DE60108799T2

DE60108799T2 - Fluoreszente Nucleotide, enthaltend einen Cyanin, Merocyanin- oder Styryl-Farbstoff, zur Erkennung von Nucleinsäuren

Info

Publication number: DE60108799T2
Application number: DE60108799T
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Asaka-shi Shinoki; Hiroko Asaka-shi Inomata; Masayoshi Asaka-shi Kojima; Yukio Asaka-shi Sudo; Osamu Asaka-shi Seshimoto
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 2000-04-10
Filing date: 2001-04-10
Publication date: 2006-04-27
Anticipated expiration: 2021-04-11
Also published as: EP1152008A3; EP1152008B1; US20020064782A1; EP1152008A2; DE60108799D1; US7109314B2; JP2001288197A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein fluoreszierendes Nucloetid und dessen Verwendung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Eine der am meisten verwendeten molekularbiologischen Techniken zur Erfassung von homologen Nucleinsäuresequenzen ist die DNA/DNA-, RNA/RNA- oder RNA/DNA-Hybridisierung. Bei dieser Technik wird die als Sonde verwendete Nucleinsäure (DNA oder RNA) markiert, und die markierte Nucleinsäure wird an eine zu erfassende Nucleinsäure (DNA oder RNA) hybridisiert. Wenn die als eine Sonde verwendete Nucleinsäure eine Homologie gegenüber der zu erfassenden Nucleinsäure aufweist, hybridisiert jede einzelsträngige Nucleinsäure an ihre komplementäre Sequenz, so dass eine doppelsträngige Sequenz gebildet wird, worauf die doppelsträngige Sequenz durch eine Markierung der Sonde erfasst wird.
Herkömmlicherweise ist, wenn Nucleinsäure als eine Sonde verwendet wird, eine Technik der Markierung der Sonde mit einem Radioisotop angewendet worden, und die Anwesenheit einer Hybridisierung zwischen der Sonde und der Ziel-Nucleinsäure ist durch Audioradiographie erfasst bzw. festgestellt bzw. gemessen worden.
Obgleich die Technik der Verwendung von Radioisotopen zur Markierung einer Gensonde aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit äußerst gut geeignet ist, bestehen doch solche Probleme, dass die Handhabung der Radioisotope kompliziert ist, weil die Sicherheit des Laboratoriums gewährleistet sein muss und weil spezielle Maßnahmen zum Entsorgen von radioaktiven Abfällen durchgeführt werden müssen. Dazu kommt noch, dass die Radioisotope nur über eine begrenzte Zeit verwendet werden können, da sie eine Halbwertszeit haben.
Wegen der oben genannten Gründe sind schon nicht-radioaktive Markierungstechniken als einfachere Techniken entwickelt worden. So sind z.B. Techniken der Markierung einer Gensonde mit Biotinmolekülen (EP-PS Nr. 0 063 879) oder mit Digoxigeninmolekülen (europäische Patentanmeldung Nr. 0 324 474 A1) bekannt. Nach der Hybridisierung einer markierten Nucleinsonde um die Nucleinsäuresequenz zu erfassen, sind Biotinmoleküle oder Digoxigeninmoleküle in der resultierenden doppelsträngigen Nucleinsäure vorhanden. Nach der Hybridisierung gestattet die Bindung eines (Strept)avidin-Marker-Enzymkomplexes oder eines Antidigoxigenin-Antikörper-Marker-Enzymkomplexes an die resultierende doppelsträngige Nucleinsäuresequenz eine Erfassung der Nucleinsäuren, an die die Sonden hybridisiert sind. Jedoch sind solche Erfassungsmethoden unter Verwendung von Enzymen hinsichtlich der Empfindlichkeit und der Spezifität nicht zufriedenstellend.
Es sind auch schon verschiedene andere Techniken als die obigen der Markierung einer Zielsubstanz mit einem fluoreszierenden Farbstoff untersucht worden. Ein anzustrebendes fluoreszierendes Markierungsmittel (1) besitzt eine hohe Fluoreszenz-Quantenausbeute, (2) besitzt einen molekularen Absorptionskoeffizienten, (3) ist wasserlöslich und es erfährt durch Agglutinierung in einer wässrigen Lösung keine Selbstauslöschung, (4) es ist gegenüber einer Hydrolyse nicht empfindlich, (5) es photodissoziiert nicht leicht, (6) es ist gegenüber einer Hintergrundfluoreszenz nicht empfänglich, und (7) es weist einen zuvor eingeführten reaktiven Substituenten auf, der eine kovalente Bindung mit einer Zielsubstanz eingeht.
Fluoresceinisothiocyanat (FITC) und Rhodaminisothiocyanat, die als fluoreszierende Markierungsreagentien gut bekannt sind, besitzen zwar hohe Fluoreszenz-Quantenausbeuten, haben aber dahingehend Nachteile, dass ihre molekularen Absorptionskoeffizienten niedrig sind und dass die Anregungs- und Leuchtwellenlänge 500 nm bis 600 nm beträgt. Daher sind diese Reagentien gegenüber dem Einfluss einer Hintergrundfluoreszenz einer zum Blotting verwendeten Membran empfindlich.
Als Farbstoffe mit hohem molekularem Absorptionskoeffizient sind z.B. Polymethinfarbstoffe bekannt, wie der Cyaninfarbstoff, beschrieben in der US-PS Nr. 5 486 616, den JP-OSen Nr. 2-191674, 5-287209, 5-287266, 8-47400, 9-127115, 7-145148 und 6-222059, und das Barbiturat Oxonol, beschrieben in Journal of Fluorescence, 5, 231, 1995, bekannt. Es bestehen jedoch einige Probleme dahingehend, dass diese Stoffe in Wasser fast unlöslich sind und dass, wenn sie aufgelöst werden, eine Hydrolyse erfolgt. Auch können starke intermolekulare Wechselwirkungen zwischen den Farbstoffen die Bildung von Aggregaten in einem wässrigen Medium bewirken, so dass oftmals ein Selbstquenchen bzw. ein Selbstauslöschen der Fluoreszenz beobachtet wird.
Weiterhin sind die in der JP-OS Nr. 2-191674 und der gleichen beschriebenen Cyaninfarbstoffe zwar überlegene Farbstoffe, weil sie eine Wasserlöslichkeit aufgrund der Einführung einer Sulfonsäuregruppe in ein relativ stabiles Chromophor haben und weil die Bildung von Aggregaten verhindert wird. Jedoch bestehen einige Probleme dahingehend, dass die Aufnahmeeffizienz der Fluoreszenznucleotide durch Synthesereaktionen der Nucleinsäuren, z.B. eine reverse Transkriptionsreaktion, schlecht ist.
Die US-PS Nr. 5 986 086 beschreibt Nucleotide oder Nucleoside, angeheftet an einen nicht-sulfonierten Cyaninfarb stoff, und Nucleotide oder Nucleoside, angefügt an ein Fluoreszenz-Markierungsmittel mit bestimmten Formeln.
Die US-PS Nr. 5 808 043 beschreibt die Herstellung eines markierten Nucleotids, umfassend mindestens eine Verbindung mit einer Mg²⁺-Assoziationskonstanten zwischen 1 × 10^–11 bis 1 × 10^–2 einschließlich. Die Verbindung wird vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus Citraten, Isocitraten, Phosphaten, EGTA, EDTA und CDTA ausgewählt. Die Konzentration der Verbindung beträgt vorzugsweise mindestens 5 mM.
Die US-PS Nr. 5 569 587 beschreibt eine Methode zur Erfassung einer Komponente einer wässrigen Flüssigkeit, umfassend die Zugabe zu der Flüssigkeit eines lumineszierten Farbstoffs, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Cyanin-, Merocyanin- und Styrylfarbstoffen, enthaltend mindestens eine Sulfonsäure- oder Sulfonatgruppe angefügt an einen aromatischen Kern, und die Umsetzung des Farbstoffs mit der Komponente. Die markierte Komponente wird dann durch ein optisches Erfassungsverfahren erfasst.
Zhu et al. (Nucleic Acids Research, 1994, Bd. 22, Nr. 16, 3418–3422) beschreiben direkt markierte fluoreszierende DNA-Sonden, die durch eine Nick-Translation und PCR unter Verwendung von dUTP, angeheftet an die fluoreszierende Markierung, Cy3, mit Verbindungsgruppen mit unterschiedlicher Länge hergestellt worden sind.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die oben genannten Probleme der herkömmlichen Techniken zu überwinden. Daher ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein fluoreszierendes Nucleotid zur Verfügung zu stellen, das für die Markierung von Nucleinsäuren wirksam ist.
Nach Durchführung von intensiven Untersuchungen zur Lösung der oben genannten Probleme, haben die benannten Erfinder einen Komplex eines Nucleotids mit einem fluoreszierenden Markierungsreagens mit niedriger negativer Ladung hergestellt und eine Nucleinsäure unter Verwendung dieses Komplexes markiert und erfasst. Als Ergebnis haben die Erfinder gefunden, dass das Aufnahmeverhältnis in die Nucleinsäure stark erhöht wird. Die vorliegende Erfindung ist auf der Basis dieser Auffindungen vervollständigt worden.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein fluoreszierendes Nucleotid, dargestellt durch die Formel: A-B-C, worin A für einen Rest eines natürlichen oder synthetischen Nucleotids, Oligonucleotids, Polynucleotids oder Derivats davon steht und an B an einer Basengruppierung in obgenannten Rest bindet; B für eine divalente Verknüpfungsgruppe oder eine Einfachbindung steht; und C für eine monovalente Gruppe, die von einem Fluoreszenzfarbstoff ohne Sulfonsäuregruppe und ohne Phosphorsäuregruppe in einem Molekül und mit einer Sulfonamidgruppe oder einer niederen Alkoholgruppe abgeleitet ist, steht; wobei der Fluoreszenzfarbstoff ein Cyanin-, Merocyanin- oder Styrylfluoreszenzfarbstoff ist.
