JP7028727B2 - ジヌクレオシドポリリン酸化合物の製造方法｛Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ａ Ｄｉｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ Ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ｝ - Google Patents

Description

本発明は、ジヌクレオシドポリリン酸化合物の製造方法に関し、ヌクレオシドリン酸化合物をハロゲン化金属の存在下でジヌクレオシドポリリン酸化合物とその塩またはその水和物に製造する方法に関する。

ヌクレオシド（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）は、核塩基と五炭糖がＮ－グリコシド結合をなした配糖体化合物であり、リン酸化酵素によってヌクレオシドにリン酸基が結合されると、ＤＮＡ鎖の基本構成成分であるヌクレオチド（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）となる。

このようなヌクレオチドの一種であるジヌクレオシドポリリン酸またはその塩は、生体内の物質と類似して体内で安定しており、それに応じた疾病治療に効果を有すると知られている。

特に、下記化学式１ａで表されるＰ^１，Ｐ^４－ジ（ウリジン５’－）四リン酸（以下、「ＵＰ_４Ｕ」と表記する）またはその塩は、眼球乾燥症または涙液分泌減少症に伴う角結膜上皮障害の治療剤として用いられており、痰排出誘導作用を有するため、去痰剤または肺炎治療剤として開発が期待されている化合物である。

従来のＵＰ_４Ｕの合成法としては、非特許文献１にはウリジン５’－三リン酸（以下、ＵＴＰと表記する）の脱水縮合反応により製造されるウリジン５’－環状三リン酸とウリジン５’－一リン酸（以下、ＵＭＰと表記する）とを反応させる従来の製造方法について報告されており、特許文献１にはその改良された製造方法について報告されている。

特許文献２には、ウリジン、ＵＭＰ、ＵＤＰまたはＵＴＰおよびその塩とウリジンヌクレオチド化合物を極性、非プロトン性有機溶媒および疏水性アミンに溶解させ、一リン酸化剤または二リン酸化剤をリン酸化剤として用いてリン酸化反応させ、カルボジイミド、活性カルボニルまたは活性リンを活性化剤として用いてＵＰ_４Ｕを製造する方法について報告されている。

また、特許文献３には、ウリジン５’－二リン酸（ＵＤＰ）、ＵＭＰまたはピロリン酸と、置換基を有してもよい、イミダゾール、ベンズイミダゾールまたは１，２，４－トリアゾールからなる群より選択される化合物とを縮合させることで合成されるリン酸活性化合物と、ＵＭＰ、ＵＤＰ、ＵＴＰおよびピロリン酸からなる群より選択されるリン酸化合物またはその塩とを、金属イオンの存在下、水または親水性有機溶媒中で反応させてＵＰ_４Ｕを製造する方法について報告されている。

しかし、従来のＵＰ_４Ｕの製造方法は、金属塩交換工程反応などの煩わしい工程過程が多数必要であり、その結果、最終化合物の合成効率および純度が低下するという問題点がある。

具体的には、特許文献２および特許文献１などの従来のＵＰ_４Ｕの製造方法は、反応直前にリン酸化合物の金属塩をトリブチルアミンまたはトリエチルアミンのようなアミン塩の形態で反応させなければならない。その結果、一般にウリジンリン酸化合物のナトリウム塩のような金属塩をイオン交換樹脂カラムクロマトグラフィーによって遊離酸の形態のリン酸化合物に変換した後、アミンと塩形成を行わなければならないという煩わしい工程過程が必要である。このような工程の遂行により、最終化合物の合成効率および純度の低下が発生しうる。特に、非常に不安定な物質として知られたＵＴＰを用いた前記合成反応の場合、純度が低下し易く、水分に敏感なＵＴＰアミン塩のような有機塩は高い吸湿性を有するようになって保管と品質の維持が非常に難しいという問題点がある。

また、特許文献３に記載された製造方法は、４５～９４％の高収率でＵＰ_４Ｕを合成することができるが、上記で言及されたリン酸化合物有機塩を準備する塩交換工程反応およびそれに応じた脱水工程過程が必要となり、有機溶媒中でリン酸活性化合物を合成した後に減圧濃縮工程により溶媒を除去し、水の存在下でｐＨを調整して反応しなければならない煩わしさに因り化合物の純度を低下させるという問題点がある。

したがって、上記のような理由で、煩わしい工程過程なしで環境に優しい反応条件下で高収率のジヌクレオシドポリリン酸化合物を高純度で製造し、産業的に大量生産に好適なジヌクレオシドポリリン酸の製造方法が求められている。

