JP5111382B2 - 新規なイミンカリックスアレーン誘導体とアミノカリックスアレーン誘導体、その製造方法及び該製造方法によって製造された自己組織化単分子層、該自己組織化単分子層を利用したオリゴ遺伝子の固定化方法及びこれによって製造されたオリゴ遺伝子チップ - Google Patents
新規なイミンカリックスアレーン誘導体とアミノカリックスアレーン誘導体、その製造方法及び該製造方法によって製造された自己組織化単分子層、該自己組織化単分子層を利用したオリゴ遺伝子の固定化方法及びこれによって製造されたオリゴ遺伝子チップ Download PDFInfo
- Publication number
- JP5111382B2 JP5111382B2 JP2008535434A JP2008535434A JP5111382B2 JP 5111382 B2 JP5111382 B2 JP 5111382B2 JP 2008535434 A JP2008535434 A JP 2008535434A JP 2008535434 A JP2008535434 A JP 2008535434A JP 5111382 B2 JP5111382 B2 JP 5111382B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- och
- group
- oligo
- oligo gene
- cooh
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 0 CC1=C(*)C=CI=C1 Chemical compound CC1=C(*)C=CI=C1 0.000 description 1
- GERNESJXLJFDGU-UHFFFAOYSA-N CCc1cc(C)c(CBr)cc1 Chemical compound CCc1cc(C)c(CBr)cc1 GERNESJXLJFDGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YJVAGZMVKRHRDS-UHFFFAOYSA-N Cc1ccc(CCCc2ccccc2)cc1 Chemical compound Cc1ccc(CCCc2ccccc2)cc1 YJVAGZMVKRHRDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C251/00—Compounds containing nitrogen atoms doubly-bound to a carbon skeleton
- C07C251/02—Compounds containing nitrogen atoms doubly-bound to a carbon skeleton containing imino groups
- C07C251/24—Compounds containing nitrogen atoms doubly-bound to a carbon skeleton containing imino groups having carbon atoms of imino groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y15/00—Nanotechnology for interacting, sensing or actuating, e.g. quantum dots as markers in protein assays or molecular motors
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y40/00—Manufacture or treatment of nanostructures
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C2603/00—Systems containing at least three condensed rings
- C07C2603/92—Systems containing at least three condensed rings with a condensed ring system consisting of at least two mutually uncondensed aromatic ring systems, linked by an annular structure formed by carbon chains on non-adjacent positions of the aromatic system, e.g. cyclophanes
Description
技術的課題
本発明の目的は、前述した従来のオリゴ遺伝子の固定化方法で発生する固定化密度の均一性問題、オリゴ遺伝子間の空間確保の問題及び作用基の付着問題等を解決するために、連続したグアニン基を有するオリゴ遺伝子に対する分子認識が可能なイミンカリックスアレーン誘導体及びその製造方法を提供することである。
本発明の新規なイミンカリックスアレーン誘導体は、下記化学式1又は2の構造を有する。上記イミンカリックスアレーン誘導体は、7個以上の連続したグアニン基を有するオリゴ遺伝子の固定化方法で用いる自己組織化単分子層に必須な化合物である。
(上記式中、R1、R2、R3及びR4は、互いに独立して−H、−CH3、−C2H5、−C3H7、−OCH3、−Cl、−C6H5及び−COORからなる群より選択され、上記−COORにおけるRは、−CH3又は−C2H5を示す。)
(上記式中、R1、R2、R3及びR4は、互いに独立して−H、−CH3、−C2H5、−C3H7、−OCH3、−Cl、−C6H5及び−COORからなる群より選択され、上記−COORにおけるRは、−CH3又は−C2H5を示す。また、上記Y1、Y2、Y3及びY4は、互いに独立して−H、−(CH2)n−CH=O、−(CH2)n−SH、−(CH2CH2O)m−CH2CH2−CH=O、−(CH2CH2O)m−CH2CH2−SH、−(CH2)m−C6H4−(CH2)c−Z及び−CO−(CH2)m−1−C6H4−(CH2)c−Zからなる群より選択される(n=2〜15、m=1〜10、c=0〜10、Z=−SH、−CHO、−COOH又は−NH2で定義される)。)
