DE3612636C2 - Nucleosid-Phospholipid-Komplexe - Google Patents
Nucleosid-Phospholipid-KomplexeInfo
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Description
Die Erfindung betrifft neue Nucleosid-Phospholipid-Konju
gate und die Salze davon.
Die Erfindung betrifft insbesondere Nucleosid-Phospholipid-
Konjugate der allgemeinen Formel (I)
worin R₁ und R₂ für langkettige Fettsäurereste stehen und
Ns für einen Nucleosidrest aus der Gruppe 5-Fluoruridin-
5′-yl, 5-Fluor-2′-deoxyuridin-5′-yl, Bredinin-5′-yl, Tuber
cidin-5′-yl, Neplanocin-A-6′-yl, 5-Fluorcytidin-5′-yl, Ara
binosylcytosin-5′-yl, Arabinosyl-5-fluorcytosin-5′-yl, Ara
binosyladenin-5′-yl und Arabinosylthymin-5′yl steht, sowie
die Salze davon.
Nucleosid-Antitumormittel werden in weitem Ausmaß als wirk
same Chemotherapeutika für neoplastische Zellen
verwendet. Bei der Anwendung als Antitumor-Chemotherapeu
tika treten jedoch verschiedene Probleme auf. So ist bei
spielsweise beim Wirkungsmechanismus eines antineoplasti
schen Nucloesidmittels die Phosphorylierung der Hydroxyl
gruppe in 5′-Stellung des Nucleosids in vivo für die An
titumoraktivität wesentlich. Die Verbindung wird durch
Inaktivierung, beispielsweise durch Phosphorylyse oder De
aminierung, zu einer inaktiven Substanz abgebaut. Die
Tumorzellenbeständigkeit gegenüber Antitumormitteln wird
erhöht und das Mittel ist manchmal für mitotische normale
Zellen toxisch. Es sind schon viele Arten von Nucleosid
derivaten synthetisiert worden, um die Nachteile der be
kannten Nucleosid-Antitumormittel zu überwinden.
Es ist bekannt, daß CDP-Diacylglycerin in vivo eine wich
tige Rolle als Zwischenprodukt der Biosynthese von Glycero
phospholipid spielt. Sein analoges Arabinosylcytosin-Phos
pholipid-Konjugat, das eine Antitumoraktivität besitzt,
wurde chemisch synthetisiert [Biochim. Biophys. Acta, 619,
(1980), J. Med. Chem., 1982, 25, 1322-1329].
Wie oben erläutert, wird das Ribonucleosid durch einen
chemischen Prozeß synthetisiert, und daher sind vielstufi
ge synthetische Verfahren notwendig. Dies bedingt eine
niedrige Ausbeute und komplizierte Verfahren. Weiterhin
ist Cytosinarabinosid nur als Nucleosidrest des Derivats
von Phospholipid-Nucleosid-Konjugat bekannt geworden. Es
besteht ein Bedarf nach einem Phospholipid-Nucleosid-Kom
plex mit einem anderen Typ von Nucleosidrest. Zu diesem
Zweck kann ein anderes Nucleosid als das Cytosinarabino
sid verwendet werden. Die chemische Synthese dieses Phos
pholipid-Nucleosid-Komplexes erfordert aber vielstufige
synthetische Verfahren mit schwierigen Reaktionsbedingun
gen. Eine chemische Synthese ist daher in der Praxis bis
lang im wesentlichen unmöglich geblieben.
Es wurde nun gefunden, daß ein neuer Phospholipid-Nucleo
sid-Komplex dadurch synthetisiert werden kann, daß man
L-Glycerophospholipid mit Nucleosid in Gegenwart von Phos
pholipase D umsetzt, wobei die primäre Hydroxylgruppe des
Nucleosids und das Glycerophospholipid miteinander reagie
ren.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, neue Nucleosid-Phospho
lipid-Konjugate der allgemeinen Formel (I)
zur Verfügung zu stellen, worin R₁ und R₂ die oben angege
benen Bedeutungen haben.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch den Gegenstand
der Ansprüche gelöst.
Ein Beispiel für ein Glycerophospholipid ist Phosphatidyl
cholin der allgemeinen Formel (II)
worin R₁ und R₂ die oben angegebenen Bedeutungen haben und
-OR₃ den Cholinrest darstellt.
