DE60318150T2

DE60318150T2 - Verfahren zur optischen Bestimmung von mehrsträngigen Nucleinsäuren mit Hilfe von Cyaninfarbstoffen

Info

Publication number: DE60318150T2
Application number: DE60318150T
Authority: DE
Inventors: Kouki Minami-ashigara-shi NAKAMURA; Kazuya Minami-ashigara-shi Takeuchi
Original assignee: Fujifilm Corp
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 2002-02-14
Filing date: 2003-02-14
Publication date: 2008-12-04
Anticipated expiration: 2023-02-15
Also published as: ATE381595T1; US20050112770A1; EP1362894A2; EP1362894B1; DE60318150D1; EP1889880A3; US20080124732A1; EP1362894A3; EP1889880A2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur optischen Messung einer vielsträngigen Nukleinsäure. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere eine Technik zur optischen Messung einer vielsträngigen Hybrid-Nukleinsäure unter Verwendung eines Fluoreszenz-Messverfahrens, welches auf dem Gebiet der Gen-Analyse nützlich ist. Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Gruppe einer neuen Klasse an Verbindungen, die als Farbstoff-Basen mit einem elektrisch neutralen Chromophor klassifiziert sind.
Stand der Technik
Anwendungen von Farbstoffen auf Verfahren zur Detektion von Nukleinsäuren ist eines der Gebiete, bei denen die Forscher in den letzten Jahren am stärksten aktiv waren. Ein breiter Bereich an Farbstoffen wurde für verschiedene Anwendungen entwickelt, einschließlich Ethidiumbromid, das zum Zweck der Analyse einer Position verwendet wird, bei der eine Nukleinsäure während der Trennung der Nukleinsäuren durch Elektrophorese existiert. Beispiele sind detailliert in Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 8. Ausgabe, Molecular Probes, Inc. (CD-ROM, herausgegeben von Molecular Probes, Inc., 2001) beschrieben. Zum Zweck des Erhaltens von genetischer Information oder des Erhaltens von Information einer Gen-Expression in pathologischem Gewebe und dergleichen wurde ein Verfahren entwickelt, bei dem die Anwesenheit oder Abwesenheit oder eine Menge der betreffenden Nukleinsäure detektiert wird, indem eine Nukleinsäure, die aus einem lebenden Organismus extrahiert wird, geeignet behandelt wird, zum Labeln mit einem fluoreszierenden Farbstoff und anschließendem Hybridisieren der entstandenen Nukleinsäuren mit einer Sonden-Nukleinsäure.
Als Mittel zum Erhalt von Information einer großen Anzahl an Genen oder gleichzeitig einer Gen-Expression unter Verwendung des oben genannten Verfahrens wurden Detektionstechniken, die als DNA-Chips oder DNA-Arrays (im allgemeinen im nachhinein in der Beschreibung als "DNA-Array" bezeichnet) bezeichnet werden, entwickelt und beträchtlich fokussiert. In diesen Techniken werden eine große Zahl Nukleinsäuren, deren Teilsequenzen oder Gesamtsequenzen bekannt sind, und die verschiedene Sequenzen aufweisen, auf eine Oberfläche eines Festphasenträgers in angeordnete Dots immobilisiert, und die Positionen der Dots auf der Oberfläche und die Sequenzen der Nukleinsäuren werden verbunden (auch als "Adressieren" bezeichnet). Eine Nukleinsäure mit einer unbekannten Sequenz (die Nukleinsäure kann aus einer oder mehreren Arten von Nukleinsäuren bestehen) wird gleichförmig auf der Oberfläche verteilt und einer Hybridisierungsbedingung ausgesetzt. Wenn eine Nukleinsäure mit einer Sequenz, die zu der Nukleinsäure der unbekannten Sequenz komplementär ist, auf der Festphasenträgeroberfläche existiert, können beide ein Hybrid bilden und verbleiben sogar nach dem Waschen auf der Festphasenoberfläche.
Wenn das Hybrid zu diesem Zeitpunkt durch ein bestimmtes Verfahren detektiert werden kann, wird es möglich, zu bestimmen, ob oder ob nicht die Sequenz, die detektiert wird, unter den unbekannten Nukleinsäuren existiert oder eine Quantifizierung oder Identifizierung der Sequenz durch Bezugnahme auf die Sequenz entsprechend der Anordnung des Hybrids, das auf der Festphasenoberfläche verbleibt, durchzuführen. Die Wahrscheinlichkeit ist extrem gering, dass verschiedene Gene eines Organismus mit 20 oder mehr Nukleotiden homolog sind, und somit wird es möglich, wenn geeignete Sequenzen von 20 oder mehr Nukleotiden als die zuvor genannte Nukleinsäuresequenzen, immobilisiert auf der Festphasenoberfläche, ausgewählt werden, nacheinander die Beziehung zwischen den immobilisierten Nukleinsäuren mit bekannten Sequenzen und Genen, die detektiert werden, zu bilden. Die meisten der Verfahren, die bis jetzt bekannt sind, die als DNA-Arrays bezeichnet werden, basieren auf dem oben angegebenen Prinzip. Unter Bezugnahme auf das oben angegebene Prinzip ergibt nur ein einziger Vorgang erfolgreich eine Information über die Anwesenheit oder Abwesenheit und Menge einer großen Anzahl von (d. h., die Anzahl der Arten der Nukleinsäuren mit Sequenzen, die den Genen entsprechen, immobilisiert auf der Festphasenoberfläche) Genen oder exprimierten Genen. Wie oben beschrieben, werden die DNA-Array-Techniken durch die Adressierungstechnik und die Hybridisierungstechnik unterstützt, um eine korrelative Homologie zwischen Nukleinsäuren nachzuweisen.
Auf Basis der oben angegebenen Techniken kann genetische Information von jedem Organismus erhalten werden, indem ein genomisches Gen in Fragmente von geeigneter Länge verdaut wird und die Fragmente unter Verwendung eines DNA-Arrays analysiert werden. Darüber hinaus kann die Amplifizierung für eine Sequenz eines spezifischen Bereichs unter Verwendung einer Technik, wie PCR, durchgeführt werden, um eine genomische Information von jedem Organismus, wie eine monobasische Polymorphie zu erhalten, und es ist auch möglich, einen Zustand einer Gen-Expression in jedem Gewebe in einem Individuum oder ein Level der Gen-Expression zu jedem Zeitpunkt der Entwicklungsstufe oder Wachstumsphase in Erfahrung zu bringen. Dieses Verfahren wird im allgemeinen als Gen-Expressionsanalyse bezeichnet und wird verwendet, um Information von Arten oder Mengen von mRNA's zu erhalten, die von einer genomischen DNA transkribiert werden, oder zum Vergleich solcher Information.
Targets der Analyse unter Verwendung eines DNA-Arrays sind hauptsächlich genomische DNA oder mRNA. Wie oben beschrieben, benötigt die DNA-Array-Technik die Detektion einer vielsträngigen Hybrid-Nukleinsäure, die mit einer komplementären Nukleinsäure gebildet wird. Allerdings können Nukleinsäuren von einem lebenden Organismus in einer extrem kleinen Menge isoliert werden, und Nukleinsäuren selbst sind nicht geeignete detektierbare chemische Spezies. Aus diesen Gründen sind die Verfahren, die am meisten verbreitet zur Detektion verwendet werden, als "Nukleinsäure-Labelverfahren" bezeichnet. Für diese Verfahren sind spezifische Verfahren in einer großen Anzahl an veröffentlichten Büchern und Literaturen beschrieben, und viele analoge Verfahren sind erhältlich. Das Prinzip des Labelns liegt darin, dass ein gelabeltes Nukleotidtriphosphat als ein Ausgangsmaterial für die Replikation bei der Herstellung eines Replikats einer Nukleinsäure, die detektiert wird, verwendet wird, so dass das Material eingearbeitet wird und ein Nukleinsäurepolymer (Oligomer), das gebildet wird, labelt. Als Arten des Labelns sind direkte Labelverfahren unter Verwendung von RI (Radioisotop) oder Fluoreszenzfarbstoff und indirekte Labelverfahren, wie solche unter Verwendung von Biotin oder Digoxigenin bekannt. Nach einer geeigneten Behandlung, die die Detektion von beispielsweise Bestrahlung für RI-Labeln Fluoreszenz- oder Fluoreszenz-Farbstoff-Labeln, Fluoreszenz oder Chemilumineszenz für Biotin oder Digoxigenin ermöglicht, wird die Detektion durchgeführt. Ein Detektionssystem wird derart gestaltet, dass jede Detektion mit einer hohen Sensitivität erreicht wird.
Allerdings werden für die Detektion eines Hybrids, basierend auf diesen Labelverfahren, zwei größere Probleme aufgeführt. Ein Problem liegt darin, dass eine quantitative Beziehung in einer ursprünglichen Nukleinsäuremischung möglicherweise nicht genau in einem Replikat in dem Verfahren der Replikation von Nukleinsäuren, die in dem Labeln von beispielsweise einer PCR(Polymerase-Kettenreaktion)- oder RT(reverse Transkription)-Reaktion verwendet werden, reflektiert werden kann. Ein anderes Problem liegt darin, dass, mit Ausnahme des RI-Labelverfahrens, eine replizierte Nukleinsäure eines Gens an eine Labelverbindung bindet, um eine andere chemische Substanz zu werden, was genau genommen kein Replikat ist. Es wird berücksichtigt, dass spezifische Beispiele, die die oben angegebenen Probleme betreffen, die Reduktion der Hybridisierungseffektivität (quantitative Verschlechterung) und fehlerhafte Erkennung (qualitative Verschlechterung der Information) aufgrund einer Verminderung der Erkennungseignung einer Sonden-Nukleinsäure und einer Proben-Nukleinsäure einschließen, was möglicherweise fundamentale Probleme der Labelverfahren mit sich bringt.
Wie oben beschrieben, weisen die Labelverfahren essentielle Probleme auf. Aus diesem Grund wurde als ein Verfahren, das die oben angegebenen Probleme lösen kann, ein Verfahren vorgeschlagen, bei dem eine nicht-gelabelte doppelsträngige Hybrid-Nukleinsäure ohne ein Labelverfahren detektiert wird. Die offengelegte Japanische Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. (Hei)5-199898 offenbart ein Verfahren zur Detektion der Bildung eines Hybrids, wobei das Hybrid auf einer Elektrode gebildet wird, und die Bildung des Hybrids wird unter Verwendung eines Interkalators detektiert, der mit einer elektrochemisch aktiven chemischen Spezies modifiziert ist. Gemäß diesem Verfahren kann ein doppelsträngiges Hybrid, das durch Hybridisierung in dem DNA-Array-Verfahren gebildet wird, ohne Label detektiert werden. Somit wird angenommen, dass das Verfahren die Probleme der Labelverfahren lösen kann. Tatsächlich weist dieses Verfahren zahlreiche Vorteile auf, beispielsweise kann eine Vorrichtung für die Detektion kleiner gemacht werden. Allerdings erfordert dieses Verfahren die Immobilisierung einer Sonden-Nukleinsäure auf der Elektrodenoberfläche, um elektrochemisch die Detektion durchzuführen. Somit ist es für eine simultane Detektion einer hohen Anzahl an Hybriden erforderlich, dass eine große Anzahl an Elektroden auf der Oberfläche gebildet wird, und jede Sonden-Nukleinsäure wird auf jeder der Elektroden immobilisiert. Somit weist dieses Verfahren für die Verwendung als Detektionsverfahren viele Probleme auf, die gelöst werden müssen. Darüber hinaus ist für ein Signal/Rausch-Verhältnis die Auflösung eines Hybrids und Nicht-Hybrids (einsträngige Sonde) nicht vollständig zufrieden stellend, und somit ist eine quantitative Detektion schwierig.
Als ein anderes Verfahren kann ein Verfahren vorgeschlagen werden, bei dem ein fluoreszierender Farbstoff verwendet wird, dessen Fluoreszenz-Intensität durch eine Interaktion mit einer vielsträngigen Nukleinsäure erhöht wird. Es wird angenommen, dass, wenn ein Farbstoff existiert, dessen Fluoreszenz-Intensität während einer Interaktion mit einer Sonden-Nukleinsäure (einsträngig) schwach bleibt, während sich die Intensität durch Interaktion mit einer vielsträngigen Nukleinsäure, die durch Hybridisierung gebildet wird, beträchtlich erhöht, eine doppelsträngige Hybridnukleinsäure ohne Labeln detektiert werden kann. Es wird berichtet, dass ein Farbstoff, der von Molecular Probes, Inc. mit einem Handelsnamen von PicoGreen, vermarktet wird, eine Quantifizierung von doppelsträngiger Nukleinsäure ermöglicht. Allerdings emittiert der Farbstoff eine nicht vernachlässigbare Fluoreszenz sogar in Anwesenheit einer einzelsträngigen Nukleinsäure, und somit kann ein hohes Signal/Rausch-Verhältnis nicht erwartet werden.
In einem Detektionsverfahren für eine Komponente in einer Spurenmenge wird im allgemeinen eine Sonde in einer Überschussmenge bezüglich eines zu detektierenden Objekts verwendet. Aus diesem Grund ist ein Verfahren erforderlich, welches strikt eine einzelsträngige Nukleinsäure diskriminieren kann, die in einer Überschussmenge vorliegt, und eine doppelsträngige Nukleinsäure wird durch Hybridisierung gebildet. Allerdings war ein solches Verfahren bis jetzt noch nicht bekannt.
Farbstoffe als Mittel zum Detektieren von Nukleinsäuren wurden seit relativ langer Zeit untersucht. Ethidiumbromid als ein Fluoreszenzfarbstoff zum Färben einer Nukleinsäure zur Bestimmung einer Position, bei der die Nukleinsäure in einer Nukleinsäure-Trennung unter Verwendung von Elektrophorese existiert, ist ein Beispiel von solchen Farbstoffen. Mit der zuvor erwähnten Innovation der Techniken zur Handhabung von Nukleinsäuren wurde die Bedeutung von fluoreszierenden Farbstoffen für die Nukleinsäure-Detektion stetig größer, und eine große Vielfalt an Farbstoffen wurde entwickelt. Beispiele sind im Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 8. Ausgabe (CD-ROM, herausgegeben von Molecular Probes, Inc., 2001) detailliert.
Bezüglich der Funktionen, die für Farbstoffe für die Nukleinsäure-Detektion erforderlich sind, wird von den Farbstoffen gefordert, dass sie eine moderate Interaktion mit einer Nukleinsäure, eine schwache Fluoreszenz-Eigenschaft in Abwesenheit einer Nukleinsäure, während sie auf der anderen Seite eine starke Fluoreszenz-Eigenschaft in Anwesenheit einer Nukleinsäure aufweisen. Zusätzlich ist eine hohe Wasserlöslichkeit und eine Expansion der Variationen der Anregungswellenlänge und Emissionswellenlänge erwünscht, um verschiedene Anregungswellenlängen und Emissionswellenlänge abzudecken.
Farbstoffe, wie asymmetrische Cyaninfarbstoffe mit einem kationischen Chromophor, die in dem US-Patent Nr. 5,658,751 offenbart sind, wurden entwickelt, welche nicht nur für die einfache Detektion einer Nukleinsäure verwendet werden, sondern auch für die Quantifizierung einer doppelsträngigen Nukleinsäure, sogar dann, wenn eine einzelsträngige Nukleinsäure co-existiert. Das US-Patent Nr. 5,656,449 offenbart asymmetrische Cyaninfarbstoffe mit einem elektrisch neutralen Chromophor, und das Patentdokument offenbart eine charakteristische Eigenschaft des Farbstoffs, der für die Fluoreszenz-Detektion einer Nukleinsäure sogar in lebenden Zellen anwendbar ist. Auch für diese Zwecke sind neue Fluoreszenzfarbstoffe erwünscht, die präzisere quantitative Ergebnisse und Variationen der Anregungswellenlänge und Emissionswellenlänge bereitstellen, und eine empfindlichere Detektion von Nukleinsäuren ermöglichen. Asymmetrische Cyaninfarbstoffe und deren Verwendungen sind auch in WO 00/66664 beschrieben.
Offenbarung der Erfindung
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt darin, eine Verbindung bereitzustellen, die durch eine Interaktion mit einer vielsträngigen Nukleinsäure unter Diskriminierung einer einzelsträngigen Nukleinsäure ein starkes Signal emittiert, und ferner darin, ein Verfahren zum Detektieren einer vielsträngigen Nukleinsäure unter Verwendung solch einer Verbindung bereitzustellen.
Ein andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen hoch-fluoreszierenden Farbstoffs zur Detektion einer Nukleinsäure, der eine breite Vielfalt an Anregungswellenlängen und Emissionswellenlängen bereitstellt und somit für eine breite Vielzahl an Zwecken verwendet werden kann. Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Fluoreszenzfarbstoffs mit einer höheren Selektivität in einem Verfahren zur Detektion einer doppelsträngigen Nukleinsäure unter Diskriminierung von einer einzelsträngigen Nukleinsäure.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben zahlreiche Forschungen durchgeführt, um die zuvor genannten Aufgaben zu erreichen. Als ein Ergebnis haben sie festgestellt, dass für die strikte Diskriminierung einer einzelsträngigen Nukleinsäure und einer vielsträngigen Nukleinsäure es extrem schwierig war, einen Farbstoff zu entwickeln, der nur an eine vielsträngige Nukleinsäure bindet und ein detektierbares Signal emittiert, einfach durch Steuerung der Affinität zu einer einzelsträngigen Nukleinsäure und zu einer vielsträngigen Nukleinsäure. Dementsprechend, basierend auf einem Konzept, das sich vollständig von den herkömmlichen Verfahren unterscheidet, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung das folgende Verfahren entwickelt. Das heißt, wenn eine Verbindung verwendet wird, die im wesentlichen in einem Zustand farblos ist, bei der nur eine einzelsträngige Nukleinsäure existiert (Bedingung, bei der keine vielsträngige Nukleinsäure existiert), sich aber in einem gefärbten Zustand ändert und Fluoreszenz emittiert, wenn eine vielsträngige Nukleinsäure existiert; keine Fluoreszenz beobachtet wird aufgrund keiner Lichtabsorption mit einer einzelsträngigen Nukleinsäure, während Lichtabsorption in Anwesenheit einer vielsträngigen Nukleinsäure auftritt, um die Detektion von Fluoreszenz zu ermöglichen. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben das zuvor angegebene Verfahren studiert und verifiziert, dass das oben angegebene Verfahren ein extrem herausragendes Verfahren für die Messung einer vielsträngigen Nukleinsäure ist. Die vorliegende Erfindung wurde auf Basis dieser Feststellungen fertiggestellt.
Die vorliegende Erfindung stellt somit ein Verfahren zur optischen Messung einer vielsträngigen Nukleinsäure bereit, umfassend das Kontaktieren einer Verbindung mit einer vielsträngigen Nukleinsäure, worin die Verbindung in der Lage ist, mit der vielsträngigen Nukleinsäure zu interagieren, worin die Verbindung die folgenden Eigenschaften aufweist:

(a) die Verbindung kann in einem im wesentlichen farblosen und nicht-fluoreszierenden Zustand unter zumindest einer Bedingung in einer wäßrigen Lösung in Abwesenheit der vielsträngigen Nukleinsäure existieren und
(b) wenn die vielsträngige Nukleinsäure in dem Zustand existieren kann, wie oben unter (a) definiert, ändert sich die Verbindung in einen im wesentlichen gefärbten Zustand, basierend auf der Wechselwirkung mit der vielsträngigen Nukleinsäure, und entwickelt im wesentlichen eine Fluoreszenzeigenschaft auf der Basis der Interaktion und worin die Verbindung wie in dem beigefügten Anspruch 1 spezifiziert ist.

Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur optischen Messung der vielsträngigen Nukleinsäure bereit, umfassend das Kontaktieren einer Verbindung mit einer vielsträngigen Nukleinsäure, worin die Verbindung mit der vielsträngigen Nukleinsäure interagieren kann, worin die Verbindung die folgenden Eigenschaften aufweist:

(c) die Verbindung ist in einem nicht-protonierten Zustand und im wesentlichen nicht-fluoreszent in einer wäßrigen Lösung in der Abwesenheit der vielsträngigen Nukleinsäure,
(d) die Verbindung kann in einem im wesentlichen farblosen und im wesentlichen nicht-fluoreszenten Zustand in einem protonierten Zustand in einer wäßrigen Lösung unter zumindest einer Bedingung in der Abwesenheit der vielsträngigen Nukleinsäure existieren, und
(e) wenn die vielsträngige Nukleinsäure in dem Zustand existieren kann, der oben unter (d) definiert ist, ändert sich die Verbindung in einen im wesentlichen gefärbten Zustand auf der Basis einer Interaktion mit der vielsträngigen Nukleinsäure und entfaltet im wesentlichen eine Fluoreszenzeigenschaft auf der Basis der Interaktion, und worin die Verbindung wie in dem beigefügten Anspruch 2 spezifiziert ist.

Somit werden gemäß der vorliegenden Erfindung die zuvor angegebenen Verfahren bereitgestellt, worin die Verbindung, die in der Lage ist, mit der vielsträngigen Nukleinsäure zu interagieren, durch die folgende Formel (V) dargestellt wird. Vergleichsverbindungen werden durch die folgenden Formeln (VI), (VII) oder (VIII) dargestellt: Formel (V)
Formel (IV)
Formel (VII)
Formel (VIII)
worin die Substituentendefinitionen wie in dem beigefügten Anspruch 1 spezifiziert sind.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur optischen Messung einer vielsträngigen Nukleinsäure bereit, umfassend:

(1) den Schritt des Kontaktierens der Verbindung (B) mit der folgenden allgemeinen Formel mit einer vielsträngigen Nukleinsäure und
(2) den Schritt der Messung der Fluoreszenz der Verbindung (C), erzeugt durch Interaktion der Verbindung (B) und der vielsträngigen Nukleinsäure:
worin die jeweils zwei Pfeile das chemische Gleichgewicht darstellen; die Verbindung (A) eine im wesentlichen nicht-fluoreszente Verbindung bedeutet, die Verbindung (B) eine im wesentlichen nicht-fluoreszente Verbindung bedeutet, die kein Absorptionsmaximum im Bereich von 400 bis 1.000 nm unter zumindest einer Bedingung aufweist, die Verbindung (C) eine Verbindung ist, die durch eine Interaktion der Verbindung (B) und der vielsträngigen Nukleinsäure unter der oben erwähnten Bedingung erzeugt ist und ein Absorptionsmaximum im Bereich von 400 bis 1.000 nm aufweist und im wesentlichen eine fluoreszente Eigenschaft auf der Basis der Wechselwirkung entfaltet; X eine Gruppe von Atomen ist, die erforderlich ist zur Bildung eines Farbstoffmoleküls durch Bindung an -C(R)=Y, wobei Y eine Gruppe von Atomen bedeutet, die erforderlich ist zur Bildung eines Farbstoffmoleküls durch Bindung an X-C(R)=; R ein Wasserstoffatom oder ein Substituent ist und an X und/oder Y zur Bildung eines Rings binden kann; Y' ein Rest ist, der als Ergebnis des Auftretens eines Elektronentransfers verbleibt, so daß die Doppelbindung von C=Y in der Verbindung (A) protoniert ist; und Z eine Konjugatbase der Säure HZ ist und an X, Y (oder Y') oder R binden kann, worin die Verbindung (A) wie in dem beigefügten Anspruch 1 spezifiziert ist.

Gemäß bevorzugten Ausführungsformen dieser Erfindungen werden die zuvor angegebenen Verfahren bereitgestellt, die den Schritt des Ermöglichens der Interaktion mit der vielsträngigen Nukleinsäure in einem Lösungszustand umfassen und die zuvor angegebenen Verfahren, die den Schritt des Ermöglichens der Interaktion mit der vielsträngigen Nukleinsäure, immobilisiert auf einem Festphasenträger, umfassen.
In einem noch weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Reagens für die optische Messung einer vielsträngigen Nukleinsäure bereit, das eine Verbindung umfasst, die zur Interaktion mit einer vielsträngigen Nukleinsäure befähigt ist, worin die Verbindung die folgenden Eigenschaften aufweist:

(a) die Verbindung kann in einem im wesentlichen farblosen und nicht-fluoreszierenden Zustand unter zumindest einer Bedingung in einer wässerigen Lösung in Abwesenheit der vielsträngigen Nukleinsäure vorliegen, und
(b) wenn die vielsträngige Nukleinsäure in dem Zustand existieren kann, wie oben unter (a) definiert, ändert sich die Verbindung in einen im wesentlichen gefärbten Zustand, basierend auf der Wechselwirkung mit der vielsträngigen Nukleinsäure und entwickelt im wesentlichen eine Fluoreszenz-Eigenschaft auf der Basis der Interaktion, und worin die Verbindung wie in dem beigefügten Anspruch 1 spezifiziert ist.

Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Reagens für die optische Messung einer vielsträngigen Nukleinsäure bereit, das eine Verbindung umfasst, die befähigt ist, mit einer vielsträngigen Nukleinsäure wechselzuwirken, worin die Verbindung die folgenden Eigenschaften aufweist:

(c) die Verbindung ist in einem nicht-protonierten Zustand und im wesentlichen nicht-fluoreszent in einer wäßrigen Lösung in der Abwesenheit der vielsträngigen Nukleinsäure,
(d) die Verbindung kann in einem im wesentlichen farblosen und im wesentlichen nicht-fluoreszenten Zustand in einem protonierten Zustand in einer wäßrigen Lösung unter zumindest einer Bedingung in der Abwesenheit der vielsträngigen Nukleinsäure existieren, und
(e) wenn die vielsträngige Nukleinsäure in dem Zustand existieren kann, der oben unter (d) definiert ist, ändert sich die Verbindung in einen im wesentlichen gefärbten Zustand auf der Basis einer Interaktion mit der vielsträngigen Nukleinsäure und entfaltet im wesentlichen eine Fluoreszenzeigenschaft auf der Basis der Interaktion und worin die Verbindung wie in dem beigefügten Anspruch 1 spezifiziert ist.

Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine neue asymmetrische Farbstoffverbindung bereit, wie es in den beigefügten Ansprüchen 1 und 6 spezifiziert ist.
Diese Farbstoffe sind dadurch gekennzeichnet, dass sie ein neutrales Chromophor und eine Klasse an Verbindungen aufweisen, die im allgemeinen als Farbstoffbasen klassifiziert werden. Die zuvor angegebenen Farbstoffverbindungen, die von den Erfindern der vorliegenden Erfindung festgestellt wurden, sind dadurch gekennzeichnet, dass sie ein neutrales Chromophor und darüber hinaus eine Struktur aufweisen, die einen heterocyclischen Ring enthält, bei dem 5-gliedrige und 6-gliedrige Ringe kondensiert sind (d. h., ein Azolring und ein Pyridinring sind kondensiert). Farbstoffe mit solch einem kondensierten Ringsystem sind im hohem Maße stabil und weisen charakteristische Eigenschaften für eine Vielzahl von Zwecken auf. Als Farbstoffe mit einem kationischen Chromophor, bei dem beispielsweise ein Azolring und Pyridinring kondensiert sind, sind beispielsweise die Farbstoffe, die in der offengelegten Japanischen Patentveröffentlichung Nr. 2001-270957 offenbart sind, die Farbstoffe, die in der offengelegten Japanischen Patentveröffentlichung Nr. 2001-163895 offenbart sind, und dergleichen bekannt. Allerdings war die Farbstoffstruktur mit dem neutralen Chromophor gemäß der Erfindung noch nicht bekannt.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung
In einer Ausführungsform wird das Verfahren der vorliegenden Erfindung für die optische Messung einer vielsträngigen Nukleinsäure verwendet und umfasst den Schritt des Kontaktierens einer Verbindung mit einer vielsträngigen Nukleinsäure, worin die Verbindung in der Lage ist, mit der vielsträngigen Nukleinsäure zu interagieren, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung die folgenden Eigenschaften aufweist:

(a) die Verbindung kann in einem im wesentlichen farblosen und nicht-fluoreszierenden Zustand unter zumindest einer Bedingung in einer wässerigen Lösung in Abwesenheit der vielsträngigen Nukleinsäure existieren,
(b) wenn die vielsträngige Nukleinsäure in dem Zustand existieren kann, wie oben unter (a) definiert, ändert sich die Verbindung in einen im wesentlichen gefärbten Zustand, basierend auf der Wechselwirkung mit der vielsträngigen Nukleinsäure und entwickelt im wesentlichen eine Fluoreszenz-Eigenschaft auf der Basis der Interaktion.

In der Beschreibung bedeutet der Begriff "farblos", dass die Verbindung einen maximalen Molekular-Extinktionskoeffizienten von Null bis weniger als 8000 aufweist, vorzugsweise Null bis weniger als 5000, am stärksten bevorzugt Null bis weniger als 3000, im Bereich von 400 bis 1000 nm (numerische Bereiche, die durch "von --- bis" in der Beschreibung angegeben sind, sind solche, die eine obere Grenze und eine untere Grenze einschließen, sofern es nicht anderweitig spezifisch angegeben ist). Darüber hinaus bedeutet der Begriff "gefärbt", dass die Verbindung einen maximalen molekularen Extinktions-Koffizienten von 20000 oder höher, vorzugsweise von 30000 oder höher, am stärksten bevorzugt von 40000 oder höher, im Bereich von 400 bis 1000 nm aufweist. Ein Verhältnis der Änderung bei dem molekularen Extinktions-Koeffizienten vom farblosen Zustand zu dem gefärbten Zustand beträgt das 5-fache oder höher, vorzugsweise das 7-fache oder höher, am stärksten das 10-fache oder höher.
In der Beschreibung bedeutet der Begriff "befähigt zur Interaktion", dass die zuvor angegebene Verbindung und eine vielsträngige Nukleinsäure eine Affinität zueinander aufweisen, und dass sie erfolgreich eine Art einer physikochemischen Interaktion, wie ein Transfer von Energie über eine reversible Bindung, erreichen. Allerdings sollte der Begriff nicht auf irgendeine beschränkende Weise ausgelegt werden und wird in seinem breitesten Sinne ausgelegt. Der Begriff "kann in einem im wesentlichen farblosen und nicht-fluoreszierenden Zustand in einer wässerigen Lösung unter zumindest einer Bedingung existieren" bedeutet, dass die Verbindung die oben angegebene Eigenschaft in einem Zustand aufweist, wobei die Bedingungen in einer Lösung, wie der pH-Wert und eine Salzkonzentration, geeignet gewählt werden, und die Verbindung kann irgendwelche Eigenschaften unter einer Bedingung, die sich von der oben angegebenen Bedingung unterscheidet, aufweisen. Der Fachmann kann leicht bestimmen, ob oder ob nicht eine Verbindung die gewünschten Eigenschaften aufweist, indem er einen pH-Wert und eine Salzkonzentration einer Lösung gemäß herkömmlichen Verfahren geeignet auswählt.
In der Beschreibung bezieht sich der Begriff "vielsträngige Nukleinsäure" auf einen Zustand von Nukleinsäuren in Assoziation durch eine Interaktion, die von komplementären Sequenzen (ein Verfahren der Bildung der vielsträngigen Nukleinsäure durch Interaktion kann manchmal als "Hybridisierung" bezeichnet werden) herrührt. Es ist bekannt, dass eine vielsträngige Nukleinsäure in einem doppelsträngigen, tripelsträngigen, vierfachsträngigen Zustand oder dergleichen existieren kann. Der Begriff "vielsträngige Nukleinsäure" in der Beschreibung schließt diese vielfältigen Stränge ein. Als Nukleinsäuren sind DNA und RNA wie auch viele chemisch modifizierten Nukleinsäuren bekannt, und Nukleinsäure-Analoga, die als PNA bezeichnet werden, die eine Polypeptidkette als ein Rückgrat aufweisen, sind auch bekannt. Die vielsträngige Nukleinsäure in der Beschreibung schließt alle diese Substanzen ein. Nukleinsäuren, die stärker bevorzugt in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind DNA, RNA und chemisch modifizierte Substanzen davon. Unter doppelsträngigen und vierfachsträngigen Nukleinsäuren sind doppelsträngige Nukleinsäuren bevorzugt. Eine vielsträngige Nukleinsäure, die durch Hybridisierung einer Sonden-Nukleinsäure und einer Proben-Nukleinsäure hergestellt wird, wird in der Beschreibung als "vielsträngige Hybrid-Nukleinsäure" bezeichnet.
Als eine Verbindung mit den zuvor angegebenen Eigenschaften, die für das Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, können beispielsweise Farbstoffverbindungen verwendet werden, die im wesentlichen farblos werden, wenn sie in einer Lösung protoniert sind. Beispielsweise werden einige der Cyaninfarbstoffe protoniert und werden in einer wässerigen Lösung farblos, und viele der Benzimidacarbocyanin-Farbstoffe weisen die zuvor angegebene Eigenschaft auf. Für das oben angegebene Phänomen wird auch berücksichtigt, dass ein Farbstoff-konjugiertes System als ein Ergebnis der Protonierung eines Kohlenstoffatoms in einer Methinkette eines Cyaninfarbstoffs abgespalten wird, wodurch die Verbindung farblos wir. Für das oben angegebene Phänomen wird auch berücksichtigt, dass sich der Cyaninfarbstoff in einem Gleichgewicht zwischen einem intrinsisch gefärbten Zustand und einem protonierten farblosen Zustand in Abhängigkeit von einer Protonen-Konzentration in dem System befindet.
Verbindungen, die für das Verfahren einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind solche, die zur Interaktion mit der vielsträngigen Nukleinsäure befähigt sind und die folgenden Eigenschaften aufweisen:

(c) in Abwesenheit einer Nukleinsäure liegt die Verbindung in einem nicht-protonierten Zustand vor und ist im wesentlichen in einer wässerigen Lösung nicht-fluoreszent,
(d) in Abwesenheit der vielsträngigen Nukleinsäure kann die Verbindung in einem protonierten Zustand in einem im wesentlichen farblosen und im nicht-fluoreszenten Zustand in einer wässerigen Lösung unter zumindest einer Bedingung existieren, und
(e) wenn die vielsträngige Nukleinsäure in dem Zustand existieren kann, der oben unter (d) definiert ist, ändert sich die Verbindung in einen im wesentlichen gefärbten Zustand, auf der Basis der Interaktion mit der vielsträngigen Nukleinsäure und zeigt im wesentlichen eine Fluoreszenz-Eigenschaft, auf der Basis der Interaktion.

Obwohl es nicht beabsichtigt ist, an irgendeine spezielle Theorie gebunden zu sein, basieren die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung auf dem Prinzip, dass, wenn die Farbstoffverbindung, die aufgrund der Protonierung farblos geworden ist, mit einer vielsträngigen Nukleinsäure wechselwirkt, sich ein Gleichgewicht zu einem intrinsischen Farbstoffzustand (Wiedergewinnung eines Farbstoffkonjugierten Systems) durch eine Interaktionsenergie, die von der vielsträngigen Nukleinsäure aufgenommen wird, verschiebt, wodurch der Farbstoff gefärbt wird und in Abwesenheit der vielsträngigen Nukleinsäure der im wesentlichen farblose Zustand erhalten bleibt. Sogar wenn eine einzelsträngige Nukleinsäure in dem Reaktionssystem existiert, wird der im wesentlichen farblose Zustand aufrechterhalten, da eine Interaktionsenergie zwischen dem Farbstoff und einer einzelsträngigen Nukleinsäure klein ist. Indes ist die Interaktionsenergie zwischen dem Farbstoff und einer vielsträngigen Nukleinsäure ausreichend hoch, und somit wird sich der Farbstoff, der farblos eingestellt wurde, in einen gefärbten Farbstoff ändern, aufgrund der Interaktion mit der vielsträngigen Nukleinsäure. Als ein Ergebnis tritt eine Lichtabsorption auf, und somit wird es möglich sein, den Farbstoff vorliegen zu haben, der Fluoreszenzeigenschaften zeigt.
Als eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung schließt ein Beispiel ein Verfahren ein, umfassend:

(1) den Schritt des Kontaktierens der Verbindung (B) mit der folgenden Formel mit einer vielsträngigen Nukleinsäure und
(2) den Schritt der Messung der Fluoreszenz der Verbindung (C), erzeugt durch Interaktion der Verbindung (B) und der vielsträngigen Nukleinsäure:
worin die jeweils zwei Pfeile das chemische Gleichgewicht darstellen; die Verbindung (A) eine im wesentlichen nicht-fluoreszente Verbindung bedeutet, die Verbindung (B) eine im wesentlichen nicht-fluoreszente Verbindung bedeutet, die kein Absorptionsmaximum im Bereich von 400 bis 1.000 nm unter zumindest einer Bedingung aufweist, die Verbindung (C) eine Verbindung ist, die durch eine Interaktion der Verbindung (B) und der vielsträngigen Nukleinsäure unter der oben erwähnten Bedingung erzeugt ist und ein Absorptionsmaximum im Bereich von 400 bis 1.000 nm aufweist und im wesentlichen eine fluoreszente Eigenschaft auf der Basis der Wechselwirkung entfaltet; X eine Gruppe von Atomen ist, die erforderlich ist, um ein Farbstoffmolekül durch Binden an -C(R)=Y; Y eine Gruppe von Atomen darstellt, die erforderlich ist zur Bildung eines Farbstoffmoleküls durch Bindung an X-C(R)=; R ein Wasserstoffatom oder ein Substituent ist, und kann an X und/oder Y zur Bildung eines Rings binden kann, Verbindung (A) wie in dem beigefügten Anspruch 1 spezifiziert ist; Y' einen Rest darstellt, der als Ergebnis des Auftretens eines Elektronentransfers verbleibt, so dass die Doppelbindung von C=Y in der Verbindung (A) protoniert ist; und Z eine Konjugatbase der Säure HZ ist und an X, Y (oder Y') oder R binden kann.

Bevorzugte basische Strukturen, die durch X und Y gebildet werden, sind unten als (DX) bzw. (DY) angegeben. Allerdings ist der Umfang der Verbindungen, die für das Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, nicht auf diese Beispiele beschränkt. In den Strukturen, die als (DX) und (DY) dargestellt werden, stellt A eine Alkylgruppe, eine aromatische Gruppe oder ein freies Elektronenpaar dar, und wenn zwei oder mehr von A existieren, können sie gleich oder verschieden sein (in den Formeln, wenn A eine Alkylgruppe oder eine aromatische Gruppe darstellt, werden Gegenionen und Zeichen, die Ionen anzeigen, weggelassen). A' und A'' stellen jeweils eine Alkylgruppe oder eine aromatische Gruppe dar. Das Symbol k stellt eine ganze Zahl von 0, 1 oder 2 dar. Wasserstoffatome können mit einem Substituenten ersetzt werden und, falls möglich, kann eine kondensierte Ringstruktur gebildet werden.

* nicht gemäß der vorliegenden Erfindung

* nicht gemäß der vorliegenden Erfindung

* nicht gemäß der vorliegenden Erfindung

* nicht gemäß der vorliegenden Erfindung

Die Verbindung als eine Farbstoffverbindung, die zur Interaktion mit der vielsträngigen Nukleinsäuren befähigt ist, die die folgenden Eigenschaften aufweist, (c) die Verbindung liegt in einem nicht-protonierten Zustand vor und ist im wesentlichen in einer wässerigen Lösung in Abwesenheit der vielsträngigen Nukleinsäure nicht-fluoreszent, (d) die Verbindung kann in einem protonierten Zustand in einem im wesentlichen farblosen und im wesentlichen nicht-fluoreszenten Zustand in einer wässerigen Lösung unter wenigstens einer Bedingung der Abwesenheit der vielsträngigen Nukleinsäure vorliegen, und (e) die Verbindung ändert sich in einen im wesentlichen gefärbten Zustand, bezogen auf eine Interaktion mit der vielsträngigen Nukleinsäure und zeigt im wesentlichen eine Fluoreszenzeigenschaft, bezogen auf die Interaktion, wenn die vielsträngige Nukleinsäure in der Bedingung, die in dem oben angegebenen (d) definiert ist, vorliegt und wird von den Verbindungen ausgewählt, die durch die Formel (V), wie in dem beigefügten Anspruch 1 definiert ist, dargestellt ist.
In Formel (V) stellen R¹, R² und R³ jeweils unabhängig von einander ein Wasserstoffatom oder einen Substituenten dar. R¹ und R² und R² und R³ können miteinander binden, um einen Ring zu bilden. Diese Substituenten, die durch R¹, R² und R³ dargestellt sind, sind aus der Gruppe ausgewählt, die aus einem Halogenatom, einer Alkylgruppe, einer Alkenylgruppe, einer Alkinylgruppe, einer Arylgruppe, einer Aminogruppe, Hydroxylgruppe, einer Alkoxylgruppe, einer Aryloxygruppe, einer Alkylthiogruppe, einer Arylthiogruppe, einer Acylaminogruppe, einer Sulfonylaminogruppe, einer heterocyclischen Gruppe, Cyanogruppe, einer Sulfonylgruppe, einer Sulfinylgruppe, Nitrogruppe, Sulfogruppe, Carboxylgruppe, einer Alkoxycarbonylgruppe, einer Aryloxycarbonylgruppe, einer Carbamoylgruppe und einer Sulfamoylgruppe besteht. Diese Substituenten können ferner substituiert sein und die Gesamtatomzahl beträgt 1 bis 50, stärker bevorzugt 1 bis 35, ferner vorzugsweise 1 bis 25.
Wenn R¹ und R² und R² und R³ miteinander binden, um einen Ring zu bilden, sind 5- bis 8-gliedrige Ringe bevorzugt. Die gebildeten Ringe können entweder nicht-aromatisch oder aromatisch sein und können entweder einen Kohlenstoffring oder einen heterocyclischen Ring aufweisen.
Q stellt ein Sauerstoffatom, Schwefelatom, -N(R²⁴)- oder -C(R²⁴(R²⁵)- dar. R²⁴ und R²⁵ stellen jeweils unabhängig voneinander eine Alkylgruppe, eine Arylgruppe oder eine heterocyclische Gruppe dar. R²⁴ und R²⁵ können miteinander binden, um einen 3- bis 8-gliedrigen Ring zu bilden. Die Alkylgruppe, Arylgruppe oder heterocyclische Gruppe, die durch R²⁴ oder R²⁵ dargestellt wird, kann weiter substituiert sein, und die Gesamt-Atomzahl beträgt vorzugsweise 3 bis 50, stärker bevorzugt 3 bis 35, ferner vorzugsweise 3 bis 25. Q ist vorzugsweise ein Sauerstoffatom oder ein Schwefelatom, am stärksten bevorzugt ein Schwefelatom. R⁶ stellt eine Alkylgruppe, eine Arylgruppe oder eine heterocyclische Gruppe dar, und diese Substituenten können ferner substituiert sein. Die Gesamt-Atomzahl beträgt vorzugsweise 4 bis 50, stärker bevorzugt 4 bis 35, ferner vorzugsweise 4 bis 25. R⁶ kann an R¹⁵ oder R¹⁷ binden, um, wenn möglich, einen Ring zu bilden.
Das Symbol n stellt eine ganze Zahl von 0, 1, 2 oder 3 dar.
Um die Interaktion mit einer Nukleinsäure zu verstärken, weisen die zuvor angegebenen Verbindungen vorzugsweise ein oder mehrere kationische Gruppen in irgendeinem der Substituenten auf. Der Begriff "kationische Gruppe" wird als ein Konzept verwendet, der diese einschließt, die Kationen durch Protonierung, wie auch Kationen, werden können. Beispiele der kationischen Gruppen schließen eine Sulfoniumgruppe, eine Phosphoniumgruppe, eine Aminogruppe und eine Ammoniumgruppe ein, und eine Aminogruppe und eine Ammoniumgruppe sind bevorzugt.
Die Verbindung, die bei Kontakt mit einer vielsträngigen Nukleinsäure eine Fluoreszenzeigenschaft zeigt, wird durch die oben angegebene Formel (V) dargestellt. Diese Verbindungen weisen signifikant Unterschiede in der Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit von der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Nukleinsäure, insbesondere Anwesenheit oder Abwesenheit einer mehrsträngigen Nukleinsäure, auf und werden vorzugsweise für den Schutz einer Nukleinsäure verwendet.
R¹⁴, R¹⁵, R¹⁶ und R¹⁷ stellen jeweils ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe, eine Alkinylgruppe, eine Arylgruppe, Aminogruppe, Hydroxylgruppe, eine Alkoxylgruppe, eine Aryloxygruppe, eine Alkylthiogruppe, eine Arylthiogruppe, eine Acylaminogruppe, eine Sulfonylaminogruppe, eine heterocyclische Gruppe, Cyanogruppe, eine Sulfonylgruppe, eine Sulfinylgruppe, Nitrogruppe, Sulfogruppe, Carboxylgruppe, eine Alkoxycarbonylgruppe, eine Aryloxycarbonylgruppe, eine Carbamoylgruppe, eine Sulfamoylgruppe, eine Acylgruppe oder eine Mercaptogruppe, stärker bevorzugt Wasserstoffatom, ein Halogenatom, eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe, eine Alkinylgruppe, eine Arylgruppe, Aminogruppe, eine Alkoxygruppe, eine Aryloxygruppe, eine Alkylthiogruppe, eine Arylthiogruppe, eine Acylaminogruppe, eine Sulfonylaminogruppe, eine heterocyclische Gruppe, Cyanogruppe, eine Sulfonylgruppe, eine Sulfinylgruppe, Sulfogruppe, Carboxylgruppe, eine Alkoxycarbonylgruppe, eine Aryloxycarbonylgruppe, eine Carbamoylgruppe, eine Sulfamoylgruppe oder eine Acylgruppe dar. Am stärksten bevorzugt sind Wasserstoffatom, ein Halogenatom, eine Alkylgruppe, eine Arylgruppe, eine Aminogruppe, eine Alkoxylgruppe, eine Aryloxygruppe, eine Alkylthiogruppe, eine Arylthiogruppe, eine Acylaminogruppe, Cyanogruppe, eine Sulfonylgruppe, Sulfogruppe, Carboxylgruppe, eine Alkoxycarbonylgruppe und eine Carbamoylgruppe. Spezielle Beispiele davon schließen solche ein, die als Beispiele von R¹, R² und R³ erwähnt sind. Diese Substituenten können ferner substituiert sein. Die Gesamt-Atomzahl von jedem von R¹⁴, R¹⁶ und R¹⁷ beträgt vorzugsweise 1 bis 50, stärker bevorzugt 1 bis 35, ferner vorzugsweise 1 bis 15.
R¹⁴ und R¹⁵ und R¹⁶ und R¹⁷ können miteinander binden, um einen 5- bis 8-gliedrigen Ring zu bilden. Der gebildete Ring kann entweder nicht-aromatisch oder aromatisch sein und kann entweder ein Kohlenstoffring oder ein heterocyclischer Ring sein. Ein aromatischer 6-gliedriger Ring ist am stärksten bevorzugt. In der vorliegenden Erfindung bilden am stärksten bevorzugt R¹⁴ und R¹⁵ oder R¹⁶ und R¹⁷ einen Benzo-kondensierten Ring, um eine Chinolin-Struktur zu bilden.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung weisen vorzugsweise ein oder mehrere kationische Gruppen in irgendeinem der Substituenten auf, um die Interaktion mit einer Nukleinsäure zu erhöhen. Der Begriff "kationische Gruppe" wird als ein Konzept verwendet, das solche einschließt, die Kationen durch Protonierung werden, wie auch Kationen. Beispiele der kationischen Gruppe schließen eine Sulfoniumgruppe, eine Phosphoniumgruppe, eine Aminogruppe und eine Ammoniumgruppe ein, und eine Aminogruppe und eine Ammoniumgruppe sind bevorzugt. Die Bindungsposition ist vorzugsweise R¹, R², R³, R¹⁴, R¹⁵, R¹⁶, R¹⁷ oder R⁶ in der Formel (V).
Spezielle Beispiele der Verbindungen, die geeignet für das Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind unten angegeben. Allerdings ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung nicht auf die Verwendung dieser Verbindungen beschränkt.