国際公開第２００８／０１２９４９号 国際公開第１９９９／０５１５５号 国際公開第２０１４／１０３７０４号

Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１１、（２００１）、１５７－１６０

本発明の目的は、大量生産に好適で且つ効率的であり、環境に無害なジヌクレオシドポリリン酸の製造方法、その塩および水和物を高純度で大量生産が可能な製造方法を提供することにある。

本発明は、下記化学式１で表されるジヌクレオシドポリリン酸、その塩およびその水和物を製造する方法を提供する。

本発明の一実施形態において、
（Ｓ－１）下記化学式２で表されるヌクレオシドリン酸化合物、その塩またはその水和物と；
カルボジイミド類の縮合剤と；および
金属イオンと；を
溶媒の存在下で反応させるステップを含む、下記化学式１で表されるジヌクレオシドポリリン酸、その塩またはその水和物の製造方法を提供する。

前記化学式において、
Ｒ_１およびＲ_２は、互いに同一であるかまたは異なり、各々独立してピリミジン塩基であり；
Ｒ_３は、ピリミジン塩基であり；
ｎは、２～６の整数であり；
ｍは、１～３の整数である。

本発明において、前記ピリミジン塩基は、シトシン（ｃｙｔｏｓｉｎｅ）、ウラシル（ｕｒａｃｉｌ）またはチミン（ｔｈｙｍｉｎｅ）からなる群より選択されることができる。

本発明の一実施形態において、前記塩基はウラシルである。

本発明の一実施形態において、前記ｎは４である。

本発明の一実施形態において、前記化学式１で表されるヌクレオシドポリリン酸は、下記化学式１ａで表される。

本発明の製造方法によれば、市中で購買可能な前記化学式２、その塩またはその水和物を別途の転換工程なしでそのまま用いることによって、生産に必要な設備の減少、転換工程で用いられる時間、努力、費用の節減が可能であり、それに応じた不純物の発生を最小化することができる。

本発明の一実施形態において、前記化学式２で表されるヌクレオシドリン酸化合物は、下記化学式２ａ～化学式２ｃのうちいずれか一つで表される。

本発明の一実施形態において、前記ヌクレオシドリン酸化合物の塩は金属塩またはアミン塩である。

前記ヌクレオシドリン酸化合物の金属塩は、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、バリウム、セリウム、鉄、ニッケル、銅、亜鉛およびホウ素からなる群より選択されてもよく、好ましくは、リチウム、ナトリウムまたはカリウムのアルカリ金属塩およびカルシウムまたはマグネシウムのアルカリ土類金属塩であってもよい。

また一つの実施形態において、前記アミン塩は、３級アミン類であってもよく、具体的には、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、トリペンチルアミン、トリヘキシルアミン、トリエタノールアミン、ピリジンなどのアルキル鎖がＣ_１～Ｃ_６で構成されたトリアルキルアミンおよび環状トリアルキルアミンからなる群より選択されてもよい。

本発明において、縮合剤（ｃｏｎｄｅｎｓｉｎｇ ａｇｅｎｔ）は、縮合反応において反応助剤として添加される化合物を意味する。

本発明の一実施形態において、前記カルボジイミド類の縮合剤は下記化学式３で表される。

前記化学式３において、
Ｒ_４およびＲ_５は、互いに同一であるかまたは異なり、各々独立して炭素数１～６の直鎖、分枝鎖もしくは環状鎖のアルキル基であり、前記アルキル基はアルキルアミン基で選択的に置換されてもよい。

具体的には、前記Ｒ_４およびＲ_５は、互いに同一であるかまたは異なり、各々独立してエチル、イソプロピル、シクロヘキシルまたはジメチルアミノプロピルである。

前記カルボイミド類の縮合剤は、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）またはその塩、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）およびＮ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）からなる群より選択される。

本発明のまた一つの実施形態において、前記（Ｓ－１）ステップは、トリアゾール類の添加剤をさらに含んで反応することができる。前記トリアゾール添加剤は、具体的には、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）または１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）であってもよい。前記トリアゾール添加剤は、前記カルボジイミド類の縮合剤の効率を上昇させる効果がある。

本発明の一実施形態において、前記金属イオンは、金属の塩化物、臭化物、硝酸化物、硫酸化物および酢酸化物からなる群から由来する。

本発明の一実施形態において、前記金属イオンは、カルシウム、マグネシウム、セリウム、鉄、リチウム、アルミニウム、チタニウムおよびナトリウムからなる群より選択される金属のイオンであってもよい。
本発明の一実施形態において、前記金属イオンは、下記化学式４で表される金属塩触媒から由来してもよい。

