여 분리 정제하는 단계를 추가로 포함하는 것인 디뉴클레오사이드 폴리포스페이트, 이의 염 및 이의 수화물의 제조방법.
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