Vorzugsweise ist der Cyanin-, Merocyanin- oder Styrylfluoreszenzfarbstoff ein Fluoreszenzfarbstoff der folgenden Formeln
Cyanin
Merocyanin
Styryl worin X und Y jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus O, S und C(CH₃)₂ ausgewählt sind; m eine ganze Zahl, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 1, 2, 3 und 4 ist; R¹ und R² jeweils unabhängig für ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe stehen, die mit einer reaktiven Gruppe substituiert sein kann, die dazu in der Lage ist, kovalent an B zu binden, und ein Sauerstoffatom oder ein Schwefelatom kann an einer Alkylkette der Alkylgruppe beteiligt sein, wobei mindestens eines aus R¹ und R² für eine Alkylgruppe steht, die mit einer reaktiven Gruppe substituiert sein kann, die dazu in der Lage ist, kovalent an B zu binden; R³ bis R⁹ jeweils unabhängig für ein Wasserstoffatom oder einen monovalenten Substituenten stehen und zwei benachbarte Gruppen davon unter Bildung eines Rings binden können; und die gestrichelten Linien für Kohlenstoffatome stehen, die zur Bildung der Cyanin-, Merocyanin- und Styrylfluoreszenzfarbstoffe erforderlich sind.
Mehr bevorzugt ist der Cyanin-, Merocyanin- oder Styrylfluoreszenzfarbstoff ein Fluoreszenzfarbstoff mit einer Struktur, angegeben durch die folgenden Formeln
Cyanin
Merocyanin
Styryl
Cyanin
Merocyanin
Styryl worin X und Y jeweils unabhängig aus der Gruppe bestehend aus O, S und C (CH₃)₂ ausgewählt sind, Z aus der Gruppe bestehend aus O und S ausgewählt ist; m eine ganze Zahl, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 1, 2, 3 und 4, ist; R¹ und R² jeweils unabhängig für ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe stehen, die mit einer reaktiven Gruppe substituiert sein kann, die dazu in der Lage ist, kovalent an B zu binden, und ein Sauerstoffatom oder ein Schwefelatom an einer Alkylkette der Alkylgruppe beteiligt sein kann, wobei mindestens eines aus R¹ und R² für eine Alkylgruppe steht, die mit einer reaktiven Gruppe substituiert sein kann, die dazu in der Lage ist, kovalent an B zu binden; und R³ bis R¹¹ jeweils unabhängig für ein Wasserstoffatom oder einen monovalenten Substituenten stehen und zwei benachbarte Gruppen davon unter Bildung eines Rings binden können.
Vorzugsweise ist mindestens eine der Gruppen R¹ und R² eine Alkylgruppe, substituiert mit einer aktiven Estergruppe, die zu einer kovalenten Bindung an eine Aminogruppe, eine Hydroxylgruppe oder eine Thiolgruppe in der Gruppe B fähig ist.
Vorzugsweise ist mindestens eine der Gruppen R¹ und R² eine Alkylgruppe, die mit einer Carboxylgruppe substituiert ist.
Vorzugsweise ist A ein Rest eines Nucleotids oder eines Derivats davon. Mehr bevorzugt steht A für einen Rest eines natürlichen oder synthetischen Nucleotids oder eines Derivats davon, das ausgewählt ist aus (1) der Gruppe, bestehend aus Nucleotiden, bestehend aus AMP, ADP, ATP, GMP, GDP, GTP, CMP, CDP, CTP, UMP, UDP, UTP, TMP, TDP, TTP, 2-Me-AMP, 2-Me-ADP, 2-Me-ATP, 1-Me-GMP, 1-Me-GDP, 1-Me-GTP, 5-Me-CMP, 5-Me-CDP, 5-Me-CTP, 5-MeO-CMP, 5-MeO-CDP und 5-MeO-CTP; (2) der Gruppe, bestehend aus Desoxynucleotiden und Didesoxynucleotiden, die diesen Nucleotiden entsprechen; und (3) der Gruppe, bestehend aus Derivaten, die weiter von in (1) und (2) beschriebenen Nucleotiden abgeleitet sind.
Vorzugsweise ist B eine Verknüpfungsgruppe, bestehend aus -CH₂-, -CH=CH-, -C≡C-, -CO-, -O-, -S-, -NH- oder Kombinationen davon, wobei ein Wasserstoffatom an der Verknüpfungsgruppe weiter durch einen Substituenten substituiert sein kann.
Mehr bevorzugt ist B eine Aminoallylgruppe.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von fluoreszenzmarkierten Nucleinsäuren zur Verfügung gestellt, das die Stufe der Durchführung einer Reaktion der Nucleinsäuresynthese unter Verwendung von Nucleinsäuresynthetase, einer Nucleinsäure als Matrize und des fluoreszierenden Nucleotids der Erfindung umfasst.
Vorzugsweise ist die Reaktion der Nucleinsäuresynthese eine Reaktion, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer reversen Transkriptionsreaktion, einer Reaktion der terminalen Transferase, einem Zufallsprimeverfahren, einem PCR-Verfahren oder einem Nick-Translationsverfahren.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Nucleinsäuresonde oder ein Primer zur Verfügung gestellt, markiert mit dem erfindungsgemäßen fluoreszierenden Nucleotid.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein diagnostisches Mittel oder ein Reagens zum Detektieren von Nucleinsäuren, bestehend aus dem erfindungsgemäßen fluoreszierenden Nucleotid, zur Verfügung gestellt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Kit zum Detektieren von Nucleinsäuren, umfassend (1) das fluoreszierende Nucleotid nach Anspruch 1, (2) eine Nucleinsäuresynthetase und (3) einen Puffer, zur Verfügung gestellt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1 zeigt das Ergebnis einer Analyse, bei der mit dem Fluoreszenzfarbstoff markierte DNA-Sonden mit Indolenincyanin-dUTP-Konjugaten (Verbindung 5 und Verbindung 6) einer Agarosegel-Elektrophorese unterworfen wurden und das Gel angefärbt und mit dem Gerät FLA2000 (Fuji Photo Film Co., Ltd.) bei einer Anregungswellenlänge von 532 nm und einer Detektionswellenlänge von 580 nm nach dem Anfärben mit SYBR Grün II (Molecular Probes) gescannt wurde.
Die 2 zeigt das Ergebnis einer Analyse, bei der mit dem Fluoreszenzfarbstoff markierte DNA-Sonden mit Indolenincyanin-dUTP-Konjugaten (Verbindung 7 und Verbindung 8) einer Agarosegel-Elektrophorese unterworfen wurden und das Gel angefärbt und mit dem Gerät FLA2000 (Fuji Photo Film Co., Ltd.) bei einer Anregungswellenlänge von 532 nm und einer Detektionswellenlänge von 580 nm nach dem Anfärben mit SYBR Grün II (Molecular Probes) gescannt wurde.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Nunmehr werden genaue Ausführungsformen und die Durchführung der vorliegenden Erfindung beschrieben. Die vorliegende Erfindung betrifft ein fluoreszierendes Nucleotid, dargestellt durch die Formel: A-B-C.
In der obigen Formel steht A für einen Rest eines natürlichen oder synthetischen Nucleotids, Oligonucleotids, Polynucleotids oder Derivats davon. Die natürlichen oder synthetischen Nucleotide schließen, jedoch ohne Einschränkung darauf, Reste von natürlichen oder synthetischen Nucleotiden oder von Derivaten davon ein, die aus (1) der Gruppe, bestehend aus Nucleotiden bestehend aus AMP, ADP, ATP, GMP, GDP, GTP, CMP, CDP, CTP, UMP, UDP, UTP, TMP, TDP, TTP, 2-Me-AMP, 2-Me-ADP, 2-Me-ATP, 1-Me-GMP, 1-Me-GDP, 1-Me-GTP, 5-Me-CMP, 5-Me-CDP, 5-Me-CTP, 5-MeO-CMP, 5-MeO-CDP und 5-MeO-CTP; (2) der Gruppe bestehend aus Desoxynucleotiden und Didesoxynucleotiden, die diesen Nucleotiden entsprechen; und (3) der Gruppe bestehend aus Derivaten, die weiter von in (1) und (2) beschriebenen Nucleotiden abgeleitet sind. Beispiele für natürliche oder synthetische Nucleotide schließen, jedoch ohne Beschränkung darauf, ATP, CTP, GTP, TTP, UTP, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dUTP, ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP, ddUTP oder die Derivate davon ein.
Das Oligonucleotid wird durch Polymerisation von etwa 1 bis 50, vorzugsweise 1 bis 30, mehr bevorzugt 1 bis 20 Nucleotiden oder Derivaten davon, wie oben beschrieben, erhalten, wobei jedes Nucleotid der konstituierenden Einheit gleich oder verschieden sein kann. Das Polynucleotid ist ein Polymeres, erhalten durch Polymerisation von vielen Nucleotiden oder Derivaten davon, wie oben beschrieben. Seine Größe (oder Länge) kann, jedoch ohne spezielle Beschränkung darauf, mehrere Basenpaare (bp) bis mehrere kbp als Anzahl der Basen sein.
Die hierin verwendete Bezeichnung "fluoreszierendes Nucleotid" soll alle Fälle umfassen, bei denen die Nucleinsäurekomponenten beliebige der vorgenannten Nucleotide, Oligonucleotide und Polynucleotide sind.
