DE3546374A1 - Verfahren zur sequenzanalyse von dna - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Bestimmung der Sequenzanalyse von DNA.

Zur Bestimmung der Sequenzanalyse von DNA sind verschiedene Methoden bekannt. Die meisten Verfahren zur Bestimmung der DNA- Sequenz basieren entweder auf einem chemischen Abbau durch basenspezifische chemische Reaktionen (vgl. . M. Maxam und W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977) 560 - 564), oder auf enzymatischen Methoden der Sequenzbestimmung auf der Grundlage der durch DNA-Polymerase katalysierten Verlängerung von DNA-Ketten (vgl. F. Sanger und A. R. Coulson, J. Mol. Biol. 94 (1975) 441 - 448; F. Sanger et al, Nature 265 (1977), 687 - 695). In einer weiteren enzymatischen DNA-Sequenzierungsmethode, der sog. "Dideoxy-Methode", werden als spezifische Terminatoren der DNA-Kettenverlängerung 2′, 3′-Didesoxynucleosid- triphosphate, z. B. ddATP, eingesetzt (F. Sanger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977) 5463 - 5467; vgl. zusammenfassend auch R. Knippers, Molekulare Genetik, 4. Auflage, Thieme-Verlag Stuttgart-New York 1985, S. 402 - 407).

Die enzymatischen Methoden sind insbesondere zur Bestimmung langer DNA-Sequenzen geeignet, weil für jede einzelne Sequenzierungsreaktion nur ein geringer Arbeitsaufwand erforderlich ist. Nachteile der enzymatischen Methoden sind aber eine unbefriedigende Genauigkeit der Bestimmung, sowie das Auftreten von Artefakten, die von der Tendenz der verwendeten Enzyme herrühren, die Reaktion in die Richtung eigentümlicher Sequenzen zu katalysieren, oder von ihrer Sensibilität gegenüber Verunreinigungen der Template-DNA, z. B. durch Polyäthylenglykol (PEG), was, insbesondere in G-C-reichen Sequenzabschnitten, zu falschen Stops ("wrong stops") in allen vier bei bei der Auftrennung erhaltenen Bandenspuren führt oder einen störenden Hintergrund verursacht.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein neues Verfahren zur Sequenzanalyse von DNA durch matrizengesteuerte Polymerisation von dNTP mit einer DNA-Polymerase in Gegenwart eines Terminators, dadurch gekennzeichnet, daß man die Polymerisation in Gegenwart von dNTPαS durchführt, den erhaltenen DNA-Strang mit Exonuclease behandelt und die erhaltenen, durch den Phosphorthioatrest terminierten Fragmente auftrennt. Bevorzugt wird Exonuclease III verwendet, aber auch andere Exonucleasen wie DNA-Polymerase I sind brauchbar.

Zweckmäßige Ausführungsform dieses Verfahrens sind Gegenstand der Ansprüche 2 bis 7.

Als DNA-Polymerase können die üblicherweise für matrizengesteuerte Polymerisationen verwendeten DNA-Polymerasen eingesetzt werden, wie z. B. die DNA-abhängigen DNA-Polymerasen I, II und III aus Bakterienzellen, z. B. aus E. coli-Zellen oder virale Reversed Transcriptase. Vorzugsweise wird das Klenow-Fragment der Polymerase I aus E. coli eingesetzt.

Die Verfahrensdurchführung, die Auftrennung der durch den Nucleosidphosphorothioatrest terminierten Fragmente (Teilstränge) und die Sequenzermittlung kann auf eine bei derartigen Sequenzierungsmethoden, z. B. bei der Didesoxymethode (F. Sanger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977) 5463-5467) übliche Weise erfolgen. Ein Sequenzierungsansatz besteht z. B. aus dem zu analysierenden DNA-Strang als Matrizenstrang, einem kurzen Stück markierter DNA (dem verlängerten Starter oder Primer, der mit dem einen Ende des Stranges komplementär ist), der DNA-Polymerase und den vier dNTPαS und ihren entsprechenden dNTP, wobei die Menge der dNTPαS in einem ganz bestimmten Verhältnis zur entsprechenden Menge von dNTP gewählt wird. Der Ansatz wird in vier aliquoten Teilen durchgeführt, von dem jeder eines der vier dNTPαS enthält. Das Verhältnis von dNTPαS/entsprechendes dNTP beträgt vorzugsweise 1 zu 2 bis 4.