* nicht gemäß der vorliegenden Erfindung

* nicht gemäß der vorliegenden Erfindung

* nicht gemäß der vorliegenden Erfindung

* nicht gemäß der vorliegenden Erfindung

* nicht gemäß der vorliegenden Erfindung

Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung, die durch die oben angegebene Formel (V) dargestellt werden, können Salze bilden. Die Arten der Salze sind nicht besonders beschränkt, und sie können entweder Säureadditionssalze oder Basenadditionssalze in Abhängigkeit von dem Typ des Substituenten und dergleichen sein. Ferner können die zuvor angegebenen Verbindungen und Salze Hydrate oder Solvate bilden. Irgendwelche dieser Substanzen fallen in den Umfang der vorliegenden Erfindung. Darüber hinaus können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung ein oder mehrere asymmetrische Kohlenstoffe in Abhängigkeit von den Arten der Substituenten aufweisen, und Isomere, wie Enantiomere und Diastereoisomere, können vorliegen. Als Verbindungen, die eine olefinische Doppelbindung enthalten, können geometrische Isomere vorliegen. Irgendwelche Isomere, irgendwelche Mischungen aus Isomeren, Racematen und dergleichen fallen alle in den Umfang der vorliegenden Erfindung. Ferner können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung auch als Tautomere existieren, und irgendwelche Tautomere und Mischungen davon fallen auch in den Umfang der vorliegenden Erfindung.
Die zuvor angegebenen Verbindungen sind im allgemeinen in Farbstoffbasen unter Cyaninfarbstoffe klassifiziert, und allgemeine Syntheseverfahren für die angegebenen Verbindungen sind auf diesem Gebiet bekannt. Somit kann der Fachmann leicht die Verbindungen synthetisieren. Beispielsweise können die Verfahren, die in dem US-Patent Nr. 5,656,449 und 5,658,751 beschrieben sind, vorzugsweise verwendet werden. Beispielsweise kann eine betreffende Substanz leicht durch Verwendung irgendeines der Syntheseverfahren, die unten erklärt sind, in Abhängigkeit, ob n in der Formel (V) 0 oder 1 ist, hergestellt werden.
< Verbindungen, wobei n = 0 ist >
Die betreffende Verbindung des Verfahrens 1 entspricht einer Vergleichsverbindung der Formel (VI), und exakt die gleichen Reaktionen können auch auf eine Vergleichsverbindung der Formel (VIII) angewendet werden. In der Formel stellt L eine Gruppe dar, die eliminiert werden kann, und ein Halogenatom, eine Alkylthiogruppe, eine Arylthiogruppe, eine Alkoxylgruppe, eine Aryloxygruppe oder dergleichen können vorzugsweise verwendet werden. Eine Alkylthiogruppe wird im allgemeinen verwendet. Für die Farbstoff-herstellende Reaktion kann ein Farbstoff durch Reaktion von Essigsäureanhydrid unter Verwendung einer Säure, wie p-Toluolsulfonsäure, als ein Katalysator in einem aprotischen polaren Lösemittel, wie Dimethylformamid, synthetisiert werden, wie US-Patent Nr. 5,656,449 spezielle Beispiele davon erwähnt.
Die betreffende Verbindung des Verfahrens 2 entspricht einer Verbindung der Formel (V), und exakt die gleichen Reaktionen können auch auf eine Vergleichsverbindung der Formel (VII) angewendet werden. In der Formel bedeutet Prot. eine Alkylgruppe, die entschützt werden kann, und eine Methoxyethoxymethylgruppe, die im US-Patent Nr. 5,656,449 beschrieben ist, wie auch eine Methylthiomethylgruppe, 4-Methoxybenzylgruppe und dergleichen können verwendet werden. Die Farbstoff-herstellende Reaktion kann unter Verwendung einer Base, wie Triethylamin, in einem aprotischen polaren Lösemittel, wie Dichlormethan und Dimethylformamid, durchgeführt werden. Die Entschützungsreaktion nach der Farbstoff-herstellenden Reaktion kann sich in Abhängigkeit von dem Typ einer verwendeten Schutzgruppe unterscheiden. Die Entschützung kann unter einer sauren Bedingung durchgeführt werden, wenn eine Methoxyethoxymethylgruppe, 4-Methoxybenzylgruppe oder dergleichen verwendet wird, oder sogar unter einer oxidierenden Bedingung, wenn eine 4-Methoxybenzylgruppe verwendet wird. Bezüglich Details kann auf "Protective Groups in Organic Synthesis, 3. Ausgabe", Theodora W. Greene, Peter G. M. Wute (Wiley, 1999) Bezug genommen werden.
Wenn Q ein Schwefelatom für die Herstellung von 2-Alkylthiothiazolopyridinen, die als Rohmaterialien für die Farbstoffe verwendet werden, ist, kann es Methyliodid ermöglicht werden, mit entsprechenden Thiazolpyridin-2-thionen in Anwesenheit einer Base, wie Kaliumcarbonat in Dimethylformamid, wie es beispielsweise in Heterocycles, S. 133, 1993 beschrieben ist, zu reagieren. Um die Thiazolopyridin-2-thion-Struktur zu synthetisieren, kann eine Synthese-Route geeignet aus den beiden synthetischen Routen unter Verwendung von 2-Aminopyridinen als Ausgangsmaterialien, die unten angegeben sind, ausgewählt werden.
Als erstes Verfahren können Thiazolopyridin-2-thione durch Reaktion von Aminopyridinen erhalten werden, wobei die ortho-Position relativ zu der Aminogruppe mit Kaliumethylxanthat in 1-Methyl-2-pyrolidon unter einer Heizbedingung (von 160 bis 170°C) bromiert oder chloriert wird. Ferner ist es auch möglich, 2-Amino-3-brompyridine durch Bromieren von Pyridin-2-onen, die als Ausgangsmaterialien in einer anordnungsselektiven Weise verwendet werden, herzustellen, und danach erfolgreich das Produkt mit Phosphoroxychlorid und wässerigem Ammoniak zur Reaktion zu bringen, wie es in Heterocycles, S. 133, 1993, beschrieben ist.
In dem zweiten Verfahren werden zunächst 2-Aminothiazolopyridine durch Reaktion von Kaliumthiocycanat mit 2-Aminopyridinen in Anwesenheit von Brom, wie beschrieben in Journal of Medicinal Chemistry (J. Med. Chem.), S. 126, 1967, synthetisiert. Die erhaltenen 2-Aminothiazolopyridine werden in Diazoniumsalze durch Reaktion von Natriumnitrit auf herkömmliche Weise konvertiert, und die Diazoniumsalze können mit Kupfer(I)-chlorid reagieren, um entsprechende 2-Chlorthiazolopyridine zu synthetisieren. Ferner können 2-Chlorthiazolopyridine mit Thioharnstoff reagieren und hydrolysiert werden, um die betreffenden Thiazolopyridin-2-thione zu erhalten.
Aminopyridine oder Pyridin-2-one können als Ausgangsmaterialien für beide der Verfahren zum Synthetisieren der Thiazolopyridin-2-thion-Struktur, die oben erwähnt wurde, verwendet werden. Allerdings ist das Ausgangsmaterial nicht auf diese Verbindungen beschränkt. Die Verfahren können auch für Aminochinoline (spezielle Beispiele sind in Chemische Berichte (Chem. Ber.), S. 869, 1959, beschrieben), Aminoisochinoline (spezielle Beispiele sind in Canadian Journal of Chemistry (Can. J. Chem.), S. 2466, 1966, beschrieben) und andere kondensierte Ring-Typ-Verbindungen, die Heteroatome enthalten (spezielle Beispiele sind in Journal of Medicinal Chemistry (J. Med. Chem.), S. 2546, 1995, beschrieben), verwendet werden. Es ist möglich, verschiedene Substituenten in R¹, R² und R³ der 2-Aminopyridine einzuführen, die die Ausgangsmaterialien des oben angegebenen Syntheseverfahrens sind, und wodurch die Verbindungen in Thiazolopyridin-2-thione abgeleitet werden können, die synthetische Intermediate der Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind.
Als Aminopyridin-Analoga gibt es viele kommerziell erhältliche Reagentien von Aminopyridinen, bei denen die ortho-Position relativ zur Aminogruppe bromiert oder chloriert ist. Allerdings können solche Aminopyridine leicht durch Halogenieren von Aminopyridinen synthetisiert werden. Die Bromierung von Aminopyridinen ist detailliert in Synthesis, S. 2175, 2001, beschrieben, und 3-Brom- und 3,5-Dibromverbindungen aus 2-Aminoverbindungen, 2-Brom- und 2,6-Dibromverbindungen aus 3-Aminoverbindungen, und 3-Brom- bzw. 3,5-Dibromverbindungen aus 4-Aminoverbindungen können selektiv durch Veränderung der Reaktionsbedingungen synthetisiert werden. Für die Chlorierung von 2-Aminopyridinen können 3-Chlorverbindungen und 3,5-Dichlorverbindungen durch Reaktion von Chlor, wie beschrieben in der Literatur (Zh. Russ. Fiz. -Khim, O-va, S. 685, 1928), erhalten werden. Als Iodierung von 2-Aminopyridinen, können 5-Iodverbindungen durch Reaktion von Iod und Periodsäure, wie in Tetrahedron Letters (Tetrahedron Lett.), S. 7493, 1993, beschrieben, erhalten werden.
Wenn eines von R¹, R² und R³ Halogen ist, können die Verbindungen ferner durch eine Substitutionsreaktion abgeleitet werden. Wenn R¹, R² oder R³ ein Chloratom ist, kann das Chloratom in eine Methoxygruppe durch eine Reaktion mit Natriummethoxid, wie beschrieben in Australian Journal of Chemistry (Aust. J. Chem.), S. 2025, 1982, konvertiert werden. Ferner kann das Chloratom in eine Ethoxygruppe durch eine Reaktion mit Natriumethoxid, wie beschrieben in Recl. Trav. Chim. Paya-Bas, S. 1187, 1956, konvertiert werden. Es kann in eine Hydroxylgruppe durch eine Reaktion mit wässerigem 3 N Natriumhydroxid, wie in Org. Prep. Proced. Int., S. 117, 1997, beschrieben, konvertiert werden. Wenn R¹, R² oder R³ ein Bromatom ist, kann das Atom in einer 2-Pyridylthiogruppe durch eine Reaktion mit 2-Mercaptopyridin in Anwesenheit von Kalium-t-butoxid und Kaliumiodid, wie beschrieben in Bull. Chim. Soc., Fr., S. 290, 1936, konvertiert werden. Das Bromatom kann in eine Methylaminogruppe durch eine Reaktion mit Methylamin in Anwesenheit von Kupfersulfat, wie beschrieben in Chem. Zentralbl., S. 1219, 1936, konvertiert werden. Das Bromatom kann in 2-Amino-5-stilylpyridin durch Reaktion mit Vinylbenzol in Anwesenheit eines Palladium-Katalysators, wie beschrieben in Journal of Organometallic Chemistry (J. Organomet. Chem.), S. 259, 1995, konvertiert werden.
Wenn R¹, R² oder R³ ein Iodatom ist, kann das Iodatom in eine Methylthiogruppe durch eine Reaktion mit Methanthiol in Anwesenheit von Kupferpulver in wässerigem Natriumhydroxid, wie beschrieben in Australian Journal of Chemistry (Aust. J. Chem.), S. 877, 1992, konvertiert werden. Ferner kann das Iodatom in eine Propylthiogruppe durch eine Reaktion mit Propanthiol in Anwesenheit von Kupferpulver in wässerigem Natriumhydroxid, wie beschrieben in Australian Journal of Chemistry (Aust. J. Chem.), S. 877, 1992, konvertiert werden. Das Iodatom kann in eine Cyanogruppe durch eine Reaktion mit Kupfercyanid, wie beschrieben in Journal of American Chemical Society (J. Am. Chem. Soc.), S. 1479, 1944, konvertiert werden. Das Iodatom kann in eine Methoxygruppe durch eine Reaktion mit Methanol in Anwesenheit von Natrium und Kupfer, wie beschrieben in Journal of Medicinal Chemistry (J. Med. Chem.), S. 3109, 1997, konvertiert werden. Das Iodatom kann in eine 1-Propoxygruppe durch eine Reaktion mit 1-Propanol in Anwesenheit von Natriumethoxid und Kupfer, wie beschrieben in Journal of Medicinal Chemistry (J. Med. Chem.), S. 1518, 1981, konvertiert werden.
Wenn R¹, R² oder R³ ein Halogen ist, kann das Halogen in irgendeine der breiten Vielfalt an Substituenten unter Verwendung einer Kupplungsreaktion unter Verwendung eines Übergangsmetallkatalysators konvertiert werden. Beispielsweise kann eine Arylierung durch eine Kupplungsreaktion mit 2-Amino-5-brompyridin und eine Arylborsäure unter Verwendung eines Palladium-Katalysators, wie beschrieben in Heterocycles, S. 2711, 1987, durchgeführt werden. Ferner kann eine Arylierung durch eine Kupplungsreaktion mit 2-Amino-6-brompyridin und einer Arylborsäure unter Verwendung eines Palladium-Katalysators, wie beispielsweise beschrieben in Journal of Medicinal Chemistry (J. Med. Chem.), S. 675, 2000, durchgeführt werden, und entsprechende Acetylen-Derivate können durch Reaktion von 2-Amino-6-brompyridin und Acetylenen in Anwesenheit eines Palladium-Katalysators und eines Kupfer-Reagens, wie beschrieben in Journal of American Chemical Society (J. Am. Chem. Soc.), S. 12416, 1995, erhalten werden.
Als Verfahren zur Einführung von anderen funktionellen Gruppen in 2-Aminopyridine, wenn 2-Aminopyridine unter Verwendung einer gemischten Säure nitriert werden, können 2-Amino-5-nitropyridine, eingeführt mit der Nitrogruppe, erhalten werden, wie es beispielsweise in Journal of American Chemical Society (J. Am. Chem. Soc.), S. 3154, 1955, beschrieben ist. Wenn 2-Aminopyridine mit rauchender Schwefelsäure oder Schwefelsäure und Schwefeltrioxid behandelt werden, können 6-Aminopyridin-3-sulfonsäuren, eingeführt mit der Sulfogruppe, erhalten werden, wie es in Bull. Soc., Chim. Fr., S. 736, 1939, beschrieben ist. Wenn es Benzylchlorid ermöglicht wird, mit 2-Aminopyridinen zu reagieren, können 2-Amino-5-benzylpyridine erhalten werden, wie es in Polish Journal of Chemistry (Pol. J. Chem.), S. 959, 1984, beschrieben ist.
Wenn R¹, R² oder R³ eine Carboxylgruppe ist, kann die genannte Gruppe auch in eine heterocyclische Gruppe konvertiert werden. Beispielsweise werden 2-(2-Aminopyridin-5-yl)benzothiazole durch eine Reaktion mit 6-Aminonicotinsäure und 2-Aminobenzolthiol, wie beschrieben in Journal of Medicinal Chemistry (J. Med. Chem.), S. 3375, 1996, erhalten. Für 2-Aminopyridin-Derivate, an die ein anderer heterocyclischer Ring gebunden ist, ist das Syntheseverfahren von 3,4'-Bipyridin-o-amin (R¹ = R³ = H und R² = 4-Pyridyl), in dem US-Patent Nr. 4,276,293 beschrieben. Für 2-Ethyl-[3,4-bipyridin]-6-amin (R¹ = H, R² = 4-Pyridyl und R³ = Ethyl) ist das Syntheseverfahren in dem US-Patent Nr. 4,313,951 beschrieben.
Verschiedene Verfahren zum Einführen eines Substituenten in Pyridin-2-one sind auch bekannt. Pyridin-2-one sind für die Synthese der Verbindungen der vorliegenden Erfindung wichtig, da Pyridin-2-one leicht in 2-Aminopyridine nach der Einführung eines Substituenten konvertiert werden können. Wenn Pyridin-2-one und Benzophenone reagiert werden, wird die Additionsreaktion für eine Carbonylgruppe fortschreiten, und Addukte, von denen R¹ ein tertiärer Alkohol ist, können erhalten werden, wie in Tetrahedron, S. 2343, 1987, beschrieben. Wenn Arylaldehyde mit Pyridin-2-onen reagiert werden, können Addukte, von denen R¹ ein sekundärer Alkohol ist, erhalten werden, wie in Tetrahedron, S. 2343, 1987, beschrieben. Wenn Kohlendioxid mit Pyridin-2-onen reagiert wird, kann R¹ in eine Carboxylgruppe konvertiert werden, wie beschrieben in Tetrahedron, S. 2343, 1987. Wenn Phenylisocyanat mit Pyridin-2-onen reagiert wird, kann R¹ in eine Anilidgruppe konvertiert werden, wie beschrieben in Tetrahedron, S. 2343, 1987. Wenn Phenylacetylchlorid mit Pyridin-2-onen reagiert wird, kann R¹ in eine Phenylacetylgruppe konvertiert werden, wie beschrieben in Tetrahedron, S. 2343, 1987. Wenn Methyliod mit Pyridin-2-onen reagiert wird, kann R¹ in eine Methylgruppe konvertiert werden, wie beschrieben in Tetrahedron, S. 2343, 1987. Wenn Kaliumperoxodisulfat mit Pyridin-2-onen reagiert wird, kann R² in eine Hydroxylgruppe konvertiert werden, wie beschrieben in Tetrahedron, S. 2891, 1990. Wenn Benzylbromid mit Pyridin-2-onen reagiert wird, kann R² in eine Benzylgruppe konvertiert werden, wie beschrieben in Chemistry Letters (Chem. Lett.), S. 333, 1996.
Verfahren zum Cyclisieren des Thiazolrings auf den Pyridinring sind oben erklärt. Ein Syntheseweg, bei dem der Thiazolring zuvor konstruiert wird, und anschließend der Pyridinring geformt wird, kann auch angewendet werden, und eine weitere Vielfalt von Derivaten kann wie unten beschrieben synthetisiert werden. Dikaliumcyanoimidodithiocarboxylat ist ein übliches Intermediat, welches viele Arten von 2-Alkylthio-4-aminothiazolen ergibt, und die Verbindung kann in Thiazolopyridine durch Erhöhen der Kohlenstoffatome abgeleitet werden. Beispielsweise können 7-Hydroxy-2-methylthiothiazolo[4,5-b]pyridin-6-carbonsäureester gemäß der folgenden Synthese-Route, die in Journal of Heterocyclic Chemistry (J. Heterocyclic Chem.), S. 1361, 1984, beschrieben ist, erhalten werden. Ferner können unter Verwendung einer ähnlichen Reaktion 7-Hydroxythiazolo[4,5-b]pyridone, wie beschrieben in einer Literatur (J. Prakt. Chem., S. 260, 1979), hergestellt werden.
Gleichermaßen kann als ein Verfahren des Startens der Synthese ausgehend von der Konstruktion eines Thiazolrings Aminoacetonitril als ein Ausgangsmaterial verwendet werden, um 2-Methylthiothiazolo[5,4-b]pyridine zu erhalten. Spezielle Beispiele schließen die Synthese-Route ein, die in Journal of Heterocyclic Chemistry (J. Heterocyclic Chem.) beschrieben ist. Zusätzlich kann eine Thiazolonaphthylidin-Struktur als kondensierte Ring-Typ-Verbindungen, wie nachfolgend, synthetisiert werden. Die Synthese von 1,6-Naphthylidinonen als Intermediate ist in Journal of Heterocyclic Chemistry (J. Heterocyclic Chem.), S. 2085, 1990, beschrieben, und deren Derivatisierung in Thiazolonaphthylidine ist in Heterocycles, S. 133, 1993, detailliert.
Wenn Q ein Sauerstoffaotm ist, schließt ein allgemein verwendetes Verfahren grundlegend die Stufe des Ermöglichens von Kohlenstoffdisulfid, Thiocarbonylchlorid oder Kaliumxanthat, mit 2-Aminopyridin mit einer Hydroxylgruppe an der 3-Position für die Umwandlung in Oxazolopyridin-2-thion zu reagieren, und die Schwefelatombindung an der 2-Position mit einem Alkylierungsreagens zu alkylieren ein, wie bei der Herstellung von Thiazolopyridinen. 2-Alkylthiooxazolopyridine können leicht erhalten werden durch Ermöglichen einer Reaktion von Methyliodid mit entsprechenden Oxazolopyridin-2-thionen in Dimethylformamid in Anwesenheit einer Base, wie Kaliumcarbonat, wie es beispielsweise in Heterocycles, S. 133, 1993, beschrieben ist. Um Oxazolopyridin-2-thione zu synthetisieren, werden 3-Hydroxypyridine zunächst mit einer gemischten Säure nitriert, und die entstandenen Nitroverbindungen werden reduziert, um 2-Amino-3-hyroxypyridine zu synthetisieren. Als diese Schritte sind solche, die beispielsweise in Pharmaceutical Bulletin (Pharm. Bull.) beschrieben sind, bekannt. Ferner können Oxazolopyridin-2-thione synthetisiert werden, indem Kaliumethylxanthat ermöglicht wird, mit 2-Amino-3-hydroxypyridinen in Ethanol, wie beschrieben in Chemistry of Heterocyclic Compound (Chem. Heterocycl. Compd.), S. 441, 1981, zu reagieren. Als Alternative können Oxazolopyridin-2-thione auch synthetisiert werden, indem es Kohlenstoffdisulfid ermöglicht wird, mit 2-Amino-3-hydroxypyridinen in einer Lösung aus Kaliumhydroxid in wasserhaltigem Methanol zu reagieren, wie es in Pharmaceutical Bulletin (Pharm. Bull.), S. 4625, 1957, beschrieben ist.
Für die Nitrierung von 3-Hydroxypyridinen sind die folgenden Synthesebeispiele bekannt. Für die Nitrierung von 3-Hydroxy-4-methylpyridinen ist beispielsweise das Verfahren, das in Heterocycles, S. 529, 1994, beschrieben ist, bekannt. Für die Nitrierung von 3-Hydroxy-5-methylpyridinen ist beispielsweise das Verfahren, das in Journal of Medicinal Chemistry (J. Med. Chem.), S. 2031, 1987, beschrieben ist, bekannt. Für die Nitrierung von 3-Hydroxy-6-methylpyridinen ist beispielsweise das Verfahren, das in Journal of Medicinal Chemistry (J. Med. Chem.), S. 2031, 1987, beschrieben ist, bekannt. Ferner können 4-Hydroxyisochinoline gleichermaßen nitriert werden, und beispielsweise ist das Verfahren, das in Chemical Pharmaceutical Bulletin (Chem. Pharm. Bull.), S. 501, 1959, beschrieben ist, bekannt.
Als Verfahren zum Einführen der Aminogruppe in 3-Hydroxypyridine sind solche Verfahren, die unten beschrieben werden, zusätzlich zu der zuvor genannten Reduktion einer Nitrogruppe bekannt. Als ein Verfahren des Ermöglichens von Ammoniak, mit 3-Hydroxy-2-iodpyridinen in Anwesenheit von Kupfersulfat zu reagieren, ist das Verfahren, das in Rocz. Chem., S. 502, 1936, beschrieben ist, bekannt. Als ein Verfahren des Ermöglichens von Natriumamid, mit 3-Hydroxypyridinen zu reagieren, ist das Verfahren, das in der Literatur (Zh. Prikl. Khim., S. 1103, 1949) beschrieben ist, bekannt. Als ein Verfahren des Ermöglichens von Natriumhypobromat, mit 3-Hydroxypyridin-2-carbonsäureamiden zu reagieren, ist das Verfahren, das in der Literatur (Biochem. J., S. 506, 1950) beschrieben ist, bekannt. Als ein Verfahren des Ermöglichens von Natriumhydrosulfit mit 3-Hydroxy-2-phenylazopyridinen zu reagieren, ist das Verfahren, das in der Literatur (Prace. Minist. Prizem. Chem., S. 14, 1952) beschrieben ist, bekannt. Als ein Verfahren des Ermöglichens von Hydrazinhydrat, mit 3-Hydroxy-2-chlorpyridinen zu reagieren, ist das Verfahren, das in Journal of Medicinal Chemistry (J. Med. Chem.), S. 248, 1994, beschrieben ist, bekannt.
Wenn Q -N(R²⁴)- ist, umfasst ein allgemein verwendetes Verfahren grundlegend die Stufe des Konvertierens von 2-Aminopyridin-Derivaten mit einer substituierten Aminogruppe an der 3-Position in Imidazolopyridin-2-thionen unter Verwendung von Kohlenstoffdisulfid oder Thiocarbonylchlorid und anschließend Alkylieren des Schwefelatoms an der 2-Position, wie bei der Herstellung von Thiazolopyridinen. Um 2-Aminopyridin-Derivate mit einer substituierten Aminogruppe an der 3-Position zu erhalten, kann auf das zuvor erwähnte Verfahren des Einführens eines Substituenten, der für die Verbindung verwendet wird, wenn Q ein Schwefelatom ist, Bezug genommen werden. Wenn Q -C(R²⁴)(R²⁵)- ist, können die Verbindungen synthetisiert werden, indem zunächst die Pyrrolino[2,3-b]pyridin-2-on-Struktur synthetisiert wird, Gruppen, die R²⁴ und R²⁵ an der 3-Position entsprechen, eingeführt werden, um eine disubstituierte Verbindung zu erhalten, und Konvertieren des Lactam-Sauerstoffatoms an der 2-Position in ein Schwefelatom unter Verwendung eines Lawesson-Reagens oder dergleichen.
Als Syntheseverfahren für die Verbindungen, bei denen n ≥ 1 ist, entsprechen die betreffenden Verbindungen des Verfahrens 3 und des Verfahrens 4 den Verbindungen der Formel (V), und es können exakt die gleichen Reaktionen auch für Vergleichsverbindungen der Formel (VII) angewendet werden. Sowohl das Verfahren 3 als auch das Verfahren 4 kann vorzugsweise verwendet werden, und jedes davon kann geeignet in Abhängigkeit von den Ausbeuten der Intermediate und den Farbstoffen, die hergestellt werden, oder der Leichtigkeit der Reinigung davon, ausgewählt werden. Der Unterschied zu der Synthese der Verbindungen, bei denen n = 0 ist, liegt darin, dass die Azolopyridine, die als Ausgangsmaterialien verwendet werden, eine Methylgruppe an der 2-Position aufweisen. Das Syntheseverfahren von 2-Methylverbindungen wird später beschrieben.
Für die Verbindungen, bei denen n ≥ 1 ist, kann die Verlängerung der Methinkohlenstoffkette durch eine Reaktion eines Säureanhydrids, wie Essigsäureanhydrid, unter Verwendung davon, durchgeführt werden, wenn n = 1 ist, N,N'-Diphenylformamidin, oder wenn n ≥ 2 ist, wird eine vinyloge Verbindung, versetzt mit Vinylgruppen, in einer Zahl, die den Methinkohlenstoffketten entspricht, zugegeben. Die Reaktionstemperatur kann aus dem Bereich von etwa Raumtemperatur bis 180°C ausgewählt werden, und Säureanhydride, wie Essigsäureanhydrid, können als Lösemittel verwendet werden. Allerdings können verschiedene aprotische Lösemittel vorzugsweise verwendet werden. Diese Reaktionen sind auf diesem Gebiet die gängigsten Verfahren.
Für die Farbstoff-Herstellungsreaktion kann entweder ein protisches oder aprotisches Lösemittel verwendet werden, und die Reaktion kann sogar durch einfaches Erwärmen fortgeführt werden. Vorzugsweise kann die Reaktion unter Verwendung einer Base, wie Triethylamin und Pyridine, in einem aprotischen Lösemittel durchgeführt werden, und die Reaktionstemperatur beträgt vorzugsweise etwa Raumtemperatur bis 120°C. Diese Reaktion ist auch eine gebräuchlichste Reaktion auf dem Gebiet, und verschiedene Reaktionsbedingungen können zusätzlich zu denen, die oben erwähnt wurden, verwendet werden.
In der Formel stellt Prot. eine Alkylgruppe dar, die entschützt werden kann, und eine Methoxyethoxymethylgruppe, wie in US-Patent Nr. 5,656,449 beschrieben, wie auch eine Methylthiomethylgruppe, 4-Methoxybenzylgruppe und dergleichen, können verwendet werden. Die Entschützungsreaktion nach der Farbstoff-herstellenden Reaktion kann sich in Abhängigkeit von der Art der verwendeten Schutzgruppe unterscheiden. Das Entschützen kann unter sauren Bedingungen durchgeführt werden, wenn eine Methoxyethoxymethylgruppe, 4-Methoxybenzylgruppe oder dergleichen verwendet wird, oder sogar unter einer oxidierenden Bedingung, wenn eine 4-Methoxybenzylgruppe verwendet wird. Für Details kann auf "Protective Groups in Organic Synthesis, 3. Ausgabe", Theodora W. Grenne, Peter G. M. Wuts (Wiley, 1999), Bezug genommen werden.
Die betreffenden Verbindungen des Verfahrens 5 und des Verfahrens 6 entsprechen den Verbindungen der Formel (V), und es können exakt die gleichen Reaktionen für die Vergleichsverbindungen der Formel (VIII) verwendet werden. Die Reaktionen, die in diesen Verfahren verwendet werden, sind die gleichen wie solche, die für das Verfahren 3 und 4 verwendet werden.
Für die Synthese von 2-Methylazolopyridinen können die Verbindungen, bei denen Q ein Sauerstoffatom oder -N(R²⁴)- ist, durch ein Verfahren synthetisiert werden, das die Verwendung von Essigsäureanhydrid mit Erwärmen anstatt Kohlenstoffdisulfid, Thiocarbonylchlorid oder Kaliumxanthat in der Reaktion für die Umwandlung in Azolopyridin-2-thione unter Verwendung von Kohlenstoffdisulfid, Thiocarbonylchlorid oder Kaliumxanthat umfasst, ein Verfahren, das das Erwärmen in Anwesenheit eines Orthoessigsäureesters, wie Triethylorthoacetat, und ein Säurekatalysator, wie p-Toluolsulfonsäure oder dergleichen, umfasst. Für die oben angegebene Herstellung beträgt die Reaktionstemperatur vorzugsweise 100 bis 170°C, und gewöhnlich wird die Reaktion vorzugsweise unter Verwendung eines Reaktionsregenten als ein Lösemittel durchgeführt.
Die Verbindungen, bei denen Q ein Schwefelatom ist, können durch Konvertieren der erwähnten Intermediate in dem Syntheseverfahren der Verbindungen hergestellt werden, bei denen n = 0 ist, 2-Amino-3-halogenpyridine, in 2-Acetalyamino-3-halogenpyridine, unter Erwärmen in Anwesenheit eines Orthoessigsäureesters und eines Säurekatalysators, wie p-Toluolsulfonsäure, ferner Umwandeln der 2-Thioacetylamino-3-halogenpyridine in 2-Acetylamino-3-halogenpyridine, unter Verwendung von Phosphorpentasulfid, eines Lawesson-Reagens oder dergleichen, und anschließend Konvertieren der 2-Thioacetylamino-3-halogenpyridine in 2-Methylthiazolopyridine unter Verwendung einer starken Base, wie Natriumhydrid und Kalium-t-butoxid. Wenn eine starke Base verwendet wird, können Lösemittel vom Ether-Typ, wie Dioxan und Tetrahydrofuran, als Lösemittel verwendet werden. Die Verbindungen, bei denen Q -C(R²⁴)(R²⁵)- ist, können unter Verwendung der Reaktion, die als die Fischer'sche-Indol-Synthese-Reaktion bekannt ist, die in der offengelegten Japanischen Patentveröffentlichung Nr. 2001-270864 oder Chemical Review (Chem. Rev.), Vol. 63, S. 373, 1963, beschrieben ist, synthetisiert werden.
Da eine enorme Anzahl an Syntheseverfahren für die Verbindungen, bei denen ein stickstoffhaltiger 6-gliedriger Ring ein Pyridinring ist, bekannt sind, kann der Fachmann solche Verbindungen unter Bezugnahme auf zahlreiche Arten an Literatur synthetisieren. Darüber hinaus ist eine enorme Anzahl der Verbindungen kommerziell erhältlich, und sie können leicht erhalten werden. Als Verbindungen, bei denen der stickstoffhaltige 6-gliedrige Ring ein Chinolinring ist, sind die Syntheseverfahren von 4-Methylchinolinen (Lepidinen) und 2-Methylchinolinen (Chinaldinen), die als Ausgangsmaterialien verwendet werden, unten beschrieben. Als Lepidine kann ein Substituent an der 2-Position von Lepidin über eine Reaktion von kommerziell erhältlichen 2-Chlorlepidin und einem geeigneten nukleophilen Mittel eingeführt werden. Beispiele der Reaktionen von 2-Chlorlepidin und einem primären Amin, sekundären Amin, cyclischen Amin, Alkohol, Thiol, Thioharnstoff, Fluorid und dergleichen sind bekannt.
Beispiele der Reaktion mit einem primären Amin schließen beispielsweise die Reaktion ein, die in Journal of American Chemical Society (J. Am. Chem. Soc.), S. 2322, 1949, beschrieben ist. Beispiele der Reaktion mit einem sekundären Amin schließen beispielsweise die Reaktion ein, die in Yakugaku Zasshi, S. 137, 1949, beschrieben ist. Als Reaktion mit einem cyclischen Amin sind beispielsweise die Reaktionen, die in Synthetic Communication (Synth. Commun.), S. 4479, 2000, und Journal of Organic Chemistry (J. Org. Chem.), S. 771, 1949, beschrieben sind, bekannt. Als Reaktion mit einem Alkohol sind beispielsweise die Reaktionen, die in Justus Liebigs Annalen der Chemie (Justus Liebigs Ann. Chem.), S. 102, 1886, und im Journal of Organic Chemistry (J. Org. Chem.), S. 1529, 1951, beschrieben sind, bekannt. Beispiele der Reaktion mit einem Thiol schließen beispielsweise die Reaktion ein, die in Journal of American Chemical Society (J. Am. Chem. Soc.), S. 491, 1948, beschrieben ist. Als Reaktion mit einem Thioharnstoff ist beispielsweise die Reaktion, die in Chemische Berichte (Chem. Ber.), S. 2732, 1929, beschrieben ist, bekannt. Als Reaktion mit einem Fluorid ist beispielsweise eine Reaktion mit Kaliumfluorid in J. Chem. Res. Synop., S. 586, 1998, beschrieben, und eine Reaktion mit Tetrabutylammoniumfluorid ist in Mutat. Res., S. 173, 2000, beschrieben. Ferner ist es auch möglich, über eine Kupplungsreaktion von 2-Chlorlepidin und einer Arylborsäure unter Verwendung eines Palladiumkatalysators zu arylieren, und beispielsweise ist die Reaktion, die in Tetrahedron, S. 8117, 1992, beschrieben ist, bekannt.
Es ist auch möglich, einen Substituenten an der 2-Position von Lepidinen über eine Cyclisierungsreaktion von Anilinen und α,β-Enonen einzuführen. Als Synthese von 2,4-Dimethylchinolinen ist beispielsweise die Synthese, die in Justus Liebigs Annalen der Chemie (Justus Liebigs Ann. Chem.), S. 7, 1887, beschrieben ist, bekannt. Als Synthese von 4-Methyl-2-phenylchinolin ist beispielsweise die Synthese, die in J. Prakt. Chem., S. 73, 1925, beschrieben ist, bekannt.
Als Synthese von Lepidinen mit einem geeigneten Substituenten an der 3-Position können die Verbindungen mit Chlor oder Brom an der 3-Position unter Verwendung von 3-Methylindol als ein Ausgangsmaterial synthetisiert werden. Als Verbindungen mit Chlor ist die Synthese, die beispielsweise in Chemische Berichte (Chem. Ber.), S. 252, 1887, beschrieben ist, bekannt. Als Verbindung mit Brom ist die Synthese, die beispielsweise in Chemische Berichte (Chem. Ber.), S. 2613, 1887, beschrieben ist, bekannt. Das Halogen der halogenierten Verbindungen, das oben erhalten wird, kann ferner in einen anderen Substituenten konvertiert werden. Beispielsweise können arylierte Verbindungen über Kupplung der halogenierten Verbindungen mit Phenylborsäure in Anwesenheit eines Palladiumkatalysators und einer Base synthetisiert werden. Als ein spezielles Beispiel ist die Reaktion, die in Tetrahedron, S. 8117, 1992, beschrieben ist, bekannt. Ferner ist es auch möglich, einen Substituenten an der 3-Position von Lepidinen über eine Cyclisierungsreaktion von Anilinen und α,β-Enonen einzuführen. Spezielle Beispiele sind unten beschrieben. Als Synthese von 2,4-Dimethylchinolinen ist die Synthese, die in Journal of Organic Chemistry (J. Org. Chem.), S. 2782, 1957, beschrieben ist, bekannt.
Lepidine mit einem geeigneten Substituenten an der 6-Position werden einfach durch eine Cyclisierungsreaktion von p-substituierten Anilinen und 3-Buten-2-onen oder deren synthetisch äquivalenten Substanzen synthetisiert. Als Reaktion mit 4-Fluoranilin ist beispielsweise das Verfahren, das in der Literatur (Mutat. Res., 173, 2000) beschrieben ist, bekannt. Als Reaktion mit 4-Chloranilin ist beispielsweise die Reaktion, die in Journal of Organic Chemistry (J. Org. Chem.), S. 682, 1957, beschrieben ist, bekannt. Als Reaktion mit 4-Bromanilin ist beispielsweise die Reaktion, die in Tetrahedron Letters (Tetrahedron Lett.), S. 531, 2000, beschrieben ist, bekannt. Als Reaktion mit 4-Methoxyanilin ist beispielsweise die Reaktion, die in Journal of American Chemical Society (J. Am. Chem. Soc.), S. 86, 1945, beschrieben ist, bekannt. Als Reaktion mit 4-Methylanilin ist beispielsweise die Reaktion, die in Journal of American Chemical Society (J. Am. Chem. Soc.), S. 2397, 1920, beschrieben ist, bekannt. Als Reaktion mit 4-Dimethylaminoanilin ist beispielsweise die Reaktion, die in der Literatur (Bull. Chim. Soc. Fr., S. 434, 1920) beschrieben ist, bekannt. Als Reaktion mit 4-Nitroanilin ist beispielsweise die Reaktion, die in Justus Liebigs Annalen der Chemie (Justus Liebigs Ann. Chem.), S. 174, 1948, beschrieben ist, bekannt. Als Reaktion mit 4-Benzothiazo-2-yl-anilin ist beispielsweise die Reaktion, die in der Literatur (Sog. Prog. Chem., S. 62, 1977) beschrieben ist, bekannt. Als Reaktion mit 4-Benzodiphenylphosphonoylanilin ist beispielsweise die Reaktion, die in Chemistry of Heterocyclic Compound (Chem. Heterocycl. Compd.), S. 315, 1982, beschrieben ist, bekannt. Als Reaktion mit 4-Acetylanilin ist beispielsweise die Reaktion, die in Chemistry of Heterocyclic Compound (Chem. Heterocycl. Compd.), S. 767, 1984, beschrieben ist, bekannt. Als Reaktion mit 4-Diethylsulfamidoanilin ist beispielsweise die Reaktion, die in Chemistry of Heterocyclic Compound (Chem. Heterocycl. Compd.), S. 767, 1984, beschrieben ist, bekannt.
Ferner ist es auch möglich, die durch die oben angegebenen Reaktionen erhaltenen Chinoline zu konvertieren. 6-Brom-4-methylchinoline können einer Kupplungsreaktion mit einem Phosphonsäurediester in Anwesenheit eines Palladiumkatalysators und einer Base unterzogen werden, um ein Phosphonsäure-Derivat zu erhalten. Insbesondere ist das Verfahren, das in der Literatur (Zh. Obshch. Khim., S. 2503, 1986) beschrieben ist, bekannt. Um 6-Amino-4-methylchinoline zu synthetisieren, können 4-Methyl-6-nitrochinoline, die unter Verwendung von 4-Nitroanilinen als ein Ausgangsmaterial erhalten werden, reduziert werden. Beispielsweise ist das Verfahren, das in Justus Liebigs Annalen der Chemie (Justus Liebigs Ann. Chem.), S. 174, 1948, beschrieben ist, bekannt.
Um 4-Methylchinolin-6-carbonsäuren zu synthetisieren, können 4,6-Dimethylaniline, die unter Verwendung von 4-Methylanilinen als ein Ausgangsmaterial erhalten werden, oxidiert werden. Beispielsweise ist das Verfahren, das in Chemische Berichte (Chem. Ber.), S. 2265, 1890, beschrieben ist, bekannt. Um 6-(2-Benzooxazolyl)-4-methylchinoline zu synthetisieren, kann 2-Aminophenol mit 4-Methylchinolin-6-carbonsäuren reagiert werden. Beispielsweise ist das Verfahren, das in Journal of Heterocyclic Chemistry (J. Heterocycl. Chem.), S. 937, 1977, beschrieben ist, bekannt. Gleichermaßen, um 6-(2-Benzothiazolyl)-4-methylchinoline zu synthetisieren, kann 2-Aminobenzolthiol mit 4-Methylchinolin-6-carbonsäuren reagiert werden, um 4-Methyl-6-(2-oxazolo[4,5-b]pyridyl)chinoline zu synthetisieren, 2-Amino-3-hydroxypyridin kann mit 4-Methylchinolin-6-carbonsäuren zur Reaktion gebracht werden, um 6-[2-(1H-Imidazo[4,5-c]pyridyl)-4-methylchinoline zu synthetisieren, 2,3-Diaminopyridin kann mit 4-Methylchinolin-6-carbonsäuren reagiert werden, und um 6-[2-(1H-Imidazo[4,5-b]pyridyl)-4-methylchinoline zu synthetisieren, kann 3,4-Diaminopyridin mit 4-Methylchinolin-6-carbonsäuren reagiert werden. Für alle diese Synthesen sind die Reaktionen, die in Journal of Heterocyclic Chemistry (J. Heterocycl. Chem.), S. 937, 1977, beschrieben sind, bekannt. Um 4-Methylchinolin-6-sulfonsäuren zu synthetisieren, können 4-Methylchinoline mit Schwefelsäure reagiert werden. Beispielsweise ist die Reaktion, die in Chemische Berichte (Chem. Ber.), S. 2680, 1890, beschrieben ist, bekannt.
Lepidine mit einem geeigneten Substituenten an der 7-Position können leicht durch eine Cyclisierungsreaktion von m-substituierten Anilinen und 3-Buten-2-on oder deren synthetisch äquivalenten Substanzen synthetisiert werden. Als Reaktion mit 3-Fluoranilin ist beispielsweise die Reaktion, die in Mutat. Res., S. 173, 2000, beschrieben ist, bekannt. Als Reaktion mit 3-Chloranilin ist beispielsweise die Reaktion, die in Journal of American Chemical Society (J. Am. Chem. Soc.), S. 1851, 1946, beschrieben ist, bekannt. Als Reaktion mit 3-Methylanilin ist beispielsweise die Reaktion, die in Journal of Organic Chemistry (J. Org. Chem.), S. 682, 1957, beschrieben ist, bekannt. Als Reaktion mit 3-Aminophenol ist beispielsweise die Reaktion, die in Tetrahedron Letters (Tetrahedron Lett.), S. 531, 2000, beschrieben ist, bekannt.
Lepidine mit einem geeigneten Substituenten an der 8-Position können leicht durch eine Cyclisierungsreaktion von o-substituierten Anilinen und 3-Buten-2-on oder deren synthetisch äquivalenten Substanzen synthetisiert werden. Als Reaktion mit 2-Methoxyanilin ist beispielsweise die Reaktion, die in DE 518291 beschrieben ist, bekannt. Als Reaktion mit o-Toluidin ist beispielsweise die Reaktion, die in Journal of Organic Chemistry (J. Org. Chem.), S. 682, 1957, beschrieben ist, bekannt. Als Reaktion mit 2-Aminophenol ist beispielsweise die Reaktion, die in Journal of American Chemical Society (J. Am. Chem. Soc.), S. 3986, 1949, beschrieben ist, bekannt. Als Reaktion mit 2-Nitroanilin ist beispielsweise die Reaktion, die in Nihon Kagaku Zassi (Journal of Japan Chemical Society), S. 408, 1958, beschrieben ist, bekannt. Ferner können 4-Methyl-8-nitrochinoline auch durch Behandlung von Lepidinen mit einer Mischsäure erhalten werden. Beispielsweise ist die Reaktion, die in Journal of American Chemical Society (J. Am. Chem. Soc.), S. 380, 1947, beschrieben ist, bekannt. Als Reaktion mit 2-Ethylanilin ist beispielsweise die Reaktion, die in Tetrahedron Asymmetry, S. 419, 1995, beschrieben ist, bekannt. Als Reaktion mit Ethyl-2-aminobenzoat ist beispielsweise die Reaktion, die in DE 518291 beschrieben ist, bekannt, und 4-Methylchinolin-8-carbonsäuren werden durch die Reaktion erhalten. Als 4-Methylchinolin-8-carbonsäuren kann die Carboxylgruppe an der 8-Position ferner konvertiert werden. Um 8-(2-Benzoxazolyl)-4-methylchinoline zu synthetisieren, kann 2-Aminophenol zur Reaktion gebracht werden, und um 8-(2-Benzothiazolyl)-4-methylchinoline zu synthetisieren, kann 2-Aminobenzolthiol reagiert werden. Beispielsweise ist die Reaktion, die in Journal of Heterocyclic Chemistry (J. Heterocycl. Chem.), S. 1579, 1979, beschrieben ist, bekannt. Um 4-Methyl-8-aminochinoline zu synthetisieren, können 4-Methyl-8-nitrochinoline reduziert werden. Beispielsweise ist die Reaktion, die in Journal of American Chemical Society (J. Am. Chem. Soc.), S. 1524, 1946, beschrieben ist, bekannt. Die oben angegebenen Erklärungen wurden für die Synthese von monosubstituierten Verbindungen von Lepidinen vorgenommen. Allerdings, wenn eine weiter substituierte Verbindung erwünscht ist, kann die gewünschte Substanz durch Kombination dieser Reaktionen synthetisiert werden.
Als typische Ausführungsformen des Verfahrens der vorliegenden Erfindung können die folgenden zwei der Ausführungsformen (1) und (2) erwähnt werden.