本発明は、また上記化学式1及び化学式2のイミンカリックスアレーン誘導体化合物を製造する方法を提供する。
本発明の上記化学式1のイミンカリックスアレーン誘導体化合物は、上記化学式3の5,11,17,23−テトラアミノカリックス[4]アレーン化合物を出発物質として化学式3のアミン作用基を下記化学式4の芳香族アルデヒドと反応させて合成する(下記実施例の反応式2参照)。
(上記化学式4において、Rは、−H、−CH3、−C2H5、−C3H7、−OCH3、−Cl、−C6H5及びCOOR’からなる群より選択され、上記COOR’におけるR’は、−CH3又は−C2H5を示す。)
また、本発明の化学式2のイミンカリックスアレーン誘導体化合物は、化学式1の化合物と末端基にハロゲンが付着されたアルデヒド化合物を反応させて、化学式1の化合物の1番目及び3番目の−OH基の位置にアルデヒド又はチオールが付着された末端基を有するように合成する(下記実施例の反応式3乃至反応式5参照)。
9T 5’−TTT TTT TTT TAA TCA ACC CAC AGC TGC A−3’(配列番号3)
9A 5’−AAA AAA AAA TAA TCA ACC CAC AGC TGC A−3’(配列番号4)
9C 5’−CCC CCC CCC CAA TCA ACC CAC AGC TGC A−3’(配列番号5)
ビオチン 5’−ビオチン−T ATA TAA TCA ACC CAC AGC TGC A−3’(配列番号6)
no 5’−AA TCA ACC CAC AGC TGC A−3’(配列番号7)
5’−Cy3−GT GCA GCT GTG GGT TGA TT−3’(配列番号2)
同時に蛍光物質(Cy3)を付着して蛍光スキャナで付着されたc−DNAの密度、即ち、c−DNAが付着された固定化されたオリゴ遺伝子の密度を相対的に分析することができるようにした。実際の実験結果によれば、それぞれのオリゴ遺伝子を上記条件で同一に塗布し、固定化した後、c−DNAを表面に最大に固定化され得るオリゴ遺伝子の量の3倍を塗布して固定化されたオリゴ遺伝子のすべてに十分に蛍光付着されたc−DNAが結合されるようにした後、洗って乾燥して蛍光スキャナで分析した。
4G 5’−GGG GAA TCA ACC CAC AGC TGC A−3’(配列番号9)
7G 5’−GGG GGG GAA TCA ACC CAC AGC TGC A−3’(配列番号10)
9G 5’−GGG GGG GGG AAA TCA ACC CAC AGC TGC A−3’(配列番号1)
12G 5’−GGG GGG GGG GGG GAA TCA ACC CAC AGC TGC A−3’(配列番号11)
15G 5’−GGG GGG GGG GGG GGG GAA TCA ACC CAC AGC TGC A−3’(配列番号12)
c−DNA 5’−Cy3−GT GCA GCT GTG GGT TGA TT−3’(配列番号2)(Cy−3;蛍光物質)
上記提示された条件と同一にオリゴ遺伝子を塗布して洗った後乾燥した。実際の実験結果によれば、それぞれのオリゴ遺伝子を上記条件で同一に塗布して固定化した後、c−DNAを表面に最大に固定化され得るオリゴ遺伝子の量の3倍を塗布して固定化されたオリゴ遺伝子のすべてに十分に蛍光付着されたc−DNAが結合され得るようにした後、洗って乾燥して蛍光スキャナで分析した。
上記式中、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R’1、R’2、R’3、R’4、R’5、R’6、R’7、R’8は、互いに独立して−H、−CH3、−C2H5、−C3H7、−OCH3、−Cl、−C6H5、−OH、−OCH2CH3、−Br、−CF3、−OCH2C6H5、−OC6H5、−OC6H4CH3、−OC6H4C(CH3)3、−OC6H4CF3、−OC6H4Cl、−OCOCH3、−NHCOCH3、−CONHCH3、−CN、−COOH、及び−COORからなる群より選択され、上記−COORにおけるRは、−CH3又は−C2H5を示す。
上記式中、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R’1、R’2、R’3、R’4、R’5、R’6、R’7、R’8は、互いに独立して−H、−CH3、−C2H5、−C3H7、−OCH3、−Cl、−C6H5、−OH、−OCH2CH3、−Br、−CF3、−OCH2C6H5、−OC6H5、−OC6H4CH3、−OC6H4C(CH3)3、−OC6H4CF3、−OC6H4Cl、−OCOCH3、−NHCOCH3、−CONHCH3、−CN、−COOH、及び−COORからなる群より選択され、上記−COORにおけるRは、−CH3又は−C2H5を示す。また、上記Y1、Y2、Y3及びY4は、互いに独立して−H、−(CH2)n−CH=O、−(CH2)n−SH、−(CH2CH2O)m−CH2CH2−CH=O、−(CH2CH2O)m−CH2CH2−SH、−(CH2)m−C6H4−(CH2)c−Z、及び−CO−(CH2)m−C6H4−(CH2)c−Zからなる群より選択される(n=2〜15、m=1〜10、c=0〜10、Z=−SH、−CHO、−COOH、−NH2、そして−C6H4−とC6H5はフェニル基で定義される)。
上記式中、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R’1、R’2、R’3、R’4、R’5、R’6、R’7、R’8は、互いに独立して−H、−CH3、−C2H5、−C3H7、−OCH3、−Cl、−C6H5、−OH、−OCH2CH3、−Br、−CF3、−OCH2C6H5、−OC6H5、−OC6H4CH3、−OC6H4C(CH3)3、−OC6H4CF3、−OC6H4Cl、−OCOCH3、−NHCOCH3、−CONHCH3、−CN、−COOH、及び−COORからなる群より選択され、上記−COORにおけるRは、−CH3又は−C2H5を示す。
