DE10024308C1

DE10024308C1 - Verfahren zur Aufreinigung und Aufkonzentrierung des Cofaktors 3'Phosphoadenosin-5'-phosphosulfats(PAPS)

Info

Publication number: DE10024308C1
Application number: DE2000124308
Authority: DE
Inventors: Robert Landsiedel
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-05-17
Filing date: 2000-05-17
Publication date: 2001-12-20
Anticipated expiration: 2020-05-18

Abstract

Vorgeschlagen wird ein 3'Phosphoadenosin-5'-phosphosulfat (PAPS), welches einen Anteil an weiteren Nukleotiden unter 2 Gew.-% - bezogen auf die Menge an PAPS - enthält sowie ein Verfahren zur Aufreinigung/Aufkonzentrierung von PAPS. Weiterhin wird die Verwendung von (PAPS), welches einen Anteil an weiteren Nukleotiden unter 2 Gew.-% - bezogen auf die Menge an PAPS - enthält, zur enzymatischen Sulfonierung sowie zur Messung von Enzymaktivitäten von Sulfotransferasen beschrieben.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Acrylamidhydrogels zur Aufreinigung und Aufkonzentrierung des Cofaktors 3'Phosphoadenosin-5'- phosphosulfat (PAPS).

3'Phosphoadenosin-5'-phosphosulfat (PAPS) [CAS-Nr. 102029-54-9] ist Cofaktor für die überwiegende Zahl aller enzymatischen Sulfonierungen. Bei diesen Reaktionen wird die Sulfogruppe des PAPS auf ein Substrat übertragen, das PAPS wird zum 3',5'Diphosphoadenosin (PAP). Katalysiert wird diese Reaktion durch Sulfotransferasen. PAPS wird daher zur enzymatischen Synthese sulfonierter Produkte (wie beispielsweise Steroide, Proteine, Polysaccharide) und zur Untersuchung von Sulfotransferasereaktionen einsetzt. PAPS kann enzymatisch aus 5'-Adenosintriphosphat (ATP), Sulfat und PAPS-Synthetase hergestellt werden, wie beispielsweise von Shailubhai et al. (in: Analytical Biochemistry, 1996, 243, 165- 170) beschrieben. Bei dieser Reaktion wird in einem ersten Reaktionsschritt Diphosphat von ATP abgespalten und das Reaktionsprodukt wird sulfatiert: es entsteht Adenosin-5'-phosphosulfat (APS), welches in einem zweiten Reaktionsschritt an der 3'-OH-Position mit ATP zur PAPS phosphoryliert wird, wobei das ATP zu ADP (5'-Adenosinmonophosphat) wird. Bekannt ist weiterhin die chemische Herstellung aus 5'-Adenosindiphosphat (ADP) aus US 3,268,416. Alte bekannten Herstellungsverfahren haben 2 Nachteile: zum einen enthalten die PAPS- Lösungen unterschiedliche Anteile an Edukten bzw Zwischenprodukten (ATP, ADP, Diphosphat, Sulfat etc.), zum anderen ist das entstandene PAPS instabil und hydrolysiert spontan zu PAP und Sulfat. Bekannte chromatographische Aufreinigungsmethoden können dieses Problem nicht lösen, da die langen Trennzeiten (und die somit stattfindende Hydrolyse) eine effektive Aufreinigung unmöglich machen. Nachteilig bei bekannten chromatograhischen Aufreinigungsmöglichkeiten ist weiterhin die Verwendung von Eluenten, die in nachfolgenden Sulfotransferasereaktionen stören bzw. teuer sind. So beschreiben z. B. Shailubhai et al. (in Analytical Biochemistry, 1996, 243, 165-170) die chromatographische Aufreinigung von PAPS mittel eines Mono Q® Materials unter Einsatz eines Bicarbonateluenten.