(1) Die Messung wird für eine vielsträngige Nukleinsäure in einer Lösung durchgeführt.
(2) Die Messung wird unter Verwendung eines DNA-Arrays für ein Spot (Gen) durchgeführt, bei der die Hybridisierung auf einem Festphasenträger bewirkt wird.

Der Begriff "Messung", der in der Beschreibung verwendet wird, sollte in seinem breitesten Sinn, einschließlich Detektion, Quantifizierung und dergleichen, interpretiert werden, und der Begriff sollte nicht auf irgendeine beschränkende Weise interpretiert werden. Unter den zuvor angegebenen Ausführungsformen wird die Ausführungsform, bei der eine Detektion und Quantifizierung für eine vielsträngige Nukleinsäure in einer Lösung durchgeführt wird, für die Verwendung bei einer einfachen Messung einer vielsträngigen Nukleinsäure in einer Probenlösung extrem wirksam, wie auch die Verwendung eines Verfahrens zum Messen einer Target-Nukleinsäuresequenz in einer Sonden-Nukleinsäure unter Verwendung eines Nukleinsäuren-Amplifizierungsverfahrens, wovon ein typisches Beispiel PCR (Polymerase-Kettenreaktion) ist, und das optische Messverfahren der vorliegenden Erfindung kann vorzugsweise für solche Zwecke verwendet werden.
Wenn eine vielsträngige Nukleinsäure in einer Lösung gemessen wird, variiert die bevorzugte Konzentration der oben angegebenen Verbindung auch in Abhängigkeit von der Konzentration der vielsträngigen Nukleinsäure, die detektiert wird. Die Konzentration kann gewöhnlich 1 × 10^–10 Mol/l bis 1 × 10^–8 Mol/l betragen, stärker bevorzugt 1 × 10^–8 Mol/l bis 1 × 10^–4 Mol/l, am stärksten bevorzugt 5 × 10^–8 Mol/l bis 1 × 10^–5 Mol/l. Um Kontakt einer vielsträngigen Nukleinsäure und der zuvor genannten Verbindung zu erhalten, kann eine Lösung der Sonden-Nukleinsäure und eine Lösung der Verbindung der vorliegenden Erfindung im allgemeinen vermischt werden. Allerdings ist es auch möglich, die zuvor angegebene Verbindung als Feststoff zu einer Lösung einer Sonden-Nukleinsäure zuzugeben, oder die Verbindung der vorliegenden Erfindung kann auf ein anderes Medium adsorbiert werden und mit einer Sonden-Nukleinsäure-Lösung gemischt werden. Wenn die optische Messung durchgeführt wird, indem die zuvor genannte Verbindung mit einer vielsträngigen Nukleinsäure kontaktiert wird, kann die Verbindung mit der vielsträngigen Nukleinsäure kontaktiert werden, während die optische Messung durchgeführt wird, oder die optische Messung kann durchgeführt werden, nachdem die Verbindung mit der mehrsträngigen Nukleinsäure in Kontakt gebracht worden ist.
Vorzugsweise wird die Detektion innerhalb von 0,01 bis 1000 Sekunden durchgeführt, stärker bevorzugt von 0,1 bis 600 Sekunden, nachdem die vielsträngige Nukleinsäure und die zuvor angegebene Verbindung miteinander kontaktiert worden sind.
Der pH-Wert einer Lösung für die Messung beträgt vorzugsweise 2,0 bis 10,0, stärker bevorzugt 3,0 bis 9,0, am stärksten bevorzugt 4,0 bis 8,0. Es ist auch bevorzugt, einen Puffer für eine pH-Einstellung zu verwenden. Puffer sind im Detail in "Tanpakusitu Koso no Kiso Jikken Ho (Fundamental Experimental methods for Proteins and Enzymes") beschrieben, übersetzt von Sikiichi Horio, Nankodo, 1993, und dergleichen. Bevorzugt verwendete Puffer sind Kaliumhydrogenphthalat/Salzsäure-Puffer, Citrat/Dinatriumphosphat-Puffer, Citronensäure/Natriumcitrat-Puffer, Essigsäure/Natriumacetat-Puffer, Succinat/Natriumhydroxid-Puffer, Natriummaleat/Natriumhydroxid-Puffer, Phosphatpuffer, Imidazol/Salzsäure-Puffer, Triethanolamin und Salzsäure/Natriumhydroxid-Puffer, N-Ethylmorpholin/Salzsäure-Puffer, Tris-Puffer, Glycylglycin/Natriumhydroxid-Puffer, Diethanolamin/Salzsäure-Puffer, Borat-Puffer, Britton-Robinson-Puffer mit einem breiten Bereich, GTA-Puffer mit einem breiten Bereich und dergleichen. Die Konzentration des Puffers beträgt vorzugsweise 0,1 mM bis 500 mM, stärker bevorzugt 0,5 mM bis 200 mM, ferner vorzugsweise 1 mM bis 50 mM. Wenn eine Verbindung für die Messung verwendet wird, die durch Protonierung farblos wird, wird der pH-Wert vorzugsweise auf einen pH-Wert eingestellt, bei dem die Protonierung stattfindet, oder der pH-Wert ist geringer als dieser Level. Eine Lösung zum Durchführen der Messung ist vorzugsweise eine wässerige Lösung. Es können auch wassermischbare Lösemittel, einschließlich Alkohole, wie Methanol, Ethanol, Ethylenglykol, Glycerol und Diethylenglykol, Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Sulforan und dergleichen, in Kombination verwendet werden.
Die optische Messung wird vorzugsweise durch Fluoreszenz-Detektionsverfahren von einem Gesichtspunkt der Sensibilität durchgeführt. Die Messung kann gewöhnlich unter Verwendung eines Fluorometers durchgeführt werden, und die Verwendung eines Verfahrens des Durchleitens eines Anregungslichts durch eine Lösung und des Messens der Fluoreszenz von einer Richtung senkrecht zu dem Licht wird vorzugsweise verwendet. Ein Verfahren des Messens von reflektiertem Licht kann auch verwendet werden. Ferner kann auch ein Verfahren des Verteilens oder des Punktzeichnens einer Probenlösung auf ein Feststoffphasenträger und anschließend Messen der Fluoreszenz mit einem Fluoreszenz-Laserscanner CCD (Ladungskopplungsspeichervorrichtung) oder dergleichen nach dem Trocknen der Lösung oder ohne Trocknen der Lösung verwendet werden. Ferner kann die Messung für jede Probe durchgeführt werden, oder die Messung kann für viele Proben zur gleichen Zeit unter Verwendung einer Mikroplatte mit 96 Wells oder 384 Wells oder dergleichen durchgeführt werden.
In der zuvor angegebenen Ausführungsform (2) kann unter Verwendung eines DNA-Arrays das Verfahren der vorliegenden Erfindung vorzugsweise für die Messung für ein Spot (Gen) auf einem Feststoffphasenträger verwendet werden, bei dem Hybridisierung auftritt. In dieser Ausführungsform kann die Sonden-Nukleinsäure vorzugsweise auf einem Feststoffphasenträger immobilisiert werden, obwohl die Sonden-Nukleinsäure in einer Lösung vorliegen kann. Als Feststoffphasenträger kann auch ein Träger mit einer geringen Planarität mit einer rauen Oberfläche verwendet werden. Das Material des Feststoffphasenträgers ist nicht besonders beschränkt, und Beispiele schließen Glas, Zement, Keramiken, wie Tonware oder neue Keramiken, Polymere, wie Polyethylenterephthalat, Celluloseacetate, Polycarbonat aus Bisphenol A, Polystyrol und Polymethylmethacrylat, Silikon, aktivierten Kohlenstoff, poröse Substanzen, wie poröses Glas, poröse Keramiken, poröses Silikon, porösen aktivierten Kohlenstoff, Gewebe, Faservlies, Basispapier, Kurzfaser und Membranfilter ein. Die Form des Feststoffphasenträgers ist nicht besonders beschränkt, und der Träger kann in plattenartiger, sphärenartiger, faserartiger, stabartiger Form oder dergleichen vorliegen. Die Größe des Feststoffphasenträgers ist auch nicht besonders beschränkt und der Träger kann eine Größe von einem Nanometer- oder Zentimeterbereich aufweisen. Die Porengröße der porösen Substanzen liegt vorzugsweise beispielsweise im Bereich von 2 bis 1000 nm, stärker bevorzugt in dem Bereich von 2 bis 500 nm. Wenn ein plattenartiger Feststoffphasenträger verwendet wird, weist der Feststoffphasenträger vorzugsweise eine Dicke im Bereich von 100 bis 200 μm auf.
Als Verfahren zum Immobilisieren einer Sonden-Nukleinsäure auf einen Feststoffphasenträger kann ein geeignetes Verfahren in Abhängigkeit von der Art des Nukleinsäure-Fragments und der Art des Feststoffphasenträgers (Protein, Nucleic acid and Enzyme, Vol. 43, Nr. 13, S. 2004–2011 (1998)) verwendet werden. Wenn beispielsweise das Nukleinsäure-Fragment cDNA oder ein PCR-Produkt ist, schließen anwendbare Verfahren ein Verfahren der elektrostatischen Kupplung des Fragments durch Verwendung einer Charge von DNA zu einem Substrat ein, das mit einem Kation, wie Polylysin, Polyethylenimin oder Polyalkylamin, einer Oberflächenbehandlung unterzogen wurde. Um eine stärkere Kupplung zu erhalten, kann auch ein Verfahren des Bestrahlens mit einem UV-Strahl verwendet werden. Eine Schicht aus einer hydrophilen Polymersubstanz oder dergleichen mit einer elektrischen Ladung oder eine Schicht, die ein Vernetzungsmittel umfasst, kann ferner auf dem oberflächenbehandelten Substrat bereitgestellt werden. Ferner kann in Abhängigkeit von einer Art des Substrats ein hydrophiles Polymer oder dergleichen in dem Substrat enthalten sein, und ein Substrat, das solch einer Behandlung unterzogen wurde, kann auch vorzugsweise verwendet werden.
Indem die Oberflächenbehandlung angewendet wird, kann die elektrostatische Interaktion zwischen einem hydrophoben Substrat oder einem schwach-hydrophilen Substrat und einem Nukleinsäure-Fragment erhöht werden. Es wird vorzugsweise Gleitglas als Substrat von dem Gesichtspunkt der Leichtigkeit der Oberflächenbehandlung und der Bereitschaft zur Analyse verwendet.
Wenn synthetische Nukleotide immobilisiert werden, schließen anwendbare Verfahren ein Verfahren des direkten Synthetisierens von Nukleotiden auf einem Substrat ein, oder ein Verfahren des Synthetisierens eines Oligomers, dessen Ende vorab mit einer funktionellen Gruppe zur Bildung einer kovalenten Bindung eingeführt wird und anschließend kovalentes Binden des Oligomers an ein oberflächenbehandeltes Substrat. Beispiele der funktionellen. Gruppe schließen eine Aminogruppe, eine Aldehydgruppe, eine Mercaptogruppe, Biotin und dergleichen ein. Das Verfahren, das in der offengelegten Japanischen Patentveröffentlichung Nr. 2001-228152 beschrieben ist, kann auch vorzugsweise verwendet werden. Als Substrat wird vorzugsweise Glas oder Silikon verwendet, und ein bekanntes Silan-Kupplungsmittel wird vorzugsweise für die Oberflächenbehandlung von Glas oder Silicon verwendet. Das Nukleinsäure-Fragment, das auf dem Substrat immobilisiert wird, kann ein Proben-Nukleinsäure-Fragment sein, das detektiert wird, was später beschrieben wird. Die folgenden Erklärungen werden unter der Voraussetzung gemacht, dass die Nukleinsäure-Fragmente, die auf einem Substrat immobilisiert werden, Nukleinsäure-Fragmente sind, deren Nukleotidsequenzen bekannt sind, und die Nukleinsäure-Fragmente, die mit der Nukleinsäure-Analysevorrichtung kontaktiert werden, sind Proben-Nukleinsäure-Fragmente.
DNA-Fragmente können in zwei Gruppen in Abhängigkeit von den Zwecken eingeteilt werden. Um die Gen-Expression zu untersuchen, werden vorzugsweise Polynukleotide, wie cDNA, ein Teil von cDNA und EST verwendet. Funktionen dieser Polynukleotide können unbekannt sein, und sie werden im allgemeinen hergestellt, indem ein DNA-Fragment mittels PCR unter Verwendung einer cDNA-Bibliothek, Genom-Bibliothek oder das gesamte Genom als ein Templat, basierend auf einer Sequenz, die in einer Datenbank registriert ist (im nachhinein als ein "PCR-Produkt" bezeichnet), amplifiziert werden. DNA-Fragmente, die nicht mittels PCR amplifiziert werden, können auch vorzugsweise verwendet werden. Ferner, um die Gen-Mutation oder Polymorphie zu untersuchen, ist es bevorzugt, verschiedene Oligonukleotide entsprechend der Mutation oder der Polymorphie, basierend auf bekannten Sequenzen, als ein Standard zu synthetisieren und diese zu verwenden. Ferner werden für die Nukleotid-Sequenzanalyse 4ⁿ (n ist eine Anzahl von Nukleotiden) Arten von synthetisierten Oligonukleotiden vorzugsweise verwendet. Die Nukleotidsequenz des DNA-Fragments wird vorzugsweise vorher durch ein gewöhnliches Nukleotidsequenzverfahren bestimmt. Das DNA-Fragment ist vorzugsweise von 2- bis 100-mer, am stärksten bevorzugt von 20- bis 80-mer.
Ein Spotten der DNA-Fragmente auf einen Feststoffphasenträger wird vorzugsweise beispielsweise durch Herstellen einer wässerigen Flüssigkeit, die die DNA-Fragmente enthält, mittels Auflösen oder Dispergieren der Fragmente in einem wässerigen Medium, Einführen dieser wässerigen Flüssigkeit in jeweils einen Well einer 96-Well- oder 384-Well-Kunststoffplatte und Eintropfen der eingeführten wässerigen Flüssigkeit auf eine Feststoffphasenträgeroberfläche unter Verwendung einer Spotting-Vorrichtung oder dergleichen durchgeführt. Um zu verhindern, dass DNA-Fragmente nach dem Spotten austrocknen, kann eine Substanz mit einem hohen Siedepunkt zu der wässerigen Flüssigkeit zugegeben werden, in der die DNA-Fragmente aufgelöst oder dispergiert sind. Als Substanz mit einem hohen Siedepunkt wird eine Substanz bevorzugt, die in der wässerigen Flüssigkeit lösbar ist, in die die DNA-Fragmente aufgelöst oder dispergiert werden, die frei von einer Inhibierung der Hybridisierung der DNA- Fragmente und der Proben-Nukleinsäure ist, und die nicht viskos ist. Beispiele von solch einer Substanz schließen Glycerin, Ethylenglykol, Dimethylsulfoxid und niedermolekulare hydrophile Polymere ein. Beispiele der hydrophilen Polymere schließen Polyacrylamid, Polyethylenglykol, Natriumpolyacrylat und dergleichen ein. Das Molekulargewicht des Polymers liegt vorzugsweise im Bereich von 10³ bis 10⁵. Als Substanz mit einem hohen Siedepunkt werden stärker bevorzugt Glycerin oder Ethylenglykol verwendet, und Glycerin wird am stärksten bevorzugt verwendet. Die Konzentration der Substanz mit einem hohen Siedepunkt in der wässerigen Flüssigkeit der DNA-Fragmente liegt vorzugsweise im Bereich von 0,1 bis 2 Vol.-%, am stärksten bevorzugt im Bereich von 0,05 bis 1 Vol.-%. Ferner ist es zum gleichen Zweck auch bevorzugt, den Feststoffphasenträger nach dem Spotten der DNA-Fragmente unter Bedingung einer Feuchtigkeit von 90% oder höher und bei einer Temperatur von 25 bis 50°C einzustellen.
Nachdem die DNA-Fragmente auf den Feststoffphasenträger gespottet wurden, kann eine Nachbehandlung unter Verwendung von Ultraviolettstrahlen, Natriumborhydrid, Schiff'sches Reagens oder dergleichen angewendet werden. Für die Nachbehandlung können zahlreiche Arten an Behandlungen in Kombination durchgeführt werden, und eine Wärmebehandlung und eine Ultraviolettstrahlung oder dergleichen werden am stärksten bevorzugt in Kombination verwendet. Die Inkubation wird auch vorzugsweise nach dem Spotten durchgeführt. Nach der Inkubierung ist es bevorzugt, nicht-immobilisierte DNA-Fragmente durch Waschen zu entfernen.
Die Dichte der DNA-Fragmente liegt vorzugsweise im Bereich von 10³ bis 10⁵ Arten/cm² auf der Feststoffphasenträgeroberfläche. Die Menge der DNA-Fragmente liegt vorzugsweise im Bereich von 1 bis 10^–15 Mol, und die Masse beträgt vorzugsweise einige wenige ng oder weniger. Durch das Spotting wird die wässerige Flüssigkeit, die die DNA-Fragmente enthält, auf der Feststoffphasenträgeroberfläche in Form eines Dots immobilisiert. Die Form der Dots ist gewöhnlich eine im wesentlichen runde Form. Für eine quantitative Analyse der Gen-Expression oder Analyse einer Einzelbasenmutation ist es wichtig, dass die Dot-Form unverändert bleibt. Der Abstand zwischen den Dots liegt vorzugsweise im Bereich von 0 bis 1,5 mm, am stärksten bevorzugt im Bereich von 100 bis 300 μm. Die Größe von einem Dot liegt vorzugsweise im Bereich von 50 bis 300 μm im Durchmesser. Das Volumen der wässerigen Flüssigkeit, die gespottet wird, liegt vorzugsweise im Bereich von 100 pL bis 1 μl, am stärksten bevorzugt im Bereich von 1 bis 100 nl.
Die Lebenszeit eines Feststoffphasenträgers, immobilisiert mit DNA-Fragmenten, der durch die zuvor erwähnten Schritte hergestellt wird, ist für einen cDNA-Chip, immobilisiert mit cDNAs einige Wochen, und für einen Oligo-DNA-Chip, immobilisiert mit Oligo-DNAs noch länger. Diese DNA-Chips können beim Monitoring der Gen-Expression der Nukleotidsequenzierung, der Mutationsanalyse, der Polymorphieanalyse und dergleichen verwendet werden. Das Detektionsprinzip besteht aus der optischen Messung einer nicht-gelabelten Nukleinsäure, bezogen auf das Prinzip der vorliegenden Erfindung. Wenn das Verfahren der vorliegenden Erfindung durchgeführt wird, kann ein anderes Nukleinsäure-Labelverfahren in Kombination verwendet werden. Als andere Labelverfahren sind RI-Verfahren und Nicht-RI-Verfahren (Fluoreszenzverfahren, Biotinverfahren, Chemilumineszenzverfahren usw.) bekannt, und das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann in Kombination mit irgendeiner Art der Verfahren durchgeführt werden. Als fluoreszente Substanzen können irgendwelche fluoreszente Substanzen, die an einen Basenanteil einer Nukleinsäure binden, verwendet werden. Beispielsweise können Cyaninfarbstoffe (z. B. Cy3, Cy5 usw. in den DyDye^TM-Serien), Rhodamin-6G-Reagens, N-Acetoxy-N2-acetylaminofluoren (AAF) oder AAIF (Iod-Derivat von AAF) verwendet werden.
Als Proben-Nukleinsäure-Fragmente wird eine Probe, die ein DNA-Fragment oder RNA-Fragment enthält, dessen Sequenz oder Funktion nicht bekannt ist, vorzugsweise verwendet. Zum Zweck der Untersuchung der Gen-Expression wird die Proben-Nukleinsäuren vorzugsweise von einer Zell- oder Gewebeprobe eines Eukaryoten isoliert. Wenn die Probe ein Genom ist, kann die Proben-Nukleinsäure von irgendwelchen Gewebeproben mit Ausnahme von Erythrozyten isoliert werden. Irgendwelche Gewebe, mit Ausnahme von Erythrozyten, können vorzugsweise periphere Blutlymphozyten, Haut, Haar, Sperma oder dergleichen sein. Wenn die Probe mRNA ist, wird die Probe vorzugsweise von einer Gewebeprobe extrahiert, bei der mRNA exprimiert wird. Obwohl mRNA direkt durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung detektiert werden kann, kann cDNA, hergestellt von mRNA, durch reverse Transkription zur Aufnahme von gelabelten dNTP ("dNTP" bezieht sich auf Desoxyribonukleotid mit einer Base aus Adenin (A), Cytosin (C), Guanin (G) oder Thymin (T)), auch verwendet werden. Als dNTP wird dCTP vorzugsweise von einem Gesichtspunkt der chemischen Stabilität verwendet. Eine Menge an mRNA, die für eine Hybridisierung erforderlich ist, variiert in Abhängigkeit von einem Flüssigkeitsvolumen oder einem Labelverfahren. Die Menge kann vorzugsweise einige wenige μg oder weniger betragen. Wenn DNA-Fragmente auf einem DNA-Chip Oligo-DNA's sind, wird die Proben-Nukleinsäure vorzugsweise zuvor in kleinere Moleküle eingestellt. Da es schwierig ist, mRNA selektiv von prokaryotischen Zellen zu extrahieren, ist es bevorzugt, Gesamt-RNA zu labeln. Zum Zweck der Untersuchung der Mutation oder der Polymorphie der Gene können die Proben-Nukleinsäure-Fragmente auch erhalten werden, indem für den Targetbereich in Anwesenheit geeigneter Primer eine PCR durchgeführt wird.
Die Hybridisierung kann durchgeführt werden durch Verteilen der wässerigen, flüssigen, auflösende oder dispergierende Proben-Nukleinsäure-Fragmente auf dem DNA-Chip, hergestellt wie oben beschrieben. Obwohl das Volumen der wässerigen Flüssigkeit, die verteilt wird, nicht besonders beschränkt ist, liegt es beispielsweise bevorzugt im Bereich von 1 bis 100 μl. Die Hybridisierung kann herkömmlich beispielsweise bei einer Temperatur im Bereich von Raumtemperatur bis 70°C für eine Reaktionszeit im Bereich von 1 bis 20 Stunden durchgeführt werden. Nach der Vervollständigung der Hybridiserung wird der Chip vorzugsweise mit einer gemischten Lösung aus einem Tensid und einem Puffer gewaschen, um nicht-reagierte Proben-Nukleinsäure zu entfernen. Als Tensid wird vorzugsweise Natriumdodecylsulfat (SDS) verwendet. Als Puffer kann Citratpuffer, Phosphatpuffer, Boratpuffer, Tris-Puffer, Good-Puffer und dergleichen verwendet werden. Am stärksten bevorzugt wird der Citratpuffer verwendet. Wenn es der zuvor angegebenen Verbindung ermöglicht wird, während der Hybridisierung zu co-existieren und mit einer vielsträngigen Hybrid-Nukleinsäure zu interagieren, obwohl der Chip auf die gleiche Weise wie oben beschrieben gewaschen werden kann, kann eine optische Detektion auch für den DNA-Chip, wie er ist, ohne besonderen Waschvorgang durchgeführt werden, und dies stellt eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar.
Die Hybridisierung unter Verwendung eines DNA-Arrays ist dadurch gekennzeichnet, dass eine sehr kleine Menge einer Proben-Nukleinsäure verwendet wird. Aus diesem Grund sollten optimale Bedingungen für die Hybridisierung in Abhängigkeit von den Längen der DNA-Fragmente, immobilisiert auf einem Feststoffphasenträger und der Art der Proben-Nukleinsäure angewendet werden. Für eine Gen-Expressionsanalyse ist es bevorzugt, die Hybridisierung für einen langen Zeitraum durchzuführen, so dass wenig Expressions-Gene auch zufriedenstellend detektiert werden können. Für die Detektion einer einzelnen Basenmutation ist es bevorzugt, die Hybridisierung für einen kurzen Zeitraum durchzuführen.
Obwohl das Lösemittel verwendet wird, wenn die zuvor angegebene Verbindung mit einer vielsträngigen Hybrid-Nukleinsäure kontaktiert wird, nicht besonders beschränkt ist, kann gewöhnlich Wasser oder irgendwelche der verschiedenen Puffer wie auch ein mit Wasser mischbares organisches Lösemittel geeignet verwendet werden. Bevorzugte Beispiele der mit Wasser mischbaren organischen Lösemittel schließen beispielsweise Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Methanol, Ethanol, Ethylenglykol, Glycerin und dergleichen ein. Ferner ist es auch bevorzugt, Wasser oder Puffer mit diesen organischen Lösemitteln für die Verwendung zu mischen. Bei der Messung einer vielsträngigen Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung variiert eine bevorzugte Konzentration der zuvor angegebenen Verbindung auch in Abhängigkeit von der Konzentration der vielsträngigen Nukleinsäure, die detektiert wird. Allerdings kann diese Konzentration 1 × 10^–10 Mol/l bis 1 × 10^–8 Mol/l, stärker bevorzugt 1 × 10^–9 Mol/l bis 1 × 10^–4 Mol/l am stärksten bevorzugt 5 × 10^–8 Mol/1 bis 1 × 10^–5 Mol/l betragen.
Wenn die oben angegebene Verbindung mit einer vielsträngigen Nukleinsäure unter Verwendung eines DNA-Arrays kontaktiert wird, wird ein Verfahren des Verteilens einer Lösung der zuvor genannten Verbindung auf dem Array am stärksten bevorzugt verwendet. Allerdings kann auch ein Verfahren mit Eintauchen eines DNA-Arrays nach Hybridisierung in eine Lösung der zuvor angegebenen Verbindung vorzugsweise verwendet werden. Ferner kann ein Verfahren des Einstellens der zuvor angegebenen Verbindung, die zur Zeit der Hybridisierung existiert, auch verwendet werden. Wenn die optische Messung durch Kontaktieren der zuvor angegebenen Verbindung mit einer vielsträngigen Nukleinsäure durchgeführt wird, wird die Detektion vorzugsweise innerhalb von 0,01 bis 1000 Sekunden gestartet, stärker bevorzugt 0,1 bis 600 Sekunden, nachdem die vielsträngige Nukleinsäuren und die oben angegebene Verbindung mit einander kontaktiert werden. Der pH-Wert einer Lösung für die optische Messung beträgt vorzugsweise 2,0 bis 10,0, stärker bevorzugt 3,0 bis 9,0, am stärksten bevorzugt 4,0 bis 8,0. Es ist auch bevorzugt, einen Puffer für die pH-Einstellung zu verwenden. Obwohl Puffer im Detail in "Tanpakusitu Koso no Kiso Jikken Ho (Fundamental Experimental methods for Proteins and Enzymes") beschrieben sind, übersetzt von Sikiichi Horio, Nankodo, 1994, und dergleichen, werden vorzugsweise Kaliumhydrogenphthalat/Salzsäure-Puffer, Citrat/Dinatriumphosphat-Puffer, Citronensäure/Natriumcitrat-Puffer, Essigsäure/Natriumacetat-Puffer, Succinat/Natriumhydroxid-Puffer, Natriummaleat/Natriumhydroxid-Puffer, Phosphatpuffer, Imidazol/Salzsäure-Puffer, Triethanolamin- und Salzsäure/Natriumhydroxid-Puffer, N-Ethylmorpholin/Salzsäure-Puffer, Tris-Puffer, Glycylglycin/Natriumhydroxid-Puffer, Diethanolamin/Salzsäure-Puffer, Borat-Puffer, Britton-Robinson-Puffer in einem weiten Bereich, GTA-Puffer in einem weiten Bereich und dergleichen verwendet. Die Konzentration des Puffers beträgt vorzugsweise 0,1 mM bis 500 mM, stärker bevorzugt 0,5 bis 200 mM, ferner vorzugsweise 1 mM bis 50 mM.