前記化学式４において、
ａは、Ｍのモル数であり、
ｂは、Ｍのイオン価数（Ｉｏｎｉｃ ｖａｌｅｎｃｙ）であり、
Ｍは、カルシウム、マグネシウム、セリウム、鉄、リチウム、アルミニウム、チタニウムまたはナトリウムであり、
ｃは、Ｘのモル数であり、
ｄは、Ｘのイオン価数であり、
Ｘは、ハロゲン、カーボネート、アセテート、ニトレート、トリフレート、サルフェート、カルボキシレートまたはこれらの誘導体であり、
ａとｂの積の値と、ｃとｄの積の値とは同一である。

本発明の一実施形態において、前記金属イオンは、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸カルシウムなどのカルシウム塩、塩化マグネシウム、炭酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、臭化マグネシウムなどのマグネシウム塩、塩化セリウム、フッ素セリウム、ヨウ化セリウム、硝酸セリウム、トリフルオロ酢酸セリウムなどのセリウム塩から由来する金属イオンであってもよく、具体的には、塩化カルシウム、塩化セリウム、ヨウ化リチウム、塩化マグネシウム、塩化鉄から由来する金属イオンであってもよいが、これらに制限されず、無水物の形態または水和物の形態の全てを含んでもよい。

本発明に係る製造方法において、安価で人体に無害な触媒類を用いることによって、反応時間の画期的な短縮と高収率のジヌクレオシドポリリン酸を提供することができるため、医薬品原料の生産に非常に好適に適用することができる。

本発明の一実施形態において、前記溶媒は水、有機溶媒または水と有機溶媒の混合溶媒である。

本発明の一実施形態において、前記溶媒としては水を単独で用いることができる。本発明に係る製造方法は、水を単独で用いることができるため、環境に優しい反応条件で産業的に大量生産に適用する場合、環境汚染の問題、有機溶媒の使用によって発生する費用および廃有機溶媒の処理費用を最小化できるので経済的で且つ環境に優しいものである。

一実施形態において、前記溶媒としては水および有機溶媒の混合溶媒を用いることができる。

また一つの実施形態において、前記有機溶媒は、Ｃ_１－Ｃ_８のアルコール、Ｃ_３－Ｃ_１０のケトン、１，４－ジオキサン、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドおよびジメチルスルホキシドからなる群より選択される。

本発明の一実施形態において、前記（Ｓ－１）ステップにおいて、前記縮合剤の当量および前記金属イオンの当量は同一であるかまたは異なり、各々前記化学式２で表されるヌクレオシドリン酸化合物１モル当量に対して０．１モル～３０．０モル当量で反応する。特に、前記縮合剤の当量および前記金属イオンの当量は同一であるかまたは異なり、各々前記化学式２で表されるヌクレオシドリン酸化合物１モル当量に対して１．０モル～１０．０モル当量で反応する。

本発明の一実施形態において、前記（Ｓ－１）ステップにおける反応温度は、一般的な医薬品の合成が可能な反応温度の範囲で無理なく実行可能であり、具体的には、前記（Ｓ－１）ステップにおける反応温度は、０℃～５０℃であってもよく、より詳細には５℃～３５℃で反応する。

本発明の一実施形態において、（Ｓ－２）前記（Ｓ－１）ステップから収得した生成物を固体化して分離精製するステップをさらに含む。

前記（Ｓ－２）ステップは、前記（Ｓ－１）ステップで行われた反応溶液を固体化した後、様々な方法を利用して医薬品として使用できるように精製するステップである。

前記（Ｓ－２）ステップは、具体的には、前記（Ｓ－１）ステップを終了した後、有機溶媒を注入または逆注入することによって、粗固体を生成し、それを濾過する第１ステップを含む。

本発明の一実施形態において、前記（Ｓ－２）ステップにおける有機溶媒は親水性有機溶媒であってもよい。前記親水性有機溶媒は、Ｃ_１－Ｃ_８のアルコール、Ｃ_３－Ｃ_１０のケトン、１，４－ジオキサン、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドおよびジメチルスルホキシドからなる群より選択される。具体的には、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノールなど、アセトン、１，４－ジオキサン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドからなる群より選択されることができる。

本発明の一実施形態において、前記（Ｓ－２）ステップは、前記第１ステップ後、生成された粗固体を水に溶解し、陰イオン交換樹脂に吸着して目的化合物を溶出した後にナトリウムの形態に転換して最終化合物を得る第２ステップをさらに含むことができる。

本発明において、前記陰イオン交換樹脂としては、弱塩基性陰イオン交換樹脂（アンバーライトＩＲＡ６７、ダイヤイオンＳＡ－１１Ａなど）、強塩基性陰イオン交換樹脂（アンバーライトＩＲＡ４０２、ダイヤイオンＰＡ－３１２など）、弱酸性陽イオン交換樹脂（ダイヤイオンＷＫ－３０など）又は強酸性陽イオン交換樹脂（ダイヤイオンＰＫ－２１６、ダウエックス５０ＷＸ２など）が用いられることができる。特に、弱塩基性陰イオン交換樹脂を介して目的化合物をより高純度で溶出することができる。

