-
Allgemein betrifft das Gebiet der
vorliegenden Erfindung stabilisierte Präparate von markierten Nucleosidtriphosphaten.
Speziell betrifft das Gebiet der vorliegenden Erfindung markierte
Nucleosidtriphosphate, die in einem Puffer mit einem Gehalt an Citrat,
Isocitrat, EGTA, EDTA und/oder CDTA gelagert werden.
-
Die DNA-Sequenzierung wird im allgemeinen
gemäß dem Verfahren
von Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 74 (1977), S.
5463–5467)
durchgeführt.
Das Verfahren umfasst die enzymatische in vitro-Synthese von einzelsträngiger DNA,
ausgehend von einer einzelsträngigen
oder doppelsträngigen DNA-Matrize.
Bei der ursprünglichen
Ausführungsform
des Sequenzierungsverfahrens wurde zunächst ein Primer, üblicherweise
ein synthetisches Oligonucleotid mit einer Länge von 15 bis 30 Basen einem
Annealing mit seiner komplementären
Sequenz an der Matrize der zu sequenzierenden einzelsträngigen DNA
unterzogen.
-
Das 3'-Ende dieses Primers wurde durch das
Klenow-Fragment von E. coli-DNA-Polymerase I in Gegenwart von 2'-Desoxynucleosid-5'-triphosphaten (dNTPs), von denen eines
eine radioaktive Markierung enthielt, verlängert. Vier separate Sequenzierungsreaktionen
wurden durchgeführt,
wobei jedes gepufferte Reaktionsgemisch sämtliche vier dNTPs (2'-Desoxyadenosin-5'-triphosphat (dATP),
2'-Desoxycytidin-5'-triphosphat (dCTP), 2'-Desoxyguanosin-5'-triphosphat (dGTP)
und 2'-Desoxythymidin-5'-triphosphat (dTTP))
und eine geringe Menge an einem spezifischen 2',3'-Didesoxynucleosid-5'-triphosphat-Kettenterminationsmittel
(entweder ddATP, ddCTP, ddGTP oder ddTTP; oder allgemein ddNTP)
enthielt. Durch Variieren des Verhältnisses des spezifischen Kettenterminations-ddNTP
zum dNTP-Analogen bei einer bestimmten Umsetzung erzeugte die Polymerase
eine Population von Fragmenten, bei denen eine spezifische ddNTP
jede mögliche
Position entlang der DNA-Matrize, wo die entsprechende dNTP eingebaut
worden wäre,
ersetzte. Nachdem die einstufige Markierung und die Terminationsstufe
beendet worden waren, wurde ein Überschuss
sämtlicher
vier dNTPs zu jedem Reaktionsgemisch gegeben, um sämtliche,
nicht durch eine spezifische ddNTP terminierten Fragmente durch
Bildung von höhermolekularer
DNA zu "vertreiben". Die Produkte der
vier getrennten Reaktionen wurden sodann in benachbarten Bahnen
eines hochauflösenden,
denaturierenden Polyacrylamid-Gelsystems fraktioniert. Die getrennten
DNA-Fragmente wurden sichtbar gemacht, indem man einen Röntgenfilm
dem Gel aussetzte und anschließend
den Film entwickelte. Jede Bande des Autoradiogramms entsprach einer
spezifischen komplementären
Nucleotidbase in der Sequenz der DNA-Matrize in der Richtung 5' (unteres Ende des Autoradiogramms)
nach 3' (oberes
Ende des Autoradiogramms) vom Primer.
-
Im Jahre 1987 beschrieben Tabor und
Richardson (S. Tabor und C. C. Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci.
(USA), Bd. 84 (1987), S. 4767–4771)
eine Modifikation des grundlegenden Sanger-Verfahrens zur Verwendung
mit T7-DNA-Polymerase, wobei die Markierungsstufe von der Terminationsstufe
abgetrennt wurde. T7-DNA-Polymerase und eine limitierende Menge
sämtlicher
vier dNTPs, von denen eines radioaktiv markiert war, wurden zu einer
Anlagerung von Matrize und Primer gegeben. Während einer kurzen Inkubationsstufe
bei einer suboptimalen Polymerisationstemperatur (Raumtemperatur)
addierte die Polymerase 1 bis mehrere 100 dNTPs an das 3'-Ende des Primers,
während
auch das radioaktiv markierte dNTP in sämtliche verlängerten Fragmente
eingebaut wurde. Am Ende der Markierungsstufe wurde das Gemisch
gleichmäßig in vier
getrennte Terminationsreaktionsgemische aufgeteilt. Jedes Terminationsreaktionsgemisch
enthielt nicht-limitierende Konzentrationen sämtlicher vier dNTPs und eine
spezifische ddNTP. Im Anschluss an eine zweite kurze Inkubationsstufe
bei der optimalen Polymerisationstemperatur für die Polymerase (37°C) wurde
der Nachweis der DNA-Fragmente gemäß dem Sanger-Verfahren durchgeführt. Das
endgültige
Verfahren bei beiden vorstehend beschriebenen Sequenzierungsverfahren
unter radioaktiver Markierung beinhaltete das Ablesen des Autoradiogramms
zur Bildung einer geordneten DNA-Sequenz und die anschließende manuelle
Eingabe dieser Sequenz in eine Datenbank für anschließende Manipulationen.