Kommerziell erhältliches PAPS hat üblicherweise ein Anteil an weiteren Nukleotiden (APS, PAP, ATP etc.) von über 15 Gew-%. Dies schränkt den Einsatz des PAPS bei der Bestimmung der Enzymaktivität von Sulfotransferasen drastisch ein. Diese Enzymbestimmung erfolgt über den Verbrauch des Cofaktors durch Messung von entstandenem PAP. Enthält das zur Bestimmung der Enzymaktivität eingesetzte PAPS jedoch PAP als Verunreinigung (als Folge der spontanen Hydrolyse des PAPS), ist eine Bestimmung der Sulfotransferaseaktivität bei geringen Enzymaktivitäten unmöglich. Darüber hinaus ist PAP in höheren Konzentrationen ein Hemmstoff der Sulfortransferasen, so dass eine exakte Aktivitätsbestimmung unmöglich ist. Andere Verfahren der Enzymbestimmung setzen eine spezielle Analytik für jedes Substrat oder dessen sulfoniertes Produkt voraus und sind entsprechend aufwendig. Die Hemmwirkung des PAP auf die Sulfotransferasen schränkt auch den Einsatz von PAPS bei der präparativen enzymatischen Sulfonierung ein.

Mit bekannten Herstellungs- und Aufreinigungsmethoden ist es bisher nur umständlich und mit hohem Zeit- und Materialaufwand möglich eine PAPS-Lösung herzustellen, die einen geringen Anteil an weiteren Nucleotiden - bezogen auf die PAPS Menge - aufweist.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung hat darin bestanden, PAPS zur Verfügung zu stellen, welches einen möglichst geringen Anteil an weiteren Nukleotiden - bezogen auf die Menge an PAPS - aufweist. Wünschenswert ist weiterhin, dass das PAPS der erforderlichen Reinheit in einem Lösungsmittel vorliegt, welches seinen direkten Einsatz sowohl in der enzymatischen Aktivitätsbestimmung als auch in der präparativen Sulfonierung ermöglicht. Zu diesem Zwecke sollte ein Verfahren zur Aufreinigung von PAPS entwickelt werden, welches es ermöglicht weitete Nukleotide, die durch die Herstellung bedingt im PAPS enthalten sind, abzutrennen.

Darüber hinaus sollte die Aufreinigungsmethode es ermöglichen, das aufgereinigte PAPS in einem Lösungsmittel zu erhalten, die einen direkten Einsatz sowohl in der Enzymaktivitätsbestimmung als auch in der präparativen enzymatischen Sulfonierung ermöglicht. Des werteren sollten große Mengen an PAPS schnell und kostengünstig aufgereinigt werden.

Überraschenderweise wurde gefunden, dass es schnell und kostengünstig möglich ist 3'Phosphoadenosin-5'-phosphosulfat herzustellen, bei dem der Anteil an weiteren Nukleotiden unter 2 Gew.-% - bezogen auf die Menge an PAPS - liegt, wenn ein Acrylamid Hydrogel zur Aufreinigung und Aufkonzentrierung verwendet wird. Als weitere Nukleotide im Sinne der vorliegenden Erfindung wird die Summe der vorhandenen Adenosinnukleotide, wie beispielsweise AMP (5'- Adenosinmonophosphat), ADP (5'-Adenosindiphosphat), ATP (5'- Adenosintriphosphat), PAP (3',5'-Adanosindiphosphat) und APS (Adenosin-5'- phosphosulfat) verstanden. Insbesondere liegt der Anteil des Adenosinnukleotids PAP - bezogen auf die Menge an PAPS - unter 1 Gew.-%, bevorzugt unter 0,5 Gew.-%.

Im Gegensatz zu den Produkten des Standes der Technik ist es mit dem erfindungsgemäßen PAPS nun erheblich besser möglich, die Enzymaktivität von Sulfotransferasen auch bei geringen Enzymaktivitäten zu bestimmen. Des weiteren lässt sich das erfindungsgemäße PAPS ohne Einschränkungen für die präparative enzymatische Sulfonierung einsetzen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur Aufreinigung und/oder Aufkonzentrierung des Cofaktors PAPS unter Verwendung eines Acrylamid Hydrogels. Überraschenderweise wurde gefunden, dass es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich ist, PAPS zu erhalten, welches einen Anteil an weiteren Nucleotiden von unter 2 Gew.-% bezogen auf die Menge an PAPS enthält. Dies ist mit dem von Shailubhai et al. in Analytical Biochemistry, 1996, 243, 165-170 beschriebenen Verfahren nicht möglich. Des weiteren ist mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eine drastische Verringerung der Elutionszeit möglich, die Elutionszeit verringert sich von Stunden in den Bereich von Minuten. Aufgrund der drastisch verkürzten Elutionszeit bestehen wenig Einschränkungen in der Wahl des Elutionsmittels. Demzufolge kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren das Elutionsmittel so gewählt werden, dass es in der späteren Anwendung des PAPS nicht stört (biokompatibel) und somit eine Abtrennung nach der Auftrennung und/oder Aufkonzentrierung entfällt. Im Gegensatz dazu muss bei der Methode des Standes der Technik der eingesetzte Bicarbonatpuffers zwingend in einem Folgeschritt abgetrennt werden. Weiterhirt ist das Verfahren nicht auf eine Gradientenelution beschränkt, sondern kann isokratisch durchgeführt werden. Vorteilhaft ist weiterhin die Elutionsreihenfolge: PAPS eluiert nach den weiteren Nukleotiden und kann so einfach abgetrennt werden.

