JP2001289848A - 蛍光インターカレータおよび相補性核酸断片の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 相補性を有する二本鎖核酸断片あるいは部分
相補性を有する二本鎖核酸断片等の検出において、特に
有効に用いることが可能な新規な水溶性インターカレー
タ蛍光インターカレータ、及び核酸断片の検出方法を提
供すること。 【解決手段】 下記式で表わされる水溶性の蛍光インタ
ーカレータを用いる。 Ｆ − Ｌａ − Ｘ ［Ｆは蛍光性基、Ｘは環状基、そしてＬａは連結基であ
って、少なくともＸとＬａのいずれかは、該インターカ
レータに、水溶性を付与できるか、あるいは水溶性を付
与できる基に変換し得る部位を有する］。Ｘには、−Ｌ
ｂ−Ｚ［Ｚは非蛍光性基、そしてＬｂは連結基である］
で表わされる置換基が結合していることが好ましい。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、試料中の核酸断片
などのオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドを
ＤＮＡチップと蛍光インターカレータとを用いて蛍光法
により検出する方法に関する。本発明はまた、該蛍光法
を用いる検出方法に有利に使用できる蛍光インターカレ
ータにも関する。

【０００２】

【従来の技術】生物学、医学分野での遺伝子解析におい
ては、特定の配列を有する核酸断片を検出する方法とし
て、ハイブリダイゼーション法が用いられている。この
中でも特に、目的とする遺伝子を特異的に検出すること
ができる方法として、サザンハイブリダイゼーション法
（サザンブロッティング法）が、一般的に有用されてい
る。サザンハイブリダイゼーション法では、まず試料Ｄ
ＮＡを一種類以上の制限酵素でフラグメントとし、アガ
ロースゲル電気泳動あるいはポリアクリルアミドゲル電
気泳動にかけてその分子量サイズによって分画ごとに分
離する。次に、分離した試料ＤＮＡ断片を一本鎖に変性
した後、ナイロン・フィルターもしくはニトロセルロー
ス・ペーパーに固定化する。そして、その試料ＤＮＡ断
片と、この試料ＤＮＡ断片に相補性を有する放射性同位
元素で標識された一本鎖ＤＮＡ断片とをハイブリダイズ
させた後、洗浄後のフィルターをオートラジオグラフィ
ーにかけ現像することによって、相補性ＤＮＡとハイブ
リダイズする特定の塩基配列を有する試料ＤＮＡ断片を
検出することができる。

【０００３】しかし、上記のサザンハイブリダイゼーシ
ョン法を含めた放射性同位元素を用いる方法は、標識と
して放射性同位元素を用いるため、検出に長時間を要
し、明確なバンドを得難いばかりでなく、放射性物質取
り扱いやコストの点において実用上の問題がある。

【０００４】サザンハイブリダイゼーション法では、放
射性同位元素による標識の代わりに蛍光による標識法も
知られている。蛍光を用いる検出方法は、安全性、迅速
さ、及び感度の点で現在のところ最も優れた方法であ
る。例えば、ＤＮＡマイクロアレイ上に固定されている
ＤＮＡ断片と、蛍光物質で標識した試料ＤＮＡ断片をハ
イブリダイズさせて、試料ＤＮＡ断片を検出するＤＮＡ
マイクロアレイ技術は既に有用されている（蛋白質・核
酸・酵素,Vol.,43,No.13,2004-2011(1998)）。蛍光物質
としては、シアニン色素であるＣｙ３（登録商標）やＣ
ｙ５（登録商標）を使用することができるが、これらは
高価であるばかりでなく、試料ＤＮＡ断片への取り込み
率が１％程度と低いため、試料ＤＮＡ断片の充分な標識
ができないという問題点を有する。

【０００５】一方、特開平９−２８８０８０号公報に
は、出力端子を備えた電極に、試料ＤＮＡ断片および電
気化学活性縫い込み型インターカレータを接触させ、電
極上に固定されているＤＮＡ断片と試料ＤＮＡ断片とで
形成されるハイブリッドＤＮＡに結合（「結合」とは、
一定の速度で、当該インターカレータのハイブリッドＤ
ＮＡの塩基対間への挿入、および塩基対間からの離脱が
繰り返されている状態をいう。）した当該インターカレ
ータと電極との間を流れる電流量を測定することによっ
て、試料ＤＮＡ断片を検出する方法が開示されている。
この方法では、標識した試料ＤＮＡ断片を調製する必要
がない。特開平９−２８８０８０号公報に開示された電
気化学活性縫い込み型インターカレータは、ナフタレン
ジイミド基の両端部に、酸化還元活性を持つフェロセン
分子が結合した構造を有し、二つの塩基対間に一個の割
合で、ナフタレンジイミド部分が二本鎖ＤＮＡ断片に結
合するため、非塩基対部分の認識も可能である。上記の
電気化学的検出法は、電極表面の処理やハイブリダイゼ
ーションの条件を改良することによって、現在では蛍光
法とほぼ同程度の感度を達成できるようになっている。

【０００６】前述したように、蛍光法は高い感度を有す
る点で非常に有用な方法である。そこで、上記の縫い込
み型インターカレータによる検出方法と同様の原理で、
蛍光性の縫い込み型インターカレータが利用できれば、
その有用性は非常に高いと考えられ、開発が行なわれて
いる。

【０００７】これまで、蛍光インターカレータとして
は、アクリジン色素が知られている。しかし、このアク
リジン色素は二本鎖ＤＮＡ断片からの脱離反応が速いと
いう問題点を有する。一方、蛍光インターカレータとし
て、両端部にアクリジン色素が結合した下記式で表され
る、Ｎ，Ｎ−ビス｛３−［４−（３−（６−クロロ−９
−イミノ−２−メトキシアクリジニル）プロピル）−
１，４−ジアザシクロヘキシル］プロピル｝ナフタレン
ジイミドも知られている（Bull.Chem.Soc.Jpn.,72,327-
337 (1999)）。