A bindet an B an einer Basengruppierung in dem Nucleotidrest. Beispiele für die Basengruppierung des Nucleotidrests schließen Purin-Derivate und Pyrimidin-Derivate ein. Bei einer Purinbase ist die Bindungsstelle für die Verknüpfungsgruppe B keinen speziellen Beschränkungen unterworfen, solange sie eine andere Stelle ist als die 9-Position für die Bindung an eine Zuckerkomponente. Wenn beispielsweise die Purinbase Adenin ist, dann kann die Bindungsstelle für die Verknüpfungsgruppe B eine 2- oder 8-Position oder eine in 6-Position vorhandene Aminogruppe sein. Wenn die Purinbase Guanin ist, dann kann die Bindungsstelle eine 1- oder 8-Position oder eine in 2-Position vorhandene Aminogruppe sein. Bei der Pyrimidinbase ist die Bindungsstelle für die Verknüpfungsgruppe B keinen speziellen Begrenzungen unterworfen, solange sie eine andere ist als die 1-Position für die Bindung an eine Zuckerkomponente. Wenn beispielsweise das Pyrimidin Cytosin ist, dann kann die Bindungsstelle die 5- oder 6-Position oder eine in 4-Position vorhandene Aminogruppe sein. Wenn die Pyrimidinbase Thymin ist, dann kann die Bindungsstelle die 3- oder 6-Position oder eine in 5-Position vorhandene Methylgruppe sein. Wenn die Pyrimidinbase Uracil ist, dann kann die Bindungsstelle für die Verknüpfungsgruppe B die 3-, 5- oder 6-Position sein.
In der obigen Formel bedeutet B eine bivalente Verknüpfungsgruppe oder eine Einfachbindung. Die Typen der Verknüpfungsgruppe sind keinen speziellen Begrenzungen unterworfen, solange sie die charakteristischen Eigenschaften des erfindungsgemäßen fluoreszierenden Nucleotids nicht in starkem Ausmaß beeinträchtigen bzw. beeinflussen (z.B. die Stabilität des fluoreszierenden Nucleotids als eine Ver bindung, die Wasserlöslichkeit, das Aufnahmeverhältnis durch die Nucleinsäure, die Intensität der Fluoreszenz und dergleichen). Der Fachmann kann in geeigneter Weise eine divalente Verknüpfungsgruppe auswählen, die für die Verknüpfung einer Nucleotidgruppierung, angegeben durch A, mit einer fluoreszierenden Verbindungskomponente, angegeben durch C, geeignet ist.
Im Allgemeinen ist die Verknüpfungsgruppe B eine Verknüpfungsgruppe bestehend aus -CH₂-, -CH=CH-, -C≡C-, -CO-, -O-, -S-, -NH- oder Kombinationen davon, wobei ein Wasserstoffatom an der Verknüpfungsgruppe weiter mit einem beliebigen Substituenten substituiert sein kann. Die Anzahl der Kohlenstoffatome, die in dem Gerüst der Verknüpfungsgruppe enthalten sind, ist keinen speziellen Beschränkungen unterworfen. Im Allgemeinen liegt die Anzahl der Kohlenstoffatome im Bereich von 1 bis 50, vorzugsweise 1 bis 20, mehr bevorzugt 1 bis 10, am meisten bevorzugt 1 bis 5.
In der obigen Formel bedeutet C (1) eine monovalente Gruppe, abgeleitet von einem fluoreszierenden Farbstoff bzw. Fluoreszenzfarbstoff, ohne eine Sulfonsäuregruppe und ohne eine Phosphorsäuregruppe in einem Molekül, der eine Sulfonamidgruppe oder eine niedere Alkoholgruppe hat, nämlich ein Cyanin-, Merocyanin- oder Styrylfluoreszenzfarbstoff.
Beispielsweise können die in der JP-OS Nr. 9-124599 beschriebenen bekannten Farbstoffe verwendet werden. Eine Indocyaninverbindung ohne Sulfonsäuregruppe wird in der JP-OS Nr. 9-124599 beschrieben. Dort findet sich aber kein Hinweis darauf, dass eine Sulfonsäuregruppe zu einer Verringerung der Aufnahmeeffizienz durch eine Nucleinsäure bei der Synthesereaktion der Nucleinsäure, wie einer reversen Transkriptionsreaktion, beitragen könnte. Die vorliegende Erfindung ist dadurch charakterisiert, dass funktionelle Gruppen mit negativen Ladungen, wie eine Sulfonsäuregruppe und eine Phosphorsäuregruppe, soweit wie es im Design für eine optimale molekulare Struktur des fluoreszierenden Nucleotids möglich ist, verringert wurden, zum Zwecke der Verringerung einer Abstoßung zwischen den Molekülen mit negativen Ladungen, weil Nucleinsäuremoleküle negative Ladungen haben. Der fluoreszierende Farbstoff ist nämlich dadurch charakterisiert, dass die Anzahl der Sulfonsäuregruppen oder Phosphorsäuregruppen, die in der fluoreszierenden Farbstoffkomponente vorhanden sind, 0 ist.
Jedoch werden insbesondere fluoreszierende Farbstoffe mit hohem Molekulargewicht manchmal aufgrund von einer Reduktion von funktionellen Gruppen, die diese negativen Ladungen haben, unlöslich. Erfindungsgemäß wird das Problem dieser Unlöslichkeit durch Einführung einer wasserlöslichen funktionellen Gruppe in ein Chromophor eines Farbstoffs gelöst.
Erfindungsgemäß ist das fluoreszierende Nucleotid dadurch charakterisiert, dass es in seiner fluoreszierenden Farbstoffkomponente eine andere wasserlösliche Gruppe hat als eine Sulfonsäuregruppe, und zwar nämlich ein Sulfonamid oder einen niederen Alkohol.
Der hierin verwendete fluoreszierende Farbstoff ist ein Cyanin-, Merocyanin- oder Styrylfluoreszenzfarbstoff. Vorzugsweise schließen spezielle Strukturen des Cyanin-, Merocyanin- oder Styrylfluoreszenzfarbstoffs z.B. die durch die folgenden Formeln angegebenen Strukturen ein:
Cyanin
Merocyanin
Styryl worin X und Y jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus O, S und C(CH₃)₂ ausgewählt sind; m eine ganze Zahl, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 1, 2, 3 und 4 ist; R¹ und R² jeweils unabhängig für ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe stehen, die mit einer reaktiven Gruppe substituiert sein kann, die dazu in der Lage ist, kovalent an B zu binden, und ein Sauerstoffatom oder ein Schwefelatom kann an einer Alkylkette der Alkylgruppe beteiligt sein, wobei mindestens eines aus R¹ und R² für eine Alkylgruppe steht, die mit einer reaktiven Gruppe substituiert sein kann, die dazu in der Lage ist, kovalent an B zu binden; R³ bis R⁹ jeweils unabhängig für ein Wasserstoffatom oder einen monovalenten Substituenten stehen und zwei benachbarte Gruppen davon unter Bildung eines Rings binden können; und die gestrichelten Linien für Kohlenstoffatome stehen, die zur Bildung der Cyanin-, Merocyanin- und Styrylfluoreszenzfarbstoffe erforderlich sind.
Mehr bevorzugt ist der Cyanin-, Merocyanin- oder Styrylfluoreszenzfarbstoff ein Fluoreszenzfarbstoff mit einer Struktur, angegeben durch die folgenden Formeln:
Cyanin
Merocyanin
Styryl
Cyanin
Merocyanin
Styryl worin X und Y jeweils unabhängig aus der Gruppe bestehend aus O, S und C(CH₃)₂ ausgewählt sind, Z aus der Gruppe bestehend aus O und S ausgewählt ist; m eine ganze Zahl, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 1, 2, 3 und 4, ist; R¹ und R² jeweils unabhängig für ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe stehen, die mit einer reaktiven Gruppe substituiert sein kann, die dazu in der Lage ist, kovalent an B zu binden, und ein Sauerstoffatom oder ein Schwefelatom an einer Alkylkette der Alkylgruppe beteiligt sein kann, wobei mindestens eines aus R¹ und R² für eine Alkylgruppe steht, die mit einer reaktiven Gruppe substituiert sein kann, die dazu in der Lage ist, kovalent an B zu binden; und R³ bis R¹¹ jeweils unabhängig für ein Wasserstoffatom oder einen monovalenten Substituenten stehen und zwei benachbarte Gruppen davon unter Bildung eines Rings binden können.
Wie hierin verwendet, kann die Alkylgruppe eine geradkettige, verzweigtkettige, ringkettige Gruppe oder eine Kombination davon sein, und sie enthält, wenn nichts anderes angegeben ist, etwa 1 bis 20 Kohlenstoffatome. Die durch R¹ und R² angegebenen Alkylgruppen können gleich oder verschieden sein. Beispiele für solche Alkylgruppen können eine Methylgruppe, eine Ethylgruppe, eine n-Propylgruppe, eine Isopropylgruppe, eine Cyclopropylgruppe, eine n-Butylgruppe, eine sek.-Butylgruppe, eine tert.-Butylgruppe, eine Cyclopropylmethylgruppe, eine n-Pentylgruppe, eine n-Hexylgruppe, eine Cyclohexylgruppe und dergleichen, einschließen. Durch R¹ und R² angegebene Alkylgruppen können einen oder mehrere Substituenten an einer beliebigen Position der Alkylkette haben. Wenn die Alkylgruppe zwei oder mehrere Substituenten enthält, dann können die Substituenten gleich oder verschieden sein. Die Arten der Substituenten der Alkylgruppen, die durch R¹ und R² angegeben werden, sind keinen speziellen Begrenzungen unterworfen. Es wird bevorzugt, dass ein reaktiver Substituent, der dazu imstande ist, eine kovalente Bindung, eine Ionenbindung, eine Wasserstoffbindung und dergleichen, mit einem Nucleotid (oder mit einer an ein Nucleotid bindenden Verknüpfungsgruppe) eingearbeitet wird um einen fluoreszierenden Farbstoff der obigen Formel in das Nucleotid als fluoreszierendes Markierungsmittel einzuführen. (Die hierin verwendete Bezeichnung "reaktiver Substituent" bedeutet einen Substituenten mit den oben genannten Eigenschaften).