上記式中、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R’1、R’2、R’3、R’4、R’5、R’6、R’7、R’8は、互いに独立して−H、−CH3、−C2H5、−C3H7、−OCH3、−Cl、−C6H5、−OH、−OCH2CH3、−Br、−CF3、−OCH2C6H5、−OC6H5、−OC6H4CH3、−OC6H4C(CH3)3、−OC6H4CF3、−OC6H4Cl、−OCOCH3、−NHCOCH3、−CONHCH3、−CN、COOH、及び−COORからなる群より選択され、上記−COORにおけるRは、−CH3又は−C2H5を示す。ただし、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R’1、R’2、R’3、R’4、R’5、R’6、R’7、R’8が同時に−Hである場合は除く。また、上記Y1、Y2、Y3及びY4は、互いに独立して−H、−(CH2)n−CH=O、−(CH2)n−SH、−(CH2CH2O)m−CH2CH2−CH=O、−(CH2CH2O)m−CH2CH2−SH、−(CH2)m−C6H4−(CH2)c−Z、及び−CO−(CH2)m−C6H4−(CH2)c−Zからなる群より選択される(n=2〜15、m=1〜10、c=0〜10、Z=−SH、−CHO、−COOH、−NH2、そして−C6H4−とC6H5は、フェニル基で定義される)。
上記化学式9のテトラアミノカリックス[4]アレーンは、カリックス[4]アレーン(calix[4]−arene)を、上記参考文献1の方法によってテトラニトロカリックス[4]アレーンに変換した後、還元反応によって合成する。
そのため、1cm2当たり存在するアミノカリックスアレーン誘導体の個数は、1/3.82×10−14cm2=2.62×1013個=43.5pmol/cm2のようである。一つのオリゴ遺伝子が固定化されるのに6−7個のアミノカリックスアレーン誘導体が結合された面積を用いるようになるので、固定化最高のオリゴ遺伝子の密度は43.5/(6〜7)pmol/cm2=6.2〜7.25pmol/cm2である。固定化用オリゴ遺伝子5’−GGG GGG GGG AAA TCA ACC CAC AGC TGC A−3’(配列番号16)を実施例24の方法によって最大密度で固定化したオリゴ遺伝子チップに蛍光付着されたc−DNA 5’−cy3−GT GCA GCT GTG GGT TGA TT−3’(配列番号19)とハイブリダイゼーションした後、実施例13の方法によって洗って乾燥した後、蛍光スキャナ(GSI、米国)を利用して蛍光感度を測定した結果が図11の2)のハイブリダイゼーション結果に示されている。その蛍光感度と類似する感度をハイブリダイゼーションに用いられたものと同一のc−DNA 5’−cy3−GT GCA GCT GTG GGT TGA TT−3’(配列番号19)を多様な濃度で乾燥して蛍光スキャナを利用して類似する蛍光感度を測定した結果、理論的な計算値の半分水準である3.8pmol/cm2の濃度で塗布して乾燥した場合に似ている水準の蛍光感度を得ることができた。この結果は、図11の1)の蛍光付着されたオリゴ遺伝子を乾燥した結果に示されている。この結果は、本発明で開発されたBMTオリゴ遺伝子チップ基板がオリゴ遺伝子をほとんど理論的な最大値に近く固定化してオリゴ遺伝子チップを製造することができ、同時に30分のハイブリダイゼーションでも最大値の蛍光の約50%水準の結果を得ることができ、超高速のハイブリダイゼーションを可能にし、同時に高密度の固定化技術を具現した世界最初のオリゴ遺伝子チップの製造技術であることを示している。
5,11,17,23−テトラアミノカリックス[4]アレーンの製造
5,11,17,23−テトラニトロカリックス[4]アレーン(TNCA;tetranitrocalix[4]arene)を出発物質とし、下記参考文献3に提示された合成方法で合成して、淡黄色の固体生成物5,11,17,23−テトラアミノカリックス[4]アレーン(TACA;tetraaminocalix[4]−arene)を75%の収率で得た[参考文献3:VanWagenigen,A.M.A.;Snip,E.;Verboom.W.;Reinhoudt,D.N.;Boerrigter,H.;Liebigs Ann/Recueil 1997年.pp2235−2245]。上記反応を反応式1に示した。
5,11,17,23−テトラベンジルイミンカリックス[4]アレーンの製造
乾燥された丸底フラスコに、TACA 500mg(1.03mmol)と無水MgSO4を200mg仕込み、150mlのアセトニトリルとベンズアルデヒド0.84ml(8.24mmol)を同時に仕込んだ後、常温で窒素交流の下に2時間の間撹拌させた。反応後、濾過して固体生成物を除去した後、溶液を減圧して余分の溶媒を除去し、5mlのCH2Cl2に完全に溶かした後、30mlのn−ヘキサンを加えれば、5,11,17,23−テトラベンジルイミンカリックス[4]アレーン(TBICA;tetrabenzylimine−calix[4]arene)が淡紅色の固体に結晶化される。減圧フィルターをし、余分の溶媒を減圧下で除去してTBICA(822mg、収率95.7%)を得た。上記反応を反応式2に示した。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ 10.15(s,4H,OH),8.34(s,4H,N=CH),7.82−7.78(m,8H,Ar),7.40−7.38(m,12H,Ar),7.01(s,8H,Ar),4.31(d,4H,ArCH2Ar,J=13Hz),3.63(d,4H,ArCH2Ar,J=13Hz)
13C NMR(300MHz,CDCl3):δ 159.26,146.28,136.40,131.32,t128.86,121.90,32.47
5,11,17,23−テトラベンジルイミンアルコキシカリックス[4]アレーンの製造