【０００８】

【化２】

【０００９】上記記載のインターカレータを用いると、
ナフタレンジイミド部分がハイブリッド複合体の塩基対
間に結合し、さらに、両端部の二つのアクリジン分子も
それぞれ塩基対間に結合する様式で二本鎖ＤＮＡ断片と
の複合体を形成するため、高い感度での二本鎖ＤＮＡ断
片の検出が可能であると考えられる。

【００１０】しかしながら、本発明者の検討によると、
水溶液中でのハイブリッド複合体への挿入と脱離とは平
衡関係にあるため、上記の蛍光インターカレータもま
た、蛍光法による測定対象の水溶液中において相当割合
にて脱離状態で存在し、この脱離状態の蛍光インターカ
レータもまた強い蛍光を示すため、充分なＳ／Ｎ比が達
成できないこと（即ち、溶液中の蛍光インターカレータ
から発せられる蛍光の強度に体する蛍光インターカレー
タが挿入されたハイブリッド複合体部分から発せられる
蛍光の強度の相違が充分高くないこと）が判明した。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、相補性を有
する二本鎖核酸断片あるいは部分相補性を有する二本鎖
核酸断片等の検出において、特に有効に用いることが可
能な新規な水溶性型蛍光インターカレータ、および相補
性を有する核酸断片の検出方法を提供することを、その
課題とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明は、下記一般式
（Ｉ）で表わされる水溶性の蛍光インターカレータにあ
る：

【化３】Ｆ − Ｌａ − Ｘ −−−（Ｉ） ［但し、Ｆは蛍光性基、Ｘは環状基、そしてＬａは連結
基であって、少なくともＸとＬａのいずれかは、該イン
ターカレータに、水溶性を付与できるか、あるいは水溶
性を付与できる基に変換し得る部位を有する］。本発明
の蛍光インターカレータは、その水溶性塩の状態にあっ
てもよい。

【００１３】一般式（Ｉ）において、Ｘには、−Ｌｂ−
Ｚ［但し、Ｚは非蛍光性基、そしてＬｂは連結基であ
る］で表わされる置換基が結合していることが好まし
い。すなわち、下記の一般式（Ｉａ）で現われる蛍光イ
ンターカレータが好ましい。 Ｆ−Ｌａ−Ｘ−Ｌｂ−Ｚ −−−（Ｉａ）

【００１４】本発明はまた、基板に固定されたヌクレオ
チド誘導体もしくはその類縁体からなる一群のプローブ
分子に相補性を示すオリゴヌクレオチド試料あるいはポ
リヌクレオチド試料を蛍光法で検出するための下記の工
程からなる方法：上記プローブ分子に、請求項１に記載
の蛍光インターカレータそして水の存在下にて、相補性
のオリゴヌクレオチド試料あるいはポリヌクレオチド試
料を接触させることにより、プローブ分子と相補性のオ
リゴヌクレオチド試料あるいはポリヌクレオチド試料と
をハイブリダイズさせて、上記蛍光インターカレータの
少なくとも一部分が挿入されたハイブリッド構造体を形
成させる工程、そして基板上のハイブリッド構造体に挿
入された蛍光インターカレータから発せられる蛍光を検
出する工程にもある。

【００１５】さらに、本発明は、基板に固定されたヌク
レオチド誘導体もしくはその類縁体からなる一群のプロ
ーブ分子に相補性を示すオリゴヌクレオチド試料あるい
はポリヌクレオチド試料を蛍光法で検出するための下記
の工程からなる方法：上記プローブ分子に、水の存在下
で、相補性のオリゴヌクレオチド試料あるいはポリヌク
レオチド試料を接触させることにより、プローブ分子と
相補性のオリゴヌクレオチド試料あるいはポリヌクレオ
チド試料とをハイブリダイズさせて、基板上にハイブリ
ッド構造体を形成させる工程、請求項１に記載の蛍光イ
ンターカレータを水の存在下にて上記ハイブリッド構造
体と接触させて、該蛍光インターカレータの少なくとも
一部分が挿入されたハイブリッド構造体を形成させる工
程、そして基板上のハイブリッド構造体に挿入された蛍
光インターカレータから発せられる蛍光を検出する工程
にもある。

【００１６】本発明の水溶性蛍光インターカレータの好
ましい態様は以下の通りである。 （１）Ｘが、縮合環を有する芳香族基である。 （２）Ｘが、ナフタレンジイミド基、アントラキノン
基、もしくはアントラセン基である。 （３）Ｆが、芳香族基を含む蛍光性基である。 （４）Ｆが、アクリジン基、インドシアニン基、もしく
はアザインドレニンシアニン基である。 （５）Ｚが、芳香族基を含まない非蛍光性基である。 （６）Ｚが、酸素原子、窒素原子及び／又は硫黄原子を
含む非蛍光性基である。 （７）Ｚが、アミノ基、カルボン酸基、スルホン酸基、
スルフィン酸基、スルフェン酸基、ヒドラジノ基、カル
バモイル基、水酸基、イミノ基、もしくはメルカプト基
である。

【００１７】（８）Ｌａ及び／又はＬｂが、芳香族基を
含まない連結基である。 （９）Ｌａ及び／またはＬｂが、イミノ基、１，４−ピ
ペラジニル基、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯＮＨ−、及び／
又は−ＳＯ₂−を含む連結基である。 （１０）ＬａのＦからＸまでの最も近い連結路に沿って
数えた主鎖の原子の数が２〜５０の範囲にある。 （１１）Ｌａ−Ｘ−Ｌｂの、ＦからＺまでの最も近い連
結路に沿って数えた主鎖の原子の数が１０〜１００の範
囲にある。