Als Ausgangsprodukte für die erfindungsgemäße Aufreinigung und/oder Aufkonzentrierung eignen sich alle PAPS Lösungen, die nach bekannten Methoden des Standes dar Technik erhalten werden können. Beispielhaft seien hier die chemische Synthese (wie im US-Patent US 3,268,416 beschrieben) oder die enzymatische Synthese (wie von Shailubhai et al. in Analytical Biochemistry, 1996, 243, 165-170 beschrieben) genannt. Je nach Herstellungsverfahren und Lagerung erhalten die zur Aufreinigung und/oder Aufkonzentrierung eingesetzten Ausgangsprodukte Edukte, Zwischenprodukte sowie Zerfallsprodukte. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich diese Lösungen - weitgehend unabhängig von ihrem Ausgangsverhältnis zwischen PAPS und den weiteten Nukleotiden - aufzureinigen bzw. aufzukonzentrieren.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird zur selektiven Abtrennung der weiteren Nukleotide eine Ionenaustauschchromatographie durchgeführt. Erfindungswesentlich ist hierbei der Einsatz eines Acrylamidhydrogel mit quarternären Aminfunktionen, welches auf einem porösen Trägermaterial aufgebracht ist. Diese chromatographischen stationären Phasen sind druckstabil und erlauben hohe Fließgeschwindigkeiten. Diese Acrylamidhydrogele sind kommerziell erhältlich, beispielsweise unter dem Handelsnamen Q/S Ceramic Hyper D® 10/20 der Fa. Biosepra. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird als Acrylamidhydrogel mit quarternären Aminfunktionen, welches auf einem porösen Trägermaterial aufgebracht ist, Q Ceramic Hyper D® 10 (Fa. Biosepra Inc. USA) eingesetzt. Aufgrund der hohen Affinität des PAPS zu diesem Material ist die Beladungskapazität für PAPS sehr hoch, selbst in Gegenwart eines hohen Oberschusses an weiteren Nucleotiden. Dies führt zu einer hohen Trennungskapazität und zur Herstellung von PAPS, welches einen Anteil an weiteren Nucleotiden von unter 2 Gew.-%, inbesondere unter 1 Gew.-% bezogen auf die Menge an PAPS enthält.

Als Elutionsmittel eignen sich beispielsweise Wässerige Phosphatpuffer (z. B. Natriumphosphat, Natriumhydrogenphosphat, Kaliumphosphat, Kaliumhydrogen phosphat) sowie wässerige Lösungen von Natriumchlorid, Kaliumchlorid oder Ammoniumacetat. Weiterhin einsetzbar sind Carbonatpuffer sowie Citratpuffer. Die vorgenannten Elutionsmittel können in Mischungen untereinander eingesetzt werden. Die Elutionsmittel können sowohl als wässerige Lösungen wie auch als wässerig- alkoholische Lösungen eingesetzt werden, bespielsweise als wässerig- methanolische Lösungen.

Die Elutionsmittel haben üblicherweise einen pH-Wert im Bereich von pH 3 bis pH 8, insbesondere von pH 4 bis pH 7, bevorzugt pH 6,8. Die Konzentration der Elutionsmittel beträgt in der Regel 0,05 bis 3 M, insbesondere 0,3 bis 1 M.

Bevorzugt ist der Einsatz einer 1,0 molare Kaliumphosphat Lösung mit pH 6,8 als Elutionsmittel.