Im Glycerophospholipid der Phosphatidylcholinreihe sind
R₁ und R₂ gleiche oder verschiedene langkettige Fettsäure
reste mit 16 bis 20 Kohlenstoffatomen. Als Beispiele hier
für können langkettige gesättigte Fettsäurereste von
C16-20, wie Palmitoyl, Stearoyl oder Dodecanoyl, und lang
kettige ungesättigte Fettsäurereste von C16-20 mit 1 bis
4 ungesättigten Bindungen, wie Palmitooleoyl, Oleoyl, Li
noleoyl oder Arachidonyl, genannt werden. Bevorzugte Bei
spiele sind Dipalmitoylphosphatidylcholin, wobei R₁ und
R₂ für Palmitoyl, Dioleylphosphatidylcholin, wobei R₁ und
R₂ für Oleoyl stehen, und Dilinoleoylphosphatidylcholin,
wobei R₁ und R₂ für Lineoleoyl stehen. Weiterhin können
natürliche Phosphatidylcholine genannt werden, bei denen
R₁ und R₂ die Reste von langkettigen Fettsäuregemischen
mit C16-20 sind. diese Phosphatidylcholine können synthe
tisiert werden oder sie sind im Handel erhältlich.
Beispiele für geeignete Nucleoside sind 5-Fluoruridin
(nachstehend als FUR bezeichnet), 5-Fluor-2′-deoxyuridin
(nachstehned als FUDR) bezeichnet, Bredinin [4-Carbamoyl-
1-β-D-ribofuranosyl-imidazolium-5-oleat], Tubercidin
[7-Deazaadenosin], Neplanocin-A [1-β-(6-Amino-9H-9-yl)-4-
hydroxymethyl-4-cyclopenten-2-α-diol] (nachstehend als NepA bezeichnet,
5-Fluorcytidin (nachstehend als FCR bezeichnet), Arabino
sylcytosin, Arabinosyl-5-fluorcytosin, Arabinosyladenin
oder Arabinosylthymin.
Nucleosid-Phospholipid-Komplexe der Formel (I) können da
durch erhalten werden, daß man das vorgenannte Glycerophos
pholipid und das Nucleosid gegebenenfalls in Gegenwart von
Metallionen mit Phospholipase D umsetzt. Ein bevorzugtes
Beispiel für eine Phospholipase D ist Phospholipase D-P,
erhalten aus Streptomyces sp. AA586 FERM P-6100 (Japan.
Pat. Unexam. Publ. No. 58-1 52 481, Toyo Jozo Co., catalogue
No. P-39). Die verwendete Menge der Phospholipase D be
trägt insbesondere 0,01 Einheiten oder mehr pro 1 mg Phos
phatidylcholin, vorzugsweise 1 bis 100 Einheiten. Beispie
le für geeignete Lösungsmittel sind Zweischichten-Lösungs
mittel aus einem organischen Lösungsmittel und Wasser, bei
spielsweise Gemische aus organischen Lösungsmitteln, wie
Ether, Benzol oder Chloroform und einer Pufferlösung mit
pH 3 bis 9, vorzugsweise pH 4 bis 6. Ein Beispiel für ein
wasserlösliches Salz für die Bildung von Metallionen ist
Calciumchlorid. Die Reaktionstemperatur beträgt im allge
meinen 20 bis 60°C. Die Reaktionszeit ist im allgemeinen
30 Minuten bis 5 Stunden. Das so erhaltene Nucleosid-Phos
pholipid-Konjugat kann durch Teilungsmethoden und/oder
Silicagel-Chromatographie gereinigt werden.
Eine einstufige Synthese des erfindungsgemäßen Nucleosid-
Phospholipid-Komplexes wird nachstehend wie folgt darge
stellt:
Das auf die obige Weise erhaltene Nucleosid-Phospholipid-
Konjugat ist eine Verbindung, bei der die Phosphatgruppe
im Phospholipid und die primäre Hydroxylgruppe in 5′-Stel
lung (oder in 6′-Stellung im Falle von Nep A) des Nucleo
sids miteinander gebunden sind. Das so erhaltene Produkt
kann als nichttoxisches Salz davon, z. B. als Natriumsalz,
hergestellt und im allgemeinen als Suspension in sterili
siertem, destilliertem Wasser verabreicht werden.
Der so hergestellte Nucleosid-Phospholipid-Komplex gemäß
der Erfindung hat die Vorteile, daß er im Vergleich zu dem
ursprünglichen Nucleosid stärker lipophil ist, daß er
nicht leicht ausgeschieden wird, d. h. über längere Zeit
räume aktiv ist, daß er durch Inaktivierung, z. B. durch
Phosphorylyse, Deaminierung oder Reduktion nicht beeinträch
tigt wird, daß er eine höhere Affinität gegenüber den Zell
membranen hat, daß antineoplastisches Nucleosid-5′-mono
phosphat in den Zellen gebildet wird, und daß er eine
langandauernde Wirkung und erhöhte Aktivität bei niedriger
Toxizität aufweist.