【００１８】本発明のＤＮＡ断片などのオリゴヌクレオ
チド試料あるいはポリヌクレオチド試料を蛍光法で検出
するための方法は、基板表面に一本鎖核酸断片を固定し
てなる核酸分析素子の該表面に、試料一本鎖核酸断片
を、液相かつ本発明の水溶性型蛍光インターカレータの
存在下で接触させる工程を含むことを特徴とする、該一
本鎖核酸断片に対して該相補性を有する核酸断片の検出
方法である。この方法で用いる核酸分析素子は、一般に
ＤＮＡチップと呼ばれる分析素子に代表されるものであ
って、「固定」とは、核酸断片の一方の末端部が基板表
面に化学結合している状態のみならず、結合はしていな
いが末端部付近が静電気的な相互作用によって仮固定状
態であるものも含む(Schena,M.et al.,Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 93,10614-10619(1996)) 。

【００１９】

【発明の実施の形態】本発明の新規な水溶性蛍光インタ
ーカレータ（以下、単に、蛍光インターカレータとい
う）は、下記一般式（Ｉ）あるいは（Ｉａ）で示す化合
物である。本発明の蛍光インターカレータは、下記式に
示すように蛍光性基を一方の端部側にのみ有することを
特徴とする。

【００２０】

【化４】Ｆ − Ｌａ − Ｘ −−−（Ｉ） Ｆ−Ｌａ−Ｘ−Ｌｂ−Ｚ −−−（Ｉａ）

【００２１】［但し、Ｆは蛍光性基、Ｘは環状基、そし
てＬａは連結基であって、少なくともＸとＬａのいずれ
かは、該インターカレータに、水溶性を付与できるか、
あるいは水溶性を付与できる基に変換し得る部位を有す
る。なお、Ｚは非蛍光性基、そしてＬｂは連結基であ
る］。

【００２２】上記式中、Ｘは、本発明の蛍光インターカ
レータのコア部分であり、置換基を有していてもよい一
価もしくは二価の環状基を表す。環状基としては、平面
性を有する環状基であることが好ましく、窒素原子に結
合手を有するナフタレンジイミド基、２位、６位、１位
もしくは５位（好ましくは、２位もしくは６位）に結合
手を有するアントラセン基、アントラセン基と同じ位置
に結合手を有するアントラキノン基、２位もしくは６位
に結合手を有するフルオレン基、２位ともしくは６位に
結合手を有するビフェニレン基、２位もしくは７位に結
合手を有するフェナントレン基、および２位もしくは７
位に結合手を有するピレン基からなる群より選ばれる環
状基であることが好ましく、二つの窒素原子に結合手を
有するナフタレンジイミド基であることが特に好まし
い。置換基としては、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、
Ｉ等）、あるいは炭素原子数が１乃至６のアルキル基で
あることが好ましいが、水素原子であることが好まし
い。炭素原子数が１乃至６のアルキル基としては、メチ
ル基、エチル基、もしくはｎ−プロピル基であることが
好ましい。

【００２３】Ｘの具体例を下記に示す。＊印は、結合手
の位置を示す。

【００２４】

【化５】

【００２５】Ｆは、蛍光性基（一つの結合手を有する蛍
光発生基）を表す。蛍光発生基は、特定の波長、例え
ば、波長が４００乃至７００ｎｍの範囲（好ましくは、
４００乃至５５０ｎｍの範囲）にある励起光の照射によ
って蛍光を発する基であることが好ましい。このような
蛍光発生基となる化合物としては、インドシアニン系化
合物、アザインドレニンシアニン系化合物、アクリジン
系化合物、および溝結合型化合物（groove binder）を
挙げることができる。ここで、溝結合型化合物とは、一
般的に、その分子内に四級カチオン性基を有し、そのカ
チオン性基の存在によって、二本鎖核酸断片のリン酸エ
ステル基のアニオンと強く相互作用する化合物をいう。
溝結合型化合物は、そのコア部分（Ｘ）と蛍光性基
（Ｆ）とが塩基対を介して積層した状態で二本鎖核酸断
片に結合する。なお、「結合」とは、一定の速度で、蛍
光インターカレータの二本鎖核酸断片の塩基対間への挿
入、および塩基対間からの離脱が繰り返されている状態
をいう。

【００２６】下記に、インドシアニン系化合物（Ｉ
Ｉ）、アザインドレニンシアニン系化合物（ＩＩＩ）、
アクリジン系化合物（ＩＶ）、および溝結合型化合物
（Ｖ）の具体例をこの順に、一つの結合手を有する構造
として示す。結合手の位置を＊印で示す。

【００２７】

【化６】（ＩＩ）

【００２８】

【化７】（ＩＩＩ）

【００２９】

【化８】（ＩＩＩ）

【００３０】

【化９】（ＩＩＩ）

【００３１】

【化１０】（ＩＶ）

【００３２】

【化１１】（Ｖ）

【００３３】

【化１２】（Ｖ）

【００３４】

【化１３】（Ｖ）

【００３５】上記式中、Ａは、酸素原子あるいはイオウ
原子を示す。

【００３６】

【化１４】（Ｖ）

【００３７】ＬａおよびＬｂは、互いに独立に、蛍光イ
ンターカレータに可溶性を付与する基を含む二価の連結
基であることが好ましく、その直鎖部分が炭素原子数が
３乃至１０の炭化水素基に相当する長さを有する基を持
つことが好ましい。ここで、直鎖部分とは、Ｌａに関し
ては、その一方の端部がコア部分（Ｘ）と縮合し、かつ
他方の端部がＦと縮合する部分、Ｌｂに関しては、その
一方の端部がコア部分（Ｘ）と縮合し、かつ他方の端部
がＺと縮合する部分をいう。ＬａとＬｂは、蛍光インタ
ーカレータの調製の都合上、互いに同一の基であること
が好ましい。なお、Ｌａは、二価の連結基中に、アルキ
レン基と、窒素原子を有する二価の基とを含む連結基で
あることがさらに好ましい。窒素原子を有する二価の基
は、Ｌａの直鎖部分に含むことが好ましい。窒素原子を
有する二価の基としては、イミノ基、１，４−ピペラジ
ニル基、１，３−イミダゾリジニル基、ピロリジニル
基、二価のピラゾリジニル基、あるいは二価のピペリジ
ニル基であることが好ましく、イミノ基、あるいは１，
４−ピペラジニル基であることが特に好ましい。