乾燥された丸底フラスコに、TBICA 500mg(0.6mmol)、無水K2CO3(830mg、6mmol)及びヨウ化ナトリウム(810mg、5.4mmol)を仕込み、アセトニトリル150mlを仕込んだ後、窒素交流の下に撹拌させた。10分後、6−ブロモヘキサナール(bromohexanal)(644mg、3.6mmol)を仕込み、反応容器の温度を80℃に上げた後、24時間の間撹拌させた。反応後、アセトニトリルを減圧して除去させ、CH2Cl2150mlを用いて反応物を溶かした。反応時に生成されるKBr、KI、K2CO3等は溶かないため、減圧濾過して除去し、濾液は減圧して溶媒を除去した後、5mlのエチルアセテートに完全に溶かした後、40mlのn−ヘキサンを加えれば、5,11,17,23−テトラベンジルイミンアルコキシカリックス[4]アレーン(TBICOCA;tetrabenzyliminealkoxy−calix[4]arene)が黄色の固体に析出される。これをCHCl3/n−ヘキサンに再結晶して淡黄色の固体生成物TBICOCA(570mg、収率90%)を得た。上記反応を反応式3に示した。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ 9.81(t,2H,CHO),8.46(s,2H,N=CH),8.24(s,2H,N=CH),7.86−7.82(m,4H,Ar),7.73−7.70(m,4H,Ar),7.43−7.31(m,12H,Ar),7.07(s,4H,Ar),6.83(s,4H,Ar),4.33(d,4H,ArCH2Ar,J=13Hz),4.04(t,4H,OCH2),3.46(d,4H,ArCH2Ar,J=13Hz),2.57(t,4H,CH2CHO),2.10(t,4H,OCH2CH2),1.88−1.70(m,8H,CH2CH2)
13C NMR(300MHz,CDCl3):δ 202.07,197.11,159.61,158.90,148.21,147.19,145.93,143.10,t136.07,130.59−129.57,128.83−128.08,122.10,121.54,43.84,31.73,25.57
5,11,17,23−テトラベンジルイミンブロモブトキシカリックス[4]アレーンの製造
乾燥された丸底フラスコに、TBICA(500mg、0.6mmol)、無水K2CO3(830mg、6mmol)及びヨウ化ナトリウム(1.08g、7.2mmol)を仕込み、アセトニトリル150mlを仕込んだ後、常温で10分間撹拌した。反応容器に、1,4−ジブロモブタン(1.3g、0.72ml、6mmol)を仕込み、反応容器の温度を80℃に上げた後、24時間の間に反応させた。反応容器を常温で冷やした後、溶媒は減圧して除去し、CH2Cl2150mlにて残渣物を溶かした。反応時に生成されるKBr、KI、K2CO3等は溶けないため、減圧濾過して除去し、濾液は、減圧して溶媒を除去した。エチルアセテート/n−ヘキサンにて析出した後、減圧濾過して、黄土色の固体生成物、5,11,17,23−テトラベンジルイミンブロモブトキシカリックス[4]アレーン(TBBCA;tetrabenzylimine−bromobutoxy−calix[4]arene)を得た。この固体をCHCl3/n−ヘキサンで再結晶して、淡黄色のTBBCA(480mg、72%)を得た。上記反応を反応式4に示した。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ 8.47(s,2H,N=CH),8.24(s,2H,N=CH),7.98(s,2H,ArOH),7.86−7.83(dd,4H,ArH),7.73−7.70(dd,4H,ArH),7.41−7.31(m,12H,ArH),7.08(s,4H,Ar),6.83(s,4H,Ar),4.33(d,4H,ArCH2Ar,J=13Hz),4.06(t,4H,OCH2),3.49(s,4H,ArCH2Ar,J=13Hz),3.45(t,4H,CH2Br),2.37−2.29(m,OCH2CH2)2.24−2.18(m,CH2CH2Br)
5,11,17,23−テトラベンジルイミンメルカプトブトキシカリックス[4]アレーンの製造
乾燥された丸底フラスコに、TBBCA(500mg、0.45mmol)及びカリウムチオアセテート(114.21mg、1mmol)を仕込み、アセトン60mlに溶かした後、窒素交流下、室温で90分間の間にソニック反応させた。反応後、溶媒を減圧下で除去し、30mlのCH2Cl2で溶かして、不溶の沈殿物は、減圧濾過した後、濾液を水で2回洗い、有機層を分離して、MgSO4で乾燥した。有機層を減圧濾過して、濾液を減圧乾燥した後、得られた固体を、エチルアセテート/n−ヘキサンを用いて再結晶し、減圧濾過して、淡黄色の固体結晶を得た。得られた固体結晶を丸底フラスコに仕込み、CH2Cl2:メタノール=5:1の比率の混合溶液に溶かして、常温で、窒素交流下でソニック反応させた。1分後、1.0M KOH(1ml、1mmol)を仕込み、30分間ソニック反応させた。反応後、溶媒を減圧下で除去した後、5mlのCH2Cl2で溶かし、0.1M HCl水溶液で1回洗浄した。有機層を分離して、MgSO4で乾燥した後、減圧濾過し、濾液の溶媒を減圧下で除去して、淡黄色の5,11,17,23−テトラベンジルイミンメルカプトブトキシカリックス[4]アレーン(TBIMBCA;tetrabenzyliminemercaptobutoxycalix[4]arene)を得た。得られたTBIMBCAをエチルアセテート/n−ヘキサンで再結晶し、TBIMBCA(450mg、収率73%)を白色の固体結晶として得た。上記反応を反応式5に示した。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ 8.48(s,2H,N=CH),8.17(s,2H,N=CH),7.84(m,4H,ArOH),7.68(m,4H,ArOR),7.38(m,6H,ArH),7.28(m,6H,ArOR),7.10(s,4H,ArH),6.81(s,4H,ArH),4.34(d,4H,ArCHA2r),4.04(t,4H,ArOCH2),3.47(d,4H,ArCH2Ar,J=13Hz),3.03(t,4H,SHCH2),2.38(m,4H,ArOCH2CH2),2.11(m,4H,CH2CH2)