Beispiele für reaktive Substituenten, die in jede der durch R¹ und R² angegebene Alkylgruppe eingearbeitet werden können, können eine Succinimidylestergruppe, eine Halogensubstituierte Toriazinylgruppe, eine Halogen-substituierte Pyrimidinylgruppe, eine Sulfonylhalogenidgruppe, eine α-Halogenacetylgruppe, eine Maleimidylgruppe und eine Aziridinylgruppe einschließen. Zusätzlich zu diesen reaktiven Substituenten können Beispiele für die reaktiven Substituenten weiterhin ein Halogenatom (die hierin verwendete Bezeichnung "Halogenatom" bedeutet ein beliebiges Atom aus der Gruppe Fluoratome, Chloratome, Bromatome und Iodatome), eine Mercaptogruppe, eine Cyanogruppe, eine Nitrogruppe, eine Carboxylgruppe, eine Phosphorsäuregruppe, eine Sulfogruppe, eine Hydroxylgruppe, eine Aminogruppe, eine Isothiocyanatgruppe, eine Isocyanatgruppe, eine Alkoxylgruppe mit einer Anzahl der Kohlenstoffatome von 1 bis 8 (z.B. eine Methoxygruppe und Ethoxygruppe), eine Aryloxygruppe mit einer Anzahl der Kohlenstoffatome von 6 bis 20 (z.B. eine Phenoxygruppe und eine Naphthoxygruppe), eine Alkoxycarbonylgruppe mit einer Anzahl der Kohlenstoffatome von 2 bis 10 (z.B. eine Methoxycarbonylgruppe und eine Ethoxycarbonylgruppe), eine Aryloxycarbonylgruppe mit einer Anzahl der Kohlenstoffatome von 6 bis 20 (z.B. Phenoxycarbonylgruppe), eine Acylgruppe mit einer Anzahl der Kohlenstoffatome von 2 bis 10 (z.B. eine Acetylgruppe und eine Pivaloylgruppe), eine Acyloxygruppe mit einer Anzahl der Kohlenstoffatome von 2 bis 8 (z.B. eine Acetyloxygruppe und eine Benzoyloxygruppe), eine Acylaminogruppe mit einer Anzahl der Kohlenstoffatome von 2 bis 8 (z.B. eine Acetylaminogruppe), eine Sulfonylgruppe mit einer Anzahl der Kohlenstoffatome von 1 bis 8 (z.B. eine Methansulfonylgruppe, eine Ethansulfonylgruppe und eine Benzolsulfonylgruppe), eine Sulfinylgruppe mit einer Anzahl der Kohlenstoffatome von 1 bis 20 (z.B. eine Methansulfinylgruppe, eine Ethansulfinylgruppe und eine Benzolsulfinylgruppe), eine Sulfonylaminogruppe mit einer Anzahl der Kohlenstoffatome von 1 bis 8 (z.B. eine Methansulfonylaminogruppe, eine Ethansulfonylaminogruppe und eine Benzolsulfonylaminogruppe), eine Carbamoylgruppe mit einer Anzahl der Kohlenstoffatome von 1 bis 10 (z.B. Carbamoylgruppe, eine Methylcarbamoylgruppe und eine Morpholinocarbamoylgruppe), eine substituierte Aminogruppe mit einer Anzahl der Kohlenstoffatome von 1 bis 20 (z.B. eine Methylaminogruppe, eine Dimethylaminogruppe, eine Benzylaminogruppe, eine Anilinogruppe und eine Diphenylaminogruppe), eine Sulfamoylgruppe mit einer Anzahl der Kohlenstoffatome von 2 bis 10 (z.B. eine Methylsulfamoylgruppe, eine Ethylsulfamoylgruppe und eine Piperidinsulfamoylgruppe), eine Ammoniumgruppe mit einer Anzahl der Kohlenstoffatome von 0 bis 15 (z.B. eine Trimethylammoniumgruppe, eine Triethylammoniumgruppe), eine Hydrazinogruppe mit einer Anzahl der Kohlenstoffatome von 0 bis 15 (z.B. eine Trimethylhydrazinogruppe), eine Ureidogruppe mit einer Anzahl der Kohlenstoffatome von 1 bis 15 (z.B. eine Ureidogruppe und eine N,N-Dimethylureidogruppe), eine Imidgruppe mit einer Anzahl der Kohlenstoffatome von 1 bis 15 (z.B. eine Succinimidgruppe), eine Alkylthiogruppe mit einer Anzahl der Kohlenstoffatome von 1 bis 20 (z.B. eine Methylthiogruppe und eine Ethylthiogruppe), eine Arylthiogruppe mit einer Anzahl der Kohlenstoffatome von 6 bis 20 (z.B. eine Phenylthiogruppe, eine p-Methylphenylthiogruppe, eine p-Chlorphenylthiogruppe, eine 2-Pyridylthiogruppe und eine Naphthylthiogruppe), eine substituierte oder unsubstituierte heterocyclische Gruppe mit einer Anzahl der Kohlenstoffatome von 1 bis 20 (z.B. eine Pyridylgruppe, eine 5-Methylpyridylgruppe, eine Thienylgruppe, eine Furylgruppe, eine Morpholinogruppe, eine Tetrahydrofurylgruppe und eine 2-Pyradylgruppe), eine gesättigte Kohlenhydratgruppe mit einer Anzahl der Kohlenstoffatome von 2 bis 18 (z.B. eine Vinylgruppe, eine Ethinylgruppe, eine 1-Cyclohexenylgruppe, eine Benzylidengruppe), eine substituierte oder unsubstituierte Arylgruppe mit einer Anzahl der Kohlenstoffatome von 6 bis 20 (z.B. eine Phenylgruppe, eine 4-Sulfophenylgruppe, eine 2,5-Disulfophenylgruppe, eine 4-Carboxyphenylgruppe und eine Naphthylgruppe), und eine Alkylgruppe mit einer Anzahl der Kohlenstoffatome von 1 bis 20 (z.B. eine Methylgruppe, eine Ethylgruppe und eine Propylgruppe), sein.
Bevorzugte Beispiele für R¹ und R² können eine Alkylgruppe mit einer Anzahl der Kohlenstoffatome von 1 bis 15, substituiert mit einer Carboxylgruppe, einer Isothiocyanatgruppe, einer Succinimidylestergruppe, einer Sulfonylhalogenidgruppe, einer α-Halogenacetylgruppe oder einer Malimidylgruppe; und eine Arylalkylgruppe mit einer Anzahl der Kohlenstoffatome von 7 bis 20, substituiert mit einer Carboxylgruppe, einer Isothiocyanatgruppe, einer Succinimidylestergruppe, einer Sulfonylhalogenidgruppe, einer α-Halogenacetylgruppe oder einer Malimidylgruppe, einschließen. Mehr bevorzugte Beispiele für R¹ und R² schließen eine Alkylgruppe mit einer Anzahl der Kohlenstoffatome von 1 bis 10, substituiert mit einer Carboxylgruppe, einer Isothiocyanatgruppe oder einer Succinimidylestergruppe, ein.
R³ bis R¹¹ stehen jeweils unabhängig voneinander für ein Wasserstoffatom oder einen monovalenten Substituenten, und zwei angrenzende Gruppen davon können sich unter Bildung eines Rings miteinander verbinden. Die durch R³ bis R¹¹ angegebenen Arten von Substituenten sind keinen speziellen Begrenzungen unterworfen, und sie können gleich oder verschieden sein. Die durch diese Gruppen angegebenen Substituenten schließen z.B. solche ein, wie sie als Substituenten an den durch R¹ und R² angegebenen Alkylgruppen als Beispiele angegeben wurden (mit Einschluss der reaktiven Substituenten).
Zwei aneinandergrenzende Gruppen unter R³ bis R¹¹ können miteinander kombiniert sein um einen gesättigten oder ungesättigten Ring zu bilden. Der so gebildete Ring schließt 5- bis 7-gliedrige Ringe ein. Ein ungesättigter Ring kann einen kondensierten aromatischen Ring bilden. Der ungesättigte Ring kann ein Heteroatom bzw. Heteroatome, wie ein Sauerstoffatom, ein Stickstoffatom und ein Schwefelatom, enthalten. An jeder beliebigen Position an dem gebildeten Ring können ein oder mehrere Substituenten, wie diejenigen, die im Zusammenhang mit den Substituenten der durch R¹ und R² angegebenen Alkylgruppen genannt wurden, oder Alkylgruppen substituiert sein.
Bevorzugte Beispiele für R³ bis R¹¹ schließen z.B. ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom (Fluoratom, Chloratom, Bromatom oder Iodatom), -SO₂NH₂, eine Alkylgruppe mit einer Anzahl der Kohlenstoffatome von 1 bis 6 (in der ein Substituent, mit Einschluss von reaktiven Substituenten, wie im Zusammenhang mit den Substituenten an den durch R¹ und R² angegebenen Alkylgruppen beschrieben, in jeder beliebigen Position substituiert sein kann), eine Arylgruppe mit einer Anzahl der Kohlenstoffatome von 6 bis 20 (in der ein Substituent, mit Einschluss von reaktiven Substituenten, wie im Zusammenhang mit den Substituenten an den durch R¹ und R² angegebenen Alkylgruppen beschrieben, in jeder beliebigen Position substituiert sein kann), eine Thioalkylgruppe mit einer Anzahl der Kohlenstoffatome von 1 bis 10, eine Alkylsulfongruppe mit einer Anzahl der Kohlenstoffatome von 1 bis 10, eine Alkoxygruppe mit einer Anzahl der Kohlenstoffatome von 1 bis 10, eine substituierte Aminogruppe, eine Isothiocyanatgruppe, eine Isocyanatgruppe, eine Succinimidylestergruppe, eine Halogensubstituierte Triazinylgruppe, eine Halogen-substituierte Pyrimidinylgruppe, eine Sulfonylhalogenidgruppe, eine α-Halogenacetylgruppe, eine Maleimidylgruppe, eine Aziridinylgruppe, Monochlortriazin, Dichlortriazin, Mono- oder Dihalogen-substituiertes Pyridin, Mono- oder Dihalogen-substituiertes Diazin, Säurehalogenid, Hydroxysuccinimidester, Hydroxysulfosuccinimidester, Imidoester, Hydrazin, Azidnitrophenyl, Azid, 3-(2-Pyrizyldithio)propionamid, Glyoxal und Aldehyd ein.