Die Zugabe der Exonuclease III erfolgt zu den vier aliquoten Teilen des Reaktionsansatzes, eine bestimmte Zeit nach der Zugabe der dNTP/dNTPαS-Mischung und nach Hitzedenaturierung des Klenowfragmentes. Die Auftrennung der markierten Teilstränge erfolgt vorzugsweise mittels Gelelektrophorese, z. B. an einem Acrylamidgel, und die erhaltenen Bandspuren können autoradiographisch sichtbar gemacht werden; an Hand des erhaltenen Musters läßt sich dann die Sequenz der DNA direkt bestimmen.

Die Markierung erfolgt vorzugsweise durch eine Fluoreszenzmarkierung, und insbesondere durch eine radioaktive Markierung. Die radioaktive Markierung der neu synthetisierten DNA kann in einem Markierungsschritt erfolgen, der der eigentlichen Verlängerungsreaktion vorausgeht, z. B. durch mit ³⁵S markierte dATPαS und dCTPαS in einer Menge, die eine Markierung der ersten 20 bis 25 Positionen ermöglicht. Obwohl ein solcher der eigentlichen Kettenverlängerungsreaktion vorausgehender Schritt nicht notwendig ist, wenn alle vier dNTPαS in markierter Form eingesetzt werden, kann es zweckmäßig sein, nach dieser Methode der vorausgehenden Markierung zu arbeiten, weil dabei im wesentlichen nach den gleichen Verfahrensschritten wie beim Dideoxyverfahren gearbeitet werden kann. Anstelle der ³⁵S-Markierung kann die Markierung auch, wie z. B. bei der Sanger- Methode, mit ³²P erfolgen.

Synthese und Eigenschaften der dNTPαS (Deoxynucleotid-α-thio- triphosphate) sind z. B. aus F. Eckstein und R. S. Goody, Biochemistry 15 (1976), 1685 - 1691, bekannt; es war auch bekannt, daß S_P-Deoxynucleotid-α-thiotriphosphate gute Substrate für DNA-Polymerasen sind (vgl. H. P. Vosberg und F. Eckstein, Biochemistry 16, (1977) 3633-3640; R. S. Brody und P. A. Frey, Biochemistry 20 (1981), 1245-1252).

Es wurde nun gefunden, daß es aufgrund des hohen Widerstandes der Thiophosphat-Diesterbindung gegenüber einer nucleolytischen Spaltung durch Exonucleasen möglich ist, durch partielle Verdauung Fragmente zu erhalten, die spezifisch durch den Nucleosidphosphorothioatrest terminiert sind. Auf diese Weise ist es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich, die bei den bisher bekannten Sequenzierungsverfahren auftretenden Nachteile zu vermeiden; mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird somit ein Verfahren bereitgestellt, das eine rasche, einfache und genaue Sequenzanalyse von DNA ermöglicht.

Die Fig. 1 veranschaulicht den Widerstand der Thiophosphat- Diesterbindung gegenüber der Spaltung durch Exonuclease III. dAMPαS-enthaltende DNA wurde einer Behandlung mit Exonuclease III bei drei verschiedenen Verhältnissen von dATPαS/dATP unterworfen. Es bedeuten a): nur dATP S; b) : dATP/dATPαS = 4/1; c): dATP/dATPαS = 10/1. Die einzelnen Spuren in den drei Blöcken stellen eine verschiedene Einwirkungsdauer der Exonuclease III dar (von links nach rechts 0,1, 2, 4, 6, 10, 20 und 30 Minuten). Im Block b) fehlt die zweiminütige Dauer.