Nachdem die Verbindung mit der vielsträngigen Hybrid-Nukleinsäure kontaktiert worden ist, kann ein Waschen durchgeführt werden, um eine Überschussmenge der Verbindung zu entfernen. Statt Waschen kann ein Verfahren durchgeführt werden, das ähnlich ist zu dem Waschen nach der Hybridisierung. Die optische Detektion ist ohne Durchführen des Waschvorgangs in den Verfahren der vorliegenden Erfindung, wie oben beschrieben, erreichbar, und ein Weglassen des Waschvorgangs ist auch bevorzugt.
Wo die vielsträngige Hybrid-Nukleinsäure in einem Lösungssystem detektiert wird, kann auch ein gewöhnliches Fluorometer für die optische Detektion verwendet werden, oder ein Fluoreszenzscanner wird auch bevorzugt aus dem Gesichtspunkt der Fähigkeit, simultan eine große Anzahl an Nukleinsäuren zu detektieren, und wegen der Empfindlichkeit verwendet. Ferner kann eine Quantifizierung der Fluoreszenz über ein herkömmliches Verfahren unter Verwendung eines Fluoreszenzlaserscanners für das Substrat, getrocknet nach der Hybridisierung, oder in Anwesenheit eines wässerigen Lösemittels durchgeführt werden, oder die Messung kann durch das gekühlte CCD(Ladungskopplungsspeichervorrichtung)-Verfahren oder durch das Fluoreszenzlaserscanner-Verfahren für ein Substrat, das mit Abdeckglas bedeckt ist, um das Substrat vom Trocknen abzuhalten, durchgeführt werden.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung, die durch die Formel (V) dargestellt werden, sind als Fluoreszenzfarbstoffe für die Nukleinsäure-Messung geeignet. Ferner können sie auch als Fluoreszenzfarbstoffe mit einer höheren Selektivität in einem Verfahren des Unterscheidens einer doppelsträngigen Nukleinsäure von einer einzelsträngigen Nukleinsäure in Nukleinsäure-Messtechniken verwendet werden. Allerdings ist die Verwendung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt, und sie können für verschiedene Anwendungen verwendet werden.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird spezieller anhand der Beispiele erklärt. Allerdings ist der Umfang der vorliegenden Erfindung nicht auf die folgenden Beispiele beschränkt.
[Synthesebeispiel 1] Synthese des Farbstoffs (D-1)
(1-1) Synthese von 2-Mercaptooxazolo[4,5-b]pyridin
Die Synthese wurde unter Bezugnahme auf das Verfahren, das in Journal of Organic Chemistry (J. Org. Chem.), Bd. 60, S. 5721 (1995), beschrieben ist, durchgeführt. Eine Menge von 10 g 2-Amino-4-hydroxypyridin, 20 g Kaliumxanthat und 200 ml Ethanol wurden vermischt und für 15 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Anschließend wurde das Lösemittel unter vermindertem Druck verdampft. Der Rückstand wurde in 80 ml Wasser aufgelöst und mit Essigsäure versetzt, und Kristalle schieden sich ab. Die Kristalle wurden durch Filtration gesammelt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 11 g.
(1-2) Synthese von 2-Methylthiooxazolo[4,5-b]pyridin
Eine Menge von 3,9 g eines Ausgangsmaterials (2-Mercaptooxazolo[4,5-b]pyridin) wurde in Dimethylformamid aufgelöst und mit 3,0 g Kalium-t-butoxid versetzt. Anschließend wurde die Reaktionsmischung mit 2 ml Methyliodid versetzt und bei Raumtemperatur für 30 Minuten gerührt. Das Ausgangsmaterial verschwand im wesentlichen, und anschließend wurde die Reaktionsmischung mit Wasser versetzt und zweimal mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, und das Lösemittel wurde unter vermindertem Druck verdampft, um die gewünschte Substanz als Öl zu erhalten. Das entstandene Öl wurde stehengelassen, um eine Kristallisation zu ermöglichen.
(1-3) Synthese von 4-(2-Carbamoylethyl)-2-methylthiooxazolo[4,5-b]pyridiniumbromid
Eine Menge von 1 g 2-Methylthiooxazol[4,5-b]pyridin wurde mit 3 g 3-Brompropionsäureamid versetzt, auf 110°C für 1 Stunde erwärmt und anschließend abgekühlt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die Komponenten, die sich in dem Ethylacetat auflösten, wurden durch Dekantieren entfernt. Dieses Verfahren wurde dreimal wiederholt und anschließend wurde der Rückstand für die folgende Reaktion ohne Behandlung verwendet.
(1-4) Synthese von 1,4-Dimethylchinolinium-p-toluolsulfonat
Eine Menge von 10 g 4-Methylchinolin (Lepidin) und 19,5 g Methyl-p-toluolsulfonat wurden vermischt und es wurde ermöglicht, bei 150°C für 1 Stunde zu reagieren. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und gerührt und Kristalle schieden sich ab. Die Kristalle wurden durch Filtration gesammelt und mit Ethylacetat gewaschen. Die entstandene Substanz wies eine hygroskopische Eigenschaft auf.
(1-5) Synthese des Farbstoffs (D-1)
Eine Menge von 100 mg 4-(2-Carbamoylethyl)-2-methylthiooxazol[4,5-b]pyridiniumbromid, hergestellt in Synthesebeispiel (1-3) und 40 mg 1,4-Dimethylchinolinium-p-toluolsulfonat, synthesiert in Synthesebeispiel (1-4) wurden in 4 ml Dimethylformamid aufgelöst und mit 0,5 ml Triethylamin bei Raumtemperatur versetzt. Nachdem eine Reaktion bei Raumtemperatur für 1 Stunde ermöglicht wurde, wurde die Reaktionsmischung mit 0,5 ml Triethylamin versetzt und es wurde ermöglicht, dass sie bei 80°C für 1 Stunde reagiert. Die Reaktionsmischung wurde ohne Behandlung einer Silikagel-Säulenchromatographie unterzogen und gelbe Fraktionen wurden gesammelt, um die Targetsubstanz zu erhalten. Die Reinigung über Chromatographie wurde wiederholt, um 2 mg der gewünschten Substanz zu erhalten.
[Synthesebeispiel 2] Synthese des Farbstoffs (D-2)
(2-1) Synthese von 4-Methyl-1-(3-trimethylammoniopropyl)chinoliniumdibromid
Eine Menge von 5 g (3-Brompropyl)trimethylammoniumbromid (Aldrich Co.) und 10 g 4-Methylchinolin wurde vermischt und es wurde ermöglicht, dass sie bei 120°C für 3 Stunden reagiert. Nachdem die Reaktionsmischung abgekühlt wurde, wurde die Reaktionsmischung mit Ethylacetat versetzt, und die Substanzen, aufgelöst in Ethylacetat, wurden durch Dekantieren entfernt. Dieses Verfahren wurde dreimal wiederholt und anschließend wurde der Rückstand für die folgende Reaktion ohne weitere Reinigung verwendet.
(2-2) Synthese des Farbstoffs (D-2)
Eine Menge von 100 mg 3-(2-Carbamoylethyl)-2-methylthiooxozol[4,5-b]pyridiniumbromid, synthetisiert in Synthesebeispiel (1-3), und 50 mg 4-Methyl-1-(3-trimethylammoniopropyl)chinoliniumdibromid, synthetisiert im Synthesebeispiel (2-1) wurden in 5 ml Dimethylformamid gelöst und mit 0,5 ml Triethylamin bei Raumtemperatur versetzt. Nachdem eine Reaktion bei Raumtemperatur für 1 Stunde ermöglicht wurde, wurde die Reaktionsmischung mit 0,5 ml Triethylamin versetzt und es wurde ermöglicht, dass sie bei 80°C für 1 Stunde reagiert. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt, und die Substanzen, aufgelöst in Ethylacetat, wurden durch Dekantieren entfernt. Anschließend wurde der Rückstand in Methanol aufgelöst und dreimal über Säulenchromatographie unter Verwendung von Sephadex LH-20 (Elutionslösemittel: Methanol) gereinigt und einmal durch Kurz-Silikagel-Säulenchromatographie (Elutionslösemittel: Chloroform/Methanol = 2/1), um 4 mg der gewünschten Substanz zu erhalten.
[Synthesebeispiel 3] Synthese des Farbstoffs (D-3)
(3-1) Synthese von 4-(2-(N-Acetyl-N-phenylamino)vinyl)-1-(3-trimethylammoniopropyl)chinoliniumdibromid
Eine Menge von 500 mg 4-Methyl-1-(3-trimethylammoniopropyl)chinoliniumdibromid, synthetisiert im Synthesebeispiel (2-1), wurde mit 2 g 1,3-Diphenylformamidin versetzt, mit 10 ml Essigsäureanhydrid versetzt und man ließ bei 120°C für 3 Stunden reagieren. Nachdem die Reaktionsmischung abgekühlt wurde, wurde die Mischung mit Ethylacetat versetzt und die Substanzen, die sich in dem Ethylacetat auflösten, wurden entfernt. Dieses Verfahren wurde dreimal wiederholt, und der Rückstand wurde für die folgende Reaktion ohne weitere Reinigung verwendet.
(3-2) Synthese von 7-(2-Methoxyethoxymetehyl)-2,3,3-trimethyl-3H-pyrrolo[2,3-b]pyridiniumchlorid
(3-2-1) Synthese von 2,3,3-Trimethyl-3H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-(7-aza-2,3,3-trimethylindolenin)
Eine Menge von 200 g 2-Hydrazinpyridin und 300 ml Toluol wurde vermischt, mit 250 g 3-Methyl-2-butanon versetzt und unter Erwärmen für 30 Minuten unter Rückfluss erhitzt. Anschließend wurde das Lösemittel vollständig konzentriert, um ein Öl zu erhalten. Dieses Öl wurde mit 10 g Zinkchlorid versetzt, auf 215°C aufgewärmt, und es wurde ermöglicht, dass es für 5 Stunden reagiert. Die Reaktionsmischung wurde abgekühlt, anschließend mit 400 ml Wasser versetzt und viermal mit 300 ml Chloroform extrahiert, und die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Anschließend wurde das Lösemittel unter vermindertem Druck verdampft und der Rückstand wurde unter vermindertem Druck destilliert (112–135°C/0,2 mmHg). Die destillierte Komponente wurde aus 1,5 l Hexan rekristallisiert, um die gewünschte Substanz zu erhalten. Ausbeute: 70,0 g, 23,8%.
(3-2-2) Synthese von 7-(2-Methoxyethoxymethyl)-2,3,3-trimethyl-3H-pyrrolo[2,3-b]pyridiniumohlorid
Eine Menge von 1 g 2,3,3-Trimethyl-3H-pyrrolo[2,3-b]pyridin, synthetisiert in Synthesebeispiel (3-2-1), wurde mit 3 g 2-Methoxyethoxymethylchlorid gemischt und es wurde ermöglicht, dass es für 1 Stunde reagiert. Die Reaktionsmischung wurde abgekühlt und anschließend mit Ethylacetat versetzt und die Komponenten, aufgelöst in Ethylacetat, wurden durch Dekantieren entfernt. Der Rückstand wurde für die folgende Reaktion ohne weitere Reinigung verwendet.
(3-3) Synthese des Farbstoffs (D-3)
Eine Menge von 50 mg 4-(2-(N-Acetyl-N-phenylamino)vinyl)-1-(3-trimethylammoniopropyl)chinoliniumdibromid, synthetisiert in Synthesebeispiel (3-1), und 100 mg 7-(2- Methoxyethoxymethyl)-2,3,3-trimethyl-3H-pyrrolo[2,3-b]pyridiniumchlorid, synthetisiert in Synthesebeispiel (3-2), wurden in 5 ml Dimethylformamid gelöst, mit 0,5 ml Essigsäureanhydrid versetzt, anschließend mit 1 ml Triethylamin versetzt und es wurde ermöglicht, dass es bei Raumtemperatur für 3 Stunde reagiert. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die Substanzen, aufgelöst in Ethylacetat, wurden durch Dekantieren entfernt. Anschließend wurde der Rückstand durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Sephadex LH-20 (Elutionslösemittel: Methanol) gereinigt, um ein Rohprodukt eines Vorläufers des Farbstoffs (D-3) in einer blauen Farbe zu erhalten. Das Rohprodukt des Vorläufers wurde mit 3% Bromwasserstoff versetzt und es wurde ermöglicht, dass es bei 80°C für 2 Stunden reagiert, und anschließend wurde die Reaktionsmischung unter vermindertem Druck verdampft. Der Rückstand wurde dreimal durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Sephadex LH-20 (Elutionslösemittel: Methanol) gereinigt und einmal durch Silikagel-Säulenchromatographie (Elutionslösemittel: Chloroform/Methanol = 3/1), um 3 mg der gewünschten Substanz zu erhalten.
[Synthesebeispiel 4] Synthese des Farbstoffs (D-4) (4-1) Synthese von 2-Methyloxazolo[4,5-b]pyridin
Eine Menge von 15 g 2-Amino-3-hydroxypyridin (Aldrich Co.) wurde mit 80 ml Ethylorthoacetat und einer katalytischen Menge von p-Toluolsulfonsäuremonohydrat versetzt, und es wurde ermöglicht, dass sie bei 120°C für 4 Stunden reagiert. Die Reaktionsmischung wurde abgekühlt und anschließend mit 2 ml Triethylamin versetzt, und anschließend wurde das Lösemittel unter vermindertem Druck verdampft. Der Rückstand wurde durch Silikagel-Säulenchromatographie (Elutionslösemittel: Hexan/Ethylacetat = 2/1) gereinigt, um die gewünschte Substanz als Kristalle zu erhalten.
(4-2) Synthese des Farbstoffs (D-4)
Der Farbstoff (D-4) wurde unter Verwendung von 2-Methyloxazolo[4,5-b]pyridin, synthetisiert in (4-1) gemäß dem Verfahren, beschrieben in Synthesebeispiel 3, erhalten.
[Synthesebeispiel 5] Synthese des Farbstoffs (D-5)
(5-1) Synthese von 6-Brom-2-mercaptooxazolo[4,5-b]pyridin
Eine Menge von 4 g 2-Amino-5-brom-3-hydroxypyridin, 8 g Kaliumxanthat und 50 ml Ethanol wurde gemischt und unter Erwärmen für 10 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Das Lösemittel wurde unter vermindertem Druck verdampft und der Rückstand wurde mit 40 ml Wasser versetzt und aufgelöst. Die Lösung wurde mit Essigsäure versetzt, und es schieden sich Kristalle ab. Die Kristalle wurden durch Filtration unter vermindertem Druck gesammelt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 4,0 g, 81,8%.
(5-2) Synthese von 6-Brom-2-methylthiooxazolo[4,5-b]pyridin
Eine Menge von 2 g 5-Brom-2-mercaptooxazolo[4,5-b]pyridin, synthetisiert in Synthesebeispiel (5-1), wurde mit 15 ml Dimethylformamid versetzt und mit 2 ml Triethylamin zum Auflösen versetzt. Anschließend wurde die Lösung mit 1 ml Methyliodid versetzt, und es wurde ermöglicht, dass bei Raumtemperatur für 1 Stunde reagiert wird. Nach der Vervollständigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit Wasser versetzt, und die abgeschiedenen Kristalle wurden durch Filtration unter vermindertem Druck gesammelt, mit Wasser gewaschen und getrocknet, um die gewünschte Substanz zu erhalten. Ausbeute: 2 g, 94,3%.
(5-3) Synthese von 1-(3-Ethoxycarbonylpropyl)-4-methylchinoliniumbromid
Eine Menge von 19,5 g 4-Brombutylsäureethylester und 14,3 g Lepidin wurde vermischt und es wurde ermöglicht, dass sie bei 130°C für 2 Stunden reagieren. Nachdem die Reaktionsmischung abgekühlt wurde, wurde die Mischung mit Ethylacetat versetzt und die Substanzen, die in dem Ethylacetat aufgelöst wurden, wurden entfernt. Dieses Verfahren wurde wiederholt, um die gewünschte Substanz als Öl zu erhalten. Das entstandene Öl wurde für die folgende Reaktion ohne weitere Reinigung verwendet.
(5-4) Synthese des Farbstoffs (D-5)
Der Farbstoff (D-5) wurde unter Verwendung der Ausgangsmaterialien, die in den Synthesebeispielen (5-2) und (5-3) synthetisiert wurden, gemäß dem Verfahren, beschrieben in Synthesebeispiel 1, synthetisiert.
[Synthesebeispiel 6] Synthese des Farbstoffs (D-6)
(6-1) Synthese von 6-Methyl-2-mercaptothiazolo[4,5-b]pyridin
Die Synthese wurde gemäß dem Verfahren, beschrieben in Journal of Medicinal Chemistry (J. Med. Chem.), Bd. 37, S. 248, 1994, durchgeführt. Eine Menge von 10 g 2-Amino-3-brom-5-methylpyridin, 120 ml N-Methylpyrolidon und 16,7 g Kaliumxanthat wurde vermischt und auf 170°C für 3,5 Stunden erwärmt. Die Reaktionsmischung wurde zunächst schwarz und dann allmählich dunkel rötlich-braun. Nach der Vervollständigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Reaktionsmischung wurde mit Essigsäure sauer eingestellt, und Kristalle der gewünschten Substanz (gräulich-gelb) wurden erhalten. Die Kristalle wurden durch Filtration gesammelt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 8,7 g, 89,2%.
(6-2) Synthese von 6-Methyl-2-methylthiothiazolo[4,5-b]pyridin
Eine Menge von 2 g des Ausgangsmaterials Thiol wurde in 10 ml Dimethylformamid aufgelöst und mit 2 ml Triethylamin versetzt. Anschließend wurde die Reaktionsmischung mit 1,5 ml Methyliodid versetzt, und es wurde eine Reaktion bei Raumtemperatur für 30 Minuten ermöglicht. Die Reaktionsmischung wurde mit 100 ml Wasser versetzt und die abgeschiedenen Kristalle wurden durch Filtration gesammelt, mit Wasser gewaschen und getrocknet, um die gewünschte Substanz zu erhalten. Ausbeute: 1,7 g, 78,9%.
(6-3) Synthese des Farbstoffs (D-6)
Der Farbstoff (D-6) wurde unter Verwendung der Ausgangsmaterialien, die in dem Synthesebeispiel (6-2) und dem Synthesebeispiel (5-2) synthetisiert wurden, gemäß dem Verfahren, beschrieben in Synthesebeispiel 1, synthetisiert.
[Synthesebeispiel 7] Synthese des Farbstoffs (D-15)
(7-1) Synthese von 4-Dimethylaminobutylsäureethylester
Ein Volumen von 250 ml 50%iger wässeriger Dimethylamin-Lösung und 200 ml Ethanol wurde gemischt und tropfenweise mit 120 g 4-Brombutylsäureethylester versetzt, während die Mischung bei 10°C oder niedriger gehalten wurde. Nach der Vervollständigung der Zugabe wurde eine Reaktion bei Raumtemperatur für 2 Stunden ermöglicht. Anschließend wurde die Temperatur auf 50°C erhöht und es wurde eine Reaktion für 2 Stunden ermöglicht. Das Lösemittel wurde auf etwa die Hälfte des Volumens konzentriert und der Rückstand wurde durch Zugabe von Natriumhydroxid basisch eingestellt, während mit Eiswasser gekühlt wurde, und mit 400 ml Ethylacetat für die Extraktion versetzt wurde. Die organische Phase wurde viermal mit 150 ml M Salzsäure extrahiert und die organische Phase wurde entsorgt. Der Salzsäure-Extrakt wurde mit Eiswasser gekühlt, durch Zugabe von Natriumhydroxid basisch eingestellt und dreimal mit 200 ml Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde über Kaliumcarbonat getrocknet und konzentriert, um die gewünschte Substanz zu erhalten. Ausbeute: 45 g.
(7-2) Synthese von (6-Bromhexyl)(3-ethoxycarbonylpropyl)dimethylammoniumbromid
Eine Menge von 15 g 4-Dimethylaminobutylsäureethylester, synthetisiert in Synthesebeispiel (7-1), wurde mit 50 g 1,6-Dibromhexan gemischt und über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Kristalle schieden sich ab, und anschließend wurde die Reaktionsmischung mit Ethylacetat versetzt, um die Kristalle aufzulösen, und unter vermindertem Druck filtriert, um die gewünschte Substanz als hygroskopische Kristalle zu erhalten. Ausbeute: 21 g.
(7-3) Synthese von 1-(6-(Dimethyl-(3-ethoxycarbonylpropyl)ammonio)hexyl)-4-methylchinoliniumdibromid
Eine Menge von 8 g 6-Bromhexyldimethyl-(3-ethoxycarbonylpropyl)ammoniumbromid und 12 g Lepidin wurde gemischt und es wurde ermöglicht, dass sie bei 125°C für 1 Stunde reagieren. Die Reaktionsmischung wurde abgekühlt, anschließend mit Ethylacetat versetzt und gerührt, und die Substanzen, die sich in dem Ethylacetat auflösten, wurden durch Dekantieren entfernt. Anschließend wurde der Rückstand in Methanol aufgelöst und unter Verwendung von Sephadex LH-20 (Eluent: Methanol) gereinigt, um die gewünschte Substanz als Öl zu erhalten. Ausbeute: 6 g.
(7-4) Synthese des Farbstoffs (D-15)
Der Farbstoff (D-15) wurde unter Verwendung der Ausgangsmaterialien, die in dem Synthesebeispiel (7-3) und in dem Synthesebeispiel (1-4) synthetisiert worden waren, gemäß dem Syntheseverfahren, beschrieben in Synthesebeispiel 1, synthetisiert.
[Synthesebeispiel 8] Synthese des Farbstoffs (D-16)
(8-1) Synthese von 5-Fluor-4-methylchinolin-p-toluolsulfonsäuresalz
Es wurde Bezug genommen auf Australian Journal of Chemistry (Aust. J. Chem.), Bd. 45, S. 1119, 1992, und Journal of American Chemical Society (J. Am. Chem. Soc.), Bd. 67, S. 86, 1945. Eine Menge von 33,2 g (0,225 Mol) 3-Fluoranilinhydrochlorid, 97,2 g (0,36 Mol) Eisenchloridhexahydrat, 3,6 g wasserfreiem Zinkchlorid und 160 ml 95%igem Ethanol wurde gemischt und langsam wurde tropfenweise mit 0,18 Mol Methylvinylketon auf ein Wasserbad bei 60 bis 65°C versetzt. Nach der Vervollständigung der Zugabe wurde die Reaktionsmischung durch Erwärmen für 2 Stunden unter Rückfluss erhitzt und über Nacht stehen gelassen. Fast das gesamte Lösemittel war verdampft und der Rückstand wurde mit 25% Natriumhydroxid alkalisch eingestellt. Der Rückstand wurde mit Celite filtriert und mit Ethylacetat gewaschen. Das Filtrat wurde abgetrennt, die organische Phase wurde einer Reinigung mittels Silikagel-Säulenchromatographie unterzogen. Die erhaltene Mischung der Isomere (5-Fluor-4-methylchinolin und 7-Fluor-4-methylchinolin) wurde destilliert. Die anfängliche destillierte Fraktion mit einem hohen Gehalt an 5-Fluor-4-methylchinolin wurde in Ethylacetat aufgelöst, mit einer Lösung aus p-Toluolsulfonsäuremonohydrat in Aceton versetzt und mit Eiswasser gekühlt, um Kristalle aus einem 5-Fluor-4-methylchinolin-p-toluolsulfonsäuresalz zu erhalten. Ausbeute: 1,7 g.
Ferner wurde 7-Fluor-4-methylchinolin auch als Kristalle von p-Toluolsulfonsäuresalz isoliert.
(8-2) Synthese von (4-Brombutyl)(3-ethoxycarbonylpropyl)dimethylammoniumbromid
Eine Menge von 15 g 4-Dimethylaminobutylsäureethylester, synthetisiert in Synthesebeispiel (7-1), wurde mit 50 g 1,4-Dibrombutan vermischt und über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Kristalle schieden sich ab, und anschließend wurde die Reaktionsmischung mit Ethylacetat versetzt, um die Kristalle aufzulösen, und unter vermindertem Druck filtriert, um die gewünschte Substanz zu erhalten. Ausbeute: 30 g.
(8-3) Synthese von 1-(4-(Dimethyl-(3-ethoxycarbonylpropyl)ammonio)butyl)-5-fluor-4-methylchinoliniumdibromid
Eine Menge von 1 g 4-Brombutyldimethyl-(3-ethoxycarbonyl)propyl)ammoniumbromid und 0,1 g 5-Fluor-4-methylchinolin-p-toluolsulfonsäuresalz wurden gemischt, mit 0,2 ml Triethylamin versetzt, und es wurde ermöglicht, dass bei 130°C für 1 Stunde reagiert wird. Die Reaktionsmischung wurde abgekühlt, anschließend wurde mit Ethylacetat versetzt und gerührt, und die Substanzen, die sich in dem Ethylacetat auflösten, wurden durch Dekantieren entfernt. Anschließend wurde der Rückstand in Methanol aufgelöst und unter Verwendung von Sephadex LH-20 (Eluent: Methanol) gereinigt, um die gewünschte Substanz als Öl zu erhalten.
(8-4) Synthese des Farbstoffs (D-16)
Der Farbstoff (D-16) wurde unter Verwendung der Verbindungen, die in dem Synthesebeispiel (8-3) und dem Synthesebeispiel (6-2) als Ausgangsmaterialien synthetisiert worden waren, gemäß dem Verfahren, beschrieben in Synthesebeispiel 1, erhalten.
[Synthesebeispiel 9] Synthese des Farbstoffs (D-17)
(9-1) Synthese von 5-Chlor-4-methylchinolin
Es wurde Bezug genommen auf auf Australian Journal of Chemistry (Aust. J. Chem.), Bd. 45, S. 1119, 1992, und Journal of American Chemical Society (J. Am. Chem. Soc.), Bd. 67, S. 86, 1945. Eine Menge von 40,0 g (0,225 Mol) 3-Chloranilinhydrochlorid, 97,2 g (0,36 Mol) Eisenchloridhexahydrat, 3,6 g wasserfreiem Zinkchlorid und 160 ml 95%igem Ethanol wurde gemischt und langsam tropfenweise mit 12,6 g (0,18 Mol) Methylvinylketon auf einem Wasserbad bei 60–65°C versetzt. Nach der Vervollständigung der Zugabe wurde die Reaktionsmischung durch Erwärmen für 2 Stunden unter Rückfluss erhitzt und über Nacht stehen gelassen. Fast das ganze Lösemittel war verdampft und der Rückstand wurde mit 25% Natriumhydroxid basisch eingestellt. Der Rückstand wurde mit Cerite filtriert und mit Ethylacetat gewaschen, und das Filtrat wurde abgetrennt. Die organische Phase enthielt 5-Chlor-4-methylchinolin und 7-Chlor-4-methylchinolin, und die Mischung wurde einer Reinigung durch Silikagel-Säulenchromatographie (Elutionslösemittel: Hexan/Ethylacetat = 9/1) unterzogen, um die Verbindungen abzutrennen.
(9-2) Synthese von 1-(4-(Dimethyl-(3-ethoxycarbonylpropyl)ammonio)butyl)-5-chlor-4-methylchinoliniumdibromid