Erfindungsgemäß ist mindestens eine der Gruppen R³ bis R⁹ oder mindestens eine der Gruppen R³ bis R¹¹ vorzugsweise eine andere Gruppe als ein Wasserstoffatom.
Der oben beschriebene fluoreszierende Farbstoff wird als fluoreszierende Markierungskomponente in dem erfindungsgemäßen fluoreszierenden Nucleotid verwendet.
Es sind verschiedene Techniken bekannt um einen fluoreszierenden Farbstoff in ein Nucleotid als ein fluoreszierendes Markierungsmittel einzuführen, und sie können in der Weise verwendet werden, dass in geeigneter Weise dem Fachmann verfügbare Auswahlmethoden angewendet werden. Beispielsweise kann eine funktionelle Gruppe, wie eine Aminogruppe oder eine Hydroxylgruppe, in dem Nucleotid direkt an einen reaktiven Substituenten, wie eine Carboxylgruppe oder eine aktive Estergruppe, in dem fluoreszierenden Farbstoff auf dem Wege über eine ionische Bindung oder eine kovalente Bindung direkt gebunden werden oder nach einer chemischen Modifizierung, z.B. einer Einarbeitung einer Verknüpfungsgruppe in einen Teil des Nucleo tids, kann der fluoreszierende Farbstoff umsetzen gelassen werden.
Das nach der Reaktion erzeugte fluoreszierende Nucleotid kann durch allgemeine Trenntechniken, beispielsweise durch Chromatographie, Elektrophorese und Umkristallisation, gereinigt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung des erfindungsgemäßen fluoreszierenden Nucleotids. Nämlich kann das erfindungsgemäße fluoreszierende Nucleotid dazu eingesetzt werden um Nucleinsäuren zu detektieren.
Wenn das erfindungsgemäße fluoreszierende Nucleotid für eine DNA-Analyse, wie die Detektion von Nucleinsäuren, verwendet wird, dann kann das erfindungsgemäße fluoreszierende Nucleotid in eine Sonde oder einen Primer durch eine Ruth-Technik (Jerry L. Ruth, DNA, 3, 123, 1984) eingearbeitet werden. Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von fluoreszenzmarkierten Nucleinsäuren zur Verfügung, umfassend die Stufen der Durchführung einer Synthesereaktion der Nucleinsäure durch Verwendung von Nucleinsäuresynthetase, einer Nucleinsäure als Matrize und des erfindungsgemäßen fluoreszierenden Nucleotids.
Beispiele für die hierin verwendete Nucleinsäuresynthetase sind, jedoch ohne Einschränkung darauf, die DNA-Polymerase (mit Einschluss einer beliebigen DNA-Polymerase, wie dem Klenow-Enzym, der Taq-DNA-Polymerase und dergleichen), die RNA-Polymerase, die reverse Transkriptase oder die terminale Transferase. Die Arten der Nucleinsäure als Matrize können DNA oder RNA sein, und sie können natürliche DNA oder RNA, rekombinante DNA oder RNA oder chemisch synthetisierte DNA oder RNA sein. Die Synthesereaktion der Nucleinsäure kann bei Bedingungen (z.B. Salzkonzentration, pH-Wert und Temperatur) durchgeführt werden, die für enzymatische Reaktionen unter Verwendung der Matrizen-DNA des nicht-fluoreszierenden Nucleotidgemisches, des erfindungsgemäßen fluoreszierenden Nucleotids und der Nucleinsäuresynthetase geeignet sind. Die Verfahren zur Synthese von Nucleinsäuren sind dem Fachmann gut bekannt. Der Fachmann kann in geeigneter Weise Substanzen und Reagentien entsprechend den Markierungszwecken auswählen.
Es können verschiedene Methoden dazu angewendet werden um die Nucleinsäure (DNA oder RNA) unter Verwendung des erfindungsgemäßen fluoreszierenden Nucleotids zu markieren.
Das Zufallsprime-Verfahren ist eines der Verfahren zur Markierung von DNA, bei dem ein Gemisch von gegebenenfalls kombinierten Hexanucleotidsequenzen als Primer (d.h. Zufallsprimer) verwendet wird und der Zufallsprimer an eine zu markierende Nucleinsäure hybridisiert wird. Ausgehend von dem 3'-OH-Terminus dieses Zufallsprimers kann ein Strang, der zu dem einzigen Strang komplementär ist, unter Verwendung einer DNA-Polymerase, wie dem Klenow-Enzym oder einer anderen DNA-Polymerase, synthetisiert werden. Zu dieser Zeit werden vier Arten von Desoxyribonucleotiden, wobei jede ein Substrat der DNA-Polymerase ist, in den komplementären Strang eingeführt. Unter Verwendung des erfindungsgemäßen fluoreszierenden Nucleotids als mindestens eine Art dieses Desoxyribonucleotids wird die mit dem fluoreszierenden Nucleotid markierte, komplementäre DNA synthetisiert.
Anstelle eines Zufallsprimers kann eine Oligo-DNA mit einer spezifischen Sequenz (ein spezifischer Primer) angewendet werden. Der spezifische Primer bindet an eine komplementäre Region in einer Matrizen-DNA, und dann beginnt die Synthese der DNA, komplementär zu der Matrizen-DNA von dem 3'-OH-Terminus des spezifischen Primers. Wie im Falle des Zufallsprimerverfahrens wird das erfindungsgemäße flu oreszierende Nucleotid während der Synthese der komplementären DNA eingearbeitet, wodurch eine fluoreszenzmarkierte komplementäre DNA synthetisiert wird.
Die Nick-Translation ist ein Verfahren, bei dem die Wirkung der DNase I auf eine doppelsträngige DNA verwendet wird. Die Aktion der DNase I erzeugt eine Spaltungsstelle, an der die doppelsträngige Matrizen-DNA zu einem einzigen Strang zerschnitten wird. Gleichzeitig werden E. coli-DNA-Polymerase I, 4 Arten von Desoxyribonucleotiden, die Substrate dieses Enzyms sind, und das erfindungsgemäße fluoreszierende Nucleotid zu dem Reaktionsgemisch gegeben. Die E. coli-DNA-Polymerase I spaltet ein 5'-terminales Desoxyribonucleotid des abgespaltenen Einzelstrangs und setzt gleichzeitig ein Substrat-Desoxyribonucleotid an einer Stelle, angrenzend an den freien 3'-OH-Terminus, ein. Durch Wiederholung dieses Verfahrens bewegt sich die Abspaltungsstelle in Richtung auf den 3'-Terminus. Dadurch, dass das erfindungsgemäße fluoreszierende Nucleotid in dem Substrat-Nucleotid enthalten ist, kann die fluoreszierende DNA durch Nick-Translation synthetisiert werden.
Um den 3'-Terminus der doppelsträngigen oder der einzelsträngigen DNA zu markieren, kann terminale Transferase, die ein Enzym zur Bindung eines Desoxyribonucleotids oder Ribonucleotids an den 3'-OH-Terminus ist, verwendet werden. Die terminale Transferase erfordert mindestens einen Typ von Desoxyribonucleotid oder Ribonucleotid als ein Substrat. Unter Verwendung des erfindungsgemäßen fluoreszierenden Nucleotids als ein Substrat für die terminale Transferase können fluoreszenzmarkierte Nucleinsäuren, die sich von dem 3'-OH-Terminus erstrecken, synthetisiert werden.
Die reverse Transkription ist eine Reaktion um komplementäre DNA aus einer einzelsträngigen RNA zu synthetisieren. Nach dem Anlagern eines Oligodesoxyribonucleotids als ein Primer an einen komplementären Teil der RNA wird eine Elongationsreaktion unter Verwendung der reversen Transkriptase durchgeführt, wodurch ein DNA-Strang, komplementär zu dem RNA-Strang, ausgehend von dem 3'-OH-Terminus des Primers, synthetisiert wird. Bei dieser DNA-Synthese werden vier Arten von Desoxyribonucleotiden als Substrate für die Enzyme verwendet. Die Verwendung des erfindungsgemäßen fluoreszierenden Nucleotids als eines dieser Substrate gestattet es, dass das fluoreszierende Nucleotid in den sich elongierenden DNA-Strang während der reversen Transkription so eingesetzt wird, dass eine fluoreszenzmarkierte DNA synthetisiert wird.
Mit dem erfindungsgemäßen fluoreszierenden Nucleotid markierte RNA kann synthetisiert werden unter Verwendung eines Enzyms, das RNA aus DNA synthetisiert. Solche Enzyme, die RNA aus DNA synthetisieren, schließen RNA-Polymerase, codiert durch einen Phagen, wie SP6-, T3- oder T7-RNA-Polymerase, ein. Diese Enzyme sind solche für die Synthese von doppelsträngiger DNA und RNA, enthaltend SP6-, T3- oder T7-Promotor, und es können vier Arten von Ribonucleotiden als Substrate verwendet werden. Unter Verwendung des erfindungsgemäßen fluoreszierenden Nucleotids als eines der Substrate kann fluoreszenzmarkierte RNA synthetisiert werden.