Fig. 1 zeigt die Abhängigkeit des Musters der Degradationsprodukte von DNA mit drei verschiedenen Substitutionsgraden (dAMPS für dAMP), die während verschiedener Zeiten einer Digestion unterworfen wurden. Es kann festgestellt werden, daß eine vollständige Substitution von dATP durch dATPαS oft zu verringerten Intensitäten der niedrigen Bänder in Multipletts führt, was einen hohen, aber nicht vollständigen Widerstand der Thiophosphat-Bindung gegenüber der Exonuclease III anzeigt. Dieses Problem kann durch Verwendung von Mischungen der Phosphorthioate mit ihren entsprechenden Deoxytriphosphaten gelöst werden. Aufgrund der verringerten Häufigkeit einer Teminierung werden die Bandintensitäten im Durchschnitt bei einem hohen Verhältnis von dATP zu dATPαS verringert. Vorzugsweise wird deshalb ein Verhältnis von ca. 2 bis 4/1 für alle vier Nucleotide verwendet, mit dem gute Ergebnisse erhalten werden. In allen Fällen stimmen die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Ergebnisse mit den für die bekannte Sequenz, die vorher mit der Dideoxy- Methode bestimmt wurde, erwarteten Ergebnissen überein.

Für einen Vergleich des erfindungsgemäßen Verfahrens mit den Dideoxy-Methoden wurden zusätzlich zu einigen wahllos ausgewählten Matrizen einige Klone ausgewählt, die in Dideoxy- Sequenzierungsverfahren verschiedene Artefakten zeigten, und mit beiden Methoden die Sequenz ermittelt. Einige der erhaltenen Ergebnisse zeigen die Fig. 2 bis 4.

Die Fig. 2 zeigt einen Vergleich der Dideoxy-Methode (erste vier Spuren von links; TCGA) mit dem erfindungsgemäßen Verfahren (zweite vier Spuren; TCGA), wobei den Bandspuren (Leitern) die gleiche Matrize (template) zugrunde liegt. Die klar lesbaren Poly-T-G-Region zeigt, daß beide Methoden funktionieren. Es ist aber auch zu erkennen, daß die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Leitern einen geringeren Hintergrund zeigen und deutlicher sind.

Die Fig. 3 zeigt das Beispiel für einen "wrong stop", der unter Verwendung des gleichen Klons nach der Dideoxy-Methode (a) erhalten wird, aber nicht nach dem erfindungsgemäßen Verfahren (b und c). Das Verhältnis dNTP/dNTPαS beträgt in b) = 1,5/1, in c) = 3/1.

Fig. 4 zeigt, daß das erfindungsgemäße Verfahren auch gut bei einem Matrizenpräparat verwendet werden kann, das für die Sequenzierung nach der Dideoxy-Methode ungeeignet ist. Die linken Spuren wurden nach der Dideoxy-Methode erhalten, die rechten nach dem erfindungsgemäßen Verfahren (TCGA).

Fig. 2 zeigt ein gesamtes Gelmuster aus einem Versuch, bei dem die Dideoxy-Methode und das erfindungsgemäße Verfahren mit dem gleichen Klon parallel durchgeführt wurden. An einzelnen Stellen zeigen die nach dem Dideoxy-Verfahren erhaltenen Leitern Unklarheiten, die in den nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Leitern fehlen. Der für Fig. 3 verwendete Klon wurde für einen Vergleich gewählt, weil er einige "wrong stops" in allen vier nach dem Dideoxy-Verfahren erhaltenen Bandenspuren (Leitern) zeigt. Auch hier wird nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wieder eine eindeutige Zuordnung dieser Stellen erhalten. Die DNA des für Fig. 4 verwendeten Klons ist für eine Sequenzierung nach dem Dideoxy-Verfahren ungeeignet, und zwar vermutlich wegen einer Verunreinigung mit PEG oder Bakterientrümmern. Das erfindungsgemäße Verfahren wird hingegen durch eine derartige Verunreinigung wesentlich weniger beeinträchtigt.