-
Murray (V. Murray, Nucl. Acids Res.,
Bd. 17 (1989), S. 8889) beschrieb ein neues Verfahren zur Sequenzbildung
aus DNA-Matrizen unter ddNTP-Termination von DNA-Fragmenten. Murray
bediente sich einer Abänderung
der Polymerase-Kettenreaktion (K. B. Mullis et al., Cold Spring
Harbor Symp. Quant. Biol., Bd. 51 (1986), S. 263–273; R. K. Saiki et al., Science,
Bd. 230 (1985), S. 1350–1354)
mit der Bezeichnung "Zyklus-Sequenzierung". Die "Zyklus-Sequenzierung" bedient sich einer
geringen Menge an Matrizen-DNA in Kombination mit einem Überschuss
an einem Primer, dNTPs, einem radioaktiv markierten dNTP, ddNTPs
und einer thermostabilen DNA-Polymerase. Das Gemisch unterliegt
20 bis 30 Zyklen eines thermischen Zyklus, wobei jeder Zyklus aus
einer Denaturierungsstufe, einer Anlagerungsstufe und einer Polymerisationsstufe
besteht. Die Denaturierungstemperaturen betragen typischerweise
94–95°C, während die
Anlagerungstemperaturen entsprechend der Schmelztemperatur zwischen
dem Primer und dessen komplementärer
Sequenz an der DNA-Matrize berechnet werden (üblicherweise zwischen 37 und
72°C). Die
Polymerisationstemperaturen werden in optimaler Weise für die bei
der Reaktion verwendete thermostabile Polymerase ausgewählt. Die
Bearbeitung der fertigen Zyklus-Sequenzierungsreaktionsgemische
umfasst wie bei den übrigen
vorerwähnten
Verfahren die Gelelektrophorese, die Dateneingabe und die Manipulation.
-
Seit Mitte der 1980er Jahre wurden
mit Hilfe von automatisierten DNA-Sequenzierungsgeräten die Stufen
der Gelelektrophorese, der Datengewinnung, der Sequenzbildung und
der Dateneingabe, die bei den vorstehend beschriebenen Verfahren
unter radioaktiver Markierung beteiligt sind, automatisiert. Diese
automatischen Geräte
bedienen sich bestimmter Farbstoffe, die bei Anregung mit einem
Laser Photonenenergie emittieren, wodurch die Notwendigkeit entfällt, sich
beim Nachweis der abgetrennten DNA-Fragmente der Radioaktivität zu bedienen.
Bei allen diesen Geräten
ist ein hochauflösendes
Polyacrylamidgel-System zur Auftrennung der markierten DNA-Fragmente
enthalten. Jedes Gerät
enthält
auch eine bestimmte Form eines Nachweissystems an einer Stelle entlang
der Länge
des Gels in der Nähe
von dessen Unterseite, um fluoreszierend markierte Fragmente bei
ihrer Wanderung während
der Elektrophorese nachzuweisen.
-
Die derzeitigen handelsüblichen
automatisierten Geräte
beruhen auf folgenden Nachweistechniken: (1) einzelne, fluoreszierend
markierte Primer oder dNTPs werden zusammen mit den Sequenzierungsreaktionsgemischen
in getrennten Bahnen eines Gels laufen gelassen und nachgewiesen
(W. Ansorge et al., Nucl. Acids Res., Bd. 15 (1987), S. 4593–4602);
(2) Primer, die mit vier getrennten Fluorophoren markiert sind (L. Smith
et al., Nucl. Acids Res., Bd. 13 (1985), S. 2399-2412; L. Smith et al. Nature, Bd. 321,
S. 674–679)
ermöglichen
die Durchführung
sämtlicher
vier Reaktionen und den Nachweis in einer einzigen Bahn an einem Gel;
oder (3) die gleiche Strategie wie in (2), mit der Ausnahme, dass
anstelle der markierten Primer vier verschiedene, fluoreszierend
markierte ddNTPs verwendet werden (J. Prober et al., Science, Bd.
238 (1987), S. 336–341).