Alternativ können Nucleinsäuren, die mit dem erfindungsgemäßen fluoreszierenden Nucleotid markiert worden sind, durch eine Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) synthetisiert werden. Bei der PCR-Reaktion werden die zu detektierenden Nucleinsäuren in der biologischen Probe zu einem Einzelstrang denaturiert, und zwei Arten von Primern werden an die einzelsträngigen Nucleinsäuren angelagert bzw. "annealed". Nach dem Anlagern wird eine Elongationsreaktion unter Verwendung von Polymerase (vorzugsweise Taq-DNA-Polymerase) und Desoxyribonucleotiden als Enzymsubstraten durchgeführt. Komplementäre DNA wird ausgehend von dem 3'- OH-Terminus des Primers synthetisiert, wodurch eine doppelsträngige DNA gebildet wird. Durch Wiederholung dieses Prozesses kann die in der Probe zu detektierende DNA amplifiziert werden. Unter Verwendung des erfindungsgemäßen fluoreszierenden Nucleotids als eines der Substrate während der Elongationsreaktion durch die Taq-DNA-Polymerase können fluoreszenzmarkierte Nucleotide amplifiziert werden.
Mit dem erfindungsgemäßen fluoreszierenden Nucleotid markierte fluoreszierende Nucleinsäuren, die auf die oben beschriebene Art und Weise hergestellt worden sind, können als Gensonden für die Detektierung von homologen Nucleinsäuresequenzen durch Hybridisierung verwendet werden. Ein fluoreszierendes Nucleotid, an dem eine Ziel-Nucleinsäure hybridisiert worden ist, kann leicht durch Messung der Fluoreszenzintensität unter Verwendung eines Fluorometers detektiert werden.
Wie oben bereits zum Ausdruck gebracht wurde, ist das erfindungsgemäße fluoreszierende Nucleotid als diagnostisches Mittel oder als Reagens für die Detektierung von Nucleinsäuren anwendbar, da das erfindungsgemäße fluoreszierende Nucleotid zur Markierung von Gensonden verwendet werden kann.
Wenn das erfindungsgemäße fluoreszierende Nucleotid als diagnostisches Mittel oder als Reagens für die Detektierung von Nucleinsäuren verwendet wird, dann kann es in Form einer Reagenszusammensetzung in Kombination mit einer oder mit mehreren Arten von Additiven geliefert werden. So kann beispielsweise das Reagens in einer gewünschten Form, z.B. als Lösung, und unter Verwendung eines geeigneten Additivs bzw. von geeigneten Additiven, mit Einschluss eines Puffers, eines Solubilisators, eines Modifizierungsmittels für den pH-Wert und eines Konservierungsmittels, hergestellt werden. Der Fachmann kann in geeigneter Weise die Form des Reagenses und sein Herstellungsverfahren auswählen.
Weiterhin kann das erfindungsgemäße fluoreszierende Nucleotid in Form eines Kits für die Detektierung von Nucleinsäuren zusammen mit einem Enzym, das bei der oben beschriebenen Nucleinsäuresynthesereaktion geeignet ist, einem Puffer und dergleichen, geliefert werden. Die Arten der Reagentien, die in dem Kit enthalten sind, können geeigneterweise entsprechend dem Verwendungszweck des Kits ausgewählt werden. Ein derartiges Reagens kann das fluoreszierende Nucleotid, Nucleinsäuresynthetase, einen Puffer sowie ein Gemisch von ein oder mehreren (vorzugsweise vier) nicht-fluoreszierenden Nucleotiden, gereinigtes Wasser oder dergleichen, enthalten. Der Kit kann weiterhin Primer, wie Zufallsprimer, einen Oligo-dT-Primer oder spezifische Primer, entsprechend dem Awendungszweck, enthalten.
Die vorliegende Erfindung wird weiterhin in den folgenden Beispielen beschrieben. Die Beispiele sollen den Rahmen der Erfindung nicht einschränken.
BEISPIELE
Die Strukturen der synthetisierten und in den Beispielen verwendeten Verbindungen (Verbindungen 1–8) werden untenstehend angegeben.
[Beispiel A: Synthese der Verbindungen 1 bis 4]
Die hierin verwendeten Verbindungen wurden aus einem 2,3,3-Trimethylindolenin-Derivat als Quellenmaterial synthetisiert. Dieses war aus einem im Handel erhältlichen 4-substituierten Anilin-Derivat (4-Chloranilin, 4-Aminobenzolsulfonamid) nach der Methode von Fischer et al. (E. Fischer, O. Hess, Berichte, 17: 559 (1883)) synthetisiert worden.
(Synthese der Verbindung 1)
Eine große überschüssige Menge von Ethyliodid wurde zu 9,5 g (0,04 mol) 2,3,3-Trimethylindolenin-5-sulfonamid gegeben, und das Gemisch wurde 24 Stunden lang am Rückfluss gekocht. Nach dem Entfernen von überschüssigem Ethyliodid durch Dekantieren und wiederholtes Waschen mit Aceton, wurde das N-Ethyl-2,3,3-trimethylindolenium-5-sulfonamidiodsalz (Verbindung A) erhalten. Die Menge war 6,8 g, und die Ausbeute betrug 42%.
6-Bromhexansäure (9,8 g, 0,05 mol) und 1,2-Dichlorbenzol (100 ml) wurden zu 2,3,3-Trimethylindolenin-5-sulfonamid (9,5 g, 0,04 mol) gegeben, und das Gemisch wurde 12 Stunden lang auf 110°C erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde die Reaktionslösung im Vakuum konzentriert und dann durch Silicagelsäulenchromatographie (Methanol/Chloroform) gereinigt, wodurch das 1-(5-Carboxypentinyl)-2,3,3-trimethylindolenium-5-sulfonamidbromsalz (Verbindung B) erhalten wurde. Die Menge war 9,0 g, und die Ausbeute betrug 52%.
Die Verbindung A (2,0 g, 0,005 mol) und die Verbindung B (2,2 g, 0,005 mol) wurden in 10 ml Pyridin aufgelöst, und das Gemisch wurde 1 Stunde lang auf 110°C erhitzt. Dann wurde 1,0 g 1,3,3-Trimethoxypropen (0,0075 mol) zugegeben, und das Gemisch wurde unter Erhitzen 1 Stunde lang umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde im Vakuum konzentriert, in Chlorform aufgelöst und dann mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen und Konzentrieren der Lösung lieferte die Reinigung durch Silicagelsäulenchromatographie die angestrebte Verbindung 1 als schwarz-grünes Pulver. Die Menge war 660 mg, und die Ausbeute betrug 20%.
(Synthese der Verbindung 2)
6-Bromhexansäure (9,8 g, 0,05 mol) und 1,2-Dichlorbenzol (100 ml) wurden zu 2,3,3-Trimethylindolenin-5-chlorid (7,7 g, 0,04 mol) gegeben, und das Gemisch wurde 12 Stunden lang auf 110°C erhitzt. Nach dem Abkühlen und dem Konzentrieren im Vakuum wurde der Rückstand durch Silicagelsäulenchromatographie (Methanol/Chloroform) gereinigt, wodurch das 2,3,3-Trimethylindolenium-5-chloridbromsalz erhalten wurde. Die Menge war 9,3 g, und die Ausbeute betrug 60%.
Iodethoxyethanol (das auf dem Wege über einen Halogenaustausch durch Kochen am Rückfluss von Chlorethoxyethanol in Aceton in Gegenwart von NAI synthetisiert wurde (10,8 g, 0,05 mol) und 1,2-Dichlorbenzol (100 ml) wurden zu 2,3,3-Trimethylindolenin-5-chlorid (7,7 g, 0,04 mol) gegeben, und das Gemisch wurde 12 Stunden lang auf 110°C erhitzt. Nach dem Abkühlen und Konzentrieren im Vakuum wurde der Rückstand durch Silicagelsäulenchromatographie (Methanol/Chloroform) gereinigt, wodurch das 1-(2-Hydroxyethoxyethyl)-2,3,3-trimethylindolenium-5-chloridiodsalz (Verbindung D) erhalten wurde. Die Menge war 7,7 g, und die Ausbeute war 47%.
Die Verbindung C (1,6 g, 0,005 mol) und die Verbindung D (1,4 g, 0,005 mol) wurden in 10 ml Pyridin aufgelöst, und das Gemisch wurde auf 110°C erhitzt. Dann wurde 1,3,3-Trimethoxypropen (1,0 g, 0,0075 mol) zugegeben, und das Gemisch wurde 1 Stunde lang unter Erhitzen umgesetzt. Nach dem Konzentrieren im Vakuum wurde die Reaktionslösung in Chloroform aufgelöst und mit Wasser gewaschen. Die Lösung wurde getrocknet und konzentriert und durch Silicagelsäulenchromatographie gereinigt, wodurch die angestrebte Verbindung 2 als schwarz-grünes Pulver erhalten wurde. Die Menge war 490 mg, und die Ausbeute betrug 16%.
(Synthese der Verbindung 3)
Die Verbindung A (2,0 g, 0,005 mol) und die Verbindung B (2,2 g, 0,005 mol) wurden in 10 ml Pyridin aufgelöst, und das Gemisch wurde auf 110°C erhitzt. Dann wurde Triethylorthoformiat (1,1 g, 0,0075 mol) zugegeben, und das Gemisch wurde 1 Stunde lang unter Erhitzen umgesetzt. Nach dem Konzentrieren im Vakuum wurde die Reaktionslösung in Chloroform aufgelöst und mit Wasser gewaschen. Die Lösung wurde getrocknet und konzentriert und dann durch Silicagelsäulenchromatographie (Methanol/Chloroform) gereinigt, wodurch die angestrebte Verbindung 3 als schwarz-braunes Pulver erhalten wurde. Die Menge war 710 mg, und die Ausbeute betrug 23%.