Die vorstehend besprochenen Ergebnisse bestätigen, daß das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung von dNTPαS in Verbindung mit dem Exonuclease III-Abbau der modifizierten DNA eine zuverlässige Methode der Sequenzermittlung darstellt. Ein großer Vorteil gegenüber der Dideoxy-Methode liegt insbesondere bei Positionen, die mit der Dideoxy-Methode in allen vier Spuren "wrong stops" hervorrufen, d. h. Stops, die an einer bestimmten Stelle der Sequenz auftreten, aber nicht durch Kettenterminatoren hervorgerufen werden. Der Nachteil, daß beim erfindungsgemäßen Verfahren manchmal schwache Banden auftreten, kann leicht durch eine längere Kontaktzeit (Exponierung) des Gels mit dem Röntgenfilm behoben werden, oder durch eine stärkere Markierung, z. B. durch Markierung aller vier dNTPαS. In Fällen, in denen hinsichtlich der Sequenz noch restliche Unklarheiten verbleiben sollten, könnten diese leicht durch Bestimmung der Sequenz des Komplementärstranges oder durch Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens in Kombination mit dem Dideoxy-Verfahren behoben werden.

Für eine weit verbreitete Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es wünschenswert, die Herstellung der unmarkierten und markierten dNTPαS nach den bekannten Verfahren (vgl. F. Eckstein und R. S. Goody, Biochemistry 15 (1976) 1685 - 1691) im Hinblick auf Zeitaufwand, Durchführung und Kosten zu verbessern.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist deshalb auch ein neues Verfahren zur Herstellung von NTPαS oder dNTPαS (N = Ribo- oder Desoxyribonucleosid), das dadurch gekennzeichnet ist, daß man das entsprechende Nucleosid mit Thiophosphorylchlorid (PSCl₃) umsetzt, das erhaltene Nucleosidphosphorthioatdichloridat mit 1 Äquivalent Wasser zum entsprechenden Monochloridat umsetzt, und das so erhaltene Monochloridat mit Pyrophosphorsäure oder einem Pyrophosphat umsetzt.

Die Umsetzung des Monochloridats mit der Pyrophosphorsäure oder dem Pyrophosphat kann dabei ohne vorhergehende Zwischenreinigung des Monochloridats erfolgen. Die Umsetzung mit PSCl₃ und die Reinigung des Endproduktes (Gemisch der Diastereomeren) kann auf an sich bekannten Weise erfolgen (vgl. z. B. F. Eckstein und R. S. Goody, Biochemistry 15 (1976) 1685 - 1691).

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Verfahren bereitgestellt, das die Herstellung von NTPαS oder dNTPαS auf einfache, rasche und kostengünstige Weise ermöglicht. Gegenüber dem gängigen bekannten Verfahren nach F. Eckstein und R. S. Goody weist es insbesondere die folgenden Vorteile auf: Alle Verfahrensschritte können in einem einzigen Kolben durchgeführt werden. Es ist nicht notwendig, das nach dem bekannten Verfahren durch einen Überschuß an Wasser erhaltene NMPS über DEAE-Zellulose zu reinigen, was allein schon für diesen Schritt eine Zeitdauer von zwei Tagen verursachte. Nach dem bekannten Verfahren mußte außerdem das AMPS mit Hilfe einer Pyridinium-Ionenaustauschersäule in das Pyridiniumsalz übergeführt, danach getrocknet und mit Tri-n-octylamin in Lösung gebracht werden. Vor der Reaktion mit dem Pyrophosphat mußte das AMPS außerdem noch mit Diphenylphosphorochloridat aktiviert werden. Das gesamte Verfahren dauerte deshalb mehr als eine Woche. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann NTPαS in zwei Tagen hergestellt werden. Die Ausbeute beträgt ca. 20%, bezogen auf das Nucleosid.