【００３８】窒素原子は、炭素原子数が１乃至３のアル
キル基、炭素原子数が２乃至４のアシル基、炭素原子数
が６乃至２０のアリール基および炭素原子数が１乃至３
のアルキル基を有する炭素原子数が７乃至２３のアラル
キル基からなる群より選ばれる基で置換されていてもよ
い。炭素原子数が１乃至３のアルキル基としては、メチ
ル基もしくはエチル基であることが好ましく、メチル基
であることが特に好ましい。炭素原子数が２乃至４のア
シル基としては、アセチル基であることが好ましい。炭
素原子数が６乃至２０のアリール基としては、フェニル
基もしくはナフチル基であることが好ましく、フェニル
基であることが特に好ましい。炭素原子数が１乃至３の
アルキル基を有する炭素原子数が７乃至２３のアラルキ
ル基としては、ベンジル基であることが好ましい。イミ
ノ基の置換基としては、メチル基であることが特に好ま
しい。従って、Ｌａ（もしくはＬｂ）は、Ｎ−メチル−
ジ（ｎ−プロピレニル）イミノ基、１，４−ジ（ｎ−プ
ロピレニル）−ピペラジニル基であることがさらに好ま
しく、Ｎ−メチル−ジ（ｎ−プロピレニル）イミノ基で
あることが特に好ましい。

【００３９】ＬａおよびＬｂは、イミノ基、チオエーテ
ル基、カルボニルオキシ基、チオカルボニルオキシ基も
しくはカルボニル基を含むことがより好ましく、イミノ
基、チオエーテル基もしくはカルボニル基を含むことが
さらに好ましく、イミノ基を含むことが特に好ましい。

【００４０】Ｚは、非蛍光性基を表し、アミノ基、カル
ボン酸基、スルホン酸基、スルフィン酸基、スルフェン
酸基、ヒドラジノ基、カルバモイル基、水酸基、イミノ
基およびメルカプト基からなる群より選ばれる基である
ことが好ましく、アミノ基、カルボン酸基、スルホン酸
基あるいはメルカプト基であることがより好ましく、ア
ミノ基であることが特に好ましい。

【００４１】本発明の蛍光インターカレータは、一般的
に、水性溶媒条件下で用いられるため、水溶性であるこ
とが必要とされる。インターカレータに水溶性を付与す
るために、前記記載のように、Ｘ、ＬａあるいはＬｂに
可溶性を付与する基を含めることも好ましいが、インタ
ーカレータの塩として用いてもよい。塩としては、塩酸
塩、硫酸塩、炭酸塩、リン酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化
水素酸塩等の無機塩との酸付加塩、あるいは酢酸塩、シ
ュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フ
マル酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、酒石酸
塩、メタンスルホン酸塩等の有機酸との付加塩、または
ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウ
ム塩等の無機塩類、あるいはピリジン塩、アンモニウム
塩、トリエチルアミン塩、エタノールアミン塩等の有機
塩類を挙げることができる。

【００４２】本発明の蛍光インターカレータは、公知の
方法（特開平９−２８８０８０号公報）を利用して簡便
に製造することができる。この方法では、蛍光性基が二
つ導入されたものも得られるが、反応条件を変えて、あ
るいは反応生成物の分離精製を行って本発明の蛍光イン
ターカレータのみを得ることができる。

【００４３】本発明の蛍光インターカレータの核酸断片
への結合と蛍光の発生との関係について説明する。図１
の（ａ）に、蛍光インターカレータの液相での積層状態
を示す。蛍光インターカレータは、一定のイオン強度下
では、二本鎖核酸断片もしくは一本鎖核酸断片が存在し
ない場合には、通常、蛍光物質（Ｆ）とコア部分（Ｘ）
とが積層した状態をとる。しかし、本発明に係るすべて
の蛍光インターカレータがこの積層状態をとるか否かは
明らかではなく、ＦとＸとの組み合わせに依存するもの
と推定される。図では、蛍光物質（Ｆ）およびコア部分
（Ｘ）以外の基を省略して示す。蛍光物質（Ｆ）とコア
部分（Ｘ）とが積層している場合には、液相に励起光を
照射しても消光する現象が認められる。

【００４４】一方、二本鎖核酸断片の存在下では、蛍光
インターカレータは、図１の（ｂ）に示すように、蛍光
性基（Ｆ）およびコア部分（Ｘ）が何れも塩基対間に結
合する態様で、二本鎖核酸断片との複合体を形成する。
このとき、蛍光性基（Ｆ）およびコア部分（Ｘ）は、そ
れぞれ、塩基対間二つに一個の割合で結合する。形成さ
れた複合体に励起光を照射すると、蛍光インターカレー
タは蛍光を発する。また、（ｃ）に示すように、（Ｘ）
のみが二本鎖核酸断片に結合する場合にも蛍光の発生が
認められる。前記記載の蛍光インターカレータの一つで
ある溝結合型化合物は、蛍光性基（Ｆ）の平面性が高い
ため、主に、図１の（ｂ）に示す態様で結合していると
推定される。

【００４５】核酸断片が存在する場合に発せられる蛍光
量は、核酸断片がまったく存在しない場合（消光状態）
に発せられる蛍光量（バックグランド値）に対して、蛍
光強度の値で１５乃至５０倍の範囲にある。この蛍光強
度の増強現象は、エンハンス効果と呼ばれる。

【００４６】一本鎖核酸断片に対しても、蛍光インター
カレータは複合体を形成し得る。しかし、一本鎖核酸断
片の場合には、二本鎖核酸断片の場合と比べて、核酸断
片からの解離速度が非常に速いために、複合体が形成さ
れても即座に解離が起こる。従って、一本鎖核酸断片
は、蛍光インターカレータの存在下では、実質的にほと
んど検出されないものと考える。実際に、一本鎖核酸断
片と蛍光インターカレータとの複合体の解離速度は、二
本鎖核酸断片との複合体のそれと比較して６０乃至１２
０倍の範囲にある。二本鎖核酸断片と一本鎖核酸断片で
は、そのエンハンス効果に大きな差が認められるため、
容易に二本鎖核酸断片の検出が可能である。