Der erfindungsgemäße neue Nucleosid-Phospholipid-Komplex
zeigt in vivo eine ausgeprägte Antitumoraktivität und wei
terhin eine antimetastatische Aktivität für Tumoren sowie
eine antivirale Aktivität.
Die Antitumoraktivitäten gegenüber Leukämie P-388-Carcino
men bei der Maus und Ehrlich-Ascites-Carcinomen werden wie
folgt angegeben.
(1) Proben: siehe Tabellen I und II
(2) Versuchstiere: BDF₁-Mäuse oder ICR-Mäuse, im Alter von 5 bis 6 Wochen, männlich, 5 Mäuse pro Gruppe, Kontrolle 7 Mäuse.
(3) Tumorzellen: P-388-Leukämiezellen; 1×10⁶/0,2 ml werden intraperitoneal in BDF₁-Mäuse inokuliert. Ehrlich-Ascites-Carcinom zellen; 2×10⁶/0,2 ml werden intraperi toneal in ICR-Mäuse inokuliert.
(4) Herstellung der Proben und Verabreichung der Arznei mittel:
Die Proben werden in Tris-HCl-Kochsalzlösung durch Be handlung mit Ultraschall suspendiert. Es werden 0,1 ml/ 10 g Körpergewicht verabreicht. Die Proben werden bei 4°C im Dunkeln gelagert.
Verabreichung: 2 Tage nach Inokulierung des Tumors, einmal täglich über 2 bis 7 Tage. Die Dosismenge ist in den Tabellen an gegeben.
(5) Erhöhung der Lebensspanne (ILS) wird durch folgende Gleichung errechnet:
(2) Versuchstiere: BDF₁-Mäuse oder ICR-Mäuse, im Alter von 5 bis 6 Wochen, männlich, 5 Mäuse pro Gruppe, Kontrolle 7 Mäuse.
(3) Tumorzellen: P-388-Leukämiezellen; 1×10⁶/0,2 ml werden intraperitoneal in BDF₁-Mäuse inokuliert. Ehrlich-Ascites-Carcinom zellen; 2×10⁶/0,2 ml werden intraperi toneal in ICR-Mäuse inokuliert.
(4) Herstellung der Proben und Verabreichung der Arznei mittel:
Die Proben werden in Tris-HCl-Kochsalzlösung durch Be handlung mit Ultraschall suspendiert. Es werden 0,1 ml/ 10 g Körpergewicht verabreicht. Die Proben werden bei 4°C im Dunkeln gelagert.
Verabreichung: 2 Tage nach Inokulierung des Tumors, einmal täglich über 2 bis 7 Tage. Die Dosismenge ist in den Tabellen an gegeben.
(5) Erhöhung der Lebensspanne (ILS) wird durch folgende Gleichung errechnet:
Versuchstage: 35 Tage (teilweise 30 Tage)
Mäuse, die an den Endtagen leben, werden
bei der ILS nicht berechnet.
(6) Ergebnisse:
(6) Ergebnisse:
Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert.
5-Fluoruridin (FUR, 4,0 g) wurde in 100 mM Acetatpuffer
(pH 5,6, 20 ml), der 100 mM CaCl₂ enthielt, aufgelöst und
bei 45°C 20 Minuten lang gerührt. Phospholipase D-P
(10 mg, aus Streptomyces, Toyo Jozo Co., spezifische Ak
tivität 160 Einheiten/mg) und eine Chloroformlösung (30 ml)
von Dipalmitoylphosphatidylcholin (1,5 g) wurde zugegeben
und es wurde bei 45°C 3 Stunden lang gerührt und hierauf
abgekühlt. Methanol (20 ml) wurde dazu zugegeben, und die
organische Schicht wurde abgetrennt. Die wäßrige Schicht
wurde mit Chloroform (30 ml) und Methanol (15 ml) extra
hiert. Die organischen Schichten wurden kombiniert und
mit Wasser (20 ml) und Methanol (20 ml) versetzt und auf
geteilt. Die abgetrennte organische Schicht wurde im Vaku
um eingetrocknet. Ein Gemisch aus Chloroform : Ethanol (1 : 1)
(30 ml) wurde zu dem Rückstand gegeben und das Gemisch
wurde erneut im Vakuum zur Trockene eingedampft.