イミンカリックスアレーン誘導体単分子層の製造
CHCl3等の有機溶媒に、実施例3で合成したTBICOCAを0.1−5mMの濃度で溶かした溶液を製造した。図1と同様に、アミン作用基が付着されたスライドグラス(アミンチップ)を、製造された溶液に1−24時間の間浸漬した後、取り出して、これをクロロホルム、アセトン及び水でそれぞれ洗浄した後、乾燥して、本発明のイミンカリックスアレーン単分子層を製造した。同一の方法によって他のイミンカリックスアレーン誘導体単分子層を製造した。
金基質におけるイミンカリックスアレーン誘導体単分子層の製造
CHCl3等の有機溶媒に、実施例5で合成されたTBIMBCAを0.1−5mMの濃度で溶かした溶液を製造した。図2のように、金基質を、製造された溶液に1−24時間の間浸漬した後、取り出して、これをクロロホルム、アセトン及び水でそれぞれ洗浄した後、乾燥して、本発明のイミンカリックスアレーン単分子層を製造した。同一の方法で他のイミンカリックスアレーン誘導体単分子層を製造した。上記金基質は多様な形態で用いることができるが、一般的に、ガラス、溶融石英、シリコンウエハ、プラスチック等にクロム(Cr)やチタン(Ti)等を5−20nmで真空蒸着した後、金を100−300nmの厚さで真空蒸着した基質が好ましい。このようにして製造された金基質は、使用直前にピラニア(piranha)溶液(濃硫酸:30%過酸化水素水=3:1で混合した混合溶液)に10秒乃至1分間程浸漬した後、水で洗浄し、窒素交流下で乾燥し、直ちに用いた。単分子層の生成は、表面反射赤外線分光分析法(FTIR−ERS)を用いて分析した。
多重分子認識によるオリゴ遺伝子の固定化方法
図3に示したオリゴ遺伝子の固定化には、ジェネティクス(Genetics)のマイクロアレイ装置(イギリス)とプロテオゼン(Proteogen Co.)のマイクロアレイ装置(韓国)を用いた。連続した9個のグアニン塩基を有するオリゴ遺伝子を6.75pmol/μlでBMTスポッティング(spotting)溶液に溶かし、固定化溶液を製造した。上記固定化溶液を、アレイピンを用いて、実施例6と同様の方式で製造された図1に提示された形態のイミンカリックスアレーン誘導体単分子層のガラス基質(ガラススライド)に1−5nLずつ塗布して、オリゴ遺伝子を直径150−180μmのスポット内に固定化した。1−4時間後にガラススライドを500mlのBMT Wa−A−1溶液で1分間1回洗浄し、BMT Wa−A−2溶液で2回洗浄した後、乾燥して、製造した。オリゴ遺伝子が固定化された以外の位置をブロッキング(blocking)するために、洗浄したガラススライドを250mlのBMTブロッキング溶液内に入れ、30分間処理を行った。その後、さらに500mlのBMT Wa−A−1溶液で3分間1回洗浄し、BMT Wa−A−2溶液で2回洗浄した後、水分を除去して乾燥して、製造した。
多重分子認識によって9個の連続したグアニン塩基を有するオリゴ遺伝子だけを非可逆的に固定化する方法
図4に示したオリゴ遺伝子の固定化には、ジェネティクスのマイクロアレイ装置(イギリス)を用いた。下記表1の9A、9G、9C、9T、no、ビオチン等の6種のそれぞれ異なる固定化用作用基の固定化効率を確認するために、それぞれのオリゴ遺伝子を6.75pmol/μlでBMTスポッティング溶液に溶かし、固定化溶液を製造した。上記固定化溶液を、アレイピンを用いて、実施例6と同様の方式で製造された図1に提示された形態のイミンカリックスアレーン誘導体単分子層ガラス基質(ガラススライド)に1−5nLずつ塗布して、オリゴ遺伝子を直径150−180μmのスポット内に固定化した。1−4時間後にガラススライドを500mlのBMT Wa−A−1溶液で1分間1回洗浄し、BMT Wa−A−2溶液で2回洗浄した後、乾燥して、製造した。オリゴ遺伝子が固定化された以外の位置をブロッキングするために、洗浄したガラススライドを250mlのBMTブロッキング溶液内に入れ、30分間処理を行った後、さらに500mlのBMT Wa−A−1溶液で3分間1回洗浄し、BMT Wa−A−2溶液で2回洗浄した。水分を除去して乾燥した後、図4に示したオリゴ遺伝子チップを製造した後、直径が0.8cmのハイブリダイゼーション用チャンバを強固に付着した。
次の蛍光付着された標的遺伝子とのハイブリダイゼーションのために、1.5mlのチューブに、2pmol/μlの濃度の蛍光が付着された標的遺伝子2μlと、BMT hyb−mixA58μlとの比率で混合溶液を製造した。これを100℃の水で3分間加熱し、氷の上で3分間放置して冷却した後、60μlの混合溶液を、ハイブリダイゼーション用チャンバが付着されたガラススライドに注入した。ガラススライドを、湿度が保持される恒温オーブンにて、50℃で30分間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションが終わったガラススライドを、30℃の恒温槽においてBMT Wa−B−1(4×SSC、0.1%SDS)溶液で2分間、常温でBMT Wa−B−2(4×SSC)溶液で2分間ずつ、2回繰り返して洗浄した。乾燥した後、マイクロアレイスキャナ(GSI Lumonics、米国)を用いて蛍光感度を定量的に分析した。実際の結果は、図5に示されたとおりである。上記結果は、9個のグアニン塩基を有するオリゴ遺伝子は高密度で固定化が進められ、他の塩基は、固定化に影響を与えないことを示す。
1−15個の連続したグアニン塩基を有するオリゴ遺伝子が多重分子認識によって非可逆的に固定化されるときの効率比較方法