Elutionszeiten betragen in der Regel 10 bis 60 min, die Elution wird in der Regel bei Raumtemperatur (20 bis 25°C) durchgeführt.

Die Detektion kann nach dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen, geeignet ist beispielsweise eins Detektion mittels eines UV-Detektors bei 240 nm oder 254 nm.

Die Elution kann sowohl isokratisch eis euch als Gradientenelution durchgeführt werden.

Die vorliegende Erfindungs umfasst auch die Erkenntnis, dass das erfindungsgemäßen Verfahren auch zweistufig durchgeführt werden kann: hierzu wird ein einem ersten Schritt eine Verreinigung mit einem billigen Elutionsmittel durchgeführt, und in einer zweiten Stufe die eigentliche Aufreinigung/Aufkonzentrierung in dem Puffer, der für den weiteren Einsatz gewünscht ist, durchgeführt. Prinzipiell sind beide Schritte sowohl isokratisch als auch als Gradientenelution durchführbar. Besonders vorteilhaft ist es, die Vorreinigung isokratisch durchzuführen und die Aufreinigung/Aufkonzentrierung mittels Gradientenelution durchzuführen.

Beispiele

Bei dem in den Beispielen verwendeten Wasser handelt es sich immer um destilliertes Wasser.

Beispiel 1 Isokratische Reinigung

Eine präparative Säule (120 × 25 mm, 20 µm) gefüllt mit Ceramic Q Hyper D® (Fa. Biosepra Inc., Marlborough, USA) wurde mit einer enzymatisch hergestellte PAPS- Lösung mit einer Konzentration von ca. 0,5 mmol/l PAPS und einer Konzentration an weiteren Mononukleotiden (ATP: 5'Adenosintriphosphat; ADP: 5'Adenosindiphosphat AMP: 5'Adenosinmonophosphat; PAP: 3',5'Adenosin diphosphat) von ca. 5 ml/min beladen. Eluiert wurde mit einer 1 molaren, wässerigen Kaliumphosphat-Lösung (pH 6,8) bei einer Flußrate von 25 ml/min und einem Druck von 10 bar. Die Detektion erfolgte mit einem UV Detektor bei 240 nm. Die abzutrennenden Mononukleotide ADP, AMP, ATP und PAP eluierten in den ersten 5 Minuten, die Elution des PAPS begann nach 7 Minuten.

Beispiel 2 Isokratische Reinigung

Eine präparative Säule (120 × 25 mm, 20 µm) gefüllt mit Ceramic Q Hyper D® (Fa. Biosepra Inc., Marlborough, USA) wurde mit einer enzymatisch hergestellte PAPS- Lösung mit einer Konzentration von ca. 0,5 mol/l PAPS und einer Konzentration an weiteren Mononukleotiden (ATP 5'Adenosintriphosphat; ADP: 5'Adenosindiphosphat AMP: 5'Adenosinmonophosphat, PAP: 3',5'Adenosin diphosphat) von ca. 5 mmol/l beladen. Eluiert wurde mit einer 0,5 molaren, wässerigen Kaliumphosphat-Lösung (pH 6,8) bei einer Flußrate von 25 ml/min und einem Druck von 10 bar. Die Detektion erfolgte mit einem UV Detektor bei 240 nm. Die abzutrennenden Mononukleotide ADP, AMP, ATP und PAP eluierten in den ersten 7 Minuten, die Elution des PAPS begann nach 14 Minuten.

Beispiel 3 Isokratische Reinigung

Eine präparative Säule (120 × 25 mm, 20 µm) gefüllt mit Ceramic Q Hyper D® (Fa. Biosepra Inc., Marlborough, USA) wurde mit einer enzymatisch hergestellte PAPS- Lösung mit einer Konzentration von ca. 0,5 mmol/l PAPS und einer Konzentration an weiteren Mononukleotiden (ATP: 5'Adenosintriphosphat; ADP: 5'Adensindiphosphat AMP: 5'Adenosinmonophosphat; PAP: 3',5'Adenosin diphosphat) von ca. 5 mmol/l beladen. Eluiert wurde mit einer 1,0 molaren Ammoniumacetat Lösung in einer 30 Vol.%igen wässerigen methanolischen Lösung bei einer Flußrate von 35 ml/min und einem Druck von 15 bar. Die Detektion erfolgte mit einem UV Detektor bei 240 nm. Die abzutrennenden Mononukleotide ADP, AMP, ATP und PAP eluierten in den ersten 6 Minuten, die Elution des PAPS begann nach 7 Minuten.