Der in einer kleinen Menge von Chloroform aufgelöste Rück
stand wurde in eine Flash-Säule von Silicagel (Merck, Sili
cagel Art. 9385, 4 cm×15 cm) gegeben und stufenweise
mit Chloroform, Chloroform : Methanol (20 : 1), (7 : 1), (4 : 1),
(3 : 1) und (2 : 1) in dieser Reihenfolge eluiert. Das Eluat
wurde im Vakuum zur Trockene eingedampft, wodurch ein
farbloses Pulver der folgenden Struktur (Ia) (0,92 g, Aus
beute: 50,5%) erhalten wurde.
worin R₁ und R₂ für Palmitoyl stehen.
UV-Absorptionsspektrum: λmax=268 nm (in Methanol : Chloro form=20 : 1)
FAB-Massenspektrum: m/e 915 (M+Na)⁺
Rf=0,37 (Chloroform : Methanol : Wasser=65 : 25 : 3, Merck Platte Art. 5715, der Flecken wurde durch UV- Lampe und Molybdän-Blau erfaßt. Nachfolgend wur de der Rf-Wert in der gleichen Weise bestimmt).
UV-Absorptionsspektrum: λmax=268 nm (in Methanol : Chloro form=20 : 1)
FAB-Massenspektrum: m/e 915 (M+Na)⁺
Rf=0,37 (Chloroform : Methanol : Wasser=65 : 25 : 3, Merck Platte Art. 5715, der Flecken wurde durch UV- Lampe und Molybdän-Blau erfaßt. Nachfolgend wur de der Rf-Wert in der gleichen Weise bestimmt).
Die Antitumoraktivität ist in der Tabelle gezeigt.
Keine akute Toxizität wurde bei einer Dosis von 150 mg/kg
i. p. in Mäusen beobachtet.
Im Beispiel 1 wurde Nep A (2,0 g) anstelle von FUR ver
wendet, wodurch die Verbindung der Formel (Ib) (0,31 g,
Ausbeute: 17,0%) erhalten wurde.
worin R₁ und R₂ für Palmitoyl stehen.
UV-Absorptionsspektrum: λmax=261 nm (in Methanol : Chloro form=20 : 1)
FAB-Massenspektrum: m/e 894 (MH)⁺
Rf=0,38
UV-Absorptionsspektrum: λmax=261 nm (in Methanol : Chloro form=20 : 1)
FAB-Massenspektrum: m/e 894 (MH)⁺
Rf=0,38
Die Antitumoraktivität dieser Verbindung wird in der Ta
belle angegeben. Es wurde keine akute Toxizität beobach
tet, als die Verbindung mit 250 mg/kg verabreicht wurde.
Dipalmitoylphosphatidylcholin in Beispiel 1 wurde durch
Dilinoleoylphosphatidylcholin (1,5 g) ersetzt, wodurch die
Verbindung der Formel (Ic) (1,09 g) erhalten wurde.
worin R₁ und R₂ für Linoleoyl stehen.
UV-Absorptionsspektrum : λmax=268 nm (in Methanol : Chloro form=20 : 1)
FAB-Massenspektrum: m/e 963 (M+Na)⁺
Rf=0,37
UV-Absorptionsspektrum : λmax=268 nm (in Methanol : Chloro form=20 : 1)
FAB-Massenspektrum: m/e 963 (M+Na)⁺
Rf=0,37
Die Antitumoraktivität dieser Verbindung ist ILS 100,8%.
(15 mg/kg, 5malige Verabreichung) gegen P-388 Leukämie der
Maus. Bei der Maus wurde keine akute Toxizität bei Dosen
von 75 mg/kg beobachtet.
5-Fluoruridin (FUR, 4,0 g) wurde zu 100 nM Acetatpuffer
(pH 5,6, 20 ml), enthaltend 100 mM CaCl₂, gegeben und das
Gemisch wurde bei 45°C 20 Minuten lang gerührt. Hierzu wur
de Phospholipase D-P (10 mg, Toyo Jozo Co.) und eine Chlo
roformlösung (30 ml) von Phosphatidylcholin (Eilecithin,
1,5 g) zugegeben. Das Gemisch wurde bei 45°C 3 Stunden lang
gerührt und abgekühlt. Nach der Reaktion erfolgte die Iso
lierung wie in Beispiel 1. Das Produkt wurde durch Silica
gel-Chromatographie gereinigt, wodurch die Verbindung der
Formel (Id) (1,11 g) erhalten wurde.
worin R₁ und R₂ für Radyl stehen.