本発明の一実施形態において、前記化学式２で表されるヌクレオシドリン酸化合物、その塩またはその水和物と；前記化学式３で表される縮合剤と；および前記化学式４で表される金属塩触媒から由来する金属イオンとを溶媒の存在下で反応させるステップを含む、前記化学式１ａで表されるＰ^１，Ｐ^４－ジ（ウリジン５’－）四リン酸、その塩またはその水和物の製造方法を提供することができる。

上記で言及されたものは、互いに矛盾しない限り同様に適用されることができる。

本発明に係る製造方法のように、前記化学式２で表されるヌクレオシドリン酸化合物を縮合剤および金属イオンと共に環境に優しい溶媒である水を用いて反応を行うことによって、比較的に簡単な工程により、前記化学式１で表されるジヌクレオシドポリリン酸、その塩またはその水和物を高効率および高純度で生産することができる。

本発明によれば、市販する形態のヌクレオシドリン酸化合物またはその金属塩をヌクレオシドリン酸化合物の遊離酸または有機塩の形態への複雑で且つ煩わしい転換工程なしで高い反応転換率でジヌクレオシドポリリン酸を合成することができる。それにより、副反応物がほぼ生成されないことによって精製が非常に容易であり、医薬品の原料として用いられるための高品質の化合物を得ることができる。また、溶媒として水を単独で用いるか、または有機溶媒と混合して用いることによって、工業的な大量生産時に環境汚染を最小化することができる、非常に効率的で且つ環境に優しい合成法である。さらに、様々な構造の置換されたリン酸化合物誘導体の合成にも広く適用可能である。

実施例１で合成されたＵＰ_４Ｕ（ジクアホソル）の核磁気共鳴分析（^１Ｈ ＮＭＲ）の結果である。 実施例１で反応終了後に得られた１次ＵＰ_４Ｕ（ジクアホソル）のＨＰＬＣデータである。 実施例１で合成および精製後に最終的に得られたＵＰ_４Ｕ（ジクアホソル）のＨＰＬＣデータである。

以下、本発明の理解を助けるために実施例を提示する。但し、下記の実施例は本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記の実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。

また、以下にて言及された試薬および溶媒は中国の原料製造元、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ＫｏｒｅａおよびＴＣＩ社から購入したものであり、ＨＰＬＣはＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社の１２００ Ｓｅｒｉｅｓを使って測定し、^１Ｈ ＮＭＲは、Ｂｒｕｋｅｒ社の４００ ｕｌｔｒａＳｈｉｅｌｄ ＮＭＲ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを使って測定した。純度はＨＰＬＣの面積％で測定した。

本発明で用いられたＨＰＬＣの条件は次の通りであり、反応後または反応混合物中のＵＰ_４Ｕ（ジクアホソル）の純度を測定した。
検出器：紫外部吸光光度計（測定波長：２６０ｎｍ）
カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－ＡＱ（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ）
移動相：０．４％リン酸二水素カリウム水溶液
流量：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
試料：ＵＰ_４Ｕ（ジクアホソル）１０ｍｇ／移動相１０ｍＬ
注入量：１０μＬ

実施例１．ＵＤＰ・２ＮａからＵＰ _４ Ｕの合成
ＵＤＰ・２Ｎａ塩（１０００ｇ、２．２３ｍｏｌ）を精製水３．０Ｌに溶解して１０℃で攪拌した後、ＥＤＣ・ＨＣｌ（４２８ｇ、２．２３ｍｏｌ）とＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ（３２８ｇ、２．２３ｍｍｏｌ）を順に滴加して１０℃で４時間３０分間攪拌した。反応はＨＰＬＣでモニターした。

前記反応の終了後、精製水３．０ＬとＥｔＯＨ １２．０Ｌで得られた化合物を固体化し、常温で約１時間攪拌した。生成された固体を濾過し乾燥して目的とするＵＰ_４Ｕ化合物１，０３８ｇ（純度９４．１％）を得た。

得られた固体を脱イオン水に溶かして弱塩基性陰イオン交換樹脂（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＡ系列）に吸着させた後、脱イオン水、低濃度の塩酸溶液、塩化ナトリウム溶液で順次溶出して減圧濃縮した後、エタノールで固体を析出した。固体を濾過、乾燥して目的とするＵＰ_４Ｕ・４Ｎａを得た（７８０ｇ、収率８０％、純度９９．９５％）。