Eine Menge von 1 g 4-Brombutyldimethyl-(3-ethoxycarbonylpropyl)ammoniumbromid (Synthesebeispiel 8-2) und 0,1 g 5-Chlor-4-methylchinolin wurde gemischt, und es wurde ermöglicht, dass bei 130°C für 1 Stunde reagiert wird. Die Reaktionsmischung wurde abgekühlt, anschließend mit Ethylacetat versetzt und gerührt, und die Komponenten, die sich in dem Ethylacetat auflösten, wurden durch Dekantieren entfernt. Der Rückstand wurde in Methanol aufgelöst und unter Verwendung von Sephadex LH-20 (Eluent: Methanol) gereinigt, um die gewünschte Substanz als Öl zu erhalten.
(9-3) Synthese des Farbstoffs (D-17)
Der Farbstoff (D-17) wurde unter Verwendung der Verbindungen, synthetisiert in Synthesebeispiel (9-2) und Synthesebeispiel (6-2), als Ausgangsmaterialien gemäß des gleichen Syntheseverfahrens, wie das Verfahren, das in Synthesebeispiel 1 beschrieben ist, erhalten.
[Synthesesbeispiel 10] Synthese des Farbstoffs (D-18)
(10-1) Synthese von 4-Methyl-1-phenyl-1,2-dihydrochinolin-2-on
Ein Volumen von 150 ml konzentrierter Schwefelsäure wurde portionsweise mit 60 g N,N-Diphenylacetoacetamid bei 5–10°C versetzt. Nachdem im wesentlichen eine vollständige Auflösung erhalten wurde, wurde die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach der Vervollständigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung in Eiswasser gegossen, mit 200 ml Ethylacetat versetzt und gerührt, und Kristalle schieden sich ab. Die Kristalle wurden durch Filtration gesammelt und getrocknet, um die gewünschte Substanz zu erhalten.
(10-2) Synthese von 4-Methyl-1-phenyl-1,2-dihydrochinolin-2-thion
Eine Menge von 10 g 4-Methyl-1-phenyl-1,2-dihydrochinolin-2-on (0,0425 Mol) und 9 g Lawesson-Reagens wurde in Toluol gemischt und durch Erwärmen unter Rückfluss erhitzt. Nachdem die Ausgangsmaterialien verschwanden, wurde die Reaktionsmischung ohne Behandlung einer Silikagel-Säulenchromatographie unterzogen. Es wurde eine Eluierung mit Chloroform durchgeführt, und das Produkt wurde aus Hexan/Ethylacetat rekristallisiert.
(10-3) Synthese von 2-(4-(Dimethyl-(3-ethoxycarbonylpropyl)ammonio)butylthio)-4-methyl-1-phenylchinoliniumdibromid
Eine Menge von 0,5 g 4-Methyl-1-phenyl-1,2-dihydrochinolin-2-thion, synthetisiert in Synthesebeispiel (10-2), und 1 g 4-Brombutyldimethyl-(3-ethoxycarbonylpropyl)ammoniumbromid, synthetisiert in Synthesebeispiel (8-2), wurde gemischt, und es wurde ermöglicht, dass bei 130°C für 1 Stunde reagiert wird. Die Reaktionsmischung wurde abgekühlt und anschließend mit Ethylacetat versetzt, und die Substanzen, die sich in dem Ethylacetat auflösten, wurden entfernt. Der Rückstand wurde in Methanol aufgelöst und unter Verwendung von Sephadex LH-20 (Eluent: Methanol) gereinigt.
(10-4) Synthese des Farbstoffs (D-18)
Der Farbstoff (D-18) wurde unter Verwendung der Ausgangsmaterialien, synthetisiert in Synthesebeispiel (6-2) und Synthesebeispiel (10-3), gemäß dem Verfahren, das in Synthesebeispiel 1 beschrieben ist, synthetisiert.
[Synthesebeispiel 11] Synthese des Farbstoffs (D-19)
(11-1) Synthese des Farbstoffs (D-19)
Der Farbstoff (D-19) wurde unter Verwendung der Verbindungen, synthetisiert in Synthesebeispiel (7-3) und in Synthesebeispiel (6-2), als Ausgangsmaterialien, gemäß dem Verfahren, das in Synthesebeispiel 1 beschrieben ist, synthetisiert.
[Synthesebeispiel 12] Synthese des Farbstoffs (D-23)
(12-1) Synthese von 3-Chlor-4-methylchinolin
Die Synthese wurde unter Bezugnahme auf Synthesis, S. 798, 1976, durchgeführt. Das heißt, 1,31 g (10 mMol) 3-Methylindol, 50 mg Benzyltrimethylammoniumchlorid und 3,2 ml einer 1:1-Mischung aus Chloroform(Ethanol-frei)/Benzol wurden bei 40°C kräftig gerührt und tropfenweise mit einer Lösung aus 3 g Natriumhydroxid in 6 ml Wasser in einem Zeitraum von 15 Minuten versetzt. Nachdem eine Reaktion für 8 Stunden ermöglicht wurde, wurde die Reaktionsmischung mit Ethylacetat verdünnt und mit Wasser und mit 2 N Salzsäure extrahiert. Diese saure Lösung wurde mit konzentriertem Natriumhydroxid schwach basisch eingestellt und mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, und das Lösemittel wurde verdampft, um die gewünschte Substanz als ein Rohprodukt zu erhalten. Das Produkt wurde ferner durch Kurz-Silikagel-Säulenchromatographie gereinigt, um die gewünschte Substanz zu erhalten.
(12-2) Synthese von 1-(6-(Dimethyl-(3-ethoxycarbonylpropyl)ammonio)hexyl)-3-chlor-4-methylchinoliniumdibromid
Eine Menge von 1 g 6-Bromhexyldimethyl-(3-ethoxycarbonylpropyl)ammoniumbromid (Synthesebeispiel 7-2) und 0,1 g 3-Chlor-4-methylchinolin (Synthesebeispiel 12-1) wurde gemischt und es wurde ermöglicht, dass bei 130°C für 1 Stunde reagiert wird. Die Reaktionsmischung wurde abgekühlt und anschließend mit Ethylacetat versetzt und gerührt, und die Substanzen, die sich in dem Ethylacetat auflösten, wurden durch Dekantieren entfernt. Der Rückstand wurde in Methanol aufgelöst und unter Verwendung von Sephadex LH-20 (Eluent: Methanol) gereinigt, um die gewünschte Substanz als Öl zu erhalten.
(12-3) Synthese des Farbstoffs (D-23)
Der Farbstoff (D-23) wurde unter Verwendung der Verbindungen, synthetisiert in Synthesebeispiel (12-2) und in Synthesebeispiel (6-2), als Ausgangsmaterialien, gemäß dem Verfahren, das in Synthesebeispiel 1 beschrieben ist, synthetisiert.
[Synthesebeispiel 13] Synthese des Farbstoffs (D-25)
(13-1) Synthese von 2,3,3-Triniethyl-3H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-5-carbonsäureethylester
(13-1-1) Synthese von 2-Hydrazinopyridin-5-carbonsäure
Eine Menge von 50 g 6-Chlornicotinsäure wurde mit 300 ml n-Butanol vermischt, mit 80 g Hydrazinmonohydrat versetzt und durch Erwärmen für 10 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Die Reaktionsmischung wurde abgekühlt und in 500 ml verdünnte Salzsäure gegossen. Die abgeschiedenen Kristalle wurden durch Filtration gesammelt, mit Wasser gewaschen und getrocknet, um die gewünschte Substanz zu erhalten. Ausbeute: 44,2 g, 90,9%.
(13-1-2) Synthese von 2,3,3-Trimethyl-3H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-5-carbonsäure
Eine Menge von 30 g 3-Hydrazinpyridin-5-carbonsäure und 30 g 3-Methyl-2-butanon wurde gemischt, mit 120 ml Ethylenglykol versetzt, und es wurde ermöglicht, bei 100°C für 1 Stunde zu reagieren. Unter vermindertem Druck wurde der Überschuss von 3-Methyl-2-butanon verdampft, und anschließend wurde die Reaktionsmischung erwärmt und für 5 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Die Reaktionsmischung wurde abgekühlt und anschließend ohne Behandlung einer Reinigung durch Silikagel-Säulenchromatographie unterzogen und eine Fraktion, die mit einer Farblösung (p-Anisaldehyd/Ethanol/Schwefelsäure = 5/90/5 (Vol.-%) gefärbt wurde, wurde in TLC gesammelt. Die Fraktion enthielt eine Mischung der gewünschten Substanz, und Ethylenglykolester der gewünschten Substanz, und die Mischung wurde einer Hydrolyse mit 1 N Natriumhydroxid als Mischung unterzogen und neutralisiert, um die gewünschte Substanz als Kristalle zu erhalten. Ferner wurden etwa 40% der gewünschten Substanz als ein Hydrazon gesammelt, hergestellt von dem Ausgangsmaterial Hydrazin und 3-Methyl-2-butanon. Ausbeute: 1,8 g, 4,5%.
(13-1-3) Synthese von 2,3,3-Trimethyl-3H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-5-carbonsäureethylester
Eine Menge von 1 g 2,3,3-Trimethyl-3H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-5-carbonsäure, 1,5 g p-Toluolsulfonsäuremonohydrat und 100 ml Ethanol wurde gemischt, erwärmt und es wird ermöglicht dass sie für 8 Stunden reagiert, während das Lösemittel nach und nach verdampft wurde, und Ethanol in einer geeigneten Menge zugegeben wurde. Die Reaktionsmischung wurde abgekühlt und anschließend wurde das Lösemittel auf etwa 70% Volumen verdampft. Der Rückstand wurde mit Wasser versetzt und mit Ethylacetat für die Extraktion. Die organische Phase wurde mit wässerigem Natriumcarbonat gewaschen und anschließend konzentriert. Der Rückstand wurde über Silikagel-Säulenchromatographie in einer Kurzsäule gereinigt, um die gewünschte Substanz zu erhalten. Ausbeute: 0,8 g, 70,3%.
(13-2) Synthese von 4-(2-(N-Acetyl-N-phenylamino)vinyl)-1-(6-(dimethyl-(3-ethoxycarbonylpropyl)ammonio)hexyl)chinoliniumdibromid
Die gewünschte Substanz wurde unter Verwendung von 1-(6-(Dimethyl-(3-ethoxycarbonylpropyl)ammonio)hexyl)-4-methylchinoliniumdibromid, sythetisiert in Synthesebeispiel (7-3) gemäß dem gleichen Syntheseverfahren, wie in Synthesebeispiel (3-1) beschrieben, erhalten.
(13-3) Synthese von 5-Ethoxycarbonyl-7-(2-methoxyethoxymethyl)-2,3,3-trimethyl-3H-pyrrolo[2,3-b]pyridiniumchlorid
Eine Menge von 0,1 g 2,3,3-Trimethyl-3H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-5-carbonsäureethylester, synthetisiert in Synthesebeispiel (13-1), und 0,8 g 2-Methoxyethoymethylchlorid wurde gemischt und es wurde ermöglicht, dass bei 110°C für 1 Stunde reagiert wird. Die Reaktionsmischung wurde abgekühlt und anschließend mit Ethylacetat versetzt, und die Substanzen, aufgelöst in Ethylacetat, wurden durch Dekantieren entfernt. Der Rückstand wurde für die nachfolgende Reaktion ohne weitere Reinigung verwendet.
(13-4) Synthese des Farbstoffs (D-25)
Der Farbstoff (D-25) wurde unter Verwendung der Verbindungen, synthetisiert in Synthesebeispiel (13-2) und Synthesebeispiel (13-3), als Ausgangsmaterialien, gemäß dem Verfahren, das in Synthesebeispiel (3-3) beschrieben ist, erhalten.
[Synthesebeispiel 14] Synthese des Farbstoffs (D-27)
(14-1) Synthese von 6-Brom-2-methylthiazolo[4,5-b]pyridin
Eine Menge von 25,2 g 2-Amino-3,5-dibrompyridin wurde in 500 ml Acetonitril suspendiert, mit 50 ml Essigsäureanhydrid versetzt und unter Erwärmen für 3 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Die Reaktionsmischung wurde abgekühlt und anschließend mit Wasser versetzt, und die abgeschiedenen Kristalle wurden durch Filtration gesammelt. Die Kristalle wurden getrocknet, anschließend in 300 ml Dioxan suspendiert und mit 6 g Natriumhydrid versetzt. Die Suspension wurde durch Erwärmen für 4 Stunden unter Rückfluss erhitzt, anschließend abgekühlt und mit 20 ml Ethanol versetzt. Das Lösemittel wurde verdampft und der Rückstand wurde durch Silikagel-Säulenchromatographie gereinigt, um die gewünschte Substanz zu erhalten.
(14-2) Synthese von 1-(4-(Dimethyl-(3-ethoxycarbonylpropyl)ammonio)butyl)-4-methylchinoliniumdibromid
Eine Menge von 1 g 4-Brombutyldimethyl-(3-ethoxycarbonylpropyl)ammoniumbromid und 2 g 4-Methylchinolin (Lepidin) wurde gemischt und es wurde ermöglicht, bei 130°C für 1 Stunde zu reagieren. Die Reaktionsmischung wurde abgekühlt, anschließend mit Ethylacetat versetzt und gerührt, und die Substanzen, aufgelöst in Ethylacetat, wurden durch Dekantieren entfernt. Der Rückstand wurde unter Verwendung von Sephadex LH-20 (Eluent: Methanol) gereinigt, um die gewünschte Substanz als Kristalle zu erhalten.
(14-3) Synthese von 4-(4-(N-Acetyl-N-phenylamino)-1,3-butadien-1-yl)-1-(4-dimethyl-(3-ethoxycarbonylpropyl)ammonio)butyl)-4-methylchinoliniumdibromid
Eine Menge von 0,5 g 1-(4-(Dimethyl-(3-ethoxycarbonylpropyl)ammonio)butyl)-4-methylchinoliniumdibromid, synthetisiert in Synthesebeispiel (14-2), wurde mit 2 g Malonaldehyddianilidhydrochlorid versetzt, mit 5 ml Essigsäureanhydrid gemischt, und es wurde ermöglicht, bei 110°C für 2 Stunden zu reagieren. Die Reaktionsmischung wurde abgekühlt und anschließend mit Ethylacetat versetzt, und die Komponenten, aufgelöst in Ethylacetat, wurden durch Dekantieren entfernt. Der Rückstand wurde für die folgende Reaktion ohne weitere Reinigung verwendet.
(14-3) Synthese des Farbstoffs (D-27)
Der Farbstoff (D-27) wurde unter Verwendung der Verbindungen, synthetisiert in Synthesebeispielen (14-1) und (14-3), als Ausgangsmaterialien, gemäß dem gleichen Verfahren, wie in Synthesebeispiel 3 beschrieben, synthetisiert.
[Synthesebeispiel 15] Synthese des Farbstoffs (D-35)
(15-1) Synthese von 5-Acetylamino-2-mercaptooxazolo[4,5-b]pyridin
(15-1-1-)Synthese von 5-Amino-3-benzyloxy-2-nitropyridin
Die Synthese wurde unter Bezugnahme auf das Verfahren, beschrieben in Journal of Organic Chemistry (J. Org. Chem.), Bd. 57, S. 4784, 1992, durchgeführt. Das heißt, die Synthese wurde durchgeführt, indem es einem Stickstoffanion von N,N-Tetramethylenthiocarbamoylsulfenamid ermöglicht wurde, mit 3-Benzyloxy-2-nitropyridin in Anwesenheit einer starken Base zu reagieren.
(15-1-2) Synthese von 5-Acetylamino-3-benzyloxy-2-nitropyridin
Eine Menge von 3 g 5-Amino-3-benzyloxy-2-nitropyridin (Synthesebeispiel 15-1-1) wurde in 30 ml Essigsäureanhydrid suspendiert, mit einer katalytischen Menge konzentrierter Schwefelsäure versetzt, und es wurde ermöglicht, dass bei 70°C für 1 Stunde reagiert wird. Nach der Vervollständigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung in Eiswasser gegossen und die abgeschiedenen Kristalle wurden durch Filtration gesammelt und getrocknet. Anschließend wurden die Kristalle durch Kurz-Silikagel-Säulenchromatographie gereinigt.
(15-1-3) Synthese von 2-Amino-5-acetylamino-3-hydroxypyridin
Eine Menge von 1 g 5-Acetylamino-3-benzyloxy-2-nitropyridin wurde mit 50 ml Methanol versetzt und einer Hydrierungsreaktion bei 50°C, unter Verwendung von 5% Palladium-aktiviertem Kohlenstoff als ein Katalysator, in einem Autoklaven unterzogen. Nachdem die Reaktionsmischung über Nacht stehen gelassen wurde, wurde der Katalysator durch Filtration abgetrennt, und das Lösemittel wurde unter vermindertem Druck verdampft. Das Produkt wurde für die folgende Reaktion ohne weitere Reinigung verwendet.
(15-1-4) Synthese von 5-Acetylamino-2-mercaptooxazolo[4,5-b]pyridin
Das Produkt von Synthesebeispiel (15-1-3) wurde mit 2 g Kaliumxanthat und mit 50 ml Ethanol versetzt und durch Erwärmen für 15 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Die Reaktionsmischung wurde abgekühlt, im Anschluß daran wurde das Lösemittel verdampft, und der Rückstand wurde mit Wasser versetzt, um den Feststoff aufzulösen. Anschließend wurde Essigsäure dazugegeben und Kristalle schieden sich ab. Die Kristalle wurden durch Filtration unter vermindertem Druck gesammelt, mit Wasser gewaschen und getrocknet, um die gewünschte Substanz zu erhalten.
(15-2) Synthese von 5-Acetylamino-2-methylthiooxazolo[4,5-b]pyridin
Die gewünschte Substanz wurde gemäß dem Verfahren von Synthesebeispiel (5-2) synthetisiert.
(15-3) Synthese des Farbstoffs (D-35)
Der Farbstoff (D-35) wurde unter Verwendung der Verbindungen, synthetisiert in den Synthesebeispielen (15-1-4) und (15-2), als Ausgangsmaterialien, gemäß dem Verfahren von Synthesebeispiel 1 erhalten.
[Synthesebeispiel 16] Synthese des Farbstoffs (D-37)
(16-1) Synthese von 5-Brom-2,3,3-trimethyl-3H-pyrrolo[2,3-b]pyridin
(16-1-1) Synthese von 5-Brom-2-hydrazinopyridin
Eine Menge von 125 g 2,5-Dibrompyridin, 350 ml Ethanol und 250 ml Hydrazinhydrat wurde gemischt und durch Erwärmen für 30 Minuten unter Rückfluss erhitzt. Das Ethanol wurde unter vermindertem Druck verdampft und der Rückstand wurde mit Wasser versetzt. Die abgeschiedenen Kristalle wurden durch Filtration gesammelt, mit Wasser gewaschen und getrocknet, um 77 g 5-Brom-2-hydrazinopyridin zu erhalten. Ausbeute: 77,6%.
(16-1-2) Synthese von 5-Brom-2,3,3-trimethyl-3H-pyrrolo[2,3-b]pyridin
Eine Menge von 76 g 5-Brom-2-hydrazinopyridin und 100 ml 3-Methyl-2-butanon wurde gemischt und es wurde ermöglicht, dass bei 100°C 30 Minuten reagiert wird. Nachdem der Überschuss 3-Methyl-2-butanon verdampft wurde, wurde der Rückstand mit 100 ml 1,4-Butandiol versetzt und für 5 Stunden unter Rückfluss erhitzt, indem auf 240°C erwärmt wurde.
Die Reaktionsmischung wurde abgekühlt und einer Silikagel-Säulenchromatographie ohne Behandlung unterzogen, und jede Fraktion wurde mittels NMR analysiert. Die Fraktionen, die die gewünschte Substanz enthielten, wurden gesammelt und das Lösemittel wurde verdampft. Der Rückstand wurde aus Hexan/Ethylacetat kristallisiert, um die gewünschte Substanz als hellbraune Kristalle zu erhalten. Ausbeute: 8,5 g, 8,8%.
(16-2) Synthese von 5-Phenyl-2,3,3-trimethyl-3H-pyrrolo[2,3-b]pyridin
Eine Menge von 0,5 g 5-Brom-2,3,3-trimethyl-3H-pyrrolo[2,3-b]pyridin, synthetisiert in Synthesebeispiel (16-1-2), 0,38 g Phenylboronsäure und 7 ml Dimethylformamid wurde gemischt und mit 0,072 g Tetrakis(triphenylphosphin)palladium und 0,9 g Kaliumcarbonat unter einem Stickstofffluss versetzt. Die Reaktionsmischung wurde gerührt und auf 100°C erwärmt, und es wurde für 4 Stunden eine Reaktion ermöglicht. Nach der Vervollständigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit Chloroform extrahiert, und das Konzentrat wurde durch Silikagel-Säulenchromatographie gereinigt. Es wurden Chloroform und Methanol als Eluenten verwendet, und die gewünschte Substanz wurde mit Chloroform/Methanol = 4/1 verdünnt. Die Fraktionen, die die gewünschte Substanz enthalten, wurden gesammelt und konzentriert, um die gewünschte Substanz als ein leicht-gelbes Öl zu erhalten. Ausbeute: 0,4 g, 91%.
(16-3) Synthese von 7-(2-Methoxyethoxymethyl)-5-phenyl-2,3,3-trimethyl-3H-pyrrolo[2,3-b]pyridiniumchlorid
Eine Menge von 0,2 g 5-Phenyl-2,3,3-trimethyl-3H-pyrrolo[2,3-b]pyridin, synthetisiert in Synthesebeispiel (16-2), und 1 g 2-Methoxyethoxymethylchlorid wurde gemischt und es wurde ermöglicht, dass bei 100°C für 1 Stunde reagiert wird. Die Reaktionsmischung wurde abgekühlt und anschließend mit Ethylacetat versetzt, und die Komponenten, die in Ethylacetat aufgelöst wurden, wurden durch Dekantieren entfernt. Nachdem dieses Verfahren dreimal wiederholt wurde, wurde der Rückstand für die folgende Reaktion ohne weitere Reinigung verwendet.
(16-4) Synthese von 6-Methoxy-4-methyl-1-(3-trimethylammoniopropyl)chinoliniumdibromid
Eine Menge von 3 g (3-Brompropyl)trimethylammoniumbromid (Aldrich Co.) und 5 g 6-Methoxy-4-methylchinolin (Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.) wurde gemischt und es wurde ermöglicht, bei 120°C für 3 Stunden zu reagieren. Die Reaktionsmischung wurde abgekühlt und dann mit Ethylacetat versetzt, und die Substanzen, die sich in dem Ethylacetat auflösten, wurden durch Dekantieren entfernt. Nachdem dieses Verfahren dreimal wiederholt wurde, wurde der Rückstand für die folgende Reaktion ohne weitere Reinigung verwendet.
(16-5) Synthese von 4-(2-(N-Acetyl-N-phenylamino)vinyl)-6-methoxy-1-(3-trimethylammoniopropyl)chinoliniumdibromid
Das Chinolinium, synthetisiert in (16-4) wurde mit 1,5 g 1,3-Diphenylformamidin versetzt, mit 5 ml Essigsäureanhydrid gemischt und es wurde ermöglicht, dass bei 120°C für 1 Stunde reagiert wird. Die Reaktionsmischung wurde abgekühlt, und anschließend mit Ethylacetat versetzt, und die Substanzen, aufgelöst in dem Ethylacetat, wurden durch Dekantieren entfernt. Nachdem dieses Verfahren zweimal wiederholt wurde, wurde der Rückstand für die folgende Reaktion ohne weitere Reinigung verwendet.
(16-6) Synthese von Farbstof (D-37)
Die Verbindung, synthetisiert in Synthesebeispiel (16-5), wurde mit 5 ml Dimethylformamid versetzt und mit 1 ml Essigsäureanhydrid versetzt. Ferner wurde die Mischung mit der Verbindung, synthetisiert in Synthesebeispiel (16-3), versetzt und in eine gleichförmige Lösung bei Raumtemperatur überführt. Die Lösung wurde mit 0,3 ml Triethylamin bei Raumtemperatur versetzt und ein Farbstoff wurde erzeugt. Der Farbstoff wurde durch Säulen-Chromatographie unter Verwendung von Sephadex LH-20 (Eluent: Methanol) gereinigt. Anschließend wurde eine Lösung des Farbstoffs in Methanol mit einer katalytischen Menge von Pyridinium-p-toluolsulfonsäuresalz versetzt und für 2 Tage bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Lösung wurde wieder durch Säulen-Chromatographie unter Verwendung von Sephadex LH-20 gereinigt, um den Farbstoff (D-37) zu erhalten.
[Synthesebeispiel 17] Synthese des Farbstoffs (D-38)
(17-1) Synthese von 2-Mercaptooxazolo[4,5-c]isochinolin
(17-1-1) Synthese von 4-Hydroxy-3-nitroisochinolin
Eine Menge von 10 g 4-Hydroxyisochinolin wurde in 80 g konzentrierter Schwefelsäure aufgelöst und bei 2°C gerührt. Die Lösung wurde langsam tropfenweise mit 2,7 ml rauchender Salpetersäure versetzt, während die Lösung bei 10°C oder darunter gehalten wurde. Die Lösung wurde stehen gelassen, um eine Reaktion bei Raumtemperatur für 2 Stunden zu ermöglichen und anschließend in 1 kg Eiswasser gegossen, und die abgeschiedenen Kristalle wurden durch Filtration gesammelt.
(17-1-2) Synthese von 2-Mercaptooxazolo[4,5-c]isochinolin
Eine Menge von 4 g 4-Hydroxy-3-nitroisochinolin wurde mit Ethylacetat und Wasser versetzt, ferner mit einer Überschussmenge Natriumhydrosulfit versetzt und durch Erwärmen für 2 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Die organische Phase wurde abgetrennt und mit Wasser gewaschen, und anschließend wurde das Lösemittel verdampft. Der Rückstand wurde mit Ethanol und 8 g Kaliumxanthat versetzt, und durch Erwärmen für 5 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Nachdem die Reaktionsmischung abgekühlt wurde, wurde das Ethanol verdampft. Der Rückstand wurde in 20 ml Wasser aufgelöst und portionsweise mit Essigsäure versetzt, und Kristalle schieden sich ab. Die Kristalle wurden durch Filtration gesammelt, mit Wasser gewaschen und getrocknet, um die gewünschte Substanz zu erhalten.
(17-2) Synthese von 2-Methylthiooxazolo[4,5-c]isochinolin
Eine Menge von 2 g des Ausgangsmaterials Thiol wurde mit 15 ml Dimethylformamid versetzt mit 2 ml Triethylamin versetzt, um das Ausgangsmaterial aufzulösen. Anschließend wurde die Lösung mit 1,5 ml Methyliodid versetzt, und es wurde eine Reaktion bei Raumtemperatur für 1 Stunde ermöglicht. Die Reaktionsmischung wurde mit 50 ml Wasser versetzt, und Kristalle schieden sich ab. Die Kristalle wurden durch Filtration gesammelt, mit Wasser gewaschen und getrocknet, um die gewünschte Substanz zu erhalten.
(17-3) Synthese des Farbstoffs (D-38)
Der Farbstoff (D-38) wurde unter Verwendung der Verbindungen, die in dem Synthesebeispiel (17-2) und dem Synthesebeispiel (14-3) synthetisiert worden waren, als Ausgangsmaterialien, gemäß dem Verfahren, beschrieben in Synthesebeispiel 3, synthetisiert.
[Testbeispiel 1] Detektion der vielsträngigen Nukleinsäure in einem Lösungssystem
(Herstellung der Proben-Nukleinsäure-Lösung)
Fibröses Desoxyribonukleinsäurenatriumsalz, abgeleitet von Salmon testis (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) als eine doppelsträngige Nukleinsäure wurde in einem Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 6,5 aufgelöst, um eine 100 μg/ml-wässerige Lösung der Nukleinsäure herzustellen. Die Lösung wurde ferner auf 100°C für 30 Minuten erwärmt und schnell mit Eiswasser abgekühlt, um eine wässerige Lösung einer einsträngigen Desoxyribonukleinsäure herzustellen.
(Herstellung von Lösungen von Verbindungen für die Detektion)
Jede der Verbindungen der vorliegenden Erfindung, die in Tabelle 1 gezeigt ist, wurde in einem Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 6,5 aufgelöst, derart, dass die Lösung eine Absorbanz von 1,0 bis 320 nm aufweist, um eine Lösung zu erhalten. Zum Vergleich wurde PicoGreen (Molecular Probes, Inc.) in dem Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 6,5 aufgelöst, um eine Lösung mit einer optischen Dichte von 0,5 in dem sichtbaren Bereich herzustellen.
(Messung der Fluoreszenz-Intensität)