Obwohl es für das erfindungsgemäße Verfahren der Sequenzanalyse von DNA nicht erforderlich ist, das z. B. nach dem vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Diastereoisomerengemisch in die beiden reinen Diastereoisomeren aufzutrennen, ist eine solche Trennung für andere Zwecke erforderlich. Eine Auftrennung des Diastereoisomerengemisches kann durch enzymatische Methoden erfolgen. Diese Methoden, die zur Auftrennung von Adenosin enthaltenden Nucleotiden, z. B. von ATPαS oder ATPβS (vgl. F. Eckstein und R. S. Goody, Biochemistry 15 (1976) 1685 bis 1691), entwickelt wurden, lassen sich aber nicht ohne weiteres auf andere Basen enthaltende Nucleotide oder auf Desoxynucleotide übertragen. Zur Trennung der Isomeren von GTPαS ist auch eine chromatographische Methode bekannt, die aber sehr langwierig ist und keine vollständige Trennung ermöglicht (vgl. B. A. Connolly et al, Biochemistry 21 (1982) 1983 bis 1989).

Es wurde nun ein Verfahren zur Diastereoisomeren-Trennung gefunden, das die vorstehend genannten Nachteile vermeidet und in kurzer Zeit eine vollständige Trennung der Diastereoisomeren aller α-Thiotri- und -diphosphate der natürlich vorkommenden Ribonucleotide oder Desoxyribonucleoside ermöglicht.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist deshalb auch ein Verfahren zur Auftrennung eines Gemisches der Diastereoisomeren von α-Thiotri- und -diphosphaten von Ribonucleosiden oder Desoxyribonucleosiden (NTPαS, dNTPαS, NDPαS oder dNDPαS) in die reinen Diastereoisomeren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man das Diastereoisomerengemisch durch Mittelhochdruckflüssigchromatographie (Mittel-HPCL) an Reversed-Phase- C₁₆-C₂₀-Kieselgel und isokratischer Elution mit Triäthylammoniumacetat (30 bis 200 mM, pH = 7 bis 8)/Acetonitril (3 bis 5%) trennt.

Die Mittelhochdruckflüssigchromatographie wird vorzugsweise bei einem Überdruck von 5 × 10⁵ bis 15 × 10⁵ Pa ( 5 bis 15 at) durchgeführt. Als Kieselgel verwendet man vorzugsweise ein solches mit einer Korngröße von 20 bis 45 µm und einer Porengröße von ca. 6 × 10^-3 µm.

Auf diese Weise lassen sich z. B. bei einer Säulengröße von ca. 40 × 3 cm (Flußgeschwindigkeit ca. 25 ml/min, Reversed- Phase-C₁₈-Kieselgel der Firma Organogen, Heidelberg) ca. 1 mMol des Diastereoisomerengemisches auftrennen.

Nach dem Verfahren wird das S_P-Diastereoisomere vor dem R_P- Diastereoisomeren eluiert. Die Reinheit der aufgetrennten Diastereoisomeren kann z. B. mittels HPLC an einer analypischen Säule (Reversed-Phase C₁₈-Kieselgel) überprüft werden, wobei die Elution isokratisch mit 2 bis 5% Acetonitril in Triäthylammoniumacetat oder mit einem Gradienten von 0 bis 10% Acetonitril erfolgen kann.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung näher, ohne sie darauf zu beschränken. Wenn nicht anders angegeben, beziehen sich Temperaturangaben auf die Celsius-Skala, und Prozent- und Mengenangaben auf Gewichtsprozent und Gewichtsteile.

Beispiele Beispiel 1

Die Deoxynucleosid-α-thio-triphosphate (Diastereomerengemisch) wurden nach F. Eckstein und R. S. Goody, Biochemistry 15 (1976) 1685 - 1691 oder nach dem Verfahren des nachfolgenden Beispiels 2 hergestellt. Sie wurden ohne Auftrennung in die Isomeren verwendet.

³⁵S-markiertes dATPαS und dCTPαS wurden von der Fa. New England Nuclear bezogen, das Klenow-Fragment der DNA Polymerase I wurde von Boehringer Mannheim bezogen, die Exonuclease III von New England Biolabs.