【００４７】二本鎖核酸断片は、液相でかつ基板表面に
区画された一つまたは複数の領域のそれぞれに核酸断片
が固定（好ましくは、核酸断片がその一端で固定）され
てなる核酸分析素子上でハイブリダイゼーションによっ
て作製された二本鎖核酸断片であっても、ハイブリダイ
ゼーション以外の方法によって入手した二本鎖核酸断片
であってもよい。後者の場合には、真核生物の細胞や組
織サンプルから単離されたものを用いることが好まし
い。

【００４８】上記記載のように、本発明の蛍光インター
カレータは二本鎖核酸断片を特異的に認識するものであ
る。従って、特定の核酸断片（Ａ）に対して相補性を有
する核酸断片（Ｂ）を含む試料を付与すると、（Ａ）と
（Ｂ）とのハイブリダイゼーションによって形成される
二本鎖核酸断片を簡便に検出することができる。すなわ
ち、試料中の（Ｂ）の検出が可能となる。検出は、二本
鎖核酸断片に結合した蛍光インターカレータの蛍光性基
から発生する蛍光量を測定することによって行う。

【００４９】ハイブリダイゼーションによって得られる
二本鎖核酸断片は、非塩基対を部分的に有する二本鎖核
酸断片であってもよい。すなわち、本発明の蛍光インタ
ーカレータによって、部分相補性核酸断片をも検出する
ことができる。部分相補性核酸断片とは、核酸断片
（Ｃ）に対して相補性を有する核酸断片を（Ｄ）とした
ときに、核酸断片（Ｄ）と塩基配列が部分的に同一性
（即ち、部分的に非同一性）を示す核酸断片をいう。こ
のような核酸断片としては、核酸断片（Ｄ）に関して塩
基欠損、塩基挿入などの塩基配列の変化を有する核酸断
片を挙げることができる。部分相補性核酸断片の検出方
法は、特に遺伝子診断分野での未知の異常遺伝子の探索
・同定に重要な手法である。詳細が特願平１１−１５９
３３９号の明細書に記載されている。

【００５０】以下、本発明の核酸断片の検出方法を、基
板表面に区画された一つまたは複数の領域のそれぞれに
核酸断片が固定（好ましくは、核酸断片がその一端で固
定）されてなる分析素子を用いて、分析素子上の核酸断
片と試料中の一本鎖の核酸断片とのハイブリダイゼーシ
ョンによって得られる二本鎖核酸断片の検出を対象とし
て説明する。

【００５１】基板は、疎水性の板状の基板、あるいは親
水性の低い板状の基板であることが好ましい。また、そ
の表面に凹凸を有した平面性の低いものも好ましく用い
ることができる。基板の材質としては、ガラス、セメン
ト、陶磁器等のセラミックスもしくはニューセラミック
ス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビ
スフェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレン、ポ
リメチルメタクリレート等のポリマー、シリコン、活性
炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔質シリコ
ン、多孔質活性炭、織編物、不織布、濾紙、短繊維、メ
ンブレンフィルター等の多孔質物質などを挙げることが
でき、上記記載の各種のプラスチック、ガラスもしくは
シリコンであることが特に好ましい。多孔質物質の細孔
の大きさは、２乃至１０００ｎｍの範囲にあることが好
ましく、２乃至５００ｎｍの範囲にあることが特に好ま
しい。基板が板状である場合には、その厚さは、１００
乃至１００００μｍの範囲にあることが好ましい。

【００５２】核酸断片は、目的によって二通りに分ける
ことができる。遺伝子の発現を調べるためには、ｃＤＮ
Ａ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳＴ等のポリヌクレオチドを使
用することが好ましい。これらのポリヌクレオチドは、
その機能が未知であってもよいが、一般的にはデータベ
ースに登録された配列を基にしてｃＤＮＡのライブラリ
ー、ゲノムのライブラリーあるいは全ゲノムをテンプレ
ートとしてＰＣＲ法によって増幅して調製する。ＰＣＲ
法によって増幅しないものも好ましく使用することがで
きる。また、遺伝子の変異や多型を調べるには、標準と
なる既知の配列をもとにして、変異や多型に対応する種
々のオリゴヌクレオチドを合成し、これを使用すること
が好ましい。さらに、塩基配列分析の場合には、４
_n（ｎは、塩基の長さ）種のオリゴヌクレオチドを合成
したものを使用することが好ましい。核酸断片の塩基配
列は、一般的な塩基配列決定法によって予めその配列が
決定されていることが好ましい。核酸断片は、２乃至５
０量体であることが好ましく、１０乃至２５量体である
ことが特に好ましい。

【００５３】核酸断片の基板への固定方法は、核酸断片
の種類および基板の種類に応じて適当な方法を選択する
ことができる（蛋白質・核酸・酵素,Vol.,43,No.13,200
4-2011(1998)）。例えば、核酸断片がｃＤＮＡやＰＣＲ
産物の場合には、ＤＮＡの荷電を利用して、ポリリシ
ン、ポリエチレンイミン、ポリアルキルアミン等の陽イ
オンで表面処理した基板に静電結合させる方法を用いる
ことができる。表面処理がされた基板上に、さらに、電
荷を有する親水性の高分子物質等からなる層や架橋剤か
らなる層を設けてもよい。また、基板によっては、その
基板中に親水性の高分子等を含ませることも可能であ
り、このような処理を施した基板も好ましく用いること
ができる。表面処理を行うことによって、疎水性、ある
いは親水性に乏しい基板と核酸断片との静電的な相互作
用を促進することができる。基板としては、表面処理の
容易さと解析の容易さのため、スライドガラスを用いる
ことが好ましい。