-
Sequenzierungsreaktionsgemische zur
Verwendung mit dem Gerät
AUTOMATED LASER FLUORESCENT (ALF) DNA-SequencerR (Pharmacia
Biotech Inc.) enthalten eine einzige Fluorescein-Markierung, die entweder
an einen Primer oder an ein dNTP-Molekül gebunden ist, um Sequenzdaten
zu erzeugen und zu gewinnen. Wenn ein mit Fluorescein markierter
Primer bei den Reaktionen verwendet wird, lassen sich Sequenzen
unter Anwendung sowohl der T7-DNA-Polymerase-Sequenzierung als auch
der Zyklus-Sequenzierung gemäß dem vorstehend
beschriebenen Prinzip bilden. Beide Methoden lassen sich leicht
zur Anwendung mit einem markierten Primer anstelle eines radioaktiv
markierten dNTP anpassen. Ferner kann die T7-Reaktion geringfügig modifiziert
werden; um in einer einzigen Stufe sowohl eine Primerverlängerung
(Markierung) als auch eine Termination zu erzielen (H. Voss et al.,
Meth. Mol. & Cell.
Biol., Bd. 1 (1989), S. 155–159),
ohne dass eine Austreibungsstufe zur Entfernung von nicht-spezifisch
terminierten Fragmenten erforderlich ist. Ferner ist es möglich, die
Fragmente intern zu markieren, indem man entweder Fluorescein-l2-dUTP
(2'-Desoxyuridin-5'-triphosphat) oder
Fluorescein-15-dATP in Kombination mit einem unmarkierten Primer
verwendet (H. Voss et al., Meth. Mol. & Cell. Biol., Bd. 3 (1992), S. 30–34; bzw.
H. Voss et al., Meth. Mol. & Cell.
Biol., Bd. 3 (1992), S. 153–155).
Derzeit gibt es für
sämtliche
vorstehend erörterten
Sequenzierungsverfahren handelsübliche
Produkte zur Verwendung mit einem ALF-DNA-SequencerR-Gerät (Pharmacia
Biotech Inc.).
-
Das handelsübliche Markierungsgemisch mit
einem Gehalt an Fluorescein-15-dATP (1)
zur Verwendung mit T7-DNA-Polymerase (Fluore-dATP Labelling Mix;
Pharmacia Biotech Inc.) enthielt ein fluoreszierendes Abbauprodukt,
das in ernsthafter Weise die Datengewinnung in einer Länge von
40 bis 50 Basen in die Sequenz hinein beeinträchtigte (2). Dieses fluoreszierende Abbauprodukt
verschleierte regelmäßig die Sequenzdaten
von 5 bis 7 Basen und machte es erforderlich, dass der Bearbeiter
bei Anwendung dieses Sequenzierverfahrens zur Ermittlung der verloren
gegangenen Sequenz zusätzlich
Zeit, Arbeit und Geld investieren musste.
-
Es gibt verschiedene Punkte, die
historisch mit der Stabilität
und Reinheit von dNTPs im Zusammenhang stehen. Bei der Synthese
war die Reinheit des Ausgangsmaterials in Bezug auf den Oxidationszustand des
Zuckerrestes (d. h. verunreinigende Gemische von D-Ribose, 2'-Desoxy-D ribose und
2',3'-Didesoxy-D-ribose)
kritisch (P-L Analects, P-L Biochemicals, Inc., Bd. 9, Nr. 4 (1981),
S. 1 & 4). Ferner
erfolgte die Lagerung der synthetisierten und gereinigten dNTPs
in fester Form bei –76°C. Jedoch
ergab sich immer noch eine instabile Lagerung von lyophilisierten
dNTPs, wenn der Feststoff auf Raumtemperatur erwärmt wurde. Hochgereinigte lyophilisierte
dNTPs waren gegenüber
einer Disproportionierung empfindlich, wodurch 1–2% Diphosphat pro Tag entstanden,
wenn das Produkt bei Raumtemperatur gehalten wurde (P-L Analects,
P-L Biochemicals, Inc., Bd. 9, Nr. 4 (1981), S. 1 & 4), oder sich
eine Zersetzung im Bereich von 4–10% innerhalb von 6 Monaten bei
Lagerung in Lösung
bei –20°C ergab (Boehringer
Mannheim Corp., Katalog 1993, S. 72).
-
Man weiß nunmehr, dass dNTPs in Lösung gegenüber einer
Disproportionierung (eine konzentrationsabhängige Reaktion) nicht so empfindlich
sind, wie die lyophilisierten Formen und ferner bei längerer Lagerung bei –20°C stabiler
sind (> 99% Triphosphat
selbst nach 30-monatiger
Lagerung; Analects, Pharmacia Biotech Inc., Bd. 22, Nr. 1 (1993),
S. 8). Mit der Einführung
von nicht mit Isotopen markierten dNTPs in den frühen 1980er
Jahren stellte die Stabilität
immer noch kein Problem dar (P. R. Langer et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, Bd. 78 (1981), S. 6633–6637). Die Typen von Reaktionen
bei Verwendung dieser Verbindungen umfassten üblicherweise eine Reinigungs-
oder Waschstufe vor der Sichtbarmachung des Endprodukts (z. B. Hybridisierungen).