Zur Sequenzierung nach der Sanger-Methode geeignete einzelsträngige Matrizen-DNA wurde wie von Sanger et al, J. Mol Biol. 143 (1980) 161 - 178 beschrieben aus M13 Klonen, die Sequenzen aus dem t-Komplex der Maus trugen, hergestellt.

Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens:

• 1. Die Verlängerungsreaktion des Oligonucleotids (Universeller Sequenzprimer, New England Biolabs 17mer) wurde durch Inkubation der in der nachfolgenden Tabelle 1 angegebenen Mischung (1 Stunde bei 65°C in einer Eppendorf- Röhre, 0,7 ml) vorbereitet. Die zum Vergleich durchgeführten Sequenzierungen nach der Dideoxy-Methode wurden im wesentlichen wie von Sanger et al, J. Mol. Biol. 143 (1980) 161 - 178 beschrieben durchgeführt.
  Tabelle 1
• 2. Zu 10 µ der wie vorstehend beschriebenen inkubierten Mischung der Tabelle 1 wurden 3,5 µ der das Klenow-Fragment enthaltenden Markierungsmischung (Labelmixlösung) zugegeben und die erhaltene Lösung in einer Mikrotiter-Schale in vier gleiche Teile (Aliquots) von jeweils 3,0 µ geteilt.
• 3. Nach 10-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden je 2 µ der Thionucleosid-Deoxynucleosid-Mischung nach Tabelle 3 zugefügt und die Inkubation weitere 10 Minuten lang fortgesetzt.
• 4. Das Klenow-Enzym wurde inaktiviert, indem die Mikrotiter- Schale 3 Minuten lang in ein Wasserbad von 70°C gegeben wurde.
• 5. Exonuclease III (je 2 µ on 2,5 Einheiten/µ wurden zugefügt, und bei Raumtemperatur 30 Minuten lang inkubiert.
• 6. Die Verdauung wurde durch Zugabe von 3 µ einer Formamid/ Farbstoff-Mischung (99% Formamid/10 mM EDTA/0,1% Bromphenolblau) gestoppt.

Nach Denaturierung werden die Proben auf ein Puffergradienten- Gel aufgebracht, wobei Herstellung des Gels und Trennung im wesentlichen wie von M. D. Biggin et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983) 3963-3965 beschrieben erfolgten. Die Gele wurden dann einer Autoradiographie (Exponierzeit 24 Stunden, Kodak-Röntgenfilm XAR-5) unterzogen.

Tabelle 2

Tabelle 3

Beispiel 2

Herstellung von ATPαS aus Adenosin

Trockenes Adenosin (1 mM) wird durch Erhitzen unter Rückfluß in Triäthylphosphat (2,4 ml) unter Argon gelöst (ca. 4 Minuten Erhitzen). Nach Abkühlung in Eis (immer noch unter Argon) wird Lutedin (2,6-Dimethylpyridin) und PSCl₃ (187 µl) zupipettiert. Nach 45 Minuten bei 4°C wird einige Minuten am Rotationsverdampfer (Ölpumpenvakuum) einrotiert und mit Petroläther (20 ml) versetzt. Nach 10 Minuten wird abdekantiert und der Rückstand mit Dioxan (3 ml) und H₂O (1 mMol) versetzt.

Währenddessen werden Pyrophosphorsäure (5 mMol freie Säure) und Tri-n-butylamin (20 mMol) in wenig Methanol gelöst und am Rotationsverdampfer eingeengt. Der Rückstand wird durch mehrmaliges einrotieren mit trockenem Dimethylformamid (Ölpumpenvakuum) getrocknet und in wenig Dimethylformamid gelöst.