【００５４】合成ヌクレオチドを固定する場合には、基
板上で直接合成する方法、あるいは予め末端に共有結合
のための官能基を導入したオリゴマーを合成し、表面処
理した基板に共有結合させる方法を用いることができ
る。官能基としては、アミノ基、アルデヒド基、メルカ
プト基、ビオチン等を挙げることができる。基板として
は、ガラスやシリコンを用いることが好ましく、ガラス
やシリコンの表面処理には、公知のシランカップリング
剤を用いることが好ましい。

【００５５】基板上に固定される核酸断片は、後述する
検出対象の試料核酸断片であってもよい。以下、基板に
固定される核酸断片を塩基配列が既知の核酸断片とし、
核酸分析素子に接触させる核酸断片を試料核酸断片とす
る。

【００５６】核酸断片の固定は、核酸断片の水性液を基
板上の領域に点着して行うことが好ましい。点着後、所
定の温度（好ましくは、室温）でそのまま数時間放置す
ると核酸断片の一端が基板上の領域に固定される。点着
の条件は、使用する基板の種類、大きさ等によって異な
る。点着は、マニュアル操作によっても行うことができ
るが、ＤＮＡチップ作製装置に装備されたスポッター装
置を用いて行うことも好ましい。即ち、基板表面に区画
された一つまたは複数の領域に、スポッター装置を用い
て核酸断片の水性液をスポットすることも好ましい。ス
ポッター装置を用いる場合には、点着される核酸断片
は、基板表面に対して、１乃至１０_-15モルの範囲にあ
ることが好ましく、そして、重量としては数ｎｇ以下で
あることが好ましい。

【００５７】点着後は、インキュベーションを行うこと
も好ましい。インキュベート後、未点着のＤＮＡ断片を
洗浄して除去することが好ましい。

【００５８】上記の工程によって作製された分析素子の
寿命は、ｃＤＮＡが固定されてなるｃＤＮＡ分析素子で
数週間、オリゴＤＮＡが固定されてなるオリゴＤＮＡ分
析素子ではさらに長期間である。これらの分析素子は、
遺伝子発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異解
析、多型解析等に利用される。検出原理は、後述する、
試料核酸断片とのハイブリダーゼーションである。

【００５９】核酸断片試料としては、その配列や機能が
未知であるＤＮＡ断片試料あるいはＲＮＡ断片試料を用
いることが好ましい。試料核酸断片は、遺伝子発現を調
べる目的では、真核生物の細胞や組織サンプルから単離
することが好ましい。試料がゲノムならば、赤血球を除
く任意の組織サンプルから単離することが好ましい。赤
血球を除く任意の組織は、末梢血液リンパ球、皮膚、毛
髪、精液等であることが好ましい。試料がｍＲＮＡなら
ば、ｍＲＮＡが発現される組織サンプルから抽出するこ
とが好ましい。ｍＲＮＡは、逆転写反応によりｃＤＮＡ
とすることが好ましい。１回のハイブリダイゼーション
に必要なｍＲＮＡ量としては、測定条件によって異なる
が、数μｇ以下を用いることが好ましい。分析素子上の
核酸断片がオリゴＤＮＡである場合には、試料核酸断片
は低分子化しておくことが望ましい。

【００６０】ハイブリダイゼーションは、前記記載の本
発明の蛍光インターカレータの存在下にて行うことが好
ましい。蛍光インターカレータは、１０ｎＭ乃至１０ｍ
Ｍの濃度範囲にて用いることが好ましい。ハイブリダイ
ゼーションは、室温乃至７０℃の温度範囲で、そして
０．５乃至２０時間の範囲で実施することが好ましい。
ハイブリダイゼーションの終了後、界面活性剤と緩衝液
との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の試料核酸断
片を除去することが好ましい。界面活性剤としては、ド
デシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが好まし
い。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、
ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いる
ことができるが、クエン酸緩衝液を用いることが特に好
ましい。

【００６１】蛍光量の測定は、ハイブリダイゼーション
後の基板を乾燥させるか、あるいは水性溶媒の存在下
に、従来の蛍光レーザースキャナー法によって行っても
よく、あるいは該基板を乾燥させないように基板をカバ
ーガラスで覆い、冷却ＣＣＤ（電荷結合素子）法によっ
て行ってもよい。

【００６２】

【実施例】［製造例］Ｎ−｛３−［４−（３−（６−ク
ロロ−９−イミノ−２−メトキシアクリジニル）プロピ
ル）−１，４−ジアザシクロヘキシル］プロピル｝−
Ｎ’−｛３−［４−（３−アミノプロピル）−１，４−
ジアザシクロヘキシル］プロピル｝ナフタレンジイミド
の製造

【００６３】

【化１５】

【００６４】冷却還流管を付けた２００ｍＬのナス型フ
ラスコに、ナフタレン−１，４，５，８−テトラカルボ
ン酸二水和物（１ｇ、３．７ミリモル）と、Ｎ，Ｎ’−
ビス（３−アミノプロピル）ピペラジン（２０ｍＬ、
９．２ミリモル）とを入れ、ここに、ＴＨＦ（１５ｍ
Ｌ）を加えて溶解させた。８時間還流した後、室温まで
冷却し、反応混合物をエーテル（１Ｌ）に注ぎ込んだ。
生じた沈殿物をガラスフィルター（Ｇ４）で濾別した。
過剰のＮ，Ｎ’−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジ
ンを除去するため、濾別した沈殿物をクロロホルムとメ
タノールとの混合溶媒に溶解させ、再度、エーテルに注
ぎ込んだ。生成した結晶をガラスフィルターにて濾別
し、減圧下で乾燥させた。

【００６５】次いで、乾燥した上記結晶（０．５２ｇ、
０．８ミリモル）および６，９−ジクロロ−２−メトキ
シアクリジン（０．５３ｇ、１．９ミリモル）を２００
ｍＬのナス型フラスコに入れ、さらに、フェノール（１
５ｍＬ）を加えてこれらの化合物を溶解させた。１００
乃至１３０℃の温度範囲で８時間加熱し、その後室温ま
で冷却し、１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）
を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を無水硫酸ナ
トリウム上で乾燥し、溶媒を減圧留去した。残留物に、
最小量のクロロホルムを加え、エーテル（１Ｌ）に注ぎ
込んだ。生じた結晶をガラスフィルターで濾別し、減圧
下で乾燥させた。得られた結晶をシリカゲルクロマトグ
ラフィーにて精製し、標題化合物を得た（収率：３７
％）。