Erst mit der Verwendung von mit Fluorescein markierten dNTPs in
den frühen
1990er Jahren für die
automatisierte Sichtbarmachung von Sequenzierreaktionen wurde die
Stabilität
von dNTP-Lösungen
kritisch.
-
Auf dem Gebiet der DNA-Sequenzierung
ist ein Verfahren zur Stabilisierung von markierten Nucleosidtriphosphaten
erforderlich, so dass die Bildung von Abbauprodukten, die für den Nachweis
von Sequenzierungsfragmenten schädlich
sind, bei Lagerung in verdünnter
Lösung
verhindert wird.
-
EP-A-0 267 996 beschreibt Nucleotid-Derivate,
die bei der Synthese von modifizierten DNA-Sonden geeignet sind.
US-4 957 865 beschreibt ein Virus zum Klonieren oder zum Exprimieren
eines fremden Gens. Radioaktive Sonden werden bei den darin beschriebenen
Verfahren verwendet. US-5
168 051 beschreibt eine für
TGF-β kodierende
Nucleinsäure.
Beim Verfahren zum Isolieren eines TGF-β-Exons wird eine radioaktive Sonde
verwendet. US-5 241 060 beschreibt chemisch modifizierte oder markierte Nucleotide
und Polynucleotide, die nach dem Einbau in Nucleinsäurematerial
nachgewiesen werden können.
-
Wir haben ein Präparat von markierten Nucleosidtriphosphaten
aufgefunden, das eine überraschende Stabilität aufweist
und die Bildung der schädlichen
Abbauprodukte des Stands der Technik vermeidet. Eine Ausführungsform
des stabilisierten Präparats
eines markierten Nucleotids umfasst mindestens eine Verbindung mit
einer Mg2+-Assoziationskonstanten von 1 × 10-11 bis einschließlich 1 × 10-2,
wobei die Konzentration der Verbindung mindestens 5 mM beträgt. Ausgenommen
vom Umfang der Erfindung sind Präparate,
die folgendes umfassen: (i)(alpha-32)TTP,
(alpha-32P)dCTP
oder biotinyliertes 5-Formyl-2'-desoxyuridin-triphosphat als
markiertes Nucleotid und EDTA als die mindestens eine Verbindung;
oder (ii) 5-Hydroxymethyl-2'-desoxycytidin-5'-triphosphat als
markiertes Nucleotid und Phosphatpuffer als die mindestens eine
Verbindung.
-
Das markierte Nucleotid weist vorzugsweise
die Formel PM-SM-BASE-SIG auf, wobei PM einen Phosphatrest bedeutet,
SM einen Zuckerrest bedeutet, BASE einen Pyrimidin-, Purin- oder
7-Desazapurinrest bedeutet, PM in der 3'- oder 5'-Position von SM gebunden ist, wenn
es sich beim Nucleotid um ein Desoxyribonucleotid handelt, und in
der 2'-, 3'- oder 5'-Position gebunden
ist, wenn es sich beim Nucleotid um ein Ribonucleotid handelt, BASE
in der 1'-Position
von SM über
die N1-Position gebunden ist, wenn BASE
Pyrimidin bedeutet, oder über
die N9-Position gebunden ist, wenn BASE
ein Purin oder 7-Desazapurin bedeutet, und SIG kovalent an BASE
gebunden ist, und wobei SIG einen nachweisbaren Rest bedeutet.
-
Vorzugsweise wird die mindestens
eine Verbindung aus der Gruppe Citrat, Isocitrat, Phosphat, EGTA, EDTA
und CDTA ausgewählt.
-
SIG ist vorzugsweise aus der Gruppe
Fluorophore, Chromophore und radioaktive Markierungen ausgewählt, wobei
Fluorophore und Chromophore besonders bevorzugt sind. Ganz besonders
ist SIG aus der Gruppe Fluoresceine, Carbocyanine und Rhodamine
ausgewählt.
-
SIG kann ein Fluorescein darstellen,
so dass es sich beim markierten Nucleotid um ein mit Fluorescein markiertes
dATP handeln kann.
-
SIG kann ein Carbocyanin darstellen,
so dass es sich beim markierten Nucleotid um ein mit Carbocyanin
markiertes dATP handeln kann.
-
Das markierte Nucleotid kann kovalent
an mindestens ein Nucleosid gebunden sein.
-
Bei der Verbindung handelt es sich
vorzugsweise um eine Carbonsäure
oder um eine Verbindung mit mindestens einer Carbonsäuregruppe.