UV-Absorptionsspektrum: λmax=268 nm (in Methanol : Chloro form=20 : 1)
Rf=0,37
UV-Absorptionsspektrum: λmax=268 nm (in Methanol : Chloro form=20 : 1)
Rf=0,37
Die Antitumoraktivität dieser Verbindung ist ILS 98,3%
(15 mg/kg, 5malige Verabreichung) gegen P-388 Leukämie der
Maus. Bei Dosen von 150 mg/kg wurde keine akute Toxizität
bei der Maus festgestellt.
Das FUR in Beispiel 1 wurde durch das in Tabelle III an
gegebene Nucleosid ersetzt, wodurch der Phospholipid-Nucleo
sid-Komplex (I) erhalten wurde, der anwendbare Antitumor
aktivitäten hatte. Bei Dosen von 150 mg/kg wurde keine aku
te Toxizität bei der Maus beobachtet.
In Tabelle III bedeutet * den Fall, daß 100 mM Acetatpuffer
(pH 5,6), enthaltend 100 mM Calciumchlorid (15 ml), verwen
det wurde ** bezeichnet das Gewinnungsverfahren der je
weiligen Verbindung wie folgt:
Zu dem Reaktionsgemisch wurde nach dem Abkühlen Methanol
(20 ml) gegeben. Unlösliche Stoffe wurden abfiltriert. Es
wurde mit Methanol : Chloroform (1 : 1) gewaschen. Die orga
nische Schicht wurde nach dem Abtrennen mit Natriumchlorid
lösung gewaschen, durch ein Filterpapier Whatman 1-PS fil
triert und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der in einer
kleinen Menge von Chloroform aufgelöste Rückstand wurde
auf eine Flash-Säule (Merck, Silicagel Art. 7747, 4 cm×15 cm)
aufgebracht und mit Chloroform, Chloroform : Metha
nol (10 : 1), (7 : 1), (5 : 1), (3 : 1) und (2 : 1) in dieser Reihen
folge eluiert.
Nucleosid: FUDR 1,5 g
Dipalmitoylphosphatidylcholin: 0,75 g
R₁ und R₂: Palmitoyl
Ns: FUDR-5′-yl
Ausbeute: 0,41 g
UV-Spektrum (λmax): 268 nm
[Methanol : Chloroform (20 : 1)]
FAB-Massenspektrum (m/e): 899 (M+Na)⁺
Rf: 0,44
Dipalmitoylphosphatidylcholin: 0,75 g
R₁ und R₂: Palmitoyl
Ns: FUDR-5′-yl
Ausbeute: 0,41 g
UV-Spektrum (λmax): 268 nm
[Methanol : Chloroform (20 : 1)]
FAB-Massenspektrum (m/e): 899 (M+Na)⁺
Rf: 0,44
Nucleosid: Bredinin (*) (**) 10 g
Dipalmitoylphosphatidylcholin: 2,0 g
R₁ und R₂: Palmitoyl
Ns: Bredinin-5′-yl
Ausbeute: 1,36 g
UV-Spektrum (λmax): 280 nm
[Methanol : Chloroform (20 : 1)]
FAB-Massenspektrum (m/e): 890 (MH)⁺
Rf: 0,25
Dipalmitoylphosphatidylcholin: 2,0 g
R₁ und R₂: Palmitoyl
Ns: Bredinin-5′-yl
Ausbeute: 1,36 g
UV-Spektrum (λmax): 280 nm
[Methanol : Chloroform (20 : 1)]
FAB-Massenspektrum (m/e): 890 (MH)⁺
Rf: 0,25
Nucleosid: Tubercidin 2,0 g
Dipalmitoylphosphatidylcholin: 1,0 g
R₁ und R₂: Palmitoyl
Ns: Tubercidin-5′-yl
Ausbeute: 0,91 g
UV-Spektrum (λmax): 270 nm
[Methanol : Chloroform (20 : 1)]
FAB-Massenspektrum (m/e): 897 (M+Na)⁺
Rf: 0,38
Dipalmitoylphosphatidylcholin: 1,0 g
R₁ und R₂: Palmitoyl
Ns: Tubercidin-5′-yl
Ausbeute: 0,91 g
UV-Spektrum (λmax): 270 nm
[Methanol : Chloroform (20 : 1)]
FAB-Massenspektrum (m/e): 897 (M+Na)⁺
Rf: 0,38
Nucleosid: FCR 0,65 g
Dipalmitoylphosphatidylcholin: 0,73 g
R₁ und R₂: Palmitoyl
Ns: FCR-5′-yl
Ausbeute: 0,33 g
UV-Spektrum (λmax): 283 nm 241 nm
[Methanol : Chloroform (20 : 1)]
FAB-Massenspektrum (m/e): 914 (M+Na)⁺
Rf: 0,30
Dipalmitoylphosphatidylcholin: 0,73 g
R₁ und R₂: Palmitoyl
Ns: FCR-5′-yl
Ausbeute: 0,33 g
UV-Spektrum (λmax): 283 nm 241 nm
[Methanol : Chloroform (20 : 1)]
FAB-Massenspektrum (m/e): 914 (M+Na)⁺
Rf: 0,30
Das FUR in Beispiel 4 wurde durch das in Tabelle IV ange
gebene Nucleosid ersetzt, wodurch der Phospholipid-Nucleo
sid-Komplex (I) mit verwendbaren Antitumoraktivitäten er
halten wurde. Bei Dosen von 150 mg/kg wurde keine akute
Toxizität beobachtet.