Es wurde eine Lösung hergestellt, indem die doppelsträngige Nukleinsäure- oder die einzelsträngige Nukleinsäure-Lösung, die Lösung der Verbindung für die Detektion, und ein Verdünnungspuffer in einem Volumenverhältnis von 1:1:8 gemischt wurde, und die Fluoreszenz-Intensität der Lösung wurde unter Verwendung eines Fluorometers gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben. Als Fluoreszenz-Intensität wurde das Fluoreszenz-Anregungsspektrum für jede Probe gemessen, und die Fluoreszenz-Intensität, die durch Anregung bei einer Wellenlänge, die eine maximale Intensität ergab, erhalten wurde, wurde in der Tabelle angezeigt. Aus diesen Ergebnissen kann verstanden werden, dass die Bereiche der Anregungs- und Fluoreszenz-Emissionswellenlängen in den Verbindungen der vorliegenden Erfindung verbreitert werden können und die Eignung für einen weiten Bereich an Lichtquellen wurde bestätigt. Ferner wurde auch festgestellt, dass die Verbindungen der vorliegenden Erfindung eine starke Fluoreszenz-Intensität aufwies und auch bei der Selektivität für eine doppelsträngige Nukleinsäure herausragend waren. Tabelle 1

Verbindung für Die Detektion	Anregung/Emission (nm)	Fluoreszenz-Intensität für eine doppelsträngige Nukleinsäure	Fluoreszenz-Intensität für eine einzelsträngige Nukleinsäure
D-2 (Erfindung)	529/543	12	4
D-6 (Erfindung)	556/570	2	0,5
D-14 (Erfindung)	528/543	14	5
D-15 (Erfindung)	528/543	12	5
D-16 (Erfindung)	558/572	6	2
D-19 (Erfindung)	557/570	24	10
D-41 (Erfindung)	560/575	27	11
PicoGreen (Vergleich)	501/523	23	9