(Synthese der Verbindung 4)
Die Verbindung C (1,6 g, 0,005 mol) und die Verbindung D (1,4 g, 0,005 mol) wurden in 10 ml Pyridin aufgelöst, und das Gemisch wurde auf 110°C erhitzt. Dann wurde Triethylorthoformiat (1,1 g, 0,0075 mol) zugegeben, und das Gemisch wurde 1 Stunde lang unter Erhitzen umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde im Vakuum konzentriert und in Chloroform aufgelöst und mit Wasser gewaschen. Dann wurde die Lösung getrocknet, konzentriert und durch Silicagelsäulenchromatographie (Methanol/Chloroform) gereinigt, wodurch die angestrebte Verbindung 4 als schwarz-braunes Pulver erhalten wurde. Die Menge war 540 mg, und die Ausbeute betrug 18%.
[Beispiel B: Synthese der Verbindungen 5 bis 8]
Unter Verwendung des Indolenincyanins der Verbindungen 1 bis 4 wurden dUTP-Konjugate jeder Verbindung (Verbindungen 5 bis 8) synthetisiert.
(Synthese der Verbindung 5)
1 ml Acetonitril und 2 ml 0,1 M MES-Puffer wurden zu 5,75 mg (1,0 Teile) der Verbindung 1 gegeben um sie aufzulösen. Dann wurden 2,20 mg (1,2 Teile) WSC-Hydrochlorid und 2,52 mg (1,2 Teile) Sulfo-NHS zugegeben, und danach wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt. Nachdem hierzu 2,2 mg Aminoallyl-dUTP (Sigma), gelöst in 200 μl 0,1 M MES-Puffer, hinzu gegeben worden waren, wurde eine Reaktion über Nacht bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach der Zugabe von 100 μl 1 M Tris-Puffer (pH 7,5) und nach dem Abbruch der Reaktion wurde die resultierende Reaktionslösung auf einer Säule, die zuvor mit 8 g ODS-Siliciumdioxid (YMC-ODS-AQ 120A) gefüllt worden war, absorbiert, und dann wurde mit einer 30%igen wässrigen Methanollösung eluiert. Nach dem Konzentrieren des Elutionsmittels wurde es weiter durch eine präparative Zwischendruckchromatographie (YAMAZEN Ultrapack ODS-S-40B) gereinigt, wodurch die Verbindung 5 mit einer Reinheit von 95% (Ausbeute: 63%) erhalten wurde.
MS-Analysenwert: M- 1211
(Synthese der Verbindung 6)
5,40 mg (1,0 Teile) der Verbindung 2 wurden in 400 μl DMSO aufgelöst, und dann wurden 1,86 mg (1,2 Teile) WSC-Hydrochlorid und 2,13 mg (1,2 Teile) Sulfo-NHS dazugegeben, wonach 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt wurde. Nachdem 2,2 mg Aminoallyl-dUTP (Sigma), gelöst in 2 ml 0,1 M MES-Puffer, dazugegeben worden waren, wurde die Reaktion über Nacht bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach der Zugabe von 100 μl 1 M Tris-Puffer (pH 7,5) und dem Abbrechen der Reaktion wurde die resultierende Reaktionslösung auf einer Säule, die zuvor mit 8 g ODS-Siliciumdioxid (YMC-ODS-AQ 120A) gefüllt worden war, absorbiert, und sie wurde mit einer wässrigen 40%igen Methanollösung eluiert. Nach dem Konzentrieren des Elutionsmittels wurde es weiter durch präparative Zwischendruckchromatographie (YAMAZEN Ultrapack ODS-S-40B) gereinigt, wodurch Verbindung 6 mit einer Reinheit von 92% (Ausbeute: 56%) erhalten wurde.
MS-Analysenwert: M- 1182
(Synthese der Verbindung 7)
5,40 mg (1,0 Teile) der Verbindung 3 wurden in 400 μl DMSO aufgelöst, und dann wurden 1,86 mg (1,2 Teile) WSC-Hydrochlorid und 2,13 mg (1,2 Teile) Sulfo-NHS hinzugegeben, gefolgt von einem 30-minütigen Rühren bei Raumtemperatur. Nachdem hierzu 2,2 mg Aminoallyl-dUTP (Sigma), gelöst in 2 ml 0,1 M MES-Puffer, hinzugegeben worden waren, wurde eine Reaktion über Nacht bei Raumtemperatur durchge führt. Nach der Zugabe von 100 μl 1 M Tris-Puffer (pH 7,5) und dem Abbrechen der Reaktion wurde die resultierende Reaktionslösung auf einer Säule, die zuvor mit 8 g ODS-Siliciumdioxid (YMC-ODS-AQ 120A) gefüllt worden war, absorbiert, und sie wurde mit einer wässrigen 40%igen Methanollösung eluiert. Nach dem Konzentrieren des Elutionsmittels wurde durch präparative Zwischendruckchromatographie (YAMAZEN Ultrapack ODS-S-40B) weiter gereinigt, wodurch Verbindung 7 mit einer Reinheit von 92% (Ausbeute: 49%) erhalten wurde.
MS-Analysenwert: M- 1185
(Synthese der Verbindung 8)
2,16 mg (1,0 Teile) der Verbindung 4 wurden in 200 μl DMSO aufgelöst, und dann wurden 0,76 mg (1,1 Teile) WSC-Hydrochlorid und 0,86 mg (1,1 Teile) Sulfo-NHS hinzu gegeben, gefolgt von einem 30-minütigen Rühren bei Raumtemperatur. Nachdem hierzu 2,2 mg Aminoallyl-dUTP (Sigma), gelöst in 1 ml 0,1 M MES-Puffer, hinzu gegeben worden waren, wurde eine Reaktion über Nacht bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach der Zugabe von 100 μl 1 M Tris-Puffer (pH 7,5) und dem Abbrechen der Reaktion, wurde die resultierende Reaktionslösung auf einer Säule, die zuvor mit 8 g ODS-Siliciumdioxid (YMC-ODS-AQ 120A) gefüllt worden war, absorbiert, und sie wurde mit einer wässrigen 40%igen Methanollösung eluiert. Nach dem Konzentrieren des Elutionsmittels wurde weiter durch präparative Zwischendruckchromatographie (YAMAZEN Ultrapack ODS-S-40B) gereinigt, wodurch Verbindung 8 mit einer Reinheit von 95% (Ausbeute: 67%) erhalten wurde.
MS-Analysenwert: M- 1156
[Beispiel C: Herstellung einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten DNA-Sonde]
Beispiel C-1: Herstellung einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten DNA-Sonde unter Verwendung eines Indolenincyanin-dUTP-Konjugats
cRNA wurde hergestellt, indem T7-RNA-Polymerase auf pBlueSCriptIISK(+)-α-2-HS-Glykoprotein als Matrize (MEGA-script, Ambion) einwirken gelassen wurde. RNaseOUT (Gibco BRL) (40 U), dATP (500 μM), dGTP (500 μM), dCTP (500 μM), dTTP (200 μM), Verbindung 5 oder Verbindung 6 (100 μM), erhalten in Beispiel B, SuperScriptII-reverse Transferase (Gibco BRL) (400 U) und mit DEPC behandeltes Wasser (bis zu einem Gesamtvolumen von 20 μl) wurden zu einem Gemisch von cRNA und Primer 1 (SEQ ID NO. 1: TGGCCGCCTTCAACGCTCAG) gegeben, und das Gemisch wurde 2 Stunden lang bei 42°C umsetzen gelassen.
Nach Beendigung der Umsetzung wurde die Reaktion abgebrochen, und die cRNA wurde durch Zugabe von EDTA und NaOH zersetzt, und das Gemisch wurde 1 Stunde lang bei 65°C inkubiert. Die Reaktionslösung wurde durch eine CentriSep-Säule (PRINCETON SEPARATION, INC) geleitet um nicht-umgesetzte Verbindung 5 oder Verbindung 6 zur Reinigung zu entfernen.
Zum Vergleich wurde die reverse Transkriptionsreaktion in der gleichen Weise, wie oben beschrieben, jedoch unter Verwendung eines fluoreszierenden Nucleotids, markiert mit Cy 5 (Cy 5-dUTP-Konjugat; Amersham Pharmacia Biotech) anstelle der Verbindung 5 oder der Verbindung 6 durchgeführt. Das jeweils erhaltene Reaktionsprodukt wurde gereinigt.
Nach der Reinigung wurde die jeweilige Reaktionslösung einer Agarosegelelektrophorese unterworfen. Das Gel wurde mit SYBR Grün II (Molecular Probes) angefärbt und mit dem Gerät FLA2000 (Fuji Photo Film Co., Ltd.) bei einer Anregungswellenlänge von 633 nm und einer Detektionswellenlänge von 675 nm gescannt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengestellt. Das Bild auf dem Gerät FLA2000 ist in 1 gezeigt.
Tabelle 1.
Wie in Tabelle 1 und 1 gezeigt wird, wurde gefunden, dass die Verbindung 5 und die Verbindung 6, die jeweils keine Sulfonsäuregruppe besitzen, eine signifikant höhere Intensität der Fluoreszenz zeigten als das Cy 5-dUTP-Konjugat, das zwei Sulfonsäuregruppen hat. Insbesondere wurde gefunden, dass die Intensität der Fluoreszenz bei Verbindungen mit weniger Sulfonsäuregruppen höher war, was darauf hinweist, dass der Effekt der verringerten Ladungen größer ist als die Beiträge der Molekulargewichte und der hydrophilen Gruppen.