In der Tabelle haben (*) und (**) die gleichen Bedeutun
gen wie oben.
Nucleosid: FUDR 2,0 g
Phosphatidylcholin: 1,0 g
R₁ und R₂: Radyl
Ns: FUDR-5′-yl
Ausbeute: 0,41 g
UV-Spektrum (λmax): 268 nm
[Methanol : Chloroform (20 : 1)]
Rf: 0,44
Phosphatidylcholin: 1,0 g
R₁ und R₂: Radyl
Ns: FUDR-5′-yl
Ausbeute: 0,41 g
UV-Spektrum (λmax): 268 nm
[Methanol : Chloroform (20 : 1)]
Rf: 0,44
Nucleosid: Bredinin (*) (**) 10 g
Phosphatidylcholin: 2,0 g
R₁ und R₂: Radyl
Ns: Bredinin-5′-yl
Ausbeute: 1,18 g
UV-Spektrum (λmax): 280 nm
[Methanol : Chloroform (20 : 1)]
Rf: 0,25
Phosphatidylcholin: 2,0 g
R₁ und R₂: Radyl
Ns: Bredinin-5′-yl
Ausbeute: 1,18 g
UV-Spektrum (λmax): 280 nm
[Methanol : Chloroform (20 : 1)]
Rf: 0,25
Nucleosid: Tubercidin 2,0 g
Phosphatidylcholin: 1,0 g
R₁ und R₂: Radyl
Ns: Tubercidin-5′-yl
Ausbeute: 0,71 g
UV-Spektrum (λmax): 270 nm
[Methanol : Chloroform (20 : 1)]
Rf: 0,38
Phosphatidylcholin: 1,0 g
R₁ und R₂: Radyl
Ns: Tubercidin-5′-yl
Ausbeute: 0,71 g
UV-Spektrum (λmax): 270 nm
[Methanol : Chloroform (20 : 1)]
Rf: 0,38
Nucleosid: NepA 2,0 g
Phosphatidylcholin: 1,5 g
R₁ und R₂: Radyl
Ns: NepA-6′-yl
Ausbeute: 1,24 g
UV-Spektrum (λmax): 216 nm
[Methanol : Chloroform (20 : 1)]
Rf: 0,38
Phosphatidylcholin: 1,5 g
R₁ und R₂: Radyl
Ns: NepA-6′-yl
Ausbeute: 1,24 g
UV-Spektrum (λmax): 216 nm
[Methanol : Chloroform (20 : 1)]
Rf: 0,38
Weitere Beispiele für Ausgangsmaterialien und Produkte von
Phospholipid-Nucleosid-Konjugat werden nachfolgend wie
folgt angegeben.
Arabinosyl-5-fluorcytosin (783 mg), gelöst in 100 mM Acetat
puffer (pH 5,4 6 ml), enthaltend 100 mM CaCl₂, wurde bei
45°C Minuten lang gerührt.
Dazu wurde Phospholipase D-P (10 mg, von Streptomyces, To
yo Jozo Co., spezifische Aktivität 160 Einheiten/mg) und
eine Chloroformlösung (20 ml) von Dipalmitoylphosphatidyl
cholin (367 mg, 0,5 mM) gegeben. Das Gemisch wurde bei 45°C
3 Stunden lang gerührt und abgekühlt. Zu dem Gemisch wurde
1N HCl (6 ml), Chloroform (20 ml) und Methanol (20 ml) ge
geben und die organische Schicht wurde abgetrennt. Die
organische Schicht wurde mit Wasser gewaschen und im Va
kuum getrocknet. Ethanol wurde zu dem Rückstand gegeben
und die Lösung wurde zweimal im Vakuum zur Trockene ein
gedampft. Der in einer kleinen Menge von Chloroform auf
gelöste Rückstand wurde auf eine Flash-Säule mit Silica
gel (Merck, Silicagel Art. 9385, 2 cm×12 cm) aufgegeben
und stufenweise mit Chloroform, Chloroform : Methanol
(20 : 1), (10 : 1), (5 : 1), (3 : 1) und (2 : 1) in dieser Reihen
folge eluiert.