実験例１．ＵＤＰ・２ＮａからＵＰ_４Ｕの合成：金属塩に対する効果
ＵＤＰ・２Ｎａ塩（５００ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）を精製水２ｍＬに溶解して、ＤＩＣ（２５９ｕＬ、１．６７ｍｍｏｌ）と各種金属塩（１．６７ｍｍｏｌ）を順に滴加して常温で反応させた。

前記反応液をＨＰＬＣで分析し、ＵＤＰ・２Ｎａに対比して目的とするＵＰ_４Ｕへの転換率と反応溶液中のＵＰ_４Ｕの純度を求めた。

前記表１の結果より、ＵＤＰ・２Ｎａ塩からＵＰ_４Ｕの合成において、金属塩がない場合の転換率は２％であるのに対し、マグネシウム塩の場合は７９％、鉄塩の場合は２５％の転換率を示し、カルシウムを金属塩として選択した場合は９７％～９８％の高い転換率を示し、反応液の純度も８３％～８４％として顕著な上昇効果を確認した。

すなわち、前記結果より、本発明の前記化学式２で表されるヌクレオシドリン酸化合物、その塩またはその水和物；縮合剤；および金属イオンを反応させる場合、金属イオンがない場合に比べて、高収率および高純度のＵＰ_４Ｕを得ることができるということを確認した。

実験例２．ＵＤＰ・２ＮａからＵＰ_４Ｕの合成：縮合剤に対する効果
ＵＤＰ・２Ｎａ塩（５００ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）を精製水２ｍＬに溶解して、各種縮合剤（１．６７ｍｍｏｌ）と金属塩ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ（２４７ｍｇ、１．６７ｍｍｏｌ）を順に滴加して常温で反応させた。

前記反応液をＨＰＬＣで分析し、ＵＤＰに対比して目的とするＵＰ_４Ｕへの転換率とＵＰ_４Ｕの純度を求めた。

前記表２の結果より、ＵＤＰ・２Ｎａ塩からＵＰ_４Ｕの合成において、縮合剤としてＤＩＣ、ＥＤＣ・ＨＣｌ、またはＤＩＣとＨＯＢｔを用いる場合、目的とするＵＰ_４Ｕへの転換率は９８％以上を示し、ＵＰ_４Ｕの純度も８４％以上を示すことを確認した。特に、ＥＤＣ・ＨＣｌを縮合剤として用いる場合、反応時間が顕著に減少し、ＵＰ_４Ｕへの高い転換率と目的化合物であるＵＰ_４Ｕを高純度で合成できるということを確認した。

実験例３．ＵＤＰ・２ＮａからＵＰ_４Ｕの合成：反応温度、縮合剤と金属塩の当量の効果
ＵＤＰ・２Ｎａ塩（５００ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）を精製水２ｍＬに溶解して、該当する当量の縮合剤と金属塩ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏを順に滴加して反応させた。

前記反応液をＨＰＬＣで分析し、ＵＤＰに対比して目的とするＵＰ_４Ｕへの転換率とＵＰ_４Ｕの純度を求めた。

前記表３の結果より、ＵＤＰ・２Ｎａ塩からＵＰ_４Ｕの合成において、４０℃以上の高い反応温度では、出発物質および目的化合物が分解されて、反応溶液中の純度が４５％～７２％に低くなった。

実験例４．ＵＤＰ・有機塩からＵＰ_４Ｕの合成：金属塩に対する効果
ＵＤＰ・２ＴＢＡ塩（１ｇ、１．３０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ １０ｍＬに溶解して、ＤＩＣ（２４０ｕＬ、１．５５ｍｍｏｌ）と各種金属塩（１．５５ｍｍｏｌ）を順に滴加して常温で反応させた。前記反応液をＨＰＬＣで分析し、ＵＤＰに対比して目的とするＵＰ_４Ｕへの転換率と純度を求めた。

ＵＤＰ・２ＴＥＡ塩（５００ｍｇ、０．８２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ ５ｍＬに溶解して、ＤＩＣと各種金属塩を下記の当量に合わせて滴加して常温で反応させた。前記反応液をＨＰＬＣで分析し、ＵＤＰに対比して目的とするＵＰ_４Ｕへの転換率と純度を求めた。

前記表４の結果より、ＵＤＰ有機塩（ＴＢＡ塩またはＴＥＡ塩）からＵＰ_４Ｕの合成において、カルシウム、鉄、マグネシウム、リチウム、又はセリウム塩の存在下では８３％～９９％の高い転換率を確認した。