図6に示したオリゴ遺伝子の固定化には、ジェネティクスのマイクロアレイ装置(イギリス)を用いた。下記表2の1G、4G、7G、9G、12G、15G等の6種のそれぞれ異なる固定化用作用基の固定化効率を確認するために、それぞれのオリゴ遺伝子を6.75pmol/μlでBMTスポッティング溶液に溶かし、固定化溶液を製造した。上記固定化溶液を、アレイピンを用いて、実施例6と同様の方式で製造された図1に提示された形態のイミンカリックスアレーン誘導体単分子層のガラス基質(ガラススライド)に1−5nLずつ塗布して、オリゴ遺伝子を直径150−180μmのスポット内に固定化した。4時間後にガラススライドを500mlのBMT Wa−A−1溶液で1分間1回洗浄し、BMT Wa−A−2溶液で2回洗浄した後、乾燥して、製造した。オリゴ遺伝子が固定化された以外の位置をブロッキングするために、洗浄したガラススライドを250mlのBMTブロッキング溶液内に入れ、30分間処理を行った。さらに、500mlのBMT Wa−A−1溶液で3分間1回洗浄し、BMT Wa−A−2溶液で2回洗浄した後、水分を除去した。乾燥した後、図4に示されたオリゴ遺伝子チップを製造し、直径が0.8cmのハイブリダイゼーション用チャンバを強固に付着した。
次の実施例9において用いられたものと同一の蛍光付着された標的遺伝子とのハイブリダイゼーションのために、1.5mlのチューブに、2pmol/μlの濃度の蛍光が付着された標的遺伝子2μlと、BMT hyb−mixA58μlとの比率で混合溶液を製造した。これを100℃の水で3分間加熱し、氷の上で3分間放置して冷却した後、60μlの混合溶液を、ハイブリダイゼーション用チャンバが付着されたガラススライドに注入した。ガラススライドを、湿度が保持される恒温オーブンにて、50℃で30分間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションが終わったガラススライドを、30℃の恒温槽においてBMT Wa−B−1(4×SSC、0.1%SDS)溶液で2分間、常温でBMT Wa−B−2(4×SSC)溶液で2分間ずつ、2回繰り返して洗浄した。乾燥した後、マイクロアレイスキャナ(GSI Lumonics、米国)を用いて蛍光感度を定量的に分析した。実際の結果は、図6に示されたとおりである。上記結果は、固定化のために7個の連続したグアニン塩基以上の連続したグアニン塩基が必要であることを示している。さらに、9個の連続したグアニン塩基の場合に、最も高い固定化密度を示すことが分かる。
イミダゾールとの競争反応を通じた多重分子認識によるオリゴ遺伝子固定化の証明
図7で示したオリゴ遺伝子の固定化には、ジェネティクスのマイクロアレイ装置(イギリス)を用いた。5’−GGG GGG GGG AAA TCA ACC CAC AGC TGC A−3’(配列番号1)の塩基配列を有するオリゴ遺伝子を6.75pmol/μlでBMTスポッティング溶液に溶かし、固定化溶液を製造した。上記固定化溶液を、アレイピンを用いて、実施例6と同様の方式で製造された図1に示された形態のイミンカリックスアレーン誘導体単分子層ガラス基質(ガラススライド)に1−5nLずつ塗布して、オリゴ遺伝子を直径150−180μmのスポット内に固定化した。但し、それぞれ異なる濃度のイミダゾールを図7に示した濃度で含まれるようにして、固定化溶液を塗布した。3時間後、ガラススライドを500mlのBMT Wa−A−1溶液で1分間1回洗浄し、BMT Wa−A−2溶液で2回洗浄し、乾燥して、製造した。オリゴ遺伝子が固定化された以外の位置をブロッキングするために、洗浄したガラススライドを250mlのBMTブロッキング溶液内に入れ、30分間処理を行った。さらに、500mlのBMT Wa−A−1溶液で3分間1回洗浄し、BMT Wa−A−2溶液で2回洗浄した後、水分を除去して乾燥した後、図4に示されたオリゴ遺伝子チップを製造し、直径が0.8cmのハイブリダイゼーション用チャンバを強固に付着した。
BMT Wa−A−1(2×SSC、0.1%SDS)
BMT Wa−A−2(0.1×SSC)
BMTブロッキング溶液(牛乳カゼイン5%水溶液)
BMT hyb−mixA(4×SSC、0.1%SDS、50%グリセロール、1×PBS)
BMT Wa−B−1(4×SSC、0.1%SDS)
BMT Wa−B−2(4×SSC)
5,11,17,23−テトラアミノカリックス[4]アレーンの合成
5,11,17,23−テトラニトロカリックス[4]アレーン(TNCA;tetranitrocalix[4]arene)を出発物質として用い、上記参考文献3に提示された合成方法で合成して、淡黄色の固体生成物、5,11,17,23−テトラアミノカリックス[4]アレーン(TACA;tetraaminocalix[4]−arene)を75%の収率で得た。
5,11,17,23−テトラ(2,4−ジメチル)ジベンジルアミノカリックス[4]アレーンの合成
乾燥された丸底フラスコに、マグネチック棒とTACA(1.0g、2.05mmol)とヨウ化ナトリウム(3.0g、20.5mmol)を仕込み、減圧乾燥した。乾燥後、無水アセトニトリル50mlを仕込んだ後、窒素交流下、加熱器で撹拌した。5分後、2,4−ジメチルベンジルブロマイド(16.2g、82mmol)を反応容器に仕込んだ後、温度をあげて交流撹拌しながらピリジン(6.62ml、82mmol)を仕込み、6時間の間反応させた。反応後、反応容器は、常温で冷やした後、溶媒は減圧下で除去した後、CH2Cl2150mlに溶かした後、水で2回有機層を洗浄した。有機層を乾燥した後、減圧下で濾過し、濾液は減圧除去した後、CH2Cl2/MeOHで再結晶し、淡灰色の固体生成物、5,11,17,23−テトラ(2,4−ジメチル)ジベンジルアミノカリックス[4]アレーン(2,4−DMTDBACA)2.1g(収率80%)を得た。
1H NMR(300MHz,CDCl3);δ 10.14(s,4H,ArOH),7.28 7.12(m,24H,ArH),6.03(s,8H,ArH),4.24(s,16H,ArNCH2),4.11(d,4H,ArCH2Ar,13Hz),3.10(d,4H,ArCH2Ar,13Hz),2.43(s,12H,ArCH3),2.28(s,12H,ArCH3)
5,11,17,23−(2,4−ジメチル)ベンジルイミンカリックス[4]アレーンの合成
乾燥された丸底フラスコに、TACA(100mg、0.2mmol)とマグネチック棒を仕込み、準備した。反応容器に15mlのアセトニトリルを仕込んだ後、撹拌した。2,4−ジメチルベンズアルデヒド(322mg、2.4mmol)を仕込んだ後、窒素交流下で、2時間の間に常温で撹拌反応させた。反応後、減圧濾過して、減圧下で溶媒を除去した後、反応物を適正量のCH2Cl2に溶かし、n−ヘキサン15mlを注いで、淡褐色の固体生成物を得た。生成物は、さらに3mlのCH2Cl2に溶かした後、n−ヘキサン15mlを加え、淡褐色の固体生成物、5,11,17,23−テトラ(2,4−ジメチル)ベンジルイミンカリックス[4]アレーン(2,4−DMICA)155mg(収率81%)を得た。
1H NMR(300MHz,CDCl3);δ 10.19(s,4H,ArOH),8.54(s,8H,N=CH),7.79(d,4H,ArH),7.02(s,4H,ArH),7.01(d,4H,ArH),6.96(s,8H,ArH),4.30(d,4H,ArCH2Ar,13Hz),3.61(s,4H,ArCH2Ar,13Hz),2.43(s,12H,ArCH3),2.30(s,12H,ArCH3)
5,11,17,23−テトラ(2,4−ジメチル)ベンジルアミノカリックス[4]アレーンの合成
乾燥された丸底フラスコに、2,4−DMICA(100mg、0.1mmol)とマグネチック棒を仕込み、減圧乾燥した後、窒素交流下、無水THF20mlを仕込んで撹拌した。10分後にBH3/THF1.0M溶液(0.8ml、0.8mmol)を仕込んだ後、常温で3時間反応させた。反応後、溶媒は減圧下で除去し、フラスコに残留する生成物は、CH2Cl2に溶かした後、0.1M HCl水溶液でそれぞれ2回洗った後、蒸留水で2回洗った。有機層を分離して、乾燥した後、減圧濾過して、濾液を減圧除去し、CH2Cl2/ヘキサンで再結晶して、淡黄色の固体生成物、5,11,17,23−テトラ(2,4−ジメチル)ベンジルアミノカリックス[4]アレーン(2,4−TDMBACA)72mg(収率75%)を得た。
1H NMR(300MHz,CDCl3);δ 9.86(s,4H,ArOH),7.33−7.18(m,12H,ArH),6.21(s,8H,ArH),4.21−4.09(m,16H,ArCH2Ar,ArNHCH2),3.58(s,4H,NH),3.22(d,4H,ArCH2Ar),2.43(s,12H,ArCH3),2.28(s,12H,ArCH3)
5,11,17,23−テトラ(2,4−ジメチルテトラベンジル)ベンジルアミノカリックス[4]アレーンの合成
乾燥された丸底フラスコに、マグネチック棒と2,4−TDMBACA(500mg、0.5mmol)とヨウ化ナトリウム(80mg、0.5mmol)とを仕込み、減圧乾燥した。乾燥後、無水アセトニトリル50mlを仕込んだ後、窒素交流下、加熱器で撹拌した。5分後、ベンジルブロマイド(1.1ml、10mmol)を反応容器に仕込み、交流攪拌した。反応容器にピリジン(0.8ml、10mmol)を仕込んだ後、6時間の間反応させた。反応後、反応容器は常温で冷やした後、溶媒は減圧除去して、CH2Cl260mlに溶かし、水で洗った後、有機層を乾燥して減圧濾過し、濾液は減圧除去した後、CH2Cl2/MeOHで再結晶して、淡灰色の固体生成物、5,11,17,23−テトラ(2,4−ジメチルテトラベンジル)ベンジルアミノカリックス[4]アレーン(TB(2,4−DMTB)ACA)521mg(収率79%)を得た。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ 10.01(s,4H,ArOH),7.35−7.10(m,34H,ArH),6.20−6.06(br,8H,ArH),4.31−4.01(m,16H,ArCH2Ar,ArNHCH2),3.14(d,4H,ArCH2Ar),2.45(s,12H,ArCH3),2.27(s,12H,ArCH3)
5,11,17,23−テトラ(2,4−ジメチル)ジベンジルアミノカリックス[4]アレーン−1,3−ヘキサナールの合成
乾燥された丸底フラスコに、マグネチック棒と2,4−DMTDBACA(500mg、0.35mmol)、K2CO3(487mg、3.5mmol)、ヨウ化ナトリウム(473mg、3.15mmol)を順次仕込んだ後、無水アセトニトリル130mlを、窒素交流下、反応容器に仕込み、加熱器で撹拌した。6−ブロモヘキサナール(376mg、2.1mmol)を仕込んだ後、16時間交流撹拌した。反応後、反応物を常温で冷やした後、減圧下で溶媒を除去する。130mlのCH2Cl2に反応物を溶かして、減圧濾過し、濾過された濾液は減圧除去した後、MeOH/CH2Cl2で再結晶し、減圧濾過して、淡黄色の固体生成物、5,11,17,23−テトラ(2,4−ジメチル)ジベンジルアミノカリックス[4]アレーン−1,3−ヘキサンアルデヒド(2,4−DMTDBACAHA)432mg(収率76%)を得た。
1H NMR(300MHz,CDCl3);δ 9.78(s,2H,CHO),7.317.04(m,12H,ArH),6.11−6.02(br,8H,ArH),4.41−4.13(m,20H,ArNCH2,ArCH2Ar),3.89(t,4H,OCH2),3.05(d,4H,ArCH2Ar,13Hz),2.57−2.49(t,4H,CHOCH2),2.45−2.39(m,12H,ArCH3),2.31−2.25(m,12H,ArCH3),2.12−1.98(t,OCH2CH2),1.78−1.62(m,8H,CH2CH2)
5,11,17,23−テトラ(2,4−ジメチルテトラベンジル)ベンジルアミノブロモブトキシカリックス[4]アレーンの合成
乾燥された丸底フラスコに、2,4−TDMBACA(500mg、0.5mmol)と、無水K2CO3(619mg、5.0mmol)と、ヨウ化ナトリウム(674mg、4.5mmol)を仕込み、無水アセトニトリル160mlを仕込んで、常温で15分間撹拌した。反応容器に1、4−ジブロモブタン(1.03g、0.6ml、5.0mmol)を仕込み、20時間の間交流撹拌した。反応容器を常温で冷やした後、溶媒は減圧除去し、CH2Cl2に溶かした後、減圧濾過して、濾液は減圧除去した後、EA/ヘキサンで再結晶し、減圧濾過して、淡褐色の固体生成物、5,11,17,23−テトラ(2,4−ジメチルテトラベンジル)ベンジルアミノブロモブトキシカリックス[4]アレーン(TB(2,4−DMTB)ABCA)610mg(収率77%)を得た。
1H NMR(300MHz,CDCl3);δ 7.81(s,2H,ArOH),7.297.04(m,34H,ArH),6.06−6.02(d,8H,ArH),4.38−4.11(m,20H,ArNCH2,ArCH2Ar),3.89(t,4H,OCH2),3.04(d,4H,ArCH2Ar,13Hz),2.46−2.43(m,12H,ArCH3),2.41−2.40(m,12H,ArCH3)2.31−2.27(t,4H,BrCH2),2.16−2.06(m,8H,CH2CH2)
5,11,17,23−テトラ(2,4−ジメチルテトラベンジル)ベンジルアミノメルカブトブトキシカリックス[4]アレーンの合成
乾燥された丸底フラスコに、TB(2,4−DMTB)ABCA(500mg、0.31mmol)と、カリウム チオアセテート(212mg、1.86mmol)を仕込み、無水アセトン60mlに溶かして、窒素交流下、90分間常温でソニック反応させた。反応後、溶媒を減圧除去した後、30mlのCH2Cl2に溶かして減圧濾過した後、濾液を水で2回洗い、有機層を分離して、乾燥した。有機層を減圧濾過し、濾液を減圧乾燥した後、得られた固体をEA/n−ヘキサンを用いて再結晶し、減圧濾過して、淡黄色の固体結晶を得た。得られた固体結晶を丸底フラスコに仕込み、CH2Cl2:メタノール=5:1の比率の混合溶液に溶かして、常温で、窒素交流下でソニック反応させた。1分後、1.0M KOH(1.5ml、1.5mmol)を仕込み、30分間ソニック反応させた。反応後、溶媒を減圧除去した後、CH2Cl2に溶かし、0.1M HCl水溶液で洗った。有機層を分離した後、乾燥して、減圧濾過し、濾液は減圧下で溶媒を除去し、CH2Cl2/MeOHを用いて再結晶すると、淡黄色の5,11,17,23−テトラ(2,4−メトキシ)ベンジルアミノメルカプトブトキシカリックス[4]アレーン(TB(2,4−DMTB)AMBCA)を320mg(収率73%)得た。
1H NMR(300MHz,CDCl3);δ 7.84(s,2H,ArOH),7.297.01(m,34H,ArH),6.25−6.19(br,8H,ArH),4.36−4.11(m,20H,ArNCH2,ArCH2Ar),3.90(t,4H,OCH2),3.05(d,4H,ArCH2Ar,13Hz),2.30(t,4H,SHCH2),2.45−2.39(m,12H,ArCH3),2.31−2.25(m,12H,ArCH3)2.05−2.02(m,CH2CH2)
図8のようなアミノカリックスアレーン誘導体単分子層の製造
CHCl3等の有機溶媒に、実施例17で合成された2,4−DMTDBACAHAを0.1−5mMの濃度で溶かした溶液を製造した。図8のように、アミン作用基が付着されたスライドグラス(アミンチップ)を、製造した溶液に1−24時間の間浸漬した後、取り出して、これをクロロホルムとアセトン、及び水でそれぞれ洗浄し、乾燥すると、図8に示されたアミノカリックスアレーン誘導体単分子層(BMTオリゴ遺伝子チップA型)が製造される。前述したA型を、BH3−THFやNaBH4inMeOH還元剤の中に1−10分間入れて置いた後、水(DI water)で3回洗浄して、窒素雰囲気下で乾燥し、図8に示されたアミノカリックスアレーン誘導体単分子層(BMTオリゴ遺伝子チップB型)を製造する。
図9のような金基質におけるアミノカリックスアレーン誘導体単分子層の製造
CHCl3等の有機溶媒に、実施例19で合成されたTB(2,4−DMTB)AMBCAを0.1−5mMの濃度で溶かした溶液を製造した。図9のように、金基質を製造した溶液に1−24時間の間浸漬した後、取り出して、これをクロロホルムとアセトン、及び水でそれぞれ洗浄し、乾燥すると、図9に示されたアミノカリックスアレーン誘導体単分子層が製造される。アミノカリックスアレーンの他の誘導体も、同様の方法で単分子層が製造される。ここに用いられる金基質は、多様な形態で用いることができるが、一般的に、ガラス、溶融石英(fused silica)、シリコンウエハ、プラスチック等にクロム(Cr)やチタン(Ti)等を2−10nmで真空蒸着した後、金を50−200nmの厚さで真空蒸着した基質が好ましい。このようにして製造された金基質は、使用直前にピラニア溶液(濃硫酸:30%過酸化水素水=3:1で混合した混合溶液)に10秒乃至1分間程浸漬した後、水で洗浄し、窒素交流下で乾燥して、直ちに用いる。単分子層の生成は、表面反射赤外線分光分析法(FTIR−ERS)を用いて分析する。
図12のアミノカリックスアレーン誘導体単分子層上に多重分子認識によって非可逆的に固定化されたグアニン塩基の最適個数の判別
−多重分子認識によるアミノカリックスアレーン誘導体単分子層上におけるオリゴ遺伝子の固定化
アミノカリックスアレーン誘導体単分子層上に多重分子認識に適合したグアニン個数の決定のために用いられるサンプル溶液及び濃度組成等は、表3のとおりである。先ず、オリゴ遺伝子の固定化のために用意されたアミノカリックスアレーン誘導体単分子層上に、下記表4の1G、4G、7G、9G、12G、15G個の連続したグアニン塩基を有したそれぞれのオリゴ遺伝子(100pmol/μl)10μlと、BMTスポッティング溶液3の148μlとの混合溶液を、マイクロアレイヤ(microarrayer)(Genetix Qarray2)を用いて1−5nlずつ塗布し、直径が150−180μmの大きさで、常温で時間別に、1時間、2時間、4時間の間、それぞれを固定化用チャンバにて固定化した。固定化後に、アミノカリックスアレーン誘導体単分子層は、余分のオリゴ遺伝子を除去するために、BMT Wa−A−1(2×SSC、0.1%SDS)で常温で1分間洗浄した後、BMT Wa−A−2(0.1×SSC)で洗浄し、BMTブロッキング溶液(牛乳カゼイン5%水溶液)により常温で30分間ブロッキングを行った。処理されたアミノカリックスアレーン誘導体単分子層は、BMT Wa−B−1(4×SSC、0.1%SDS)で常温で3分間洗浄した後、BMT Wa−A−2(0.1×SSC)洗浄瓶(wash−bottle)で洗浄し、乾燥した。
オリゴ遺伝子の固定化後に乾燥したアミノカリックスアレーン