Das Eluat wurde im Vakuum zur Trockene eingedampft und der
Rückstand wurde in Chloroform : Methanol (2 : 1) (25 ml) auf
gelöst. Sodann wurde Wasser zur Trennung der organischen
Schicht zugegeben. Diese wurde im Vakuum zur Trockene ein
gedampft, wodurch ein farbloses Pulver (156 g, Ausbeute:
35,0%) erhalten wurde.
UV-Absorptionsspektrum: λmax=284 nm, 240 nm (in Chloro form : Methanol=20 : 1)
FAB-Massenspektrum: m/e 914 (M+Na)⁺
Rf=0,31 (Chloroform : Methanol : Wasser=65 : 25 : 3, Merck Platte Art. 5715, der Flecken wurde durch UV-Lam pe und Molybdän-Blau erfaßt. Nachfolgend wurde der Rf-Wert auf die gleiche Weise bestimmt.
UV-Absorptionsspektrum: λmax=284 nm, 240 nm (in Chloro form : Methanol=20 : 1)
FAB-Massenspektrum: m/e 914 (M+Na)⁺
Rf=0,31 (Chloroform : Methanol : Wasser=65 : 25 : 3, Merck Platte Art. 5715, der Flecken wurde durch UV-Lam pe und Molybdän-Blau erfaßt. Nachfolgend wurde der Rf-Wert auf die gleiche Weise bestimmt.
Die Antitumoraktivität dieser Verbindung ist oben angege
ben. Weiterhin wurde ein ILS-Wert von mehr als 60% beobach
tet, als Ehrlich-Ascites-Carcinom, 2×10⁶-Zellen, 0,2 ml
intraperitoneal in Mäuse inokuliert wurden und als 2 Tage
danach diese Verbindung (30 mg/kg) einmal täglich über
7 Tage verabreicht wurde. Es wurde keine akute Toxizität
bei Dosen von 150 mg/kg bei Mäusen beobachtet.
Arabinosylcytosin (962 mg, 15 Äquivalente) wurde in 100 mM
Acetatpuffer (pH 5,4, 5 ml), enthalten 100 mM CaCl₂,
aufgelöst. Das Gemisch wurde bei 45°C 10 Minuten lang ge
rührt. Phospholipase D-P (5 mg) und eine Chloroformlösung
(10 ml) von L-α-lecithindioleyl (200 mg, 0,263 mM) wurde
zugegeben. Das Gemisch wurde bei 45°C 2 Stunden lang ge
rührt und abgekühlt. Chloroform (6,6 ml) und Methanol
(8,3 ml) wurde zugesetzt und die organische Schicht wurde
abgetrennt. Die organische Schicht wurde mit Wasser (5 ml)
gewaschen und im Vakuum zur Trockene eingedampft. Ethanol
(15 ml) wurde zu dem Rückstand gegeben und im Vakuum zwei
mal zur Trockene eingedampft. Der in einer kleine Menge
von Chloroform aufgelöste Rückstand wurde auf eine Flash-
Säule mit Silicagel (Merck, Silicagel Art. 9385, 2,5 cm×
12 cm) aufgegeben und stufenweise mit Chloroform : Methanol
(15 : 1) und (10 : 1) und weiter mit Chloroform : Methanol : Was
ser (100 : 10 : 1), (70 : 10 : 1) und (50 : 10 : 1) in dieser Reihen
folge eluiert. Das Eluat wurde im Vakuum zur Trockene ein
gedampft, dann in Chloroform : Methanol (2 : 1) (25 ml) aufgelöst und
mit Wasser (5 ml) unter Schütteln versetzt. Die hierbei
entstandene organische Schicht wurde im Vakuum zur Trocke
ne eingedampft. Methanol wurde zugegeben und das Gemisch
wurde im Vakuum zur Trockene eingedampft, wodurch ein farb
loses Pulver erhalten wurde (184 mg, Ausbeute: 75,5%).