-
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung umfasst
ein Verfahren zum Stabilisieren eines markierten Nucleotids, das
die folgende Stufe umfasst: Zugabe eines Stabilisierungsmittels
zum markierten Nucleotid, wobei es sich beim Stabilisierungsmittel
um mindestens eine Verbindung mit einer Mg2+-Assoziationskonstanten von
1 × 10-11 bis 1 × 10-2 handelt,
wobei die Endkonzentration der Verbindung mindestens 5 mM beträgt. Das Verfahren
umfasst ferner vorzugsweise eine Stufe, bei der zunächst Pyrogene
aus den Bestandteilen entfernt werden. Zur Entfernung der Pyrogene
bedient man sich vorzugsweise der Filtration.
-
Gemäß einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung wird ein Polymerisationsverfahren bereitgestellt,
bei dem das vorstehende Präparat
als Substrat verwendet wird. Dieses Verfahren umfasst die Inkubation des
Präparats
in Gegenwart einer DNA-Polymerase, einer RNR-Polymerase oder einer
reversen Transkriptase.
-
Gemäß einem weiteren Aspekt handelt
es sich beim markierten Nucleotid um Fluorescein-15-dATP. Gemäß diesem
Aspekt können
die folgenden Puffer für
F-dATP-Vorratslösungen
verwendet werden (Reihenfolge von besonders bevorzugten Puffern
zu weniger bevorzugten Puffern): EGTA > Citrat, pH-Wert 7,7 = EDTA = CDTA = Isocitrat,
pH-Wert 7,7 > Isocitrat,
pH-Wert 6,4 = Citrat, pH-Wert 6,6 > Phosphat > dH2O.
Für verdünnte FdATP-Markierungsgemische
werden die folgenden Puffer bevorzugt (Reihenfolge von besonders bevorzugten
Puffern zu weniger bevorzugten Puffern): Citrat, pH-Wert 7,7 = EGTA
= Isocitrat, pH-Wert 7,7 > CDTA > Citrat, pH-Wert 6,6 > EDTA > Isocitrat, pH-Wert
6,4 > Phosphat > dH2O.
-
Gemäß einem weiteren Aspekt handelt
es sich beim markierten Nucleotid um Carbocyanin-l3-dATP. Bei diesem
Aspekt werden für
Carbocyanin-dATP-Vorratslösungen
folgende Puffer verwendet (Reihenfolge von besonders bevorzugten
Puffern zu weniger bevorzugten Puffern): CDTA > EGTA > EDTA
= Isocitrat, pH-Wert 6,4 > Phosphat > Isocitrat, pH-Wert
7,7 > Citrat, pH-Wert
7,7 > Citrat, pH-Wert
6,6 > dH2O.
Für verdünnte Carbocyanin-dATP-Markierungsgemische
werden folgende Puffer verwendet (Reihenfolge von besonders bevorzugten
Puffern zu weniger bevorzugten Puffern): EDTA > Isocitrat, pH-Wert 7,7 > Isocitrat, pH-Wert 6,4 > CDTR = Citrat, pH-Wert
7,7 = Citrat, pH-Wert 6,6 > EGTA > Phosphat > dH2O.
Die Konzentration der Puffer in den einzelnen vorstehenden Präparaten
beträgt
mindestens 5 mM und vorzugsweise mindestens 50 mM.
-
Zu den Zielen der Erfindung gehört daher
die Bereitstellung von Präparaten
von markierten Nucleotiden der vorstehenden Art, mit denen folgendes
erreicht wird:
- (a) Vermeidung von schädlichen
Abbauprodukten, die die DNA-Sequenzierung
stören;
- (b) Stabilisierung von markierten dNTPs während der PCR;
- (c) Stabilisierung von markierten Primern während der PCR;
- (d) Stabilisierung von dNTPs während der Lyophilisation; und
- (e) Verhinderung der Depurinierung von markierten Molekülen. Diese
und weitere Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben
sich aus der nachstehenden Beschreibung. Diese Beschreibung betrifft
jedoch lediglich die bevorzugten Ausführungsformen. Zur Feststellung
des gesamten Schutzumfangs der Erfindung sind daher die Ansprüche heranzuziehen.
-
1 zeigt
die Struktur von Fluorescein-15-dATP.
-
2 zeigt
das Depurinierungsprodukt von Fluorescein-15-dATP, das die Sequenzdaten
verschleiert.
-
3 zeigt
die Struktur von CY5R-13-dATP.
-
4 zeigt
die Sequenzierungsergebnisse unter Verwendung von FdATP, das in
50 mM Citrat vom pH-Wert 7,7 stabilisiert ist.
-
Gemäß einem Aspekt beschreibt die
Erfindung einen Weg zum Stabilisieren von Fluorescein-l5-dATP (F-dATP)
während
der Lagerung in Lösung,
um eine Depurinierung des Moleküls
zu verhindern. Dieses Stabilisierungsverfahren wird leicht den T7-Sequenzierungsreaktionen
einverleibt und hat offensichtlich keine schädlichen Auswirkungen auf die
Fähigkeit
der Polymerase zur Erzeugung von Sequenzdaten.
-
Gemäß einer weiteren Ausführungsform
beinhaltet die vorliegende Erfindung ein Verfahren und eine Zusammensetzung
zur Lagerung von Lösungen
mit einem Gehalt an CY5R-13-dATP (Carbocyanin-l3-dATP) (Biological
Detection Systems, Inc.), das bei T7-Sequenzierungsreaktionen mit
einem anderen handelsüblichen
automatisierten DNA-Sequenzierungsgerät, nämlich ALFREDR DNA-Sequencer (Pharmacia Biotech Inc.),
verwendet wird. Die vorliegende Erfindung eignet sich auch zum Stabilisieren
von markiertem dNTP zur Verwendung bei PCR-Reaktionen, mit markierten
Primern, markierten dNTPs während
der Lyophilisation, markierten ddNTPs und rNTPs.
-
Beispiele
-
Die folgenden Beispiele dienen der
Erläuterung
und stellen keine Beschränkung
dar.
-
Sämtliche
Temperaturen sind in °C
angegeben (25°C
bedeutet Umgebungs oder Raumtemperatur). Die folgenden Abkürzungen
werden verwendet: EGTA (Ethylenglykol-bis-(β-aminoethylether)-N,N,N',N'tetraessigsäure); EDTA
(Ethylendiamintetraessigsäure);
CDTA (Trans-l,2-diaminocyclohexan-N,N,N',N'-tetraessigsäure); dH2O (steriles destilliertes Wasser); mM (millimolar); μM (mikromolar);
F-dATP (Fluorescein-15-dATP); FPLCR (Fast
Protein Liquid Chromatography); d (Dalton).
-
Unter der Mg2+-Assoziationskonstanten
(Stabilitätskonstanten)
verstehen wir die in den folgenden Druckschriften definierte und
festgelegte Größe: Stability
constants of metal-ion complexes, Hrsg. L. G. Sillen et al., Special
Pub., Nr. 17 (1964), The Chemical Society, London; Stability constants
of metal-ion complexes, Ergänzungsband
Nr. 1, Hrsg. L. G. Sillen et al., Special Pub., Nr. 25 (1971), The
Chemical Society, London; Stability constants of metal-ion complexes:
organic ligands, Hrsg. D. D. Perrin, (1979), Pergamon Press, Oxford;
F. Rossotti et al., The determination of stability constants, McGraw-Hill,
New York (1961); und Data for Biochemical Research, 3. Auflg., Hrsg.
R. Dawson et al., Clarendon Press, (1986), Oxford.
-
Die Mg2+-Assoziationskonstante
für Citrat
beträgt
1 × 10–3,6, für
Isocitrat 1 × 10–2,6,
für CDTR
1 × 10–11, für EDTA 1 × 10–8'7,
für EGTA
1 × 1–5,2.
Unter einem "nachweisbaren
Rest" verstehen
wir beispielsweise beliebige fluoreszierende Reste, Biotin, radioaktive
Markierungen, magnetische Markierungen und Antikörper. Unter dem Ausdruck "fluoreszierender
Rest" verstehen
wir beispielsweise Fluorophore und Chromophore. Bevorzugte Verbindungen
für das
stabilisierte Präparat
sind Verbindungen mit mindestens einer Carbonsäuregruppe.
-
Die Elektrophoresediagramme der verschiedenen
Proben in den Beispielen 1, 2, 4, 5 und 6 wurden qualitativ und
vergleichend analysiert, indem man ihnen die Symbole "+" (oder gegebenenfalls "–") in Bezug auf die Breite und Höhe der Verunreinigungspeaks
(Disproportionierung und Depurinierung) zuordnete. Jedes Symbol "+" bedeutet einen höheren Stabilisierungsgrad.
Der Ausdruck "Stabilität" bezieht sich auf
einen Vergleich der bei –20°C gehaltenen
Lösung.
-
Sämtliche
Puffer wurden mit der Stabilität
der markierten Nucleotide in Citrat vom pH-Wert 7,7 verglichen,
dem willkürlich
ein Wert von drei "+"-Zeichen (+++) zugeordnet wurde.
-
Beispiel 1
-
Wie in der nachstehenden Tabelle
1 dargelegt, wurden Vorratslösungen
von F-dATP in den aufgeführten
Puffern mit den angegebenen pH-Werten und Konzentrationen hergestellt.
Aliquotanteile der einzelnen F-dATP-Vorratslösungen wurden 3 Tage bei +50°C gelagert.
Identische Aliquotanteile wurden ferner 3 Tage bei –20°C gelagert.
Nach dieser Zeitspanne wurden die einzelnen Aliquotanteile unter
Verwendung des entsprechenden Puffers oder von dH2O
auf 0,3 μM
verdünnt.
Die Lagerung bei 50°C
bedeutet einen beschleunigten Stabilitätstest.
-
7 μl
der verdünnten
Proben wurden sodann mit 5 μl
Gel-Beladungsfarbstoff
(etwa 100% entionisiertes Formamid mit einem Gehalt an 5 mg/ml Dextranblau
2000) vermischt. 8 μl
der erhaltenen Lösung
wurden in Vertiefungen eines Sequenzierungsgels gegeben. Die Proben
wurden unter Verwendung des Geräts
AUTOMATED LASER FLUORESCENT (ALF) DNA SequenzerR der
Elektrophorese unterzogen. Elektrophoresediagramme der einzelnen
Lösungen
wurden bewertet und sind in der nachstehenden Tabelle 1 aufgeführt.
-
Diese Ergebnisse belegen die Wirksamkeit
der Puffer in der angegebenen Reihenfolge: EGTA > Citrat, pH-Wert 7,7 = EDTA = CDTA = Isocitrat,
pH-Wert 7,7 > Isocitrat,
pH-Wert 6,4 = Citrat, pH-Wert 6,6 > Phosphat > dH2O.
-
-
Beispiel 2
-
Die einzelnen F-dATP-Vorratslösungen von
Beispiel 1 (bei –20 °C gelagert)
wurden zur Herstellung eines Markierungsgemisches zur Verwendung
mit T7-DNA-Polymerase entsprechend der folgenden Zusammensetzung
verwendet.
-
-
Der identische Puffer, der zur Herstellung
der konzentrierten FdATP-Vorratslösung verwendet wurde, wurde
zur Herstellung des Markierungsgemisches eingesetzt, ausgenommen
der Fall, bei dem dH2O verwendet wurde.
Aliquotanteile der Markierungsgemische wurden ferner bei +50°C oder –20°C 3 Tage
inkubiert (wie in Beispiel 1). Nach der Inkubationsdauer wurden
die Markierungsgemische unter Verwendung des entsprechenden Puffers
oder von dH2O 1 : 3 l verdünnt. 7 μl der verdünnten Markierungsgemische
wurden sodann mit 5 μl
Gel-Beladungsfarbstoff vermischt. 8 μl der erhaltenen Lösung wurden
in die entsprechenden Vertiefungen eines Sequenzierungsgels gegeben.
Elektrophoresediagramme der einzelnen Lösungen belegen die Wirksamkeit
der Puffer in der angegebenen Reihenfolge: Citrat, pH-Wert 7,7 =
EGTA = Isocitrat, pH-Wert 7,7 > CDTA > Citrat, pH-Wert 6,6 > EDTA > Isocitrat, pH-Wert
6,4 > Phosphat > dH2O.
Ferner wurde jedes Markierungsgemisch zur Erzeugung einer DNA-Sequenz
mit T7-DNR-Polymerase, AUTOREADR Sequencing
Kit (Pharmacia Biotech Inc.) verwendet. Ein unmarkierter Primer
und ein M13mp18(+)-Strang wurden als DNA-Matrize verwendet. Die
Ergebnisse der DNA-Sequenzierungsreaktionen spiegeln die vorstehenden
Elektrophoresediagramme wieder.
-
-
Beispiel 3
-
100 mM Vorratslösungen von dATP, dCTP, dGTP
und dTTP wurden auf 90 mM verdünnt,
wobei 1 M Citrat-Vorratslösungen
verschiedener pH-Werte verwendet wurden: pH-Wert 4,5, pH-Wert 6,5
oder pH-Wert 7,5. Die Endkonzentration an Citrat in sämtlichen
Verdünnungen
betrug 100 mM. Sämtliche
Proben wurden innerhalb von 20 Stunden bei einem Temperaturgradienten
von –40
bis +16°C
lyophilisiert. Nach dem Trocknen wurden sämtliche Proben in dH2O resuspendiert und durch FPLCR unter
Verwendung einer MONO QR-Säule
mit einem Natriumchlorid-Gradienten beim pH-Wert 7,5 analysiert.
Die Integrationswerte für
die lyophilisierten dNTPs und die Disproportionierungsprodukte sind
in Tabelle 3 aufgeführt.
-
Die Ergebnisse zeigen, dass diese
Lösungen
während
des Lyophilisationsverfahrens eine gute Stabilität gegen Disproportionierung
zeigen.
-
-
Beispiel 4
-
Wie in der nachstehenden Tabelle
4 dargelegt, wurden Vorratslösungen
von CY5R-dATP in den aufgeführten Puffern
mit den angegebenen pH-Werten und Konzentrationen hergestellt. Ferner
wurden die entsprechenden Puffer oder das dH2O,
das in diesem Beispiel verwendet wurde, durch eine Membran mit einer
molekularen Trenngrenze von 10 000 d (CENTRIPREP-10, Amicon, Inc.)
filtriert.
-
Aliquotanteile von jeder CY5R-dATP-Vorratslösung wurden entweder bei 50°C oder bei –20°C 3 Tage gelagert
(wie in Beispiel 1). Nach Ablauf dieser Zeitspanne wurden die einzelnen
Aliquotmengen unter Verwendung des entsprechenden Puffers oder von
dH2O auf 0,3 μM verdünnt. 7 μl der verdünnten Proben wurden sodann
mit 5 μl
Gel-Beladungsfarbstoff vermischt. 8 μl der erhaltenen Lösung wurden
in Vertiefungen eines Sequenziergels gegeben. Die Proben wurden
der Elektrophorese unter Verwendung eines ALFREDR-DNA-Sequencer-Geräts (Pharmacia
Biotech Inc.) unterzogen. Die Elektrophoresediagramme dieser Lösungen wurden
analysiert. Sie sind in der nachstehenden Tabelle 4 aufgeführt.
-
Diese Ergebnisse belegen die Wirksamkeit
der Puffer in der angegebenen Reihenfolge: CDTA > EGTA > EDTA
= Isocitrat, pH-Wert 6,4 > Phosphat > Isocitrat, pH-Wert
7,7 > Citrat, pH-Wert
7,7 > Citrat, pH-Wert
6,6 > dH2O.
-
-
Beispiel 5
-
Die einzelnen CYSR-dATP-Vorratslösungen von
Beispiel 4 (bei –20 °C gelagert)
wurden zur Herstellung eines Markierungsgemisches zur Verwendung
mit T7-DNA-Polymerase gemäß der nachstehenden
Zubereitung verdünnt.
-
-
Der gleiche Puffer, der zur Herstellung
der konzentrierten Vorratslösung
von CY5R-dATP eingesetzt wurde, wurde zur
Herstellung des Markierungsgemisches verwendet, ausgenommen der
Fall, bei dem dH2O verwendet wurde. Aliquotanteile
der Markierungsgemische wurden ferner entweder bei +50 °C oder bei –20 °C 3 Tage
inkubiert (wie in Beispiel 1). Nach der Inkubationsdauer wurden
die Markierungsgemische unter Verwendung des entsprechenden Puffers
oder von dH2O 1 : 3 l verdünnt. 7 μl der verdünnten Markierungsgemische
wurden sodann mit 5 μl
Gel-Beladungsfarbstoff
vermischt. 8 μl
der erhaltenen Lösungen
wurden in Vertiefungen eines Sequenzierungsgels gegeben. Die Elektrophoresediagramme
der einzelnen Lösungen
wurden analysiert. Es ergibt sich die Wirksamkeit der Puffer in
folgender Reihenfolge: EDTA > Isocitrat,
pH-Wert 7,7 > Isocitrat,
pH-Wert 6,4 > CDTA
= Citrat, pH-Wert 7,7 = Citrat, pH-Wert 6,6 > EGTA > Phosphat > dH2O. Ferner
wurden die einzelnen Markierungsgemische zur Bildung einer DNA-Sequenz
mit T7-DNA-Polymerase, dem
ALFREDR AUTOREADR Sequencing Kit (Pharmacia
Biotech Inc.), einem unmarkierten Primer und dem M13mp18(+)-Strang
als DNA-Matrize
verwendet. Die Ergebnisse der DNA-Sequenzierungsreaktionen spiegeln
die Ergebnisse der vorstehenden Elektrophoresediagramme wieder.
-
Die Ergebnisse sind in Tabelle 5
aufgeführt.
-
-
Beispiel 6
-
CY5R-markierter
M13-Universalprimer (5'-Cy5-CGA
CGT TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3'-OH)
wurde in einer Konzentration von 3 μM entweder in filtriertem (MG-Trenngrenze
10 000 dH2O) oder in filtriertem 10 mM Isocitrat
vom pH-Wert 6,6 resuspendiert. Aliquotanteile der einzelnen Lösungen wurden
17 Tage bei –20°C oder bei
+50°C gelagert
(wie in Beispiel 1). Proben der einzelnen Primer wurden in dH2O bzw. in 10 mM Isocitrat vom pH-Wert 6,6
1 : 15 verdünnt
und sodann mit der Stopplösung
im Verhältnis
von 2 μl
Primer + 5 μl dH2O + 5 μl
Stopplösung
vermischt. 8 μl
der einzelnen Lösungen
wurden unter Verwendung eines ALFREDR-Sequencer-Geräts aufgesetzt
und der Elektrophorese unterzogen. Ferner wurden 2 μl jeder Primerlösung direkt
in einer T7-Sequenzierungsreaktion unter Verwendung des ALFREDR
AUTOREADR Sequencing Kits, M13mp18(+)-Strang
als Matrize und des ALFREDR-DNA-Sequencer-Geräts verwendet. Die Ergebnisse
dieser ALFREDR-Ansätze
wurden analysiert. Sie belegen (gemäß nachstehender Tabelle 6),
dass Isocitratpuffer vom pH-Wert 6,6 als Stabilisierungsmittel wirkte.
-