前記転換率の高い反応溶液中、カルシウム塩又はマグネシウム塩の存在下で反応した時、ＵＰ_４Ｕを７１％～８３％の高純度で得ることができるということを確認した。

すなわち、前記結果より、本発明の前記化学式２で表されるヌクレオシドリン酸化合物、その塩またはその水和物；縮合剤；および金属イオンを反応させる場合、高収率および高純度のＵＰ_４Ｕを得ることができるということを確認した。

実験例５．ｃＵＴＰからＵＰ_４Ｕの合成：金属塩に対する効果
ＵＴＰ・ＴＢＡ塩（５ｇ、９．１０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ ５０ｍＬに溶解して、ＤＩＣ（１．６９ｍＬ、１０．９２ｍｍｏｌ）でｃＵＴＰ溶液を作り、ＨＰＬＣで定量したｃＵＴＰ溶液１ｍｌ（０．１１ｍｍｏｌ）を取って、ＵＭＰ・ＴＢＡ塩溶液（０．１３ｍｍｏｌ）と各種金属塩（０．１３２ｍｍｏｌ）を順に滴加して常温で反応させた。

前記反応液をＨＰＬＣで分析し、ＵＴＰに対比して目的とするＵＰ_４Ｕへの転換率とＵＰ_４Ｕの純度を求めた。

前記表５の結果より、ＵＴＰ・ＴＢＡ塩からＵＰ_４Ｕの合成において、カルシウム、鉄、マグネシウム、リチウム、又はセリウム塩の存在下では８３％～９９％の高い転換率を示したが、金属塩がない場合の転換率は４１％として顕著に低いということを確認することができる。

前記結果より、本発明の前記化学式２で表されるヌクレオシドリン酸化合物、その塩またはその水和物；縮合剤；および金属イオンを反応させる場合、金属イオンがない場合に比べて、高収率および高純度のＵＰ_４Ｕを得ることができるということを確認した。

比較例１．ＵＤＰからＵＰ_４Ｕの合成：国際公開第２０１４／１０３７０４号
ＵＤＰ・２Ｎａ塩（５０ｇ、０．１１２ｍｍｏｌ）を精製水４００ｍＬに溶解して、Ｄｏｗｅｘ ５０ｗ×２－１００強酸性陽イオン交換樹脂に吸着させた後、精製水１２００ｍＬを３０ｍＬ／分の速度で通過させて、Ｎａ塩が除去されたＵＤＰ溶液を溶出する。溶出液にトリブチルアミン（８０ｍＬ、０．３３６ｍｍｏｌ）を注入してｐＨ７以上に中和し、６０℃で減圧濃縮した後、１，４－ジオキサンで数回にかけて共沸減圧濃縮して水を除去する。得られた残渣を常温で１２時間真空乾燥してＵＤＰ・２ＴＢＡ塩７５ｇ（収率８７％、水分１．２％）を得た。

前記ステップでＮａ塩をＴＢＡ塩に置換させたＵＤＰ・２ＴＢＡ（１４．０ｇ、１８．１ｍｍｏｌ）をプロピオニトリル４６ｍＬに溶解し、カルボニルジイミダゾール（８．８ｇ、５４．３ｍｍｏｌ）を投入して常温で約３０分間攪拌し減圧濃縮して溶媒を除去する。得られた残渣に精製水７ｍＬを注入して約５℃に冷却した後、ＵＤＰ・２Ｎａ（４．１ｇ、９．１ｍｍｏｌ）を投入する。６Ｎ塩酸水溶液を用いて反応溶液をｐＨ３．９に滴定した後、６０％塩化第２鉄水溶液（７５μＬ、０．３６ｍｍｏｌ）を加え、１０℃で２７時間攪拌した。反応溶液を７．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ１０に滴定し、５℃で１時間攪拌した。同一温度でエタノール９０ｍＬを注入し、同一温度で１２時間静置し濾過して固体形態のＵＰ_４Ｕ化合物１３．８ｇ（純度８６．９％）を得た。

前記実験例１～５の結果に基づき、実施例１で確認された本発明に係る製造方法のように、前記化学式２で表されるヌクレオシドリン酸化合物、その塩またはその水和物；縮合剤；および金属イオンを反応させる場合、煩わしい転換工程なしで高い反応転換率で高収率および高純度のジヌクレオシドポリリン酸を合成できるということを確認した。これは、先行技術のうち最も効果的であった実験方法である比較例１に比べるにしても、煩わしいＵＤＰの塩置換工程なしで市販のナトリウム塩などの金属塩形態の出発物質を別途の加工なしで利用可能であり、非常に簡素化された反応工程によって作業時間も画期的に改善したことを確認した。