Beispiel 4 (Vor)Reingung mittels Gradientenelution

Eins enzymatisch hergestellte PAPS-Lösung mit einer Konzentration von ca. 0,5 mmol/l PAPS und einer Konzentration an weiteren Mononukleotiden (ATP: 5' Adenosintriphosphat; ADP: 5'Adenosindiphosphat AMP: 5'Adenosinmonophosphat; PAP: 3',5'Adenosindiphosphat) von ca. 5 mmol/l wurde mit Wasser verdünnt bis zu einer Ionenstärke, die der einer wässerigen Kaliumphosphatlösung einer Konzentration von 0,4 mol/l entspricht. Diese Lösung wurde auf eine präparative Säule (120 × 25 mm, 20 µm) gefüllt mit Ceramic Q Hyper D® (Fa. Biosepra Inc, Marlborough, USA) gegeben. Danach wurde die Säule mit einer 5 bis 10 fach Menge des Säulenvolumens an Wasser gespült. Anschließend wurde mit einer wässerigen 1,0 molaren Kaliumphosphat-Lösung (pH 6,8) bei einer Flußrate von 25 ml/min und einem Druck von 10 bar eluiert. Die Detektion erfolgte mit einem UV Detektor bei 254 nm. PAPS eluierte nach 15 Minuten.

Beispiel 5 Aufkonzentrierung mittels Gradientenelution

Das aus Beispiel 1 aufgereinigte Produk wird soweit mit Wasser verdünnt, daß die Konzentration der wässerigen Kaliumphosphatlösung maximal 0,3 mmol/l betragt. Diese Lösung wird auf eine präparative Säule (120 × 25 mm, 20 µm) gefüllt mit Ceramic Q Hyper D® (Fa. Biosepra Inc., Marlborough, USA) gegeben. Danach wurde die Säule mit einer 5 bis 10 fach Menge des Säulenvolumens an Wasser gespült. Danach wurde einer 1 molaren, wässerigen Kaliumphosphat-Lösung (pH 6,8) bei einer Flußrate von 25 ml/min und einem Druck von 10 bar eluiert. Die Detektion erfolgte mit einem UV Detektor bei 240 nm. Die Elution des PAPS begann nach 15 Minuten.

Beispiel 6 Aufkonzentrierung mittels Gradientenelution

Das aus Beispiel 2 aufgereinigte Produkte wird soweit mit Wasser verdünnt, daß die Konzentration der wässerigen Kaliumphosphatlösung maximal 0,3 mmol/l beträgt. Diese Lösung wird auf eine präparative Säule (120 × 25 mm, 20 µm) gefüllt mit Ceramic Q Hyper D® (Fa. Biosepra Inc., Marlborough, USA) gegeben. Danach wurde die Säule mit einer 5 bis 10 fach Menge das Säulenvolumens an Wasser gespült. Danach wurde einer 0,5 molaren, wässerigen Kaliumphosphat-Lösung (pH 6,8) bei einer Flußrate von 25 ml/min und einem Druck von 10 bar eluiert. Die Detektion erfolgte mit ein UV Detektor bei 240 nm. Die Elutions des PAPS begann nach 15 Minuten.

Claims

1. Verfahren zur Aufreinigung und/oder Aufkonzentrierung von 3'Phosphoadenosin-5'- phosphosulfat mittels Ionenaustauschromatographie, dadurch gekennzeichnet, dass die Ionenaustauschchromatographie mit einem Acrylamidhydrogel mit quarternären Aminfunktionen durchgeführt wird, welches auf einem porösen Trägermaterial aufgebracht ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenzeichnet, dass als Trägermaterial Q Ceramic Hyper D® eingesetzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Ionenaustauschchromatographie isokratisch oder mittels Gradientenelution durchführt wird.

4. Verwendung eines Acrylamidhydrogel mit quaternären Aminfunktionen, welches auf einem porösen Trägermaterial aufgebracht ißt, zur Aufreinigung und/oder Aufkonzentrierung von 3'Phosphoadenosin-5'-phosphosulfat.