【００６６】［実施例］ （１）蛍光インターカレータの二本鎖ＤＮＡへの結合の
検出 仔牛胸腺ＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ、１００μＭ）および硫
酸ナトリウム（５ｍＭ）を含む５ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）に、製造例１で得られた縫い込み型蛍光イン
ターカレータ（２μＭ）を添加し、仔牛胸腺ＤＮＡと蛍
光インターカレータとの複合体をリン酸緩衝液中で形成
させ、この複合体を含むリン酸緩衝液の蛍光スペクトル
（励起光の照射波長は、４３４ｎｍ）を４４０乃至６０
０ｎｍの波長の範囲にて測定した。また、仔牛胸腺ＤＮ
Ａを入れない場合についても、上記と同様にしてその蛍
光スペクトルを測定した。その結果、仔牛胸腺ＤＮＡを
存在させた場合には、存在させない場合に比較して蛍光
強度が大きくなることが分かる。即ち、波長４７５ｎｍ
において、仔牛胸腺ＤＮＡを含む場合の蛍光強度は、仔
牛胸腺ＤＮＡを含まない場合の蛍光強度に対して約３０
倍の値を示した。

【００６７】（２）蛍光インターカレータの仔牛胸腺Ｄ
ＮＡからの解離速度の測定 上記（１）で用いた仔牛胸腺ＤＮＡと蛍光インターカレ
ータとの複合体を含むリン酸緩衝液に、最終濃度が０．
５容量％となるようにＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウ
ム）水溶液を添加した。添加後の該複合体を含むリン酸
緩衝液について、吸光度の経時変化を測定した。この結
果より、仔牛胸腺ＤＮＡからの蛍光インターカレータの
解離速度を求めたところ、０．０２／秒であった。

【００６８】［比較例１］二本鎖の仔牛胸腺ＤＮＡの代
わりに、仔牛胸腺ＤＮＡを９０℃にて２０分間加熱処理
して得られた一本鎖ＤＮＡを用いる以外は実施例１と同
様にして、蛍光インターカレータの一本鎖ＤＮＡへの結
合の検出、および蛍光インターカレータの一本鎖ＤＮＡ
からの解離速度の測定を行った。その結果、一本鎖ＤＮ
Ａを含む場合の蛍光強度は、含まない場合の蛍光強度の
約１６倍であり、また、一本鎖ＤＮＡからの蛍光インタ
ーカレータの解離速度は、１．２／秒であった。

【００６９】実施例１および比較例１より、一本鎖ＤＮ
Ａは、二本鎖ＤＮＡと比べて、蛍光インターカレータと
の複合体を形成しにくく、また、一本鎖ＤＮＡとインタ
ーカレータとで形成された複合体から、インターカレー
タがより速く解離することが分かる。従って、本発明の
蛍光インターカレータは、二本鎖ＤＮＡを特異的に検出
することができる。

【００７０】（２）蛍光物質の仔牛胸腺ＤＮＡからの解
離速度の測定 仔牛胸腺ＤＮＡと蛍光物質との複合体を含むリン酸緩衝
液を用いる以外は実施例１の（２）と同様にして蛍光強
度の経時変化を測定した。この結果より、蛍光物質の仔
牛胸腺ＤＮＡからの解離速度を求めたところ、１９．０
／秒であった。

【００７１】［比較例２］製造例１で得られた型蛍光イ
ンターカレータの代わりに、下記式で表される９−アミ
ノ−６−クロロ−２−メトキシアクリジン（Molecular
Probe,Inc.社製）を用いる以外は実施例１と同様にし
て、仔牛胸腺ＤＮＡを含む場合と含まない場合について
それぞれ蛍光強度を求めたところ、前者は後者の約６倍
の蛍光強度を示した。

【００７２】

【化１６】

【００７３】［比較例３］製造例１で得られた型蛍光イ
ンターカレータの代わりに、前述のＮ，Ｎ−ビス｛３−
［４−（３−（６−クロロ−９−イミノ−２−メトキシ
アクリジニル）プロピル）−１，４−ジアザシクロヘキ
シル］プロピル｝ナフタレンジイミド）を用いる以外は
実施例１と同様にして、仔牛胸腺ＤＮＡを含む場合と含
まない場合についてそれぞれ蛍光強度を求めたところ、
前者は後者に対して高いＳ／Ｎ比をもたらすような充分
相違する蛍光強度を示さなかった。

【００７４】実施例および比較例より、本発明の蛍光イ
ンターカレータは、９−アミノ−６−クロロ−２−メト
キシアクリジンに比較して、仔牛胸腺ＤＮＡと安定な複
合体を形成することが分かる。このことは、本発明の蛍
光インターカレータが、二本鎖ＤＮＡ断片を高感度に検
出できるものであることを示す。

【００７５】

【発明の効果】一本鎖核酸断片に対して一時的に複合体
を形成したとしてもその複合体からの解離速度が大き
く、一本鎖核酸断片とは安定な複合体を形成しにくいこ
とから、二本鎖核酸断片のみを簡便に検出することがで
きるものである。また、本発明の水溶性縫い込み型蛍光
インターカレータは、二本鎖核酸断片に結合する性質を
有する蛍光物質として公知の９−アミノ−６−クロロ−
２−メトキシアクリジンと比較して、二本鎖核酸断片に
特異的に結合するばかりでなく、その結合安定性が大き
いため、従来のインターカレータでは達成できなかった
検出感度を有する。