UV-Absorptionsspektrum: λmax=273 nm (in Chloroform : Me thanol=20 : 1)
FAB-Massenspektrum: m/e 948 (M+Na)⁺
Rf=0,36
UV-Absorptionsspektrum: λmax=273 nm (in Chloroform : Me thanol=20 : 1)
FAB-Massenspektrum: m/e 948 (M+Na)⁺
Rf=0,36
Die Antitumoraktivität dieser Verbindung ist oben angege
ben. Weiterhin war die Antitumoraktivität gegen Ehrlich-
Ascites-Carcinom bei Mäusen ILS 65,6%. Bei Dosen von
150 mg/kg wurde bei Mäusen keine akute Toxizität und kei
ne Sterblichkeit festgestellt.
Arabinosyl-5-fluorcytosin wurde durch Arabinosyladenin
in Beispiel 13 und Arabinosylthymin ersetzt, wodurch Di
palmitoylphosphatidylarabinosyladenin und Dipalmitoylphos
phatidylarabinosylthymin erhalten wurde. Diese Verbindungen
mit einer antiviralen Aktivität und keiner Sterblichkeit
wurden bei Dosen von 150 mg/kg bei Mäusen getestet.
Dipalmitoylphosphatidylarabinosyladenin:
UV-Absorptionsspektrum: λmax=259 nm (in Chloroform : Me thanol=20 : 1)
FAB-Massenspektrum: m/e 898 (MH)⁺ und (M+Na)⁺
Rf=0,39
Dipalmitoylphosphatidylarabinosylthymin:
UV-Absorptionsspektrum: λmax=269 nm (in Chloroform : Me thanol=20 : 1)
FAB-Massenspektrum: m/e 911 (M+Na)⁺
Rf=0,46
Dipalmitoylphosphatidylarabinosyladenin:
UV-Absorptionsspektrum: λmax=259 nm (in Chloroform : Me thanol=20 : 1)
FAB-Massenspektrum: m/e 898 (MH)⁺ und (M+Na)⁺
Rf=0,39
Dipalmitoylphosphatidylarabinosylthymin:
UV-Absorptionsspektrum: λmax=269 nm (in Chloroform : Me thanol=20 : 1)
FAB-Massenspektrum: m/e 911 (M+Na)⁺
Rf=0,46
In den Beispielen 16 bis 21 wurde FUR durch das in Tabelle
V gezeigte Nucleosid ersetzt und das Dipalmitoylphosphati
dylcholin wurde durch Distearoylphosphatidylcholin ersetzt,
wodurch die Verbindung mit der Formel (I) gemäß Tabelle
V erhalten wurde.
Claims (8)
1. Nucleosid-Phospholipid-Komplexe der allgemeinen Formel (I)
worin R₁ und R₂ langkettige Fettsäurereste sind, und Ns
ein Nucleosidrest aus der Gruppe 5-Fluoruridin-5′-yl, 5-
Fluor-2′-deoxyuridin-5′-yl, Bredinin-5′-yl, Tubercidin-
5′-yl, Neplanocin-A-6′-yl, 5-Fluorcytidin-5′-yl, Arabino
sylcytosin-5′-yl, Arabinocyl-5-fluorocytosin-5′-yl, Ara
binosyladenin-5′-yl und Arabinosylthymin-5′-yl ist, und
die Salze davon.
2. Nucleosid-Phospholipid-Konjugate nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß R₁ und R₂
für Palmitoyl stehen und Ns für 5-Fluoruridin-5′-yl steht,
sowie die Salze davon.
3. Nucleosid-Phospholipid-Konjugat nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß R₁ und R₂ für
Palmitoyl stehen und Ns für Neplanocin-A-6′-yl steht, so
wie die Salze davon.
4. Nucleosid-Phospholipid-Konjugat nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß R₁ und R₂ für
Palmitoyl stehen, Ns für Arabinosyl-cytosin-5′-yl, Arabi
nosyl-adenin-5′-yl oder Arabinosyl-thymin-5′-yl steht,
oder die Salze davon.
5. Nucleosid-Phospholipid-Konjugat nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß R₁ und R₂ für
Oleoyl stehen und Ns für Arabinosyl-cytosin-5′-yl steht,
oder die Salze davon.
6. Nucleosid-Phospholipid-Konjugat nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß R₁ und R₂ für
Stearoyl stehen und Ns für 5-Fluoruridin-5′-yl steht, oder
die Salze davon.
7. Nucleosid-Phospholipid-Konjugat nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß R₁ und R₂ für
Stearoyl stehen und Ns für Neplanocin-A-6′-yl steht, oder
die Salze davon.
8. Nucleosid-Phospholipid-Konjugat nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß R₁ und R₂ für
Stearoyl stehen und Ns für Arabinosyl-cytosin-5′-yl steht,
oder die Salze davon.
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