Beispiel C-2: Herstellung einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten DNA-Sonde unter Verwendung eines Indolenincyanin-dUTP-Konjugats
cRNA wurde hergestellt, indem T7-RNA-Polymerase auf pBlueScriptIISK(+)-α-2-HS-Glykoprotein als Matrize (MEGA-script, Ambion) einwirken gelassen wurde. RNaseOUT (Gibco BRL) (40 U), dATP (500 μM), dGTP (500 μM), dCTP (500 μM), dTTP (200 μM), Verbindung 7 oder Verbindung 8 (100 μM), erhalten in Beispiel B, SuperScriptII-reverse Transferase (Gibco BRL) (400 U) und mit DEPC behandeltes Wasser (bis zu einem Gesamtvolumen von 20 μl) wurden zu einem Gemisch von cRNA und Primer 1 (SEQ ID NO. 1: TGGCCGCCTTCAACGCTCAG) gegeben, und das Gemisch wurde 2 Stunden lang bei 42°C umsetzen gelassen.
Nach Beendigung der Umsetzung wurde die Reaktion abgebrochen, und die cRNA wurde durch Zugabe von EDTA und NaOH zersetzt, und das Gemisch wurde 1 Stunde lang bei 65°C inkubiert. Die Reaktionslösung wurde durch eine CentriSep-Säule (PRINCETON SEPARATION, INC) geleitet um nicht-umgesetzte Verbindung 7 oder Verbindung 8 zur Reinigung zu entfernen.
Zum Vergleich wurde die reverse Transkriptionsreaktion in der gleichen Weise, wie oben beschrieben, jedoch unter Verwendung eines fluoreszierenden Nucleotids, markiert mit Cy 3 (Cy 3-dUTP-Konjugat; Amersham Pharmacia Biotech) anstelle der Verbindung 7 oder der Verbindung 8 durchgeführt. Das jeweils erhaltene Reaktionsprodukt wurde gereinigt.
Nach der Reinigung wurde die jeweilige Reaktionslösung einer Agarosegelelektrophorese unterworfen. Das Gel wurde mit SYBR Grün II (Molecular Probes) angefärbt und mit dem Gerät FLA2000 (Fuji Photo Film Co., Ltd.) bei einer Anregungswellenlänge von 532 nm und einer Detektionswellenlänge von 580 nm gescannt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengestellt. Das Bild auf dem Gerät FLA2000 ist in 2 gezeigt.
Tabelle 2.
Wie in Tabelle 2 und 2 gezeigt wird, wurde gefunden, dass die Verbindung 7 und die Verbindung 8, die jeweils keine Sulfonsäuregruppe besitzen, eine signifikant höhere Intensität der Fluoreszenz zeigten als das Cy3-dUTP-Konjugat, das zwei Sulfonsäuregruppen hat. Insbesondere wurde gefunden, dass die Intensität der Fluoreszenz bei Verbindungen mit weniger Sulfonsäuregruppen höher war, was darauf hinweist, dass der Effekt der verringerten Ladungen größer ist als die Beiträge der Molekulargewichte und der hydrophilen Gruppen.
Die vorliegende Erfindung stellt verwendbare fluoreszierende Nucleotide zur Markierung von Nucleinsäuren, und insbesondere fluoreszierende Nucleotide, deren Aufnahmeverhältnis bei der Synthesereaktion von Nucleinsäuren hoch ist, bereit.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Fluoreszierendes Nucleotid, dargestellt durch die Formel A-B-C, worin A für einen Rest eines natürlichen oder synthetischen Nucleotids, Oligonucleotids, Polynucleotids oder Derivats davon steht und an B an einer Basengruppierung in dem Rest bindet; B für eine divalente Verknüpfungsgruppe oder eine Einfachbindung steht; und C für eine monovalente Gruppe, die von einem Fluoreszenzfarbstoff ohne Sulfonsäuregruppe und ohne Phosphorsäuregruppe in einem Molekül und mit einer Sulfonamidgruppe oder einer niederen Alkoholgruppe abgeleitet ist, steht; wobei der Fluoreszenzfarbstoff ein Cyanin-, Merocyanin-, oder Styrylfluoreszenzfarbstoff ist.
Fluoreszierendes Nucleotid nach Anspruch 1, wobei der Cyanin-, Merocyanin- oder Styrylfluoreszenzfarbstoff ein Fluoreszenzfarbstoff ist, der durch die folgenden Formeln dargestellt wird:
Cyanin
Merocyanin
Styryl worin X und Y jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus O, S und C(CH₃)₂ ausgewählt sind; m eine ganze Zahl, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 1, 2, 3 und 4 ist; R¹ und R² jeweils unabhängig für ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe stehen, die mit einer reaktiven Gruppe substituiert sein kann, die dazu in der Lage ist, kovalent an B zu binden, und ein Sauerstoffatom oder ein Schwefelatom kann an einer Alkylkette der Alkylgruppe beteiligt sein, wobei mindestens eines aus R¹ und R² für eine Alkylgruppe steht, die mit einer reaktiven Gruppe substituiert sein kann, die dazu in der Lage ist, kovalent an B zu binden; R³ bis R⁹ jeweils unabhängig für ein Wasserstoffatom oder einen monovalenten Substituenten stehen und zwei benachbarte Gruppen davon unter Bildung eines Rings binden können; und die gestrichelten Linien für Kohlenstoffatome stehen, die zur Bildung der Cyanin-, Merocyanin- und Styrylfluoreszenzfarbstoffe erforderlich sind.
Fluoreszierendes Nucleotid nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Cyanin-, Merocyanin- oder Styrylfluoreszenzfarbstoff ein Fluoreszenzfarbstoff mit einer durch die folgenden Formeln dargestellten Struktur ist:
Cyanin
Merocyanin
Styryl
Cyanin
Merocyanin
Styryl worin X und Y jeweils unabhängig aus der Gruppe bestehend aus O, S und C (CH₃)₂ ausgewählt sind, Z aus der Gruppe bestehend aus O und S ausgewählt ist; m eine ganze Zahl, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 1, 2, 3 und 4, ist; R¹ und R² jeweils unabhängig für ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe stehen, die mit einer reaktiven Gruppe substituiert sein kann, die dazu in der Lage ist, kovalent an B zu binden, und ein Sauerstoffatom oder ein Schwefelatom an einer Alkylkette der Alkylgruppe beteiligt sein kann, wobei mindestens eines aus R¹ und R² für eine Alkylgruppe steht, die mit einer reaktiven Gruppe substituiert sein kann, die dazu in der Lage ist, kovalent an B zu binden; und R³ bis R¹¹ jeweils unabhängig für ein Wasserstoffatom oder einen monovalenten Substituenten stehen und zwei benachbarte Gruppen davon unter Bildung eines Rings binden können.
Fluoreszierendes Nucleotid nach Anspruch 2 oder 3, wobei mindestens eines aus R¹ und R² eine Alkylgruppe ist, die mit einer Aktivestergruppe substituiert ist, die dazu in der Lage ist, kovalent an eine Aminogruppe, eine Hydroxylgruppe oder eine Thiolgruppe in der Gruppe B zu binden.
Fluoreszierendes Nucleotid nach Anspruch 2 oder 3, wobei mindestens eines aus R¹ und R² eine Alkylgruppe ist, die mit einer Carboxylgruppe substituiert ist.
Fluoreszierendes Nucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei A ein Rest eines Nucleotids oder eines Derivats davon ist.
Fluoreszierendes Nucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei A für einen Rest eines natürlichen oder synthetischen Nucleotids oder eines Derivats davon steht, das ausgewählt ist aus (1) der Gruppe, bestehend aus Nucleotiden, bestehend aus AMP, ADP, ATP, GMP, GDP, GTP, CMP, CDP, CTP, UMP, UDP, UTP, TMP, TDP, TTP, 2-Me-AMP, 2-Me-ADP, 2-Me-ATP, 1-Me-GMP, 1-Me-GDP, 1-Me-GTP, 5-Me-CMP, 5-Me-CDP, 5-Me-CTP, 5-MeO-CMP, 5-MeO-CDP und 5-MeO-CTP; (2) der Gruppe, bestehend aus Desoxynucleotiden und Didesoxynucleotiden, die diesen Nucleotiden entsprechen; und (3) der Gruppe, bestehend aus Derivaten, die weiter aus in (1) und (2) beschriebenen Nucleotiden abgeleitet sind.
Fluoreszierendes Nucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei B eine Verknüpfungsgruppe ist, bestehend aus -CH₂-, -CH=CH-, -C≡C-, -CO-, -O-, -S-, -NH- oder Kombinationen davon, wobei ein Wasserstoffatom an der Verknüpfungsgruppe weiter durch einen Substituenten substituiert sein kann.
Fluoreszierendes Nucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei B eine Aminoallylgruppe ist.
Verfahren zur Herstellung von fluoreszenzmarkierten Nucleinsäuren, das die Stufe der Durchführung einer Reaktion der Nucleinsäuresynthese unter Verwendung von Nucleinsäuresynthetase, einer Nucleinsäure als ein Templat und des fluoreszierenden Nucleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 9 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Reaktion der Nucleinsäuresynthese eine Reaktion ist, die aus der Gruppe, bestehend aus einer reversen Transkriptionsreaktion, einer Reaktion der terminalen Transferase, einem Zufallsprimeverfahren, einem PCR-Verfahren oder einem Nick-Translationsverfahren, ausgewählt ist.
Nucleinsäuresonde oder -primer, die/der mit dem fluoreszierenden Nukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 9 markiert ist.
Diagnostisches Mittel oder Reagenz zum Detektieren von Nucleinsäuren, das aus dem fluoreszierenden Nukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 9 besteht.
Kit zum Detektieren von Nucleinsäuren, umfassend (1) das fluoreszierende Nukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 9, (2) eine Nucleinsäuresynthetase und (3) einen Puffer.