【００７６】さらに、蛍光物質で標識された核酸断片を
使用するこれまでの蛍光法は、核酸断片に充分な量の蛍
光物質を取り込むことが困難であるが（取り込み率が１
％程度）、本発明の蛍光インターカレータは、二本鎖核
酸断片の二つの塩基対間に一つの割合で結合するため、
充分な量の蛍光物質を二本鎖核酸断片に導入することが
できる。従って、本発明の蛍光インターカレータを用い
る検出方法では、相補性を有する試料核酸断片のみなら
ず、部分的に相補性を有する試料核酸断片をも高感度で
簡便に検出することができる。

【００７７】本発明の蛍光インターカレータは、二つの
蛍光物質を有する公知の蛍光インターカレータ（Bull.C
hem.Soc.Jpn., 72,327-337 (1999)）と比較して、高い
感度（Ｓ／Ｎ比）を有することが確認されており、相補
性試料核酸断片および部分相補性試料核酸断片の検出に
有効に用いることができる。また、本発明の蛍光インタ
ーカレータは二つの蛍光物質を有する蛍光インターカレ
ータの製造時に同時に得られるものであるため、有効利
用という観点からもメリットを有する。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の水溶性縫い込み型蛍光インターカレー
タの液相における積層状態を示す模式図である。

【図２】本発明の水溶性縫い込み型蛍光インターカレー
タと二本鎖核酸断片とで形成される複合体を示す模式図
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 竹中 繁織 福岡県古賀市舞の里４−23−21

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記一般式で表わされる水溶性の蛍光イ
   ンターカレータ： 【化１】Ｆ − Ｌａ − Ｘ ［但し、Ｆは蛍光性基、Ｘは環状基、そしてＬａは連結
   基であって、少なくともＸとＬａのいずれかは、該イン
   ターカレータに、水溶性を付与できるか、あるいは水溶
   性を付与できる基に変換し得る部位を有する］。
2. 【請求項２】 Ｘに、−Ｌｂ−Ｚ［但し、Ｚは非蛍光性
   基、そしてＬｂは連結基である］で表わされる置換基が
   結合している請求項１に記載の蛍光インターカレータ。
3. 【請求項３】 Ｘが、縮合環を有する芳香族基である請
   求項１に記載の蛍光インターカレータ。
4. 【請求項４】 Ｘが、ナフタレンジイミド基、アントラ
   キノン基、もしくはアントラセン基である請求項３に記
   載の蛍光インターカレータ。
5. 【請求項５】 Ｆが、芳香族基を含む蛍光性基である請
   求項１に記載の蛍光インターカレータ。
6. 【請求項６】 Ｆが、アクリジン基、インドシアニン
   基、もしくはアザインドレニンシアニン基である請求項
   ５に記載の蛍光インターカレータ。
7. 【請求項７】 Ｚが、芳香族基を含まない非蛍光性基で
   ある請求項２に記載の蛍光インターカレータ。
8. 【請求項８】 Ｚが、酸素原子、窒素原子及び／又は硫
   黄原子を含む非蛍光性基である請求項７に記載の蛍光イ
   ンターカレータ。
9. 【請求項９】 Ｚが、アミノ基、カルボン酸基、スルホ
   ン酸基、スルフィン酸基、スルフェン酸基、ヒドラジノ
   基、カルバモイル基、水酸基、イミノ基、もしくはメル
   カプト基である請求項８に記載の蛍光インターカレー
   タ。
10. 【請求項１０】 Ｌａが、芳香族基を含まない連結基で
    ある請求項１に記載の蛍光インターカレータ。
11. 【請求項１１】 Ｌａが、イミノ基、１，４−ピペラジ
    ニル基、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯＮＨ−、及び／又は−
    ＳＯ₂−を含む連結基である請求項１に記載の蛍光イン
    ターカレータ。
12. 【請求項１２】 ＬａのＦからＸまでの最も近い連結路
    に沿って数えた主鎖の原子の数が２〜５０の範囲にある
    請求項１に記載の蛍光インターカレータ。
13. 【請求項１３】 Ｌａ−Ｘ−Ｌｂの、ＦからＺまでの最
    も近い連結路に沿って数えた主鎖の原子の数が１０〜１
    ００の範囲にある請求項２に記載の蛍光インターカレー
    タ。
14. 【請求項１４】 基板に固定されたヌクレオチド誘導体
    もしくはその類縁体からなる一群のプローブ分子に相補
    性を示すオリゴヌクレオチド試料あるいはポリヌクレオ
    チド試料を蛍光法で検出するための下記の工程からなる
    方法：上記プローブ分子に、請求項１に記載の蛍光イン
    ターカレータそして水の存在下にて、相補性のオリゴヌ
    クレオチド試料あるいはポリヌクレオチド試料を接触さ
    せることにより、プローブ分子と相補性のオリゴヌクレ
    オチド試料あるいはポリヌクレオチド試料とをハイブリ
    ダイズさせて、上記蛍光インターカレータの少なくとも
    一部分が挿入されたハイブリッド構造体を形成させる工
    程、そして基板上のハイブリッド構造体に挿入された蛍
    光インターカレータから発せられる蛍光を検出する工
    程。
15. 【請求項１５】 基板に固定されたヌクレオチド誘導体
    もしくはその類縁体からなる一群のプローブ分子に相補
    性を示すオリゴヌクレオチド試料あるいはポリヌクレオ
    チド試料を蛍光法で検出するための下記の工程からなる
    方法：上記プローブ分子に、水の存在下で、相補性のオ
    リゴヌクレオチド試料あるいはポリヌクレオチド試料を
    接触させることにより、プローブ分子と相補性のオリゴ
    ヌクレオチド試料あるいはポリヌクレオチド試料とをハ
    イブリダイズさせて、基板上にハイブリッド構造体を形
    成させる工程、 請求項１に記載の蛍光インターカレータを水の存在下に
    て上記ハイブリッド構造体と接触させて、該蛍光インタ
    ーカレータの少なくとも一部分が挿入されたハイブリッ
    ド構造体を形成させる工程、そして基板上のハイブリッ
    ド構造体に挿入された蛍光インターカレータから発せら
    れる蛍光を検出する工程。