DE60006634T2

DE60006634T2 - Fluoreszente materialen

Info

Publication number: DE60006634T2
Application number: DE60006634T
Authority: DE
Inventors: Hiroko Asaka-shi Inomata; Hiroshi Asaka-shi Shinoki; Masayoshi Asaka-shi Kojima; Yukio Asaka-shi Sudo; Junji Minami-ashigara-shi Nishigaki; Osamu Asaka-shi Seshimoto
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 1999-12-07
Filing date: 2000-12-06
Publication date: 2004-04-15
Anticipated expiration: 2020-12-07
Also published as: EP1106621A3; DE60006634D1; EP1106621B1; US20030013088A1; EP1106621A2; US6642375B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine fluoreszierende Substanz unter Verwendung von Azamethinverbindungen, die als fluoreszierende Markierungsreagentien nützlich sind, und ihre Verwendung. Die Erfindung betrifft insbesondere fluoreszierende Nukleotide und fluoreszierendes Avidin unter Verwendung von Azamethinverbindungen und deren Verwendungen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Eines der am häufigsten verwendeten molekularen biologischen Verfahren zur Detektion homologer Nukleinsäuresequenzen ist die DNA/DNA-, RNA/RNR- oder RNA/DNA-Hybridisierung. Bei diesem Verfahren wird eine Nukleinsäure (DNA oder RNA), die als Sonde verwendet wird, markiert, und die markierte Nukleinsäure wird zu der Nukleinsäure (DNA oder RNA), die nachgewiesen werden soll, hybridisiert. Wenn die als Sonde verwendete Nukleinsäure eine Homologie zu der zu detektierenden Nukleinsäure besitzt, hybridisiert jede einstrangige Nukleinsäure zu ihrer komplementären Sequenz, so dass eine doppelsträngige Sequenz gebildet wird, und dann wird die doppelsträngige Sequenz mit einer Markierung der Sonde detektiert.
Üblicherweise wird, wenn eine Nukleinsäure als Sonde verwendet wird, ein Verfahren der Markierung der Sonde mit einem Radioisotop verwendet, und die Anwesenheit der Hybridisierung zwischen der Sonde und der Ziel-Nukleinsäure wurde unter Verwendung von Autoradiographie detektiert.
Obgleich das Verfahren unter Verwendung von Radioisotopen für die Markierung einer Gensonde in seiner Empfindlichkeit besonders überlegen ist, treten solche Schwierigkeiten auf, dass die Handhabung der Radioisotope kompliziert ist, da die Sicherheit des Labors sichergestellt werden muss und spezielle Vorsichtsmaßnahmen bei der Beseitigung der radioaktiven Abfälle ergriffen werden müssen. Weiterhin können Radioisotope nur während einer beschränkten Zeit verwendet werden, da sie eine Halbwertsperiode besitzen.
Es wurden daher nicht-radioaktive Markierungsverfahren als einfachere Verfahren entwickelt. Beispielsweise sind Verfahren für die Markierung einer Gensonde mit Biotinmolekülen (europäisches Patent Nr. 0 063 879) oder mit Digoxigeninmolekülen (europäische Patentanmeldung Nr. 0 324 474 Al) bekannt. Nach der Hybridisierung einer markierten Nukleinsäuresonde zu der zu detektierenden Nukleinsäuresequenz sind Biotinmoleküle oder Digoxigeninmoleküle in der entstehenden doppelstrangigen Nukleinsäure vorhanden. Nach der Hybridisierung erlaubt die Bindung des (Strept)avidin-Markerenzymkomplex oder des Anti-Digoxige-nin-Antikörper-Markerenzymkomplex an die entstehende doppelstrangige Nukleinsäuresequenz die Detektion der Nukleinsäuren, an die die Sonden hybridisiert wurden. Jedoch sind solche Detektionsverfahren unter Verwendung von Enzymen hinsichtlich der Empfindlichkeit und der Spezifizität nachteilig.
Außer den obigen Verfahren wurden verschiedene Verfahren für die Markierung einer Zielsubstanz mit Fluoreszenzfarbstoff untersucht. Beispielsweise besitzt das gewünschte fluoreszierende Markierungsmittel (1) eine hohe Fluoreszenz-Quantenausbeute, (2) einen hohen Molekularextinktionskoeffizienten, (3) ist es wasserlöslich und ist nicht selbstlöschend, durch Agglutination in wässrigem Lösungsmittel, (4) ist es nicht gegenüber Hydrolyse empfindlich, (5) photo-dissoziiert es nicht leicht, (6) ist es nicht empfänglich für Hintergrundfluoreszenz, und (7) besitzt es einen zuvor eingeführten reaktiven Substituenten, der mit der Zielsubstanz eine kovalente Bindung bildet.
Fluoresceinisothiocyanat (FITC) und Rhodaminisothiocyanat, die gut bekannte fluoreszierende Markierungsmittel sind, besitzen hohe Fluoreszenz-Quantenausbeuten, besitzen aber den Nachteil, dass ihr molekularer Extinktionskoeffizient niedrig ist und dass die Anregung und die Lichtwellenlänge 500 nm bis 600 nm betragen, und daher sind die Reagentien gegenüber dem Einfluss von Hintergrundfluoreszenz der Membran, die für das Blotten verwendet wird, empfindlich.
Als Farbstoffe mit hohem Molekularextinktionskoeffizienten sind Polymethin-Farbstoffe bekannt, wie die Cyanin-Farbstoffe, die in dem US-Patent Nr. 5 486 616, den offengelegten japanischen Patentanmeldungen Nr. 2-191674, 5-287209, 5-287266, 8-47400, 9-127115, 7-145148 und 6-222059 beschrieben werden, und Barbituratoxonol, wie in Journal of Fluorescence, 5, 231, 1995, beschrieben. Es treten jedoch einige Schwierigkeiten auf, dass sie fast in Wasser unlöslich sind und dass, wenn sie gelöst werden, eine Hydrolyse auftritt. Auch können starke intermolekulare Wechselwirkungen zwischen den Farbstoffen die Bildung von Aggregaten in einem wässrigen Medium verursachen, so dass ein Selbstauslöschen der Fluoreszenz oft beobachtet wird.
Cyanin-Farbstoffe, die in der offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 2-191674 und ähnlichen Literaturstellen beschrieben werden, sind überlegene Farbstoffe, da sie Wasserlöslichkeit besitzen, bedingt durch die Einführung einer Sulfonsäuregruppe in den relativ stabilen Chromophoren, und die Bildung von Aggregaten verhindert wird. Jedoch ist die Fluoreszenz-Quantenausbeute nicht ausreichend hoch, und die Synthese der Farbstoffe ist schwierig, bedingt durch die Einführung einer Sulfonsäuregruppe. Unter solchen Umständen ist es erforderlich, fluoreszierende Farbstoffe mit starker Fluoreszenz wie auch hoher Wasserlöslichkeit mit ausreichender Stabilität, so dass kein Auslöschen der Fluoreszenz, bedingt durch Aggregation stattfindet, zu entwickeln.
Ein weiteres Beispiel eines Rahmenfarbstoffs mit hoher Flureszenzintensität ist der Azaindolenincyanin-Farbstoff, wie in GB-Patent Nr. 870 753 beschrieben. Jedoch verbleibt die Anwendbarkeit dieses Azaindolenincyanin-Farbstoffs als fluoreszierendes Markierungsmittel unbekannt, da sich in dieser Patentanmeldung keine Beschreibung hinsichtlich der wesentlichen Merkmale des fluoreszierenden Markierungsmittels findet, wie der Wasserlöslichkeit, der Kohäsion und der Lösungsstabilität, und es gibt keine Beispiele für die Einführung eines reaktiven Substituenten, der eine kovalente Bindung mit der Zielsubstanz ergibt. Weiterhin sind Beispiele für die Anwendung von Azaindolenincyanin bei der photographischen Verwendung aus den offengelegten japanischen Patentanmeldungen Nr. 4-358143, 3-135553, 1-280750 und dem europäischen Patent Nr. 341958 bekannt. Bei diesen Beispielen werden die Extinktionseigenschaften von Azaindolenincyanin verwendet, aber es wird nicht auf die Lumineszenzeigenschaften geachtet und sie werden nicht positiv ausgenutzt.
F. A. Mikhailenko et al. (Sov. J. Quantum Electron. 10(3), März 1980, S. 322–324) beschreiben eine Unter-suchung der photoprotolytischen Reaktionen, die in angeregtem Zustand bestimmter Azapolymethin-Farbstoffmoleküle, die als aktive Medien von Lasern verwendet werden, stattfinden. Sie beschreiben bestimmte Azapolymethine als fluoreszierende Verbindungen mit Strukturen, entsprechend den Chromophoren, die bei den erfindungsgemäßen Substanzen verwendet werden. Jedoch enthält dieses Dokument keine Bezugnahme auf die Verwendung solcher Verbindungen als fluoreszierende Labels für (Poly)nukleotide.
In der US-Patentschrift 5 986 086 werden nicht-sulfonierte Cyanin-Farbstoffe für die Markierung von Nukleosiden und Nukleotiden beschrieben. Insbesondere werden Verbindungen der folgenden Formel:
beschrieben, worin R¹ inter alia Alkyl bedeuten kann; R³, R⁴ und R⁵ inter alia Wasserstoff bedeuten; r 1, 2 oder 3 bedeutet; X oder Y ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus O, S, C (R⁶)₂ oder N (R₆) , worin R⁶ bevorzugt CH₃ oder Niedrigalkyl bedeutet und R³-O-Zucker-Base ein Nukleosid oder Nukleotid ist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Aufgabe, die gemäß der vorliegenden Erfindung gelöst werden soll, besteht darin, die oben erwähnten Probleme der bekannten Verfahren zu vermeiden. Durch die vorliegende Erfindung soll die Aufgabe gelöst werden, dass ein neues fluoreszierendes Nukleotid zur Verfügung gestellt wird, welches nützlich ist bei der Markierung von Nukleinsäuren, und weiterhin soll ein neues fluoreszierendes Avidin zur Verfügung gestellt werden, welches nützlich ist bei der Analyse biologischer Komponenten, wie Nukleinsäure, Proteine oder Zucker.
Nachdem die genannten Erfinder ausgedehnte Untersuchungen durchgeführt haben um die oben beschriebenen Probleme zu lösen, bildeten sie einen Komplex aus einem Nukleotid und einem kürzlich entwickelten fluoreszierenden Markierungsmittel, d. h., eine Azamethinverbindung, und markierten und detektierten Nukleinsäuren unter Verwendung dieses Komplexes. Als Ergebnis haben die genannten Erfinder gefunden, dass der Komplex in dem Verhältnis der Aufnahme in Nukleinsäuren zu der Fluoreszenzintensität bei der Detektion überlegen ist. Die genannten Erfinder bildeten ein Konjugat aus einer Streptavidin- und einer Azamethinverbindung und detektierten Biotin-markierte Nukleinsäuren unter Verwendung des Konjugats. Als Ergebnis haben die Erfinder gefunden, dass die Fluoreszenz in einer Intensität detektiert wird, die von dem Gehalt der Nukleinsäure abhängt. Die vorliegende Erfindung wurde aufgrund dieser Erkenntnisse vervollständigt.
Gegenstand der Erfindung ist eine fluoreszierende Substanz, die durch die Formel: A-B-C dargestellt wird, worin A den Rest eines natürlichen oder synthetischen Nukleotids, Oligonukleotids, Polynukleotids oder Derivats davon bedeutet, und an B an der Basengruppierung des Restes bindet, oder worin A der Rest von Avidin oder Streptavidin bedeutet;
B eine zweiwertige Verbindungsgruppe oder eine einfache Bindung ist; und
C eine einwertige Gruppe ist, die sich von der allgemeinen Formel (I) ableitet und an B an der reaktiven Gruppe, die in R¹ oder R² vorhanden ist, bindet;
worin R¹ und R² je unabhängig eine Alkylgruppe, die mit einer reaktiven Gruppe, die kovalent an A-B- binden kann, substituiert sein kann; R³, R⁴, R⁵ und R⁶ je unabhängig eine Alkylgruppe bedeuten; und R³ und R⁴ und/oder R⁵ und R⁶ zusammen einen gesättigten Kohlenstoffring, zusammen mit dem beziehungsweise den Kohlenstoffatom(en), an das sie gebunden sind bilden; V¹ V² V³ V⁴ V⁵ V⁶ V⁷ V⁸ V⁹ und V¹⁰ je unabhängig ein Wasserstoffatom oder einen einwertigen Substituenten bedeuten und zwei benachbarte Gruppen davon einen Ring bilden können; L¹, L² und L³ eine substituierte oder unsubstituierte Methingruppe bedeuten; und jeder von m, n, s und t 0 oder 1 bedeutet, mit der Maßgabe, dass m + n = 1 und s + t = 1; p 1, 2 oder 3 bedeutet; M ein Gegenion bedeutet; und q eine Zahl bedeutet, die erforderlich ist um die Ladung des Moleküls zu neutralisieren.
Bevorzugt ist mindestens eins von R¹ und R² eine Alkylgruppe, substituiert mit einer aktiven Estergruppe, die kovalent an eine Aminogruppe, eine Hydroxylgruppe oder eine Thiolgruppe, die in der Gruppe vorhanden ist, die durch A-B- dargestellt wird, binden kann.
Bevorzugt ist mindestens einer von R¹ und R² einer Alkylgruppe, substituiert mit einer Carboxylgruppe.
Bevorzugt ist A der Rest eines natürlichen oder synthetischen Nukleotids, Oligonukleotids oder Polynukleotids oder eines Derivats davon.
Bevorzugt ist A der Rest eines Nukleotids oder Derivats davon.