Fluorometer: RF-5300PC (Shimadzu),
Bandbreite: 3,
Sensibilität: gering

[Testbeispiel 2] Detektion der vielsträngigen Nukleinsäure in einem Lösungssystem
(Herstellung der Proben-Nukleinsäure-Lösung)
Fibröses Desoxyribonukleinsäurenatriumsalz, abgeleitet von Salmon testis (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) als eine doppelsträngige Nukleinsäure wurde in einem 20 mM Citrat-Dinatriumphosphat-Puffer bei einem pH-Wert von 6,0 aufgelöst, um eine 100 μg/ml-wässerige Lösung der Nukleinsäure herzustellen. Die Lösung wurde ferner auf 100°C für 30 Minuten erwärmt und schnell mit Eiswasser abgekühlt, um eine wässerige Lösung von einsträngiger Desoxyribonukleinsäure herzustellen.
(Herstellung von Lösungen von Verbindungen für die Detektion)
Jede der Verbindungen der vorliegenden Erfindung, die in Tabelle 2 gezeigt ist, wurde in einem 20 mM Citrat/Dinatriumphosphat-Puffer bei einem pH-Wert von 4,0 aufgelöst, um eine 5 × 10^–5 Mol/l-Lösung zu erhalten. Die Lösung war im wesentlichen farblos und für alle Verbindungen nicht fluoreszent. Zum Vergleich wurde PicoGreen (Molecular Probes, Inc.) in dem 20 mM Citrat/Dinatriumphosphat-Puffer bei einem pH-Wert von 4,0 aufgelöst, um eine Lösung mit einer optischen Dichte von 0,5 in dem sichtbaren Bereich herzustellen.
(Messung der Fluoreszenz-Intensität)

Es wurde eine Lösung hergestellt, indem eine Proben-Nukleinsäurelösung, eine Lösung der Verbindung für die Detektion und ein Verdünnungspuffer in einem Volumen in einem Verhältnis von 1:1:8 gemischt wurde, und die Fluoreszenz-Intensität der Lösung wurde unter Verwendung eines Fluorometers gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Als Fluoreszenz-Intensität wurde das Fluoreszenz-Anregungsspektrum für jede Probe gemessen, und die Fluoreszenz-Intensität, die durch Anregung bei einer Wellenlänge, die eine maximale Intensität ergab, erhalten wurde, wurde in der Tabelle angegeben. Tabelle 2

Verbindung für die Detektion	PH-Wert des Puffers	Fluoreszenz-Intensität für eine doppelsträngige Nukleinsäure (Absorbanz)	Fluoreszenz-Intensität für eine einzelsträngige Nukleinsäure (Absorbanz)
D-2 (Erfindung)	4,0	280 (0,01)	60 (0,00)
D-19 (Erfindung)	4,0	466 (0,01)	31 (0,00)
D-43 (Erfindung)	4,0	385 (0,01)	24 (0,00)
PicoGreen (Vergleich)	4,0	434 (0,04)	193 (0,05)

Fluorometer: RF-5300PC (Shimadzu),
Bandbreite: 3,
Sensibilität: hoch

Aus den Ergebnissen, die in Tabelle 2 angegeben sind, kann verstanden werden, dass, wenn eine doppelsträngige Nukleinsäure vorliegt, eine hohe Fluoreszenz-Effektivität (Fluoreszenz-Intensität/Absorbanz) in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wurde. Ferner erhöhte sich die Fluoreszenz-Intensität in Anwesenheit der doppelsträngigen Nukleinsäure im Vergleich zu der einzelsträngigen Nukleinsäure beträchtlich, was aufzeigte, dass das Verfahren der vorliegenden Erfindung ein extrem verbessertes Verfahren zur Detektion einer doppelsträngigen Nukleinsäure ist.
[Beispiel 3] Detektion einer vielsträngigen Nukleinsäure auf einem Feststoffphasenträger
(1) Herstellung eines DNA-Fragment-immobilisierten Träger
Trägerglas (25 mm × 75 mm) wurde in einer 2 gew.-%igen Lösung aus Aminopropylethoxysilan (Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) in Ethanol für 10 Minuten eingetaucht, aus der Lösung herausgenommen, mit Ethanol gewaschen und bei 110°C für 10 Minuten getrocknet, um einen mit einer Silanverbindung beschichteten Träger (A) herzustellen. Anschließend wurde der mit einer Silanverbindung beschichtete Träger (A) in eine 3 Massen-%-ige Lösung der Verbindung VS-1 für 10 Minuten eingetaucht, aus der Lösung herausgenommen, mit Ethanol gewaschen und bei 120°C für 15 Minuten getrocknet, um einen VS-1-beschichteten Träger (B) herzustellen.
(2) Spotting der DNA-Fragmente und Messung der Fluoreszenz-Intensität
Eine wässerige Flüssigkeit, die ein DNA-Fragment enthält, dessen 3'-Ende mit einer Aminogruppe (U-1: SEQ ID NO: 1) modifiziert wurde, und ein Komplementärstrang des DNA-Fragments, dessen 3'-Ende gleichermaßen mit einer Aminogruppe (U-2) modifiziert wurde, eingetaucht in 0,1 M Carbonatpuffer (pH-Wert: 9,8, 1 × 10^–5 M), wurde hergestellt und auf den Träger (B), der gemäß dem oben angegebenen Punkt (1) erhalten wurde, gespottet. Unmittelbar nach dem Spotten wurde der Träger über Nacht bei 60°C und einer Feuchtigkeit von 90% stehen gelassen. Dieser Träger wurde anschließend zweimal mit einer gemischten Lösung aus 0,1 Massen-% SDS (Natriumdodecylsulfat) und 2 × SSC (2 × SSC: eine Lösung, erhalten durch Verdünnung einer Vorratslösung von SSC 2-fach, SSC: Standard-Salinecitratpuffer) und einmal mit einer 0,2 × SSC-wässerigen Lösung gewaschen. Anschließend wurde der Träger nach dem zuvor genannten Waschschritt in eine wässerige 0,1 M-Glycinlösung (pH-Wert 10) für 1 Stunde und 30 Minuten eingetaucht, mit destilliertem Wasser gewaschen und bei Raumtemperatur getrocknet, um einen Träger (C) zu erhalten, auf dem die DNA-Fragmente immobilisiert wurden.
Eine 60-mer DNA (U-3) mit einer Sequenz, die zu der zuvor angegebenen DNA-Sequenz (U-1) komplementär ist, wurde in einer Hybridisierungslösung (gemischte Lösung aus 4 × SSC und 10 Massen-% SDS, 20 μl) dispergiert und auf den Träger (C), der oben erhalten wurde, aufgetragen. Nachdem die Oberfläche des Trägers (C) mit Abdeckglas für die Mikroskopie geschützt wurde, wurde der Träger in einer Feuchtigkeitskammer bei 60°C für 10 Stunden inkubiert. Anschließend wurde dieser Träger mit einer gemischten Lösung aus 0,1 Massen-% SDS und 2 × SSC für 10 Sekunden gewaschen, bei 600 U/min für 20 Sekunden zentrifugiert und bei Raumtemperatur getrocknet, um den Träger (D) zu erhalten. Ferner wurde zum Vergleich eine Probe auf die gleiche Weise unter Verwendung einer 60-merDNA mit der gleichen Sequenz wie (U-3) hergestellt, deren 5'-Ende mit Cy3 gelabelt wurde, um den Träger (E) zu erhalten. Die Fluoreszenz-Intensität von jedem Trägerglas wurde mit einer Fluoreszenz-Scanningvorrichtung gemessen. Die Anregung wurde bei einer Wellenlänge von 532 nm erhalten, und die Detektion wurde unter Verwendung eines Bandpassfilters, der den maximalen Durchgang bei 570 nm zeigt, durchgeführt. Tabelle 3

Probe Fluoreszenz-Intensität des U-1-Spots Fluoreszenz-Intensität des U-2-Spots

Träger (D) 244 222

Träger (E) (Cy3-gelabelt) 23080 210

Die gleiche Probe wie Träger (D) wurde hergestellt, und 40 μl einer 2 × 10^–5 Mol/l-Lösung von jeder Verbindung in 20 mM Citrat/Dinatriumphosphat-Puffer bei einem pH-Wert von 5 wurden auf den Träger (D) durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung verteilt. Die Lösung war im wesentlichen farblos und für alle Verbindungen nicht fluoreszent. Nachdem die Oberfläche des Trägers mit Abdeckglas für die Mikroskopie geschützt wurde, wurde die Fluoreszenz-Intensität durch eine Fluoreszenz-Scanningvorrichtung auf die gleiche Weise wie oben beschrieben gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 angegeben. Aus diesen Ergebnissen ist es klar verständlich, dass gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung eine vielsträngige Nukleinsäure ohne Labeln detektiert werden kann. Tabelle 4

Probe	Fluoreszenz-Intensität des U-1-Spots	Fluoreszenz-Intensität des U-2-Spots
D-2	12550	2655
D-6	3090	339
D-14	14113	1888
D-16	9076	370
D-19	27310	395
D-30	22503	535
D-34	26822	312

Das gleiche Experiment wurde unter Verwendung jeweils der Nukleinsäure von SEQ ID NO: 2 (80-mer), der Nukleinsäure von SEQ ID NO: 3 (80-mer) und der Nukleinsäure von SEQ ID NO: 4 (100-mer) durchgeführt. Als ein Ergebnis wurden im wesentlichen die gleichen Ergebnisse wie solche, die oben erwähnt wurden, zufriedenstellend erhalten, und somit wurde bestätigt, dass eine vielsträngige Nukleinsäure ohne Labeln detektierbar ist.
[Beispiel 4] Detektion eines DNA/RNA-Hybrids
Das gleiche Experiment wie in Beispiel 3 wurde durchgeführt, mit der Ausnahme, dass 40-mer Oligodesoxy-A auf der Gleitglasoberfläche anstatt der 60-mer-DNA immobilisiert wurde, und Oligo-U als Komplementärsequenz verwendet wurde. Als ein Ergebnis wurden Spots, bei denen die Hybridisierung auftrat, detektiert, und somit wurde bestätigt, dass auch RNA ohne Labeln detektierbar ist.
Sequenzprotokoll

Claims

Verfahren zur optischen Messung einer vielsträngigen Nukleinsäure, umfassend das Kontaktieren einer Verbindung mit einer vielsträngigen Nukleinsäure, worin die Verbindung in der Lage ist, mit der vielsträngigen Nukleinsäure zu interagieren, worin die Verbindung die folgenden Eigenschaften aufweist: (a) die Verbindung kann in einem im wesentlichen farblosen und nicht-fluoreszierenden Zustand unter zumindest einer Bedingung in einer wäßrigen Lösung in Abwesenheit der vielsträngigen Nukleinsäure existieren und (b) wenn die vielsträngige Nukleinsäure in dem Zustand existieren kann, wie oben unter (a) definiert, ändert sich die Verbindung in einen im wesentlichen gefärbten Zustand, basierend auf der Wechselwirkung mit der vielsträngigen Nukleinsäure, und entwickelt im wesentlichen eine Fluoreszenzeigenschaft auf der Basis der Interaktion, worin die Verbindung, die mit der vielsträngigen Nukleinsäure interagieren kann, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Verbindungen mit der folgenden Formel (V):
worin R¹, R² und R³ jeweils unabhängig ein Wasserstoffatom oder einen Substituenten bedeuten, ausgewählt aus einem Halogenatom, einer Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-, Amino-, Hydroxyl-, Alkoxyl-, Aryloxy-, Alkylthio-, Arylthio-, Acylamino-, Sulfonylamino-, heterocyclischen, Cyano-, Sulfonyl-, Sulfinyl-, Nitro-, Sulfo-, Carboxyl-, Alkoxycarbonyl-, Aryloxycarbonyl-, Carbamoyl- und Sulfamoylgruppe, worin diese Substituenten weiterhin so substituiert sein können, daß die gesamte Atomzahl von 1 bis 50 ist, und R¹ und R² und R² und R³ aneinander binden können unter Bildung eines Rings; Q ein Sauerstoffatom, Schwefelatom, -N(R²⁴)- oder -C(R²⁴)(R²⁵)- ist (R²⁴ und R²⁵ bedeuten jeweils unabhängig eine Alkylgruppe, Arylgruppe oder heterocyclische Gruppe und R²⁴ und R²⁵ können aneinander zur Bildung eines 3- bis 8-gliedrigen Rings binden), n eine ganze Zahl von 0, 1, 2 oder 3 ist, R⁶ eine Alkylgruppe, Arylgruppe oder heterocyclische Gruppe ist, und diese Substituenten weiterhin so substituiert sein können, daß die gesamte Atomzahl von 4 bis 50 ist, und an R¹⁵ oder R¹⁷ zur Bildung eines Rings binden können; R¹⁴, R¹⁵, R¹⁶ und R¹⁷ jeweils Wasserstoffatom oder ein Substituent sind, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Halogenatom, einer Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-, Amino-, Hydroxyl-, Alkoxyl-, Aryloxy-, Alkylthio-, Arylthio-, Acylamino-, Sulfonylamino-, heterocyclischen, Cyano-, Sulfonyl-, Sulfinyl-, Nitro-, Sulfo-, Carboxyl-, Alkoxycarbonyl-, Aryloxycarbonyl-, Carbamoyl-, Sulfamoyl-, Acyl- und Mercaptogruppe, und R¹⁴ und R¹⁵ und R¹⁶ und R¹⁷ aneinander zur Bildung eines 5- bis 8-gliedrigen Rings binden können, und worin die Substituenten R¹⁴, R¹⁵, R¹⁶ und R¹⁷ weiterhin substituiert sein können und die Atomzahl von R¹⁴, R¹⁵, R¹⁶ und R¹⁷ jeweils von 1 bis 50 ist.
Verfahren zur optischen Messung der vielsträngigen Nukleinsäure, umfassend das Kontaktieren einer Verbindung mit einer vielsträngigen Nukleinsäure, worin die Verbindung mit der vielsträngigen Nukleinsäure interagieren kann, worin die Verbindung die folgenden Eigenschaften aufweist: (c) die Verbindung ist in einem nicht-protonierten Zustand und im wesentlichen nicht-fluoreszent in einer wäßrigen Lösung in der Abwesenheit der vielsträngigen Nukleinsäure, (d) die Verbindung kann in einem im wesentlichen farblosen und im wesentlichen nicht-fluoreszenten Zustand in einem protonierten Zustand in einer wäßrigen Lösung unter zumindest einer Bedingung in der Abwesenheit der vielsträngigen Nukleinsäure existieren, und (e) wenn die vielsträngige Nukleinsäure in dem Zustand existieren kann, der oben unter (d) definiert ist, ändert sich die Verbindung in einen im wesentlichen gefärbten Zustand auf der Basis einer Interaktion mit der vielsträngigen Nukleinsäure und entfaltet im wesentlichen eine Fluoreszenzeigenschaft auf der Basis der Interaktion, worin die Verbindung, die mit der vielsträngigen Nukleinsäure interagieren kann, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Verbindungen mit der folgenden Formel (V):
worin R¹, R² und R³ jeweils unabhängig ein Wasserstoffatom oder einen Substituenten bedeuten, ausgewählt aus einem Halogenatom, einer Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-, Amino-, Hydroxyl-, Alkoxyl-, Aryloxy-, Alkylthio-, Arylthio-, Acylamino-, Sulfonylamino-, heterocyclischen, Cyano-, Sulfonyl-, Sulfinyl-, Nitro-, Sulfo-, Carboxyl-, Alkoxycarbonyl-, Aryloxycarbonyl-, Carbamoyl- und Sulfamoylgruppe, worin diese Substituenten weiterhin so substituiert sein können, daß die gesamte Atomzahl von 1 bis 50 ist, und R¹ und R² und R² und R³ aneinander binden können unter Bildung eines Rings; Q ein Sauerstoffatom, Schwefelatom, -N(R²⁴)- oder -C(R²⁴)(R²⁵)- ist (R²⁴ und R²⁵ bedeuten jeweils unabhängig eine Alkylgruppe, Arylgruppe oder heterocyclische Gruppe und R²⁴ und R²⁵ können aneinander zur Bildung eines 3- bis 8-gliedrigen Rings binden), n eine ganze Zahl von 0, 1, 2 oder 3 ist, R⁶ eine Alkylgruppe, Arylgruppe oder heterocyclische Gruppe ist, und diese Substituenten weiterhin so substituiert sein können, daß die gesamte Atomzahl von 4 bis 50 ist, und an R¹⁵ oder R¹⁷ zur Bildung eines Rings binden können; R¹⁴, R¹⁵, R¹⁶ und R¹⁷ jeweils Wasserstoffatom oder ein Substituent sind, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Halogenatom, einer Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-, Amino-, Hydroxyl-, Alkoxyl-, Aryloxy-, Alkylthio-, Arylthio-, Acylamino-, Sulfonylamino-, heterocyclischen, Cyano-, Sulfonyl-, Sulfinyl-, Nitro-, Sulfo-, Carboxyl-, Alkoxycarbonyl-, Aryloxycarbonyl-, Carbamoyl-, Sulfamoyl-, Acyl- und Mercaptogruppe, und R¹⁴ und R¹⁵ und R¹⁶ und R¹⁷ aneinander zur Bildung eines 5- bis 8-gliedrigen Rings binden können, und worin die Substituenten R¹⁴, R¹⁵, R¹⁶ und R¹⁷ weiterhin substituiert sein können und die Atomzahl von R¹⁴, R¹⁵, R¹⁶ und R¹⁷ jeweils von 1 bis 50 ist.
Verfahren zur optischen Messung einer vielsträngigen Nukleinsäure, umfassend: (1) den Schritt des Kontaktierens der Verbindung (B) mit der folgenden allgemeinen Formel mit einer vielsträngigen Nukleinsäure und (2) den Schritt der Messung der Fluoreszenz der Verbindung (C), erzeugt durch Interaktion der Verbindung (B) und der vielsträngigen Nukleinsäure:
worin die jeweils zwei Pfeile das chemische Gleichgewicht darstellen; die Verbindung (A) eine im wesentlichen nicht-fluoreszente Verbindung bedeutet, die Verbindung (B) eine im wesentlichen nicht-fluoreszente Verbindung bedeutet, die kein Absorptionsmaximum im Bereich von 400 bis 1.000 nm unter zumindest einer Bedingung aufweist, die Verbindung (C) eine Verbindung ist, die durch eine Interaktion der Verbindung (B) und der vielsträngigen Nukleinsäure unter der oben erwähnten Bedingung erzeugt ist und ein Absorptionsmaximum im Bereich von 400 bis 1.000 nm aufweist und im wesentlichen eine fluoreszente Eigenschaft auf der Basis der Wechselwirkung entfaltet; X eine Gruppe von Atomen ist, die erforderlich ist zur Bildung eines Farbstoffmoleküls durch Bindung an -C(R)=Y, wobei Y eine Gruppe von Atomen bedeutet, die erforderlich ist zur Bildung eines Farbstoffmoleküls durch Bindung an X-C(R)=; R ein Wasserstoffatom oder ein Substituent ist und an X und/oder Y zur Bildung eines Rings binden kann; Y' ein Rest ist, der als Ergebnis des Auftretens eines Elektronentransfers verbleibt, so daß die Doppelbindung von C=Y in der Verbindung (A) protoniert ist; und Z eine Konjugatbase der Säure HZ ist und an X, Y (oder Y') oder R binden kann, worin die Verbindung (A) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Verbindungen mit der Formel (V) nach Anspruch 1.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend das Ermöglichen der Interaktion mit der vielsträngigen Nukleinsäure in einem Lösungszustand.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend den Schritt der Ermöglichung der Interaktion mit der vielsträngigen Nukleinsäure, die auf einem Festphasenträger immobilisiert ist.
Verbindung mit der Formel (V) nach Anspruch 1 oder ein Säureadditionssalz oder ein Basenadditionssalz davon.
Verbindung nach Anspruch 6, worin Q Sauerstoff- oder Schwefelatom ist.