Nach 10 Minuten bei 0° wird das so erhaltene Tri-n-butylammoniumpyrophosphat zu dem Rückstand gegeben. Das Volumen wird durch Einrotieren auf ca. 50% reduziert. Das Gemisch wird sofort mit einigen kleinen Eisstücken versetzt und das Dimethylformamid wird am Rotationsverdampfer entfernt. Der Rückstand wird in Wasser gelöst, pH auf 8,0 mit KOH gebracht und mit Äther ausgeschüttelt. Die wäßrige Phase wird durch Säulenchromatographie über QAE-Sequadez A25 mit Triäthylammoniumbicarbonat pH 7,5 (Gradientenelution; 0,3 bis 0,5 M; 2 × 1500 ml) bei 4°C getrennt. Der letzte große Peak enthält ATPαS in ca. 20%iger Ausbeute (bezogen auf Adenosin).

Das erhaltene Diastereomerengemisch kann durch Mittelhochdruckflüssigkeitschromatographie an reversed phase C₁₈-Kieselgel (bezogen von Organogen, Heidelberg) (Überdruck: 5 × 10⁵ - 10⁵ Pa; Elutionsmittel: 50 mM Triäthylammoniumacetat (pH = 7,6)/Acetonitril (3 bis 5%; Flußgeschwindigkeit 20 bis 60 ml/min; Säule 40×3cm) in die reinen Isomeren getrennt werden.

Auf analoge Weise werden, ausgehend von anderen Ribo- und Desoxyribonucleosiden, die entsprechenden NTP S oder dNTP S erhalten. Wird Pyrophosphorsäure durch Orthophosphorsäure ersetzt, können Ribo- oder Desoxyribonucleosid- 5′-0-1-thiodiphosphate hergestellt werden.

Claims (9)

1. Verfahren zur Sequenzanalyse von DNA durch matrizengesteuerte Polymerisation von dNTP mit einer DNA- Polymerase in Gegenwart eines Terminators, dadurch gekennzeichnet, daß man die Polymerisation in Gegenwart von dNTPαS durchführt, den erhaltenen DNA-Strang mit Exonuclease III behandelt und die erhaltenen, durch Nukleosidphosphorothioatrest terminierten Fragmente auftrennt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gemisch einer Matrizen-DNA und eines markierten Primers mit einer DNA-Polymerase versetzt, das erhaltene Gemisch in vier gleiche Teile teilt, nach einer Inkubationszeit jedem der vier Teile eine Mischung der vier DNTPαS und ihrer entsprechenden vier dNTP zufügt, und nach einer weiteren Inkubationszeit und Inaktivierung der Polymerase Exonuclease III zufügt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis von dNTPαS / entsprechendes dNTP 1 zu 2 bis 4 beträgt.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Markierung mit ³⁵S oder ³²P vornimmt.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als DNA-Polymerase das Klenow-Fragment der Polymerase I aus E. coli einsetzt.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Auftrennung der durch die Nukleotidphosphorothioatreste terminierten Fragmente durch Gelelektrophorese vornimmt und die erhaltenen Banden durch Autoradiographie sichtbar macht.

7. Verfahren zur Herstellung von NTPαS oder dNTPαS, dadurch gekennzeichnet, daß man das entsprechende Nucleosid mit Thiophosphorylchlorid umsetzt, das erhaltene Nucleosid-Phosphorothioatdichloridat mit einem Äquivalent Wasser zum entsprechenden Monochloridat umsetzt, und das so erhaltene Monochloridat mit Pyrophosphorsäure oder einem Pyrophosphat umsetzt.

8. Verfahren zur Trennung eines Gemisches der Diastereoisomeren von α-Thiotri- und -diphosphaten von Ribonucleosiden oder Desoxyribonucleosiden in die reinen Diastereoisomeren, dadurch gekennzeichnet, daß man das Diastereoisomerengemisch durch Mittelhochdruckflüssigkeitschromatographie an Reversed-Phase C₁₈-Kieselgel und isokratischer Elution mit Triäthylammoniumacetat (50 mM, pH = 7,6)/Acetonitril (3 bis 5%) trennt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mittelhochdruckflüssigkeitschromatographie bei einem Überdruck von 5 × 10⁵ bis 15 × 10⁵ Pa durchführt.