前記のような結果より、本発明に係るジヌクレオシドポリリン酸、その塩またはその水和物の製造方法は、産業に親和的で且つ大量生産に有用に適用できるということを確認することができる。
以下に、本発明の実施形態を列挙する。
実施形態１
（Ｓ－１）下記化学式２で表されるヌクレオシドリン酸化合物、その塩またはその水和物と；
カルボジイミド類の縮合剤と；および
金属イオンと；を
溶媒の存在下で反応させるステップを含む、下記化学式１で表されるジヌクレオシドポリリン酸、その塩またはその水和物の製造方法：

前記化学式において、
Ｒ _１ およびＲ _２ は、互いに同一であるかまたは異なり、各々独立してピリミジン塩基であり；
Ｒ _３ は、ピリミジン塩基であり；
ｎは、２～６の整数であり；
ｍは、１～３の整数である。
実施形態２
前記ピリミジン塩基はウラシルである、実施形態１に記載のジヌクレオシドポリリン酸、その塩またはその水和物の製造方法。
実施形態３
前記化学式１で表されるヌクレオシドポリリン酸は下記化学式１ａで表される、実施形態１に記載のジヌクレオシドポリリン酸、その塩またはその水和物の製造方法。

実施形態４
前記化学式２で表されるヌクレオシドリン酸化合物は下記化学式２ａ～化学式２ｃのうちいずれか一つで表される、実施形態１に記載のジヌクレオシドポリリン酸、その塩またはその水和物の製造方法：

実施形態５
前記ヌクレオシドリン酸化合物の塩は金属塩またはアミン塩である、実施形態１に記載のジヌクレオシドポリリン酸、その塩またはその水和物の製造方法。
実施形態６
前記金属塩は、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、バリウム、セリウム、鉄、ニッケル、銅、亜鉛およびホウ素からなる群より選択される、実施形態５に記載のジヌクレオシドポリリン酸、その塩またはその水和物の製造方法。
実施形態７
前記アミン塩は、アルキル鎖がＣ _１ ～Ｃ _６ で構成されたトリアルキルアミンおよび環状トリアルキルアミンからなる群より選択される、実施形態５に記載のジヌクレオシドポリリン酸、その塩またはその水和物の製造方法。
実施形態８
前記環状トリアルキルアミンは、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、トリペンチルアミン、トリヘキシルアミン、トリエタノールアミン、及びピリジンからなる群より選択される、実施形態７の記載のジヌクレオシドポリリン酸、その塩またはその水和物の製造方法。
実施形態９
前記カルボジイミド類の縮合剤は下記化学式３で表される、実施形態１に記載のジヌクレオシドポリリン酸、その塩またはその水和物の製造方法：

前記化学式３において、
Ｒ _４ およびＲ _５ は、互いに同一であるかまたは異なり、各々独立して炭素数１～６の直鎖、分枝鎖もしくは環状鎖のアルキル基であり、前記アルキル基はアルキルアミン基で選択的に置換されてもよい。
実施形態１０
前記Ｒ _４ およびＲ _５ は、互いに同一であるかまたは異なり、各々独立してエチル、イソプロピル、シクロヘキシルまたはジメチルアミノプロピルである、実施形態８に記載のジヌクレオシドポリリン酸、その塩またはその水和物の製造方法。
実施形態１１
前記カルボジイミド類の縮合剤は、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）またはその塩、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）およびＮ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）からなる群より選択される、実施形態１に記載のジヌクレオシドポリリン酸、その塩またはその水和物の製造方法。
実施形態１２
前記金属イオンは、金属の塩化物、臭化物、硝酸化物、硫酸化物および酢酸化物からなる群から由来する、実施形態１に記載のジヌクレオシドポリリン酸、その塩またはその水和物の製造方法。
実施形態１３
前記金属イオンは、カルシウム、マグネシウム、セリウム、鉄、リチウム、アルミニウム、チタニウムおよびナトリウムからなる群より選択される金属である、実施形態１に記載のジヌクレオシドポリリン酸、その塩またはその水和物の製造方法。
実施形態１４
前記金属イオンは下記化学式４で表される金属塩触媒から由来する、実施形態１に記載のジヌクレオシドポリリン酸、その塩またはその水和物の製造方法：