Bevorzugt ist A der Rest eines natürlichen oder synthetischen Nukleotids oder eines Derivats davon, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (1) Nukleotiden, bestehend aus AMP, ADP, ATP, GMP, GDP, GTP, CMP, CDP, CTP, UMP, UDP, UTP, TMP, TDP, TTP, 2-Me-AMP, 2-Me-ADP, 2-Me-ATP, 1-Me-GMP, 1-Me-GDP, 1-Me-GTP, 5-Me-CMP, 5-Me-CDP, 5-Me-CTP, 5-MeO-CMP, 5-MeO-CDP und 5-MeO-CTP; (2) Desoxynukleotiden und Didesoxynukleotiden, entsprechend den Nukleotiden; und (3) Derivaten, die sich von den bei (1) und (2) beschriebenen Nukleotiden ableiten.
Bevorzugt ist A der Rest von Avidin oder Streptavidin.
Bevorzugt ist B eine Verbindungsgruppe, ausgewählt aus -CH₂-, -CH=CH-, -C≡C-, -CO-, -O-, -S-, -NH- oder Kombinationen davon, wobei ein Wasserstoffatom der Verbindungsgruppe weiter mit einem Substituenten substituiert sein kann.
Bevorzugt ist B eine Aminoallylgruppe.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Fluoreszenzmarkierten Nukleinsäuren, das die Stufen umfasst: Durchführung einer Synthesereaktion der Nukleinsäure unter Verwendung von Nukleinsäuresynthetase, einer Nukleinsäure als Matrize und der erfindungsgemäßen fluoreszierenden Substanz.
Bevorzugt ist die Synthese der Nukleinsäure eine Reaktion, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus reverser Transkriptionsreaktion, terminaler Transferasereaktion, Randomprimeverfahren, einem PCR-Verfahren und einem Nick-Translationsverfahren.
Die Erfindung betrifft gemäß einem weiteren Aspekt eine Nukleinsäuresonde oder einen Primer, markiert mit der erfindungsgemäßen Substanz. Die Erfindung betrifft gemäß einem noch weiteren Aspekt ein diagnostisches Mittel oder Reagens zur Detektion von Nukleinsäuren, das erfindungsgemäß die fluoreszierende Substanz umfasst.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen Kit zur Detektion von Nukleinsäuren, der umfasst (1) die erfindungsgemäße fluoreszierende Substanz, (2) Nukleinsäuresynthetase, und (3) einen Puffer.
Die Erfindung betrifft gemäß einem weiteren Aspekt ein analytisches Reagens oder ein diagnostisches Reagens, umfassend die erfindungsgemäße fluoreszierende Substanz.
Die Erfindung betrifft gemäß einem weiteren Aspekt einen analytischen Kit, der umfasst (1) die erfindungsgemäße fluoreszierende Substanz, und (2) Biotin oder eine Biotinmarkierte Substanz.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Ergebnisse der Detektion von biotinylierter DNA unter Verwendung des erfindungsgemäßen fluoreszierenden Streptavidins.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Ausführungsformen und die Durchführung der vorliegenden Erfindung werden jetzt in Einzelheiten erläutert.
1. Erfindungsgemäße fluoreszierende Substanz
Die vorliegende Erfindung betrifft eine fluoreszierende Substanz, dargestellt durch die Formel: A-B-C.
In der obigen Formel bedeutet A den Rest eines natürlichen oder synthetischen Nukleotids, Oligonukleotids, Polynukleotids oder Derivats davon; oder A bedeutet den Rest von Avidin oder Streptavidin.
Die natürlichen oder synthetischen Nukleotide umfassen, aber dies ist keine Beschränkung, den Rest eines natürlichen oder synthetischen Nukleotids oder eines Derivats davon, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (1) Nukleotiden, bestehend aus AMP, ADP, ATP, GMP, GDP, GTP, CMP, CDP, CTP, UMP, UDP, UTP, TMP, TDP, TTP, 2-Me-AMP, 2-Me- ADP, 2-Me-ATP, 1-Me-GMP, 1-Me-GDP, 1-Me-GTP, 5-Me-CMP, 5-Me-CDP, 5-Me-CTP, 5-MeO-CMP, 5-MeO-CDP und 5-MeO-CTP; (2) Desoxynukleotiden und Didesoxynukleotiden, entsprechend den zuvor erwähnten Nukleotiden; und (3) Derivaten, die sich von den bei (1) und (2) beschriebenen Nukleotiden ableiten. Beispiele natürlicher oder synthetischer Nukleotide umfassen, dies ist keine Beschränkung, ATP, CTP, GTP, TTP, UTP, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dUTP, ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP, ddUTP, oder die Derivate davon.
Das Oligonukleotid wird durch Polymerisation von etwa 1 bis 50, bevorzugt 1 bis 30, bevorzugter 1 bis 20, Nukleotiden oder Derivaten davon, wie oben beschrieben, erhalten. Jedes Nukleotid der konstitutiven Einheit kann identisch oder unterschiedlich sein. Das Polynukleotid ist ein Polymer, erhalten durch Polymerisation einer Vielzahl von Nukleotiden oder Derivaten davon, wie oben beschrieben, und seine Größe (oder Länge) kann, aber dies ist nicht spezifisch beschränkt, mehrere Basenpaare (bp) bis mehrere kbp als Zahl der Basen betragen.
Wenn A den Rest eines natürlichen oder synthetischen Nukleotids, Oligonukleotids oder Polynukleotids oder Derivats davon bedeutet, bindet A an B an der Basengruppierung in dem Nukleotidrest. Beispiele der Basengruppierung des Nukleotidrests umfassen Purinderivate und Pyrimidinderivate. Bei einer Purinbase ist die Bindungsstelle für die Verbindungsgruppe B nicht spezifisch beschränkt, solange es eine andere Stellung ist als die 9-Stellung für die Bindung der Zuckerkomponente. Beispielsweise kann, wenn die Purinbase Adenin ist, die Bindungsstelle für die Verbindungsgruppe B die 2- oder 8-Stellung sein, oder es kann eine Aminogruppe in der 6-Stellung vorhanden sein. Wenn die Purinbase Guanin ist, kann die Bindungsstelle die Stellung 1 oder 8 sein, oder eine Aminogruppe kann in der Stellung 2 vorhanden sein. Bei einer Pyrimidinbase ist die Bindungsstelle für die Verbindungsgruppe B nicht besonders beschränkt, solange es eine andere Stellung ist als die Stellung 1 für die Bindung der Zuckerkomponente. Wenn beispielsweise die Pyrimidinbase Cytosin ist, kann die Bindungsstelle die 5- oder 6-Stellung sein, oder eine Aminogruppe kann in der 4-Stellung vorhanden sein; wenn die Pyrimidinbase Thymin ist, kann die Bindungsstelle die 3- oder 6-Stellung sein oder eine Methylgruppe kann in der 5- Stellung vorhanden sein, und wenn die Pyrimidinbase Uracil ist, kann die Bindungsstelle für die Verbindungsgruppe B die 3-, 5- oder 6-Stellung sein.
A kann den Rest von Avidin oder Streptavidin bedeuten. Avidin oder Streptavidin ist ein Proteinmolekül mit einem Molekulargewicht von etwa 60 kDa. Wenn A den Rest von Avidin oder Streptavidin bedeutet, ist die Stelle, an der A an die Gruppe, dargestellt durch -B-C, bindet, nicht beschränkt, und A kann an -B-C an der freien Amino- oder Carboxylgruppe am Ende des Proteinmoleküls oder an eine Aminogruppe, Carboxylgruppe oder Hydroxylgruppe, die in den konstitutiven Aminosäuren des Proteins vorhanden ist, binden. Eine Verbindungsgruppe, die eine geeignete reaktive Gruppe enthält, kann vorab in Avidin oder Streptavidin eingeführt werden, und die Verbindungsgruppe kann an die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) binden, wie im Folgenden beschrieben.
In der obigen Formel bedeutet B eine Verbindungsgruppe oder eine einfache Bindung. Wenn A den Rest von Avidin oder Streptavidin bedeutet, ist B bevorzugt eine einfache Bindung.
Arten der Verbindungsgruppe sind nicht spezifisch beschränkt, solange sie nicht stark die Eigenschaften der erfindungsgemäßen fluoreszierenden Substanz beeinflussen (beispielsweise die Stabilität der fluoreszierenden Substanz als Verbindung, die Wasserlöslichkeit, das Aufnahmeverhältnis durch die Nukleinsäure, die Fluoreszenzintensi tät, und ähnlichen). Der Fachmann kann auf geeignete Weise eine zweiwertige Verbindungsgruppe auswählen, die geeignet ist, das Nukleotid oder die Avidingruppierung, dargestellt durch A, mit einer fluoreszierenden Verbindungskomponente, dargestellt durch C, zu verbinden.
Im Allgemeinen ist die Verbindungsgruppe B eine Verbindungsgruppe, ausgewählt aus -CH₂-, -CH=CH-, -C≡C-, -CO-, -O-, -S-, -NH- oder Kombinationen davon, wobei ein Wasserstoffatom der Verbindungsgruppe weiter mit irgendeinem Substituenten substituiert sein kann. Die Zahl der Kohlenstoffatome, die in dem Grundgerüst der Verbindungsgruppe vorhanden ist, ist nicht besonders beschränkt. Im Allgemeinen liegt die Zahl der Kohlenstoffatome im Bereich von 1 bis 50, bevorzugt 1 bis 20, bevorzugter 1 bis 10, und am meisten bevorzugt 1 bis 5.
In der obigen Formel bedeutet C eine einwertige Gruppe, die sich von der folgenden Formel (I) ableitet und an B an der reaktiven Gruppe, die in R¹ oder R² vorhanden ist, bindet.
worin R¹ und R² je unabhängig eine Alkylgruppe bedeuten, die mit einer reaktiven Gruppe, die kovalent an A-B- binden kann, substituiert sein kann; R³, R⁴, R⁵ und R⁶ je unabhängig eine Alkylgruppe bedeuten; oder R³ und R⁴ und/oder R⁵ und R⁶ zusammen einen gesättigten Kohlenstoffring, zusammen mit dem beziehungsweise den Kohlenstoffatom(en), an das sie gebunden sind, bilden; V¹, V², V³, V⁴, V⁵, V⁶, V⁷, V⁸, V⁹ und V¹⁰ je unabhängig ein Wasserstoffatom oder einen einwertigen Substituenten bedeuten und zwei benachbarte Gruppen davon einen Ring bilden können; L¹, L² und L³ eine substituierte oder unsubstituierte Methingruppe bedeuten; und jeder von m, n, s und t 0 oder 1 bedeutet, mit der Maßgabe, dass m + n = 1 und s + t = 1; p 1, 2 oder 3 bedeutet; M ein Gegenion bedeutet; und q eine Zahl bedeutet, die erforderlich ist um die Ladung des Moleküls zu neutralisieren.
Die Alkylgruppierung einer Alkylgruppe oder eines Substituenten, enthaltend eine Alkylgruppierung, wie eine Alkoxygruppe, kann, wie es hier verwendet wird, geradkettig oder verzweigtkettig, eine Ringkette oder eine Kombination davon, enthalten, und etwa 1 bis 20 Kohlenstoffatome, sofern nicht anders angegeben, enthalten. Alkylgruppen, die durch R¹ und R² dargestellt werden, können identisch oder unterschiedlich sein. Beispiele solcher Alkylgruppen umfassen eine Methylgruppe, eine Ethylgruppe, eine Propylgruppe, eine Isopropylgruppe, eine Cyclopropylgruppe, eine n-Butylgruppe, eine sek.-Butylgruppe, eine tert.-Butylgruppe, eine Cyclopropylmethylgruppe, eine n-Pentylgruppe, eine n-Hexylgruppe und eine Cyclohexylgruppe. Alkylgruppen, die durch R¹ und R² dargestellt werden, können einen oder mehrere Substituenten an irgendeiner Stelle der Alkylgruppen enthalten. Wenn die Alkylgruppen zwei oder mehrere Substituenten enthalten, können die Substituenten identisch oder unterschiedlich sein.
Die Typen an Substituenten der Alkylgruppe, dargestellt durch R¹ und R², sind nicht besonders beschränkt. Es ist bevorzugt, dass ein reaktiver Substituent, der eine kovalente Bindung, eine Ionenbindung, eine Wasserstoffbindung und eine ähnliche Bindung mit einer Substanz, die markiert werden soll, bilden kann, eingearbeitet ist zur Einführung einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) als fluoreszierende Markierung in die Substanz, die markiert werden soll, einschließlich eines Nukleotids, Avidin oder Streptavidin. Der Ausdruck "reaktiver Substituent" wie er hier verwendet wird, bedeutet einen Substituent, der die obigen Eigenschaften besitzt.
Beispiele von reaktiven Substituenten, die in jede der Alkylgruppen, dargestellt durch R¹ und R², vorhanden sein können, umfassen eine Succinimidylestergruppe, eine Halogen-substituierte Toriazinylgruppe, eine Halogensubstituierte Pyrimidinylgruppe, eine Sulfonylhalogenidgruppe, eine Halogenacetylgruppe, eine Maleimidylgruppe und eine Aziridinylgruppe. Zusätzlich zu diesen reaktiven Substituenten umfassen Beispiele von reaktiven Substituenten weiter ein Halogenatom (der Ausdruck "Halogenatom", wie er hier verwendet wird, bedeutet irgendein Fluoratom, ein Chloratom, ein Bromatom oder ein Iodatom), eine Mercaptogruppe, Cyanogruppe, Nitrogruppe, eine Carboxylgruppe, eine Phosphorsäuregruppe, eine Sulfogruppe, eine Hydroxylgruppe, eine Aminogruppe, eine Isothiocyanatgruppe, eine Isocyanatgruppe, eine Alkoxygruppe mit einer Kohlenstoffzahl von 1 bis 8 (beispielsweise eine Methoxygruppe und eine Ethoxygruppe), eine Aryloxygruppe mit einer Kohlenstoffzahl von 6 bis 20 (beispielsweise eine Phenoxygruppe und eine Naphthoxygruppe), eine Alkoxycarbonylgruppe mit einer Kohlenstoffzahl von 2 bis 10 (beispielsweise eine Methoxycarbonylgruppe und eine Ethoxycarbonylgruppe), eine Aryloxycarbonylgruppe mit einer Kohlenstoffzahl von 6 bis 20 (beispielsweise eine Phenoxycarbonylgruppe), eine Acylgruppe mit einer Kohlenstoffzahl von 2 bis 10 (beispielsweise eine Acetylgruppe und eine Pivaloylgruppe), eine Acyloxygruppe mit einer Kohlenstoffzahl von 2 bis 8 (beispielsweise eine Acetyloxygruppe und eine Benzoyloxygruppe), eine Acylaminogruppe mit einer Kohlenstoffzahl von 2 bis 8 (beispielsweise eine Acetylaminogruppe), eine Sulfonylgruppe mit einer Kohlenstoffzahl von 1 bis 8 (beispielsweise eine Methansulfonylgruppe, eine Ethansulfonylgruppe und eine Benzolsulfonylgrup pe), eine Sulfinylgruppe mit einer Kohlenstoffzahl von 1 bis 20 (beispielsweise eine Methansulfinylgruppe, eine Ethansulfinylgruppe und eine Benzolsulfinylgruppe), eine Sulfonylaminogrupe mit einer Kohlenstoffzahl von 1 bis 8 (beispielsweise eine Methansulfonylaminogruppe, eine Ethansulfonylaminogruppe und eine Benzolsulfonylaminogruppe), eine Carbamoylgruppe mit einer Kohlenstoffzahl von 1 bis 10 (beispielsweise eine Carbamoylgruppe, eine Methylcarbamoylgruppe und eine Morpholinocarbamoylgruppe), eine substituierte Aminogruppe mit einer Kohlenstoffzahl von 1 bis 20 (beispielsweise eine Methylaminogruppe, eine Dimethylaminogruppe, eine Benzylaminogruppe, eine Anilinogruppe und eine Diphenylaminogruppe), eine Sulfamoylgruppe mit einer Kohlenstoffzahl von 2 bis 10 (beispielsweise eine Methylsulfamoylgruppe, eine Ethylsulfamoylgruppe und eine Piperidinsulfamoylgruppe), eine Ammoniumgruppe mit einer Kohlenstoffzahl von 0 bis 15 (beispielsweise eine Trimethylammoniumgruppe und eine Triethylammoniumgruppe), eine Hydrazinogruppe mit einer Kohlenstoffzahl von 0 bis 15 (beispielsweise eine Trimethylhydrazinogruppe), eine Ureidogruppe mit einer Kohlenstoffzahl von 1 bis 15 (beispielsweise eine Ureidogruppe und eine N,N-Dimethylureidogruppe), eine Imidgruppe mit einer Kohlenstoffzahl von 1 bis 15 (beispielsweise eine Succinimidgruppe), eine Alkylthiogruppe mit einer Kohlenstoffzahl von 1 bis 20 (beispielsweise eine Methylthiogruppe und eine Ethylthiogruppe), eine Arylthiogruppe mit einer Kohlenstoffzahl von 6 bis 20 (beispielsweise eine Phenylthiogruppe, eine p-Methylphenylthiogruppe, eine p-Chlorphenylthiogruppe, eine 2-Pyridylthiogruppe und eine Naphthylthiogruppe), eine substituierte oder unsubstituierte heterocyclische Gruppe mit einer Kohlenstoffzahl von 1 bis 20 (beispielsweise eine Pyridylgruppe, eine 5-Methylpyridylgruppe, eine Thienylgruppe, eine Furylgruppe, eine Morpholinogruppe, eine Tetrahydrofurylgruppe und eine 2-Pyradylgruppe), eine ungesättigte Kohlenwasserstoffgruppe mit einer Kohlenstoffzahl von 2 bis 18 (beispielsweise eine Vinylgruppe, eine Ethinylgruppe, eine 1-Cyclohexenylgruppe, eine Benzylydingruppe und eine Benzylidengruppe), eine gesättigte oder ungesättigte Arylgruppe mit einer Kohlenstoffzahl von 6 bis 20 (beispielsweise eine Phenylgruppe, eine 4-Sulfophenylgruppe, eine 2,5-Disulfophenylgruppe, eine 4-Carboxyphenylgruppe und eine Naphthylgruppe) und eine Alkylgruppe mit einer Kohlenstoffzahl von 1 bis 20 (beispielsweise eine Methylgruppe, eine Ethylgruppe und eine Propylgruppe).
Bevorzugte Beispiele von R¹ und R² umfassen eine Alkylgruppe mit 1 bis 15 Kohlenstoffatomen, die mit einer Carboxylgruppe, einer Isothiocyanatgruppe, einer Succinimidylestergruppe, einer Sulfonylhalogenidgruppe, einer Halogenacetylgruppe oder einer Maleimidylgruppe substituiert ist;
und eine Arylalkylgruppe mit einer Kohlenstoffzahl von 7 bis 20, die mit einer Carboxylgruppe, einer Isothiocyanatgruppe, einer Succinimidylestergruppe, einer Sulfonylhalogenidgruppe, einer Halogenacetylgruppe oder einer Maleimidylgruppe substituiert ist. Bevorzugtere Beispiele von R¹ und R² umfassen eine Alkylgruppe mit einer Kohlenstoffzahl von 1 bis 10, die mit einer Carboxylgruppe, einer Isothiocyanatgruppe oder einer Succinimidylestergruppe substituiert ist.
Beispiele von R³, R⁴ und R⁵ umfassen eine Alkylgruppe mit einer Kohlenstoffzahl von 1 bis 20, und die Alkylgruppe kann irgendwelche Substituenten, die als Beispiele von R¹ und R² erläutert wurden (bevorzugt sind reaktive Substituenten ausgeschlossen), in irgendeiner Stellung enthalten. R³ und R⁴ können miteinander einen gesättigten Kohlenstoffring bilden, und R⁵ und R⁶ können miteinander einen gesättigten Kohlenstoffring bilden. Solche gesättigten Kohlenstoffringe sind 3- bis 8-gliedrige Ringe, bevorzugt 5- oder 6-gliedrige Ringe. An dem Kohlenstoffring kann ein oder können mehrere Substituenten, wie Alkylgruppen vor handen sein. Beispiele von R³, R⁴, R⁵ und R⁶ umfassen bevorzugt Alkylgruppen mit Kohlenstoffzahlen von 1 bis 6, bevorzugter von 1 bis 3.
V¹, V², V³, V⁴, V⁵, V⁶, V⁷, V⁸, V⁹ und V¹⁰ bedeuten je unabhängig ein Wasserstoffatom oder einen einwertigen Substituenten. Typen von Substituenten, die durch V¹, V², V³, V⁹, V⁵, V⁶, V⁷, V⁸, V⁹ und V¹⁰ dargestellt werden, sind nicht besonders beschränkt, und sie können gleich oder unterschiedlich sein. Beispiele dieser Substituenten umfassen solche, die als Substituenten für die Alkylgruppen, die durch R¹ und R² dargestellt werden (einschließlich reaktiver Substituenten), erläutert wurden.
Zwei der Gruppen V¹ V² V³ V⁴ V⁵ V⁶ V⁷ V⁸ V⁹ und V¹⁰ die benachbart zueinander sind, können zusammen einen gesättigten oder ungesättigten Ring bilden. Beispiele von den gebildeten Ringen umfassen 5- bis 7-gliedrige Ringe. Ein kondensierter aromatischer Ring kann als ungesättigter Ring gebildet werden. Der ungesättigte Ring kann ein oder mehrere Heteroatome, wie ein Sauerstoffatom, Stickstoffatom, Schwefelatom, enthalten. An irgendeiner Stellung des so gebildeten Rings kann eine beziehungsweise können mehrere der Substituenten, wie sie bei den Alkylgruppen, die durch R¹ und R² dargestellt wurden, erläutert wurden, vorhanden sein, oder eine Alkylgruppe kann substituiert sein.
Bevorzugte Beispiele von V¹, V², V³, V⁴, V⁵, V⁶, V⁷, V⁸, V⁹ und V¹⁰ umfassen ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen (wobei die Substituenten reaktive Substituenten, wie sie bei den Alkylgruppen, dargestellt durch R¹ und R², erläutert wurden, umfassen, und sie können in irgendeiner Stellung substituiert sein), eine Arylgruppe mit einer Kohlenstoffzahl von 6 bis 20 (wobei die Substituenten reaktive Substituenten umfassen, die bei den Alkylgruppen, dargestellt durch R¹ und R², erläutert wurden, und sie können in irgendeiner Stellung vorhanden sein), ein Halogenatom, eine Thioalkylgruppe mit einer Kohlenstoffzahl von 1 bis 10, eine Alkylsulfongruppe mit einer Kohlenstoffzahl von 1 bis 10, eine Phosphorsäuregruppe, eine Carboxylgruppe, eine Sulfogruppe, eine Alkoxygruppe mit einer Kohlenstoffzahl von 1 bis 10, eine substituierte Aminogruppe, eine Isothiocyanatgruppe, eine Isocyanatgruppe, eine Succinimidylestergruppe, eine Halogen-substituierte Triazinylgruppe, eine Halogensubstituierte Pyrimidinylgruppe, eine Sulfonylhalogenidgruppe, eine Halogenacetylgruppe, eine Maleimidylgruppe und eine Aziridinylgruppe.
Bevorzugter sind ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, eine Arylgruppe mit einer Kohlenstoffzahl von 6 bis 20 (die mit einer Isothiocyanatgruppe, einer Isocyanatgruppe, einer Succinimidylestergruppe, einer Carboxylgruppe oder einer Sulfogruppe substituiert sein kann), eine Sulfogruppe, eine Alkoxygruppe mit einer Kohlenstoffzahl von 1 bis 10 (die mit einer Isothiocyanatgruppe, einer Isocyanatgruppe, einer Succinimidylestergruppe, einer Carboxylgruppe oder einer Sulfogruppe substituiert sein kann), eine Alkylthiogruppe mit einer Kohlenstoffzahl von 1 bis 20 (die mit einer Isothiocyanatgruppe, einer Isocyanatgruppe, einer Succinimidylestergruppe, einer Carboxylgruppe oder einer Sulfogruppe substituiert sein kann), eine Isothiocyanatgruppe, eine Succinimidylestergruppe, eine Sulfonylhalogenidgruppe, eine Halogenacetylgruppe und eine Maleimidylgruppe.
L¹, L² und L³ bedeuten je unabhängig eine substituierte oder unsubstituierte Methingruppe. Die Zahl, Stellung und die Art des Substituenten an der Methingruppe sind nicht besonders beschränkt, und zwei oder mehrere Substituenten, wenn vorhanden, können identisch oder unterschiedlich sein. Beispiele von Substituenten umfassen eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe mit einer Kohlenstoffzahl von 1 bis 15, bevorzugt 1 bis 10, und bevorzug ter 1 bis 5 (beispielsweise eine Methylgruppe, eine Ethylgruppe und eine Carboxyethylgruppe), eine substituierte oder unsubstituierte Arylgruppe mit einer Kohlenstoffzahl von 6 bis 30, bevorzugt 6 bis 20, bevorzugter 6 bis 15 (beispielsweise eine Phenylgruppe und eine o-Carboxyphenylgruppe), eine substituierte oder unsubstituierte heterocyclische Ringgruppe mit einer Kohlenstoffzahl von 3 bis 20, bevorzugt 4 bis 15, bevorzugter 6 bis 10 (beispielsweise eine N,N-Dimethylbarbituratgruppe), ein Halogenatom, eine Alkoxygruppe mit einer Kohlenstoffzahl von 1 bis 20, bevorzugt 1 bis 15, bevorzugter 1 bis 10 (beispielsweise eine Methoxygruppe und eine Ethoxygruppe), eine Aminogruppe mit einer Kohlenstoffzahl von 0 bis 20, bevorzugt 2 bis 15, bevorzugter 4 bis 15 (beispielsweise eine Methylaminogruppe, eine Dimethylaminogruppe, eine N-Methyl-N-phenylaminogruppe und eine N-Methylpiperazinogruppe), eine Alkylthiogruppe mit einer Kohlenstoffzahl von 1 bis 15, bevorzugt 1 bis 10, bevorzugter 1 bis 8 (beispielsweise eine Methylthiogruppe und eine Ethylthiogruppe), und eine Arylthiogruppe mit einer Kohlenstoffzahl von 6 bis 20, bevorzugt 6 bis 18, bevorzugter 6 bis 15 (beispielsweise eine Phenylthiogruppe und eine p-Methylthiogruppe). Zwei dieser Substituenten, die an L¹, L² und L³ vorhanden sein können, können zusammen einen Ring bilden. Beispielsweise können zwei dieser Substituenten, die an L¹, L² und L³ vorhanden sind, zusammen eine Alkylenkette mit einer Kohlenstoffzahl von 2 oder 3 bilden und einen Ring bilden.
p bedeutet 1, 2 oder 3, bevorzugt 1 oder 2. Der Fall, wenn p 1 bedeutet, ist am meisten bevorzugt, da in diesem Fall die Anregungseffizienz bei der Anregung mit einem Halbleiterlaser oder einem Heliumneonlaser (Anregungswellenlänge: 630 bis 650 nm) sehr hoch wird. Jeder von m, n, s oder t bedeutet 0 oder 1 und erfüllt die Bedingungen von m + n = 1 und s + t = 1.
M bedeutet ein Gegenion, und es kann ein positives oder negatives Ion sein. Die positiven Ionen können entweder anorganische positive Ionen oder organische positive Ionen sein, und sie können beispielsweise sein: Alkalimetallionen, einschließlich von Natriumionen, Kaliumionen und Lithiumionen, und die organischen Ionen umfassen Tetralkylammoniumionen und Pyridiniumionen. Das negative Ion kann entweder ein anorganisches negatives oder ein organisches negatives Ion sein, und es kann ein negatives Halogenidion (beispielsweise ein Fluoridion, Chloridion, Bromidion und ein Iodidion), ein substituiertes Arylsulfonation (beispielsweise ein p-Toluolsulfonation und p-Chlorbenzolsulfonation), ein Aryldisulfonation (beispielsweise 1,3-Benzoldisulfonation und 1,5-Naphthalindisulfonation), ein Alkylsulfation (beispielsweise ein Methylsulfation), ein Sulfation, ein Thiocyanation, ein Perchloration, ein Tetrafluorboration, ein Picration, ein Acetation und ein Trifluormethansulfonation sein. M kann ein Wasserstoffion sein. Bevorzugte Beispiele von Gegenionen umfassen ein Ammoniumion, ein Alkalimetallion, ein negatives Halogenidion, ein substituiertes Arylsulfonation, bevorzugter ein Alkalimetallion, ein negatives Halogenidion und ein substituiertes Arylsulfonation. q bedeutet eine Zahl, die erforderlich ist um die Ladung des Moleküls zu neutralisieren. Wenn eine Verbindung, die durch die allgemeine Formel (I) dargestellt wird, ein intramolekulares Gegenion bildet, kann q 0 bedeuten.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) können ein oder mehrere asymmetrische Kohlenstoffe, abhängig von den Arten der Substituenten, enthalten. Die vorliegende Erfindung umfasst irgendwelche Stereoisomeren, einschließlich optischer Isomere und Diastereoisomere, Gemische aus Stereoisomeren, und Racemate.
Bevorzugte Beispiele der Verbindungen, die durch die allgemeine Formel (I) dargestellt werden, werden im Folgenden aufgeführt, aber der Umfang der vorliegenden Erfindung ist nicht auf die folgenden spezifischen Verbindungen beschränkt.
Beispiele des Verfahrens zur Herstellung typischer Verbindungen werden in den Beispielen der vorliegenden Beschreibung beschrieben. Unter Bezugnahme auf die praktische Erläuterung, die in diesen Beispielen gegeben wird, kann ein Fachmann irgendwelche Verbindungen herstellen, die durch die obige Formel (I) dargestellt werden, durch geeignete Auswahl der Ausgangsverbindung, der Reaktionsbedingungen, der Reagentien, und ähnliche, und Modifizierung und Änderung der Verfahren, die in den Beispielen aufgeführt werden, sofern erforderlich. Es ist leicht verständlich, dass das Verfahren zur Herstellung der Verbindungen, die durch die allgemeine Formel (I) oben dargestellt werden, nicht besonders beschränkt ist, und dass Verbindungen, die durch irgendein Verfahren hergestellt wurden, bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Die Verbindungen, die durch die allgemeine Formel (I) dargestellt werden, werden ebenfalls in der japanischen Patentanmeldung Nr. 11-264845 beschrieben.
Die Verbindungen, die durch die allgemeine Formel (I) dargestellt werden, werden als fluoreszierende Markierungskomponenten in den erfindungsgemäßen fluoreszierenden Substanzen verwendet.
Verschiedene Verfahren für die Einführung der Verbindungen, die durch die allgemeine Formel (I) dargestellt werden, als fluoreszierende Markierung in ein Nukleotid und Avidin oder Streptavidin, sind bekannt, und Verfahren, die dem Fachmann geläufig sind, können auf geeignete Weise ausgewählt und verwendet werden. Beispielsweise kann eine funktionelle Gruppe, wie eine Aminogruppe oder eine Hydroxylgruppe, in ein Nukleotid oder eine Aminogruppe, eine Carboxylgruppe oder eine Hydroxylgruppe in Avidin oder Streptavidin direkt an einen reaktiven Substituenten, wie die Carboxylgruppe, oder an eine aktive Estergruppe in der Verbindung der allgemeinen Formel (I) über eine Ionenbindung oder kovalente Bindung gebunden werden oder nach che mischer Modifizierung, wie Einarbeitung einer Verbindungsgruppe (oder Linker) in ein Teil des Nukleotids, des Avidins oder des Streptavidins, können die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) umgesetzt werden.
Die fluoreszierende Substanz, die nach dieser Reaktion erhalten wird, kann nach allgemeinen Trennverfahren, wie Chromatographie, Elektrophorese und Umkristallisation, gereinigt werden.
2. Verwendung der erfindungsgemäßen fluoreszierenden Substanzen
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen fluoreszierenden Substanz. Die erfindungsgemäßen fluoreszierenden Substanzen können als fluoreszierende Nukleotide (im Folgenden als "fluoreszierendes Nukleotid" bezeichnet) verwendet werden, wenn A den Rest eines natürlichen oder synthetischen Nukleotids, Oligonukleotids oder Polynukleotids oder eines Derivats davon in der Formel: A-B-C bedeutet, und sie können als fluoreszierendes Avidin (im Folgenden als "erfindungsgemäßes fluoreszierendes Avidin" bezeichnet), wenn A den Rest von Avidin oder Streptavidin bedeutet, verwendet werden. Der Ausdruck "fluoreszierendes Nukleotid" umfasst in dieser Beschreibung alle Fälle, wenn A in der Formel A-B-C den Rest eines natürlichen oder synthetischen Nukleotids, Oligonukleotids oder Polynukleotids oder eines Derivats davon betrifft, und der Ausdruck "fluoreszierendes Avidin" umfasst in der vorliegenden Beschreibung beide Fälle, wenn A in der Formel A-B-C den Rest von Avidin oder Streptavidin bedeutet. Die Verwendung des erfindungsgemäßen fluoreszierenden Nukleotids und des erfindungsgemäßen fluoreszierenden Avidins wird im Folgenden näher erläutert.
(A) Verwendung der fluoreszierenden erfindungsgemäßen Nukleotide
Die erfindungsgemäßen fluoreszierenden Nukleotide können zur Detektion von Nukleinsäuren verwendet werden.
Wenn das erfindungsgemäße fluoreszierende Nukleotid für die DNA-Analyse, wie die Detektion von Nukleinsäuren, verwendet wird, kann das erfindungsgemäße fluoreszierende Nukleotid in eine Sonde oder einen Primer gemäß dem Ruth-Verfahren (Jerry L. Ruth, DNA, 3, 123, 1984) eingearbeitet werden. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung Fluoreszenz-markierter Nukleinsäuren, das umfasst die Stufe der Durchführung einer Reaktion der Synthese der Nukleinsäure unter Verwendung von Nukleinsäuresynthetase, einer Nukleinsäure als Matrize und des erfindungsgemäßen fluoreszierenden Nukleotids.
Beispiele von Nukleinsäuresynthetasen, die verwendet werden, umfassen, aber dies ist keine Beschränkung, DNA-Polymerase (jede DNR-Polymerase, wie Klenow-Enzym, Taq-DNA-Polymerase, und ähnliche), RNR-Polymerase, Umkehrtranskriptase oder terminale Transferase. Der Typ der Nukleinsäure als Matrize kann DNA oder RNA sein, und kann sein natürliche DNA oder RNA, rekombinante DNA oder RNA, chemisch synthetisierte DNA oder RNA. Die Synthesereaktion der Nukleinsäure kann bei solchen Bedingungen (beispielsweise Salzkonzentration, pH und Temperatur) durchgeführt werden, die für die enzymatische Reaktion unter Verwendung einer Matrizen-DNA, eines nicht-fluoreszierenden Nukleotidgemisches, dem erfindungsgemäßen fluoreszierenden Nukleotid und Nukleinsäuresynthetase geeignet sind. Dieses Verfahren für die Synthese von Nukleinsäuren sind dem Fachmann gut geläufig. Der Fachmann kann auf geeignete Weise Substanzen und Reagentien gemäß dem Zweck der Markierung auswählen.
Verschiedene Verfahren können zur Markierung der Nukleinsäuren (DNA oder RNA) unter Verwendung des erfindungsgemäßen fluoreszierenden Nukleotids verwendet werden.
Das Random-Prime-Verfahren ist eines der Verfahren für die Markierung von DNA, wobei ein Gemisch aus gegebenenfalls kombinierten Hexanukleotidsequenzen als Primer verwendet wird (d. h. ein Randomprimer), und der Randomprimer an eine Nukleinsäure, die markiert werden soll, hybridisiert wird. Ausgehend von dem 3'-OH-Terminus dieses Randomprimers wird ein Strang, komplementär zu dem Einzelstrang, unter Verwendung von DNA-Polymerase, wie eines Klenow-Enzyms oder einer anderen DNA-Polymerase, synthetisiert. 4 Typen von Desoxyribonukleotid, einem Substrat für DNA-Polymera-se, werden in den komplementären Strang eingeführt. Unter Verwendung des erfindungsgemäßen fluoreszierenden Nukleotids als ein Typ dieses Desoxyribonukleotids, wird komplementäre DNA, markiert mit dem fluoreszierenden Nukleotid, synthetisiert.
Anstelle des Randomprimers kann man eine Oligo-DNA mit einer spezifischen Sequenz (spezifischen Primer) verwenden. Der spezifische Primer bindet an den komplementären Bereich in einer Matrizen-DNA, dann beginnt die Synthese der DNA, komplementär zu der Matrizen-DNA, beginnend von dem 3'-OH-Terminus des spezifischen Primers. Wie im Falle des Randomprimer-Verfahrens wird das erfindungsgemäße fluoreszierende Nukleotid während der Synthese der komplementären DNA eingebaut, wobei eine fluoreszierende markierte komplementäre DNA synthetisiert wird.
Die Nick-Translation ist ein Verfahren, bei dem die Wirkung von DNase I auf doppelsträngige DNA ausgenutzt wird. Der Einfluss der DNA I erzeugt eine Spaltungsstelle, bei der die Matrize der doppelsträngigen DNA in einen Einzelstrang geschnitten wird. Gleichzeitig werden E. coli-DNA-Polymerase I, 4 Typen von Desoxyribonukleotiden, die Sub strate für dieses Enzym sind, und das erfindungsgemäße fluoreszierende Nukleotid zu dem Reaktionsgemisch gegeben. E. coli-DNA-Polymerase I spaltet das 5'-terminale Desoxyribonukleotid an dem gespaltenen Einzelstrang und insertiert gleichzeitig ein Substrat-Desoxyribonukleotid an der Stelle, benachbart zu dem freien 3'-OH-Terminus. Durch Wiederholen dieses Verfahrens bewegt sich die Spaltungsstelle in Richtung auf den 3'-Terminus. Indem das erfindungsgemäße fluoreszierende Nukleotid in dem Substrat-Nukleotid enthalten ist, kann eine fluoreszierende DNA durch Nick-Translation gebildet werden.
Zur Markierung des 3'-Terminus der doppel- oder einsträngigen DNA kann terminale Transferase verwendet werden, die ein Enzym ist um Desoxyribonukleotid oder Ribonukleotid an den 3'-OH-Terminus zu binden. Die terminale Transferase erfordert mindestens einen Typ von Desoxyribonukleotid oder Ribonukleotid als Substrat. Unter Verwendung des erfindungsgemäßen fluoreszierenden Nukleotids als Substrat für die terminale Transferase, können Fluoreszenz-markierte Nukleinsäuren, verlängert von dem 3'-OH-Terminus, synthetisiert werden.
Die Umkehrtranskription ist eine Reaktion zur Synthese komplementärer DNA aus einer einzelsträngigen RNA. Nach der Anlagerung eines Oligodesoxyribonukleotids als Primer an den komplementären Teil von RNA wird eine Verlängerungsreaktion unter Verwendung der Umkehrtranskriptioe durchgeführt, wobei ein DNA-Strang synthetisiert wird, der zu dem RNA-Strang komplementär ist, ausgehend von dem 3'-OH-Terminus des Primers. Bei dieser DNA-Synthese werden vier Typen von Desoxyribonukleotiden als Substrat für die Enzyme verwendet. Die Verwendung des erfindungsgemäßen fluoreszierenden Nukleotids als eins dieser Substrate erlaubt, dass das fluoreszierende Nukleotid in den verlängerten DNA-Strang während der Umkehrtranskription einge führt wird, so dass die fluoreszierend markierte DNA synthetisiert wird.
RNA, markiert mit dem erfindungsgemäßen fluoreszierenden Nukleotid, kann unter Verwendung des Enzyms, welches RNA aus DNA synthetisiert, synthetisiert werden. Solche Enzyme, die RNA aus DNA synthetisieren, umfassen RNA-Polymerase, die durch einen Phagen, wie SP6, codiert wird, T3 oder T7-RNA-Polymerase. Diese Enzyme sind solche für die Synthese doppelsträngiger DNA und RNA, enthaltend einen SP6-, T3- oder T7-Promotor, und vier Arten von Ribonukleotiden als Substrate. Unter Verwendung der erfindungsgemäßen fluoreszierenden Nukleotide als eines der Substrate kann Fluoreszenz-markierte RNA synthetisiert werden.
Alternativ können Nukleinsäuren, markiert mit dem erfindungsgemäßen fluoreszierenden Nukleotid, durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) synthetisiert werden. Bei der PCR werden Nukleinsäuren, die in einer biologischen Probe detektiert werden sollen, zu einem Einzelstrang denaturiert, und zwei Typen von Primern werden an die einsträngigen Nukleinsäuren angelagert. Nach der Anlagerung wird die Verlängerungsreaktion unter Verwendung von Polymerase (bevorzugt Taq-DNA-Polymerase) und Desoxyribonukleotiden als Enzymsubstrate durchgeführt. Komplementäre DNA wird, beginnend von dem 3'-OH-Terminus des Primers, synthetisiert, wobei eine doppelsträngige DNA gebildet wird. Durch Verwendung dieses Verfahrens kann die DNA, die in der Probe detektiert werden soll, vervielfacht werden. Unter Verwendung des erfindungsgemäßen fluoreszierenden Nukleotids als eins der Substrate während der Verlängerungsreaktion durch Taq-DNA-Polymerase, können Fluoreszenz-markierte Nukleotide amplifiziert werden.
Fluoreszierende Nukleinsäuren, markiert mit dem erfindungsgemäßen fluoreszierenden Nukleotid, hergestellt wie oben, können als Gensonden für die Detektion homologer Nukleinsäuresequenzen durch Hybridisierung verwendet werden. Das fluoreszierende Nukleotid, an das eine Zielnukleinsäure hybridisiert wurde, kann leicht detektiert werden, indem die Fluoreszenzintensität unter Verwendung eines Fluorometers gemessen wird.
Wie oben beschrieben, sind die erfindungsgemäßen fluoreszierenden Nukleotide nützlich als diagnostische Mittel oder als Reagens für die Detektion von Nukleinsäuren, da die erfindungsgemäßen fluoreszierenden Nukleotide für die Markierung von Gensonden verwendet werden können.
Wenn das fluoreszierende erfindungsgemäße Nukleotid als diagnostisches Mittel oder als Reagens für die Detektion von Nukleinsäuren verwendet wird, kann es in Form einer Reagenszusammensetzung in Kombination mit einem oder mehreren Typen von Additiven vorliegen. Beispielsweise kann das Reagens in gewünschter Form, wie einer Lösung, unter Verwendung eines oder mehrerer geeigneter Additive, einschließlich eines Puffers, eines Solubilisierungsmittels, eines pH-Modifizierungsmittels und eines Konservierungsmittels, hergestellt werden. Der Fachmann kann auf geeignete Weise die Form des Reagens und das Verfahren zu seiner Herstellung auswählen.
Das erfindungsgemäße fluoreszierende Nukleotid kann in Form eines Kits für die Detektion von Nukleinsäuren, zusammen mit einem Enzym, das bei der oben beschriebenen Nukleinsäure-Biosynthesereaktion verwendet werden kann, einem Puffer und einem ähnlichen Mittel, geliefert werden. Typen von Reagentien, die in dem Kit enthalten sein können, können auf geeignete Weise entsprechend dem Zweck des Kits ausgewählt werden. Solche Reagentien können umfassen ein Gemisch aus einem oder mehreren (bevorzugt vier) nicht-fluoreszieren-den Nukleotiden, gereinigtem Wasser oder ähnlichem, zusätzlich zu dem fluoreszierenden Nukleotid, der Nukleinsäuresynthetase und dem Puffer. Der Kit kann weiter Randomprimer, einen Oligo-dT-Primer oder einen spezifischen Primer, entsprechend dem Zweck, enthalten.
(B) Verwendung des erfindungsgemäßen Fluoreszenz-Avidins
Das erfindungsgemäße Fluoreszenz-Avidin kann zur Detektion biologischer Komponenten, wie Nukleinsäure und Proteine oder Zucker, verwendet werden. Bei der Verwendung des fluoreszierenden erfindungsgemäßen Avidins für die DNA-Analyse, wie die Detektion von Nukleinsäuren, ist es beispielsweise bevorzugt, dass das Biotin vorab in eine Sonde oder einen Primer, die beziehungsweise der durch das erfindungsgemäße fluoreszierende Avidin detektiert werden soll, eingearbeitet wird. Wenn das erfindungsgemäße Fluoreszenz-Avidin zu einer Sonde oder einem Primer mit Biotin gegeben wird, kuppeln Biotin und (Strept)avidin zusammen unter Komplexbildung, bedingt durch die Affinität zwischen ihnen. Durch Messungen der Fluoreszenz des Komplexes kann eine Sonde oder ein Primer detektiert werden.
Ein Verfahren zur Herstellung der Biotin-markierten Sonde oder des Biotin-markierten Primers ist dem Fachmann geläufig. Beispielsweise können Biotin-markierte Nukleinsäuren unter Verwendung eines Biotin-markierten Nukleotids (beispielsweise biotinyliertes dUTP) gemäß einem Verfahren, das ein Random-Prime-Verfahren, ein Nick-Translationsverfahren und ein terminales Transferaseverfahren umfasst, oder durch Umkehrtranskription, Polymerase-Kettenreaktion (PCR), oder ähnlichen, synthetisiert werden. Die so erhaltene Biotin-markierte Nukleinsäure kann als Sonde oder Primer, die durch das erfindungsgemäße Fluoreszenz-Avidin detektiert werden soll, verwendet werden.
Ähnlich kann das erfindungsgemäße Fluoreszenz-Avidin zur Analyse von Proteinen verwendet werden. Beispielsweise wird ein Biotin-markierter Antikörper mit einer biologischen Probe, dann mit dem erfindungsgemäßen fluoreszieren den Avidin unter Bildung eines Komplexes zwischen dem markierten Antikörper und dem erfindungsgemäßen fluoreszierenden Avidin umgesetzt. Die Anwesenheit des Biotinmarkierten Antikörpers, die ein Anzeichen für die Anwesenheit des Zielproteins in der biologischen Probe ist, kann durch Messung der Fluoreszenz dieses Komplexes detektiert werden.
Beispielsweise kann die Anwesenheit von Krebszellen oder Krebsgewebe nachgewiesen werden durch Markierung eines Anti-Tumor-Antikörpers mit Biotin, Behandeln des markierten Antikörpers mit Geweben oder Organen, und dann Umsetzung des Produkts mit dem erfindungsgemäßen fluoreszierenden Avidin. Für die Diagnose kann beispielsweise ein Gewebeschnitt in einem Mikroskop beobachtet werden, indem er gemäß einem geeigneten Verfahren, wie dem Paraffinverfahren, fixiert wird, oder der Gewebeschnitt kann mit einem Endoskop nach immunochemischer Färbung des biologischen Gewebes beobachtet werden. Kürzlich wurden verschiedene Fluoreszenz-Abbildungsverfahren unter Verwendung von im nahen Infrarot fluoreszierenden Substanzen vorgeschlagen (beispielsweise offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 9-309845; J. Neurosurg., 87, S. 738–745, 1997; Medical Electronics and bioengineering, 34, S. 316–322, 1996). Das erfindungsgemäße fluoreszierende Avidin kann als diagnostisches Mittel für Fluoreszenz-Abbildungsverfahren verwendet werden.
Die Fluoreszenz des erfindungsgemäßen fluoreszierenden Avidins, an die eine Biotin-Komponente in einer Substanz, die detektiert werden soll (Nukleinsäure, Protein oder Zucker), gebunden ist, kann leicht durch Messung der Fluoreszenzintensität unter Verwendung eines Fluorometers detektiert werden. Wie oben beschrieben wurde, ist das fluoreszierende Avidin der vorliegenden Erfindung als Reagens zur Analyse biologischer Komponenten verwendbar.
Für die Verwendung des erfindungsgemäßen fluoreszierenden Avidins als Analysereagens oder als diagnostisches Mittel kann es in Form einer Reagenszusammensetzung in Kombination mit einer oder mehreren Arten von Additiven geliefert werden. Beispielsweise kann das Reagens in der gewünschten Form als Lösung unter Verwendung eines oder mehrerer geeigneter Additive, einschließlich eines Puffers, eines Solubilisierungsmittels, eines pH-Modifizierungsmittels und eines Konservierungsmittels, hergestellt werden. Der Fachmann kann auf geeignete Weise die Art des Reagens und das Verfahren zu seiner Herstellung auswählen.
Das erfindungsgemäße fluoreszierende Avidin kann in Form eines analytischen Kits, zusammen mit Biotip oder Biotinmarkierten Substanzen, geliefert werden. Der Typ des Reagens, das in dem Kit enthalten ist, kann auf geeignete Weise, entsprechend dem Zweck des Kits, ausgewählt werden. Zusätzlich zu dem erfindungsgemäßen fluoreszierenden Avidin und Biotip oder einer Biotip-markierten Substanz (beispielsweise eines Biotip-markierten Nukleotids oder eines Biotip-markierten Antikörpers) können ein Primer (beispielsweise ein Randomprimer, ein Oligo-dT-Primer und ein spezifischer Primer), ein Nukleotidgemisch, ein Puffer, gereinigtes Wasser oder ähnliches, ebenfalls in Kombination verwendet werden, abhängig von dem Zweck des Kits.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Diese Beispiele dienen nur zur Erläuterung und sollen den Rahmen der vorliegenden Erfindung nicht beschränken.
BEISPIELE
Jede der Verbindungen 1, 4, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 17 und 18 bis 22, die in den folgenden Synthesebeispielen synthetisiert werden, entsprechen den Verbindungen X-1, X-4, X-6, X-7, X-9, X-10, X-11, X-12, X-13, X-14, X-17 und X-18 bis X-22, die hier als bevorzugte Verbindungen erläutert werden.
Synthesebeispiel 1: Synthese von Verbindung 1
Das Syntheseschema der Verbindung 1 wird im Folgenden dargestellt:
(Synthese der Verbindung 1b)
Die Verbindung 1a (2,36 g, 10 mmol) wird in Aceton (10 ml) gelöst, Ethyl-6-bromhexanoat (3,3 g, 15 mmol) wird zugegeben, und das Gemisch wird am Rückfluss 5 Stunden erhitzt. Bei dieser Reaktion findet die Alkylierung am heterocyclischen Stickstoff (Indolringteil) statt, anstatt an der Zielstelle. Jedoch wird eine Ölkomponente durch Zugabe von Ethylacetat (50 ml) und Hexan (50 ml) zu der Reaktionslösung gebildet und durch Dekantieren abgetrennt. Ethylacetat (10 ml) und Isopropylalkohol (5 ml) werden zu diesem Öl gegeben, und das Gemisch wird am Rückfluss 30 Minuten erhitzt, wobei nur eine Kristallisation nur der Verbindung 1b stattfindet, welche das Produkt von Interesse ist, bei dem der Pyridinring Stickstoff quaternär ist.
Menge: 2,8 g, Ausbeute: 60%
(Synthese der Verbindung 1c)
Die Verbindung 1b (2,3 g, 5 mmol) wird in einer Lösungsmittelmischung aus Pyridin (5 ml) und Essigsäure (2 ml) gelöst. Triethylorthoformiat (1 ml) und Triethylamin (1 ml) werden zugegeben, und das Gemisch wird bei 140°C 1 Stunde umgesetzt. Durch Zugabe von Ethylacetat (50 ml) zu der Reaktionslösung scheidet sich ein Feststoff, der die Verbindung 1c enthält, ab. Der Feststoff wird abfiltriert und für die folgende Reaktion ohne Reinigung verwendet.
Masse (posi): 768
(Synthese der Verbindung 1)
Die Gesamtmenge der oben erwähnten ungereinigten Verbindung 1c wird in Methanol (10 ml), Tetrahydrofuran (5 ml) und Wasser (10 ml) gelöst. 10%ige Natriumhydroxidlösung (5 ml) werden zugegeben, und dann wird das Gemisch bei Raumtemperatur 30 Minuten umgesetzt. Nach der Zugabe einer gesättigten Natriumbicarbonatlösung (10 ml) zu der Reaktionslösung wird das Gemisch im Vakuum konzentriert um Rohkristalle der Verbindung 1 abzuscheiden. Die Rohkristalle werden durch Gelfiltration (SEPHADEX LH-20) gereinigt, wobei die Verbindung 1 erhalten wird.
Menge: 0,7 g, Ausbeute 40% (aus der Verbindung 1b)
Masse (nega): 709 (M-Na)
Absorptionsmaximum (Methanol): 634 nm
Molekularabsorptionskoeffizient: 190.000
Synthese Beispiel 2: Synthese der Verbindung 4
Die Verbindung 4 wird gemäß dem gleichen Verfahren wie die Verbindung 1, mit der Ausnahme, dass die Verbindung 1a durch 5-(3-Methoxyphenyl)-7-azaindolenin ersetzt ist, synthetisiert.
Masse (nega): 769 (M-Na)
Absorptionsmaximum (Methanol): 636 nm
Molekularabsorptionskoeffizient: 190.000
Synthesebeispiel 3: Synthese der Verbindung 9
Die Verbindung 9 wird auf gleiche Weise wie Verbindung 1 synthetisiert, mit der Ausnahme, dass die Verbindung 1a durch 5-Benzofuranyl-7-azaindolenin ersetzt ist.
Masse (nega): 790 (M-Na)
Absorptionsmaximum (Methanol): 658 nm
Molekularabsorptionskoeffizient: 200.000
Synthesebeispiel 4: Synthese der Verbindung 6
Das Syntheseschema der Verbindung 6 wird im Folgenden erläutert:
(Synthese der Verbindung 6b)
Die Verbindung 6a (2,7 g, 10 mmol) wird in Aceton (10 ml ) gelöst, Iodmethan (4,3 g, 30 mmol) wird zugegeben, und das Gemisch wird am Rückfluss 2 Stunden erhitzt. Die schwachgelben Kristalle der Verbindung 6b, die sich nach 1 Stunde nach Beginn der Reaktion abzuscheiden beginnen, werden durch Zugabe von Ethylacetat (20 ml) abfiltriert, wobei die Verbindung 6b erhalten wird.
Menge: 3,2 g, Ausbeute: 80%
Masse (posi): 281
(Synthese der Verbindung 6c)
Die Verbindung 6b (4,1 g, 10 mmol), N,N'-Diphenylformamidin (9,8 g, 50 mmol) und Essigsäureanhydrid (5 ml) werden vermischt und bei 60°C 1 Stunde und dann bei 100°C 3 Stunden umgesetzt.
Ethylacetat (50 ml) wird zu der Reaktionslösung zur Abscheidung der Verbindung 6c gegeben.
Menge: 3,3 g, Ausbeute 60% Masse (posi) : 426
(Synthese der Verbindung 6d)
Die Verbindung 6a (2,66 g, 10 mmol) wird in Dimethylformamid (10 ml) gelöst, und Ethyl-6-bromhexanoat (5,9 g, 30 mmol) wird zugegeben, und anschließend wird bei 120°C 1,5 Stunden umgesetzt. Bei dieser Reaktion findet die Alkylierung des heterocyclischen Stickstoffs (Indolringteil) nicht an der Zielstelle statt. Jedoch wird eine Ölkomponente durch Zugabe von Ethylacetat (50 ml) zu der Reaktionslösung gebildet, durch Abdekantieren abgetrennt und mit Diethylether kristallisiert, wobei nur die Verbindung 6d erhalten wird, die das Produkt von Interesse ist, wobei der Pyridinring-Stickstoff quaternär ist.
Menge: 2,3 g; Ausbeute: 60%
Masse (posi): 380
(Synthese der Verbindung 6)
Die Verbindung 6c (2,76 g, 5 mmol) und die Verbindung 6d (1,9 g, 5 mmol) werden in Dimethylformamid (20 ml) gelöst, und Triethylamin (2 ml) werden zugegeben, und anschließend wird bei Raumtemperatur 30 Minuten umgesetzt.
Die rohen Kristalle der Verbindung 6 werden durch Zugabe von Ethylacetat (30 ml) zu der Reaktionslösung abgeschieden.
Die erhaltenen rohen Kristalle werden durch Umkristallisation aus Methanol gereinigt, wobei die Verbindung 6 erhalten wird.
Menge: 1,8 g, Ausbeute: 55%
Masse (nega): 671
Absorptionsmaximum (Methanol): 637 nm
Molekularabsorptionskoeffizient: 190.000
Synthesebeispiel 5: Synthese der Verbindung 7
Die Verbindung 6 (0,67 g, 1 mmol) wird in Dimethylformamid (2 ml) gelöst, und Schwefelrolioxiddimethylformamid-Komplex (0,76 g, 5 mmol) wird zugegeben, und anschließend wird bei 90°C 5 Stunden umgesetzt. Aceton (30 ml) wird zu der Reaktionslösung zur Abscheidung der Rohkristalle der Verbindung 7 zugegeben, welche abfiltriert werden. Die rohen Kristalle werden in Methanol gelöst, und Kaliumacetat (0,5 g) wird zur Durchführung einer Salzbildungsreaktion zugegeben, wobei sich die Verbindung 7 abscheidet.
Menge: 0,59 g, Ausbeute: 65%
Masse (nega): 868
Absorptionsmaximum (Methanol): 640 nm
Molekularabsorptionskoeffizient: 190.000
Synthesebeispiel 6: Synthese der Verbindung 10
Das Syntheseschema der Verbindung 10 wird im Folgenden angegeben:
(Synthese der Verbindung 10b)
Die Verbindung 10a (2,76 g, 10 mmol) wird in Aceton (10 ml) gelöst, Butansulfon (2,0 g, 15 mmol) wird zugegeben, und das Gemisch wird am Rückfluss 5 Stunden zur Abscheidung der Verbindung 10b erhitzt. Ethylacetat (20 ml) wird zugegeben, dann wird die Verbindung abfiltriert.
Menge: 3,3 g, Ausbeute. 80%
Masse (posi): 412
(Synthese der Verbindung 10c)
Die Verbindung 10b (4,1 g, 10 mmol), N,N'-Diphenylformamidin (9,8 g, 50 mmol) und Essigsäureanhydrid (5 ml) werden vermischt und bei 60°C 1 Stunde und bei dann 100°C 3 Stunden umgesetzt.
Ethylacetat (50 ml) wird zu der Reaktionslösung zur Abscheidung der Verbindung 10c gegeben.
Menge: 2,8 g, Ausbeute: 50%
Masse (posi): 557
Synthese der Verbindung 10 e)
Die Verbindung 10e wird aus der Verbindung 10d gemäß dem Verfahren für die Synthese der Verbindung 6d synthetisiert.
Masse (posi): 380
(Synthese der Verbindung 10)
Die Verbindung 10c (2, 79 g, 5 mmol) und die Verbindung 6d (1, 9 g, 5 mmol) werden in Dimethylformamid (20 ml) gelöst. Triethylamin (2 ml) wird zugegeben, und das Gemisch wird bei Raumtemperatur 30 Minuten umgesetzt.
Durch Zugabe von Methylacetat (30 ml) zu der Reaktionslösung scheiden sich die Rohkristalle der Verbindung 10 ab.
Die Rohkristalle werden durch Umkristallisation aus einer Lösungsmittelmischung aus Methanol und Chloroform gereinigt, wobei die Verbindung 10 erhalten wird.
Menge: 1,8 g, Ausbeute: 45%
Masse (nega): 803
Absorptionsmaximum (Methanol): 646 nm
Molekularabsorptionskoeffizient: 190.000
Synthesebeispiel 7: Synthese der Verbindung 11
Die Verbindung 10 (0,80 g, 1 mmol) wird in Dimethylformamid (2 ml) gelöst, und ein Schwefelrolioxiddimethylformamid-Komplex (0,46 g, 3 mmol) wird zugegeben. Anschließend wird für 5 Stunden bei 90°C umgesetzt. Aceton (30 ml) wird zu der Reaktionslösung zur Abscheidung der Rohkristalle der Verbindung 11 zugegeben, welche abfiltriert werden. Die Rohkristalle werden in Methanol gelöst, und Kaliumacetat (0,5 g) wird zur Durchführung einer Salzbildungsreaktion zugegeben, wobei sich die Verbindung 11 abscheidet.
Menge. 0,46 g, Ausbeute: 50%
Masse (nega): 882
Absorptionsmaximum (Methanol): 648 nm
Molekularabsorptionskoeffizient: 190.000
Synthesebeispiel 8: Synthese der Verbindung 12
Die Verbindung 12 wird gemäß dem Verfahren für die Synthese der Verbindung 10 synthetisiert.
Masse (nega): 803
Absorptionsmaximum (Methanol): 646 nm
Molekularabsorptionskoeffizient: 190.000
Synthesebeispiel 9: Synthese der Verbindung 13
Die Verbindung 13 wird gemäß dem Verfahren für die Synthese der Verbindung 11 synthetisiert.
Masse (nega) : 882
Absorptionsmaximum (Methanol): 648 nm
Molekularabsorptionskoeffizient: 190.000
Synthesebeispiel 10: Synthese der Verbindung 14
Das Syntheseschema der Verbindung 14 wird im Folgenden erläutert:
(Synthese der Verbindung 14b)
Die Verbindung 14a (1,9 g, 10 mmol) wird in Aceton (10 ml) gelöst, Iodmethan wird zugegeben, und das Gemisch wird am Rückfluss 2 Stunden erhitzt. Die Kristalle, die sich durch Zugabe von Methylacetat (40 ml) zu der Reaktionslösung abscheiden, werden abfiltriert, wobei die Verbindung 14b erhalten wird.
Menge: 4,0 g, Ausbeute: 85%
Masse (posi): 349
(Synthese der Verbindung 14c)
Die Verbindung 14b (2,4 g, 5 mmol) wird einer Lösungsmittelmischung aus Pyridin (5 ml) und Essigsäure (2 ml) gelöst. Triethylorthoformiat (1 ml) und Triethylamin (1 ml) werden zugegeben, und das Gemisch wird bei 140°C 1 Stunde umgesetzt. Durch Zugabe von Ethylacetat (50 ml) und Hexan (50 ml) zu der Reaktionslösung scheidet sich ein Feststoff, der die Verbindung 14c enthält, ab. Der Feststoff wird abfiltriert und für die folgende Reaktion ohne Reinigung verwendet.
Masse (posi): 708
(Synthese der Verbindung 14)
Die Gesamtmenge der obigen ungereinigten Verbindung 14c wird in Methanol (10 ml), Tetrahydrofuran (5 ml) und Wasser (10 ml) gelöst. Eine Lösung von 10% Natriumhydroxid (5 ml) wird zugegeben, und das Gemisch wird bei Raumtemperatur 2 Stunden umgesetzt. Nach der Zugabe von gesättigter Natriumbicarbonatlösung (10 ml) zu der Reaktionslösung wird das Gemisch im Vakuum konzentriert, wobei Rohkristalle der Verbindung 14 erhalten werden. Die Rohkristalle werden durch Gelfiltration (SEPHADEX LH-20) gereinigt, wobei die Verbindung 14 erhalten wird.
Ausbeute: 0,59 g, Ausbeuterate: 35% (aus der Verbindung 14b)
Masse (nega): 650 (M-Na)
Absorptionsmaximum (Methanol): 632 nm
Molekularabsorptionskoeffizient: 170.000
Synthesebeispiel 11: Synthese der Verbindung 17
Das Syntheseschema der Verbindung 17 wird im Folgenden dargestellt:
(Synthese der Verbindung 17b)
Die Verbindung 17a (2,6 g, 16,2 mmol) wird in Aceton (10 ml) gelöst, Ethyl-6-bromhexanoat (3,6 g, 16,2 mmol) wird zugegeben, und das Gemisch wird am Rückfluss 5 Stunden erhitzt. Bei dieser Reaktion findet die Alkylierung am heterocyclischen Stickstoff-Indolring an anderer Stelle als der Zielstelle statt. Jedoch bildet sich eine Ölkomponente durch Zugabe von Ethylacetat (50 ml) und Hexan (50 ml) zu der Reaktionslösung, welche durch Rbdekantieren abgetrennt wird, und Ethylacetat (10 ml) und Isopropylalkohol (5 ml) werden zu diesem Öl gegeben, und dieses Gemisch wird am Rückfluss 30 Minuten erhitzt, wobei eine Kristallisation von nur der Verbindung 17b stattfindet, die das Produkt von Interesse ist, bei der der Pyridinring-Stickstoff quaternär ist.
Menge: 4,0 g, Ausbeute: 65%
Masse (posi): 337
(Synthese der Verbindung 17c)
Die Verbindung 17b (4,0 g, 10,4 mmol) wird in einer Lösungsmittelmischung aus Pyridin (5 ml) und Essigsäure (2 ml) gelöst. Triethylorthoformiat (2 ml) und Triethylamin (0,5 ml) werden zugegeben, und anschließend wird bei 140°C während 1 Stunde umgesetzt. Durch Zugabe von Ethylacetat (50 ml) und Hexan (50 ml) zu der Reaktionslösung scheidet sich ein Feststoff, der die Verbindung 17c enthält, ab. Der Feststoff wird abfiltriert und für die nächste Reaktion ohne Reinigung verwendet.
Masse (posi): 615
(Synthese der Verbindung 17)
Die Gesamtmenge der obigen ungereinigten Verbindung 17c wird in Methanol (10 ml) und Wasser (10 ml) gelöst. Eine Lösung von 10% Natriumhydroxid (5 ml) wird zugegeben, und das Gemisch wird bei Raumtemperatur 30 Minuten umgesetzt. Nach der Zugabe von gesättigter Natriumbicarbonatlösung (10 ml) zu der Reaktionslösung scheiden sich Rohkristalle der Verbindung 17 bei Vakuumkonzentration ab. Die Rohkristalle werden durch Gelfiltration (SEPHADEX LH-20) gereinigt, wobei die Verbindung 17 erhalten wird.
Menge: 1,5 g, Ausbeute: 50% (aus der Verbindung 17b)
H-NMR (DMSO-d6) δ; 8,90 (t, 1H), 8,08 (d, 2H), 7,80 (d, 2H), 6,98 (t, 2H), 6,00 (d, 2H), 4,42 (t, 4H), 2,13 (t, 4H), 1,78 (m, 4H), 1,58 (m, 4H), 1,37 (s, 12H), 1,12 (m, 4H)
Absorptionsmaximum (Methanol): 609 nm
Molekularabsorptionskoeffizient: 120.000
Synthesebeispiel 12: Synthese der Verbindung 18
Die Verbindung 18 wird auf gleiche Weise gemäß dem Verfahren, das für die Verbindung 1 verwendet wurde, syntheti siert, mit der Ausnahme, dass die Verbindung 1a durch 5-(4-Methylphenyl)-7-azaindolenin ersetzt wurde.
Masse (nega): 738 (M-Na)
Absorptionsmaximum (Methanol): 636 nm
Molekularabsorptionskoeffizient: 190.000
Synthesebeispiel 13: Synthese der Verbindung 19
Die Verbindung 18 wird in konzentrierter Schwefelsäure gelöst, und das Gemisch wird bei 100°C 30 Minuten umgesetzt. Die Reaktionslösung wird mit Eis gekühlt, und der pH wird auf pH 8 mit 10%iger Natriumhydroxidlösung eingestellt, anschließend wird im Vakuum konzentriert. Der erhaltene Rückstand wird durch Sephadex LH20 dreimal gereinigt, wobei die Verbindung 19 erhalten wird.
Masse (nega): 942 (M-Na)
Absorptionsmaximum (Methanol): 636 nm
Molekularabsorptionskoeffizient: 190.000
Synthesebeispiel 14: Synthese der Verbindung 20
Die Verbindung 20 wird auf gleiche Weise gemäß dem Verfahren, das für die Verbindung 6 verwendet wurde, synthetisiert, mit der Ausnahme, dass die Verbindung 6a durch 5-(4-Methylphenyl)-7-azaindolenin ersetzt wurde.
Masse (nega): 639 (M-Na)
Absorptionsmaximum (Methanol): 636 nm
Molekularabsorptionskoeffizient: 190.000
Synthesebeispiel 15: Synthese der Verbindung 21
Die Verbindung 21 wird auf gleiche Weise gemäß dem Verfahren, das für die Verbindung 19 verwendet wurde, synthetisiert, mit der Ausnahme, dass die Verbindung 18 durch die Verbindung 20 ersetzt wurde.
Masse (nega): 798 (M-K)
Absorptionsmaximum (Methanol): 638 nm
Molekularabsorptionskoeffizient: 195.000
Synthesebeispiel 16: Synthese der Verbindung 22
Das Syntheseschema der Verbindung 22 wird im Folgenden näher erläutert:
(Synthese der Verbindung 22b)
Die Verbindung 22a (5,0 g, 19 mmol) wurde in 47%igem Bromwasserstoff in Wasser (50 ml) gelöst, und das Gemisch wurde am Rückfluss 3 Stunden erhitzt. Nach dem Abkühlen der Reaktionslösung auf Raumtemperatur wird Wasser zur Kristallisation der Verbindung 22b gegeben.
Menge: 3,8 g, Ausbeute: 80%
Masse (posi): 253 (M + H)
(Synthese der Verbindung 22c)
Die Verbindung 22b (3,0 g, 12 mmol) wird in Dimethylformamid (30 ml) gelöst, und unter Eiskühlung werden 62,5%iges Natriumhydrid (0,46 g, 12 mmol) und Propansulfon (1,5 g, 12 mmol) zugegeben, und anschließend wird 1 Stunde umgesetzt. Ethylacetat und Isopropylalkohol werden zu der Reaktionslösung zur Kristallisation der Verbindung 22c gegeben.
Menge: 4,4 g, Ausbeute: 93%
Masse (nega) : 373 (M-Na)
(Synthese der Verbindung 22d)
Die Verbindung 22c (3,0 g, 7,6 mmol) wird in Dimethylformamid (5 ml) gelöst, und Ethyl-6-bromhexanoat (3,3 g, 15 mmol) wird zugegeben, und anschließend wird bei 120°C 6 Stunden umgesetzt. Bei dieser Reaktion findet eine Alkylierung am heterocyclischen Stickstoff-Indolringteil an anderer Stelle als der Zielstelle statt. Es wurde Isopropylalkohol (5 ml) zu der Reaktionslösung gegeben, das Gemisch wurde am Rückfluss während 30 Minuten erhitzt, nur die Verbindung 22b wurde kristallisieren gelassen, die das Produkt von Interesse ist, bei der der Pyridinring-Stickstoff quaternär ist.
Menge: 2,8 g, Ausbeute: 72%
Masse (posi): 488 (M-Na)
(Synthese der Verbindung 22)
Die Verbindung 10c (2,79 g, 5 mmol) und die Verbindung 22d (2,6 g, 5 mmol) werden in Dimethylformamid (100 ml) gelöst, und Triethylamin (2 ml) wird zugegeben, und anschließend wird bei 40°C 1 Stunde umgesetzt.
Ethylacetat (30 ml) wird zu der Reaktionslösung zur Abscheidung von Rohkristallen der Verbindung 22 gegeben.
Die erhaltenen Rohkristalle werden durch Umkristallisation aus einer Lösungsmittelmischung aus Methanol und Chloroform gereinigt, wobei die Verbindung 22 erhalten wird.
Menge: 1,8 g, Ausbeute: 40%
Masse (nega): 910 (M-Na)
Absorptionsmaximum (Methanol): 648 nm
Molekularabsorptionskoeffizient: 195.000
Beispiel 1: Synthese der Verbindung 17-dUTP-Konjugat
5 mg (2,5 Teile) der Verbindung 17 wurden in 0,1 M MES (2-Morpholinoethansulfonsäure)-Puffer (2 ml) gelöst, dann wurden 3,66 mg (5 Teile) WSC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid)hydrochlorid und 4,20 mg (5 Teile) Sulfo-NHS-(N-hydroxysulfosuccinimid) zugegeben, und anschließend wurde bei Raumtemperatur 15 Minuten gerührt. Nach der Zugabe von 2,2 mg Aminoallyl-dUTP (Sigma), gelöst in 200 μl 0,1 M MES-Puffer, wurde die Reaktion bei Raumtemperatur während 2 Stunden durchgeführt. Nach der Zugabe von 100 μl 1 M Tris-Puffer (pH 7,5) und Beendigung der Reaktion, wurde die erhaltene Reaktionslösung an einer Säule absorbiert, die vorab mit 8 g ODS-Silica (YMC-ODS-AQ 120A) gefüllt worden war, und dann wurde mit einer 30%igen Methanollösung eluiert. Nach dem Konzentrieren des Eluierungsmittels wurde es weiter durch präparative Zwischendruckchromatographie (YAMAZEN Ultrapack ODS-S-40B) gereinigt, wobei das Produkt von Interesse mit 95%iger Reinheit (Ausbeute: 71%) erhalten wurde.
MS-Analysewert: M-1128
Beispiel 2: Synthese der Verbindung 14-dUTP-Konjugat
5,5 mg (2,5 Teile) der Verbindung 14 wurden in 200 μl DMSO gelöst, dann wurden 3,1 mg (5 Teile) WSC-Hydrochlorid und 3,55 mg (5 Teile) Sulfo-NHS zugegeben, und anschließend wurde bei Raumtemperatur 15 Minuten gerührt. Nach der Zugabe von 2,2 mg Aminoallyl-dUTP (Sigma), gelöst in 2 ml 0,1 M MES-Puffer, wurde eine Reaktion bei Raumtemperatur während 2 Stunden durchgeführt. Nach der Zugabe von 100 μl 1 M Tris-Puffer (pH 7,5) und Beendigung der Reaktion wurde die erhaltene Reaktionslösung an einer Säule absorbiert, die vorab mit 8 g ODS-Silica (YMC-ODS-AQ 120A) gefüllt worden war, und dann wurde mit einer 45%igen Methanollösung eluiert. Nach dem Konzentrieren des Eluats wurde es weiter durch präparative Zwischendruckchromatographie (YAMAZEN Ultrapack ODS-S-40B) gereinigt, wobei das Produkt von Interesse mit 94%iger Reinheit (Ausbeute: 66%) erhalten wurde.
MS-Analysewert: M-1206
Beispiel 3: Synthese der Verbindung 1-dUTP-Konjugat
6,00 mg (2,5 Teile) der Verbindung 1 wurden in 200 μl DMSO gelöst, dann wurden 3,1 mg (5 Teile) WSC-Hydrochlorid und 3,55 mg (5 Teile) Sulfo-NHS zugegeben, und anschließend wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten gerührt. Nach der Zugabe dazu von 2,2 mg Aminoallyl-dUTP (Sigma), gelöst in 2 ml 0,1 M MES-Puffer, wurde eine Reaktion bei Raumtemperatur während 2 Stunden durchgeführt. Nach der Zugabe von 100 μl 1 M Tris-Puffer (pH 7,5) und Beendigung der Reaktion wurde die erhaltene Reaktionslösung an einer Säule absorbiert, die vorab mit 8 g ODS-Silica (YMC-ODS-AQ 120A) gefüllt worden war, und dann wurde mit einer 50%igen Methanollösung eluiert. Nach dem Konzentrieren des Eluats wurde es weiter durch präparative Zwischendruckchromatographie (YAMAZEN Ultrapack ODS-S-40B) gereinigt, wobei das Produkt von Interesse mit 92%iger Reinheit (Ausbeute: 74%) erhalten wurde.
MS-Analysewert: M-1266
Beispiel 4: Synthese der Verbindung 10-dUTP-Konjugat
3,27 mg (1,0 Teile) der Verbindung 10 wurden in 200 μl DMSO gelöst, dann wurden 0,76 mg (1,1 Teile) WSC-Hydrochlorid und 0,86 mg (1,1 Teile) Sulfo-NHS zugegeben, und anschließend wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten gerührt. Nach der Zugabe dazu von 2,2 mg Aminoallyl-dUTP (Sigma), gelöst in 2 ml 0,1 M MES-Puffer, wurde eine Reaktion bei Raumtemperatur während 2 Stunden durchgeführt. Nach der Zugabe von 100 μl 1 M Tris-Puffer (pH 7,5) und Beendigung der Reaktion wurde die erhaltene Reaktionslösung an einer Säule absorbiert, die vorab mit 8 g ODS-Silica (YMC-ODS-AQ 120A) gefüllt worden war, und dann wurde mit einer 40%igen Methanollösung eluiert. Nach dem Konzentrieren des Eluats wurde es weiter durch präparative Zwischendruckchromatographie (YAMAZEN Ultrapack ODS-S-40B) gereinigt, wobei das Produkt von Interesse mit 95%iger Reinheit (Ausbeute: 77%) erhalten wurde.
MS-Analysewert: M-1359
Beispiel 5: Synthese der Verbindung 19-dUTP-Konjugat
1,00 mg (1,0 Teil) der Verbindung 19 wurde in 300 μl 0,1 M MES-Puffer gelöst, dann wurden 0,44 mg (2,2 Teile) WSC-Hydrochlorid und 0,50 mg (2,2 Teile) Sulfo-NHS zugegeben, und anschließend wurde bei Raumtemperatur 60 Minuten gerührt. Nach der Zugabe dazu von 0,25 mg (0,4 Teile) Aminoallyl-dUTP (Sigma) und 300 μl 1 M Carbonat-Puffer (pH 9,0), wurde die Reaktion bei Raumtemperatur über Nacht durchgeführt. Nach der Zugabe von 100 μl 1 M Tris-Puffer (pH 7, 5) und Beendigung der Reaktion wurde die erhaltene Reaktionslösung durch präparative Zwischendruckchromatographie (YAMAZEN Ultrapack ODS-S-40B) gereinigt, wobei das Produkt von Interesse mit 90%iger Reinheit (Ausbeute: 62%) erhalten wurde.
MS-Analysewert: M-1513
Beispiel 6: Synthese der Verbindung 22-dUTP-Konjugat
1,00 mg (1,0 Teil) der Verbindung 22 wurde in 300 μl 0,1 M MES-Puffer gelöst, dann wurden 0,23 mg (1,1 Teile) WSC-Hydrochlorid und 0,26 mg (1,1 Teile) Sulfo-NHS zugegeben, und anschließend wurde bei Raumtemperatur 60 Minuten gerührt. Nach der Zugabe dazu von 0,66 mg (1,0 Teil) Aminoallyl-dUTP (Sigma) und 300 μl 1 M Carbonat-Puffer (pH 9,0), wurde die Reaktion bei Raumtemperatur über Nacht durchgeführt. Nach der Zugabe von 100 μl 1 M Tris-Puffer (pH 7, 5) und Beendigung der Reaktion wurde die erhaltene Reaktionslösung durch präparative Zwischendruckchromatographie (YAMAZEN Ultrapack ODS-S-40B) gereinigt, wobei das Produkt von Interesse mit 96%iger Reinheit (Ausbeute: 44%) erhalten wurde.
MS-Analysewert: M-1503
Verwendungsbeispiel 1: Herstellung einer Fluoreszenzmarkierten DNA-Sonde für die Transkription
Humane Leber-mRNA (Clontech) (0,5 μg) und Oligo-dT-Primer (dT_18-21 Gibco BRL) (0, 5 μg) wurden vermischt, bei 70°C 10 Minuten erhitzt und auf Eis abgeschreckt. Zu dem Gemisch wurden RNaseOUT (Gibco BRL) (40E), dATP (500 μM), dGTP (500 μM), dCTP (500 μM), dTTP (200 μM), die Verbindung 17-dUTP-Konjugat, erhalten gemäß Beispiel 1 (100 μM), SuperScriptII-Umkehrtranskriptase (Gibco BRL) (400E) und DEPC-behandeltes Wasser (bis zu einer Gesamtmenge von 20 μl) gegeben, und das Gemisch wurde bei 42°C 2 Stunden umgesetzt. Nach der Reaktion wurden EDTA und NaOH zugegeben, und dann wurde bei 65°C während 1 Stunde inkubiert um die Reaktion zu beendigen und die mRNA zu zersetzen. Die Reaktionslösung wurde in eine CentriSep-Säule (PRINCETON SEPARATION, INC) eingeführt, und die nicht-umgesetzte Verbindung 17-dUTP-Konjugat oder ähnliche wurden zur Reinigung des Produkts entfernt.
Als Kontrolle wurde die Umkehrtranskriptionsreaktion auf gleiche Weise, wie oben angegeben, unter Verwendung eines Kontroll-Fluoreszenz-Nukleotids (Cy5-AP3-dUTP, Amersham Pharmacia Biotech), markiert mit einem Farbstoff (Cy5) anstelle der Verbindung 17-dUTP-Konjugat durchgeführt, und das erhaltene Reaktionsprodukt wurde gereinigt.
Nach der Reinigung wurde jede der Reaktionslösungen der Agarosegelelektrophorese unterworfen. Das Gel wurde mit SYBR Green II (Molekularsonden) angefärbt und mit FLA2000 (Fuji Photo Film co., Ltd.) gescannt. Als Ergebnis wurde gefunden, dass eine intensivere und schärfere Fluoreszenz mit der erfindungsgemäßen Verbindung 17-dUTP-Konjugat als mit der Vergleichsprobe erhalten wurde.
Die Fluoreszenzintensität wurde mit einem Fluorometer gemessen, und die Menge an DNA wurde bei der Absorption von 260 nm gemessen. Aus diesen Ergebnissen wurden sowohl die Aufnahmerate als auch die Fluoreszenzintensität pro 1 μM der Sonde berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt. Aus Tabelle 1 ist erkennbar, dass sowohl die Aufnahmerate, als auch die Fluoreszenzintensität höher waren, wenn die erfindungsgemäße Verbindung 17-dUTP-Konjugat verwendet wurde.
Tabelle 1
Verwendungsbeispiel 2: Herstellung einer Fluoreszenzfarbstoff-markierten DNA-Sonde gemäß PCR
Zusammensetzung der PCR-Reaktionslösung:
Matrizen-DNA: 10 pg
Primer 1 und 2: Je 0,5 μM
dATP, dGTP, dCTP: Je 200 μM
dTTP: Je 150 μM
Verbindung 17-dUTP-Konjugat oder Cy5-AP3-dUTP: 50 μM
Pyrobest DNA-Polymerase (TAKARA): 0,5 Einheiten
Destilliertes Wasser: Gesamtmenge bis zu 20 μl
Bemerkung: Als Matrizen-DNA wurde pCR-Script^TMSK(+) (STRATAGENE), in das ein α-2-HS-Glicoproteingen integriert war, verwendet, und jede Sequenz der Primer 1 beziehungsweise 2 waren tggccgcctt caacgctcag (SEQ ID NO: 1 im Sequenzproto koll) und tcaggcactt tcattaacag gcacat (SEQ ID NO: 2 im Sequenzprotokoll).
Unter Verwendung der Lösung der obigen Zusammensetzung als PCR-Reaktionslösung wurde ein Zyklus bei 94°C während 30 Sekunden, 60°C während 30 Sekunden und 72°C während 30 Sekunden 30 Mal für die PCR-Reaktion wiederholt. Die Reaktionslösung wurde in eine CentriSep-Säule (PRINCETON SEPARATION, INC) gegeben, und nicht-umgesetzte fluoreszierende Nukleotide und ähnliche wurden zur Reinigung des Produkts entfernt. Nach der Reinigung wurde die Reaktionslösung der Agarosegelelektrophorese unterworfen. Das Gel wurde mit SYBR Green II (Molekularsonden) angefärbt und mit FLA2000 (Fuji Photo Film co., Ltd.) gescannt. Als Ergebnis wurde gefunden, dass eine intensivere und schärfere Fluoreszenz mit der erfindungsgemäßen Verbindung 17-dUTP-Konjugat als mit der Vergleichsprobe erhalten wurde.
Die Fluoreszenzintensität wurde mit einem Fluorometer gemessen, und die Menge an DNA wurde bei einer Extinktion von 260 nm gemessen. Aus diesen Ergebnissen wurde sowohl die Aufnahmerate als auch die Fluoreszenzintensität pro 1 μM der Sonde berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt. Aus Tabelle 2 ist erkennbar, dass sowohl die Aufnahmerate als auch die Fluoreszenzintensität höher waren, wenn die erfindungsgemäße Verbindung 17-dUTP-Konjugat verwendet wurde.
Tabelle 2
Beispiel 7: Synthese eines Streptavidin-Verbindung-1-Konjugats
1. Aktivierung des Fluoreszenzfarbstoffs
Zu 100 μl DMSO-Lösung, enthaltend 24 mg/ml der Verbindung 1, wurden nacheinander gegeben: 31 μl DMSO-Lösung, enthaltend 48 mg/ml WSC (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) und 36 μl DMSO-Lösung, enthaltend 48 mg/ml sufoNHS (Dojin Do Laboratories), und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde gerührt.
2. Synthese des Streptavidin-Verbindung 1-Konjugats
Zu 300 μl 100 nM Carbonat-Puffer (pH 8,3), enthaltend 4 mg/ml Streptavidin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), wurden 83 μl der oben hergestellten, aktivierten Form des Fluoreszenzfarbstoffs (Verbindung 1) gegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde gerührt. Die Reaktionslösung wurde durch Gelfiltration unter Verwendung von 100 mM Phosphatpuffer (pH 7,5) von NAP25 (Pharmacia) zur Entfernung des nicht-umgesetzten Fluoreszenzfarbstoffs unterworfen.
Beispiel 8: Synthese eines Streptavidin-Verbindung 10-Konjugats
1. Aktivierung des Fluoreszenzfarbstoffs
Zu 100 μl DMSO-Lösung, enthaltend 24 mg/ml der Verbindung 10, wurden nacheinander gegeben: 29 μl DMSO-Lösung, enthaltend 48 mg/ml WSC (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) und 33 μl DMSO-Lösung, enthaltend 48 mg/ml sufoNHS (Dojin Chemicals Co.), und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde gerührt.
2. Synthese von Streptavidin und Fluoreszenzfarbstoff
Zu 300 μl 100 nM Carbonat-Puffer (pH 8,3), enthaltend 4 mg/ml Streptavidin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), wurden 83 μl der oben hergestellten, aktivierten Form des Fluoreszenzfarbstoffs (Verbindung 10) gegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde gerührt. Die Reaktionslösung wurde der Gelfiltration unter Verwendung von 100 mM Phosphatpuffer (pH 7,5) von NAP25 (Pharmacia) zur Entfernung des nicht-umgesetzten Fluoreszenzfarbstoffs unterworfen.
Beispiel 9: Synthese des Streptavidin-Verbindung 14-Konjugats
1. Aktivierung des Fluoreszenzfarbstoffs
Zu 100 μl DMSO-Lösung, enthaltend 12 mg/ml der Verbindung 14, wurden nacheinander gegeben: 16 μl DMSO-Lösung, enthaltend 48 mg/ml WSC (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) und 17 μl DMSO-Lösung, enthaltend 48 mg/ml sufoNHS (Dojin Chemicals Co.), und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde gerührt.
2. Synthese von Streptavidin und Fluoreszenzfarbstoff
Zu 150 μl 100 nM Carbonat-Puffer (pH 8,3), enthaltend 4 mg/ml Streptavidin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), wurden 40 μl der oben hergestellten, aktivierten Form des Fluoreszenzfarbstoffs (Verbindung 14) gegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde gerührt. Die Reaktionslösung wurde der Gelfiltration unter Verwendung von 100 mM Phosphatpuffer (pH 7,5) von NAP25 (Pharmacia) zur Entfernung des nicht-umgesetzten Fluoreszenzfarbstoffs unterworfen.
Beispiel 10: Bestätigung des Streptavidin-Fluoreszenzfarbstoff-Konjugats
Unter Verwendung des Streptavidin-Verbindung 14-Konjugats, synthetisiert gemäß Beispiel 9, wurde die Konjugation von Streptavidin an die Verbindung 14 wie folgt bestätigt.
Spreptoavidin (2,5 μg), ein Streptavidin-Verbindung 14-Konjugat (3,6 μg) und ein Molekulargewichtsmarker (1,7 μg) wurden der SDS-PAGE-Elektrophorese gemäß Standardverfahren unterworfen. Das Gel wurde mit FLA2000 (Fuji Photo Film Co., Ltd.) zur Messung der Fluoreszenz gescannt. Als Ergebnis wurden Fluoreszenzbanden an den Stellungen von ungefähr 15 kDa und etwa 30 kDa in der Bahn, die das Streptavidin-Verbindung 14-Konjugat der Elektrophorese unterworfen worden war, detektiert. Es ist bekannt, dass Spreptoavidin ein tetrameres Protein ist, bei dem 4 Untereinheiten zusammen vorhanden sind, und dass es ein Molekulargewicht von etwa 60 kDa besitzt. Es wird angenommen, dass jede der etwa 15 kDa- und etwa 30 kDa-Banden, die, wie oben beschrieben, detektiert wurden, monomeren beziehungsweise dimeren Untereinheiten entspricht.
Das gleiche Gel wurde mit Cypro-orange zur Detektion des Proteins angefärbt. Als Ergebnis wurden in der Bahn des Streptavidin-Verbindung 14-Konjugats Fluoreszenzbanden in den Positionen von etwa 15 kDa und etwa 30 kDa detektiert.
Aus den obigen Ergebnissen wurde gefunden, dass das Streptavidin-Verbindung 14-Konjugat, das fluoreszierend ist, synthetisiert worden war.
Verwendungsbeispiel 3
Jede der 2- bis 512fach verdünnten Lösungen (1 μl), erhalten durch Verdünnung verschiedener Biotin-markierter PCR-Produkte (20, 200, 500, 1.000 und 1.500 bp (jedes 90 ng/ml)), die für α-2-HS-Glycoprotein codieren, wurden auf eine Nylonmembran (Hybond/Amersham Pharmacia) aufgetüpfelt, an der Luft getrocknet und UV-vernetzt. Die Membran wurde gewaschen und mit DIGWash und Block Set (Roche) blockiert. Dann wurde die Membran mit Avidin-Fluoreszenzfarbstoff (Proteinkonzentration: 3 μg/ml), der in Beispiel 7 hergestellt worden war, imprägniert und bei Raumtemperatur 30 Minuten stehen gelassen. Nach dem Waschen mit der obigen Waschlösung wurde die Membran mit FLA2000 (Fuji Photo Film Co., Ltd.) zur Messung der Fluoreszenz gescannt.
Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt.
Wie aus 1 folgt, wurde beobachtet, dass die Fluoreszenzintensität von der Menge der Ziel-Nukleinsäure (PCR-Produkt) abhängt. Aus dem Verwendungsbeispiel 3 wurde bestätigt, dass die Verwendung des erfindungsgemäßen Fluoreszenz-Streptavidins die Detektion und quantitative Bestimmung der Zielsubstanz ermöglicht.
Industrielle Anwendbarkeit
Die erfindungsgemäßen Fluoreszenz-Nukleotide sind neue Verbindungen. Da sowohl die Aufnahmerate während der DNA-Synthese und die Fluoreszenzintensität nach der Aufnahme ausgezeichnet sind, sind sie als Markierungssubstanzen für Nukleinsäuren nützlich. Das erfindungsgemäße fluoreszierende Avidin ist eine neue Substanz und ist als Reagens für die Analyse biologischer Komponenten, wie Nukleinsäuren, Proteine oder Zucker, nützlich.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Fluoreszierende Substanz, dargestellt durch die Formel A-B-C, worin A den Rest eines natürlichen oder synthetischen Nukleotids, Oligonukleotids oder Polynukleotids bedeutet, und an B an einer Basengruppierung in dem Rest gebunden ist, oder worin A den Rest von Avidin oder Streptavidin bedeutet; B eine zweiwertige Verbindungsgruppe oder eine einfache Bindung bedeutet; und C eine einwertige Gruppe, die sich von der allgemeinen Formel (I) ableitet, bedeutet und an B an den reaktiven Gruppen, die in R¹ oder R² vorhanden sind, bindet:
worin R¹ und R² jeweils unabhängig eine Alkylgruppe, die mit einer reaktiven Gruppe, die covalent an A-B- binden kann, bedeuten, R³, R⁴, R⁵ und R⁶ jeweils unabhängig eine Alkylgruppe bedeuten und R³ und R⁴ und/oder R⁵ und R⁶ aneinander unter Bildung eines gesättigten Kohlenstoffrings, zusammen mit einem oder mehreren Kohlenstoffatomen, an das sie gebunden sind, gebunden sein können; V¹, V², V³, V⁴, V⁵, V⁶, V⁷, V⁸, V⁹ und V¹⁰ jeweils unabhängig ein Wasserstoff atom oder einen einwertigen Substituenten bedeuten, und zwei benachbarte Gruppen davon unter Bildung eines Rings gebunden sein können; L¹, L² und L³ eine substituierte oder unsubstituierte Methingruppe bedeuten; jedes von m, n, s und t 0 oder 1 bedeutet, mit der Maßgabe, dass m + n = 1 und s + t = 1; p 1, 2 oder 3 bedeutet; M ein Gegenion bedeutet; und q die Zahl bedeutet, die erforderlich ist um die Ladung des Moleküls zu neutralisieren.
Fluoreszierende Substanz nach Anspruch 1, wobei mindestens eines von R¹ und R² eine Alkylgruppe mit 1 bis 15 Kohlenstoffatomen, die mit einer Carboxylgruppe, einer Isothiocyanatgruppe, einer Succinimidylestergruppe, einer Sulfonylhalogenidgruppe, einer Halogenacetylgruppe oder einer Maleimidylgruppe substituiert ist, bedeutet.
Fluoreszierende Substanz nach Anspruch 1, worin mindestens eines von R¹ und R² eine Alkylgruppe, substituiert mit einer Carboxylgruppe, bedeutet.
Fluoreszierende Substanz nach Anspruch 1, worin A der Rest eines natürlichen oder synthetischen Nukleotids, Oligonukleotids oder Polynukleotids bedeutet.
Fluoreszierende Substanz nach Anspruch 1, worin A der Rest eines Nukleotids bedeutet.
Fluoreszierende Substanz nach Anspruch 1, worin A der Rest eines natürlichen oder synthetischen Nukleotids bedeutet, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (1) Nukleotiden, bestehend aus AMP, ADP, ATP, GMP, GDP, GTP, CMP, CDP, CTP, UMP, UDP, UTP, TMP, TDP, TTP, 2-Me-AMP, 2-Me-ADP, 2-Me-ATP, 1-Me-GMP, 1-Me-GDP, 1-Me-GTP, 5-Me-CMP, 5-Me-CDP, 5-Me-CTP, 5-MeO-CMP, 5-MeO-CDP und 5-MeO-CTP; und (2) Desoxynukleotiden und Didesoxynukleotiden, entsprechend den Nukleotiden.
Fluoreszierende Substanz nach Anspruch 1, worin A den Rest von Avidin oder Streptavidin bedeutet.
Fluoreszierende Substanz nach Anspruch 1, worin B eine Verbindungsgruppe, ausgewählt aus -CH₂-, -CH=CH-, -C≡C-, -CO-, -O-, -S-, -NH- oder Kombinationen davon bedeutet, wobei ein Wasserstoffatom an der Verbindungsgruppe weiter mit einem Substituenten substituiert sein kann.
Fluoreszierende Substanz nach Anspruch 1, worin B eine Aminoallylgruppe bedeutet.
Verfahren zur Herstellung Fluoreszenz-markierter Nukleinsäuren, umf assend die Stufe Durchführung einer Synthesereaktion von Nukleinsäure unter Verwendung von Nukleinsäure-Synthetase, einer Nukleinsäure als Matrize und der fluoreszierenden Substanz nach Anspruch 4.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Synthesereaktion der Nukleinsäure eine Reaktion ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Umkehrtranskriptions-Reaktion, einer terminalen Transferase-Reaktion, einem Random-Prime-Verfahren, einem PCR-Verfahren und einem Nick-Translations-Verfahren.
Nukleinsäuresonde oder -primer, markiert mit der fluoreszierenden Substanz nach Anspruch 4.
Diagnostisches Mittel oder Reagens zur Detektion von Nukleinsäuren, umfassend die fluoreszierende Substanz nach Anspruch 4.
Kit zur Detektion von Nukleinsäure, umfassend (1) die fluoreszierende Substanz nach Anspruch 4, (2) eine Nukleinsäure-Synthetase und (3) einen Puffer.
Analytisches Reagens oder diagnostisches Mittel, zusammengesetzt aus der fluoreszierenden Substanz nach Anspruch.
Analytischer Kit, umfassend (1) die fluoreszierende Substanz nach Anspruch 7 und (2) Biotin oder eine Biotinmarkierte Substanz.