前記化学式４において、
ａは、Ｍのモル数であり、
ｂは、Ｍのイオン価数であり、
Ｍは、カルシウム、マグネシウム、セリウム、鉄、リチウム、アルミニウム、チタニウムまたはナトリウムであり、
ｃは、Ｘのモル数であり、
ｄは、Ｘのイオン価数であり、
Ｘは、ハロゲン、カーボネート、アセテート、ニトレート、トリフレート、サルフェート、カルボキシレートまたはこれらの誘導体であり、
ａとｂの積の値と、ｃとｄの積の値とは同一である。
実施形態１５
前記溶媒は、水、有機溶媒または水と有機溶媒の混合溶媒である、実施形態１に記載のジヌクレオシドポリリン酸、その塩またはその水和物の製造方法。
実施形態１６
前記有機溶媒は、Ｃ _１ －Ｃ _８ のアルコール、Ｃ _３ －Ｃ _１０ のケトン、１，４－ジオキサン、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドおよびジメチルスルホキシドからなる群より選択される、実施形態１４に記載のジヌクレオシドポリリン酸、その塩およびその水和物の製造方法。
実施形態１７
前記縮合剤の当量および前記金属イオンの当量は、同一であるかまたは異なり、各々前記化学式２で表されるヌクレオシドリン酸化合物１モル当量に対して０．１モル～３０．０モル当量で反応する、実施形態１に記載のジヌクレオシドポリリン酸、その塩またはその水和物の製造方法。
実施形態１８ 前記反応温度は０℃～５０℃である、実施形態１に記載のジヌクレオシドポリリン酸、その塩またはその水和物の製造方法。
実施形態１９
（Ｓ－２）前記（Ｓ－１）ステップから収得した生成物を固体化して分離精製するステップをさらに含む、実施形態１に記載のジヌクレオシドポリリン酸、その塩およびその水和物の製造方法。

Claims (14)

1. （Ｓ－１）下記化学式２で表されるヌクレオシドリン酸化合物のナトリウム塩と；
   カルボジイミド類の縮合剤と；および
   金属イオンと；を
   溶媒の存在下で反応させるステップを含む、下記化学式１で表されるジヌクレオシドポリリン酸の製造方法であって、
   前記金属イオンがカルシウムのイオンである、方法：
   

   

   前記化学式において、
   Ｒ_１およびＲ_２は、互いに同一であるかまたは異なり、各々独立してピリミジン塩基であり；
   Ｒ_３は、ピリミジン塩基であり；
   ｎは、４の整数であり；
   ｍは、１～３の整数である。
2. 前記ピリミジン塩基はウラシルである、請求項１に記載の方法。
3. 前記化学式１で表されるヌクレオシドポリリン酸は下記化学式１ａで表される、請求項１に記載の方法。
   

   
4. 前記化学式２で表されるヌクレオシドリン酸化合物は下記化学式２ａ～化学式２ｃのうちいずれか一つで表される、請求項１に記載の方法：
   

   
5. 前記カルボジイミド類の縮合剤は下記化学式３で表される、請求項１に記載の方法：
   

   

   前記化学式３において、
   Ｒ_４およびＲ_５は、互いに同一であるかまたは異なり、各々独立して炭素数１～６の直鎖、分枝鎖もしくは環状鎖のアルキル基であり、前記アルキル基はアルキルアミン基で選択的に置換されてもよい。
6. 前記Ｒ_４およびＲ_５は、互いに同一であるかまたは異なり、各々独立してエチル、イソプロピル、シクロヘキシルまたはジメチルアミノプロピルである、請求項５に記載の方法。
7. 前記カルボジイミド類の縮合剤は、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）またはその塩、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）およびＮ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
8. 前記金属イオンは、金属の塩化物、臭化物、硝酸化物、硫酸化物および酢酸化物からなる群から由来する、請求項１に記載の方法。
9. 前記金属イオンは下記化学式４で表される金属塩触媒から由来する、請求項１に記載の方法：
   

   

   前記化学式４において、
   ａは、Ｍのモル数であり、
   ｂは、Ｍのイオン価数であり、
   Ｍは、カルシウムであり、
   ｃは、Ｘのモル数であり、
   ｄは、Ｘのイオン価数であり、
   Ｘは、ハロゲン、カーボネート、アセテート、ニトレート、トリフレート、サルフェート、カルボキシレートまたはこれらの誘導体であり、
   ａとｂの積の値と、ｃとｄの積の値とは同一である。
10. 前記溶媒は、水、または水と有機溶媒の混合溶媒である、請求項１に記載の方法。
11. 前記有機溶媒は、Ｃ_１－Ｃ_８のアルコール、Ｃ_３－Ｃ_１０のケトン、１，４－ジオキサン、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドおよびジメチルスルホキシドからなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
12. 前記縮合剤の当量および前記金属イオンの当量は、同一であるかまたは異なり、各々前記化学式２で表されるヌクレオシドリン酸化合物１モル当量に対して０．１モル～３０．０モル当量で反応する、請求項１に記載の方法。
13. 前記反応温度は０℃～５０℃である、請求項１に記載の方法。
14. （Ｓ－２）前記（Ｓ－１）ステップから収得した生成物を固体化して分離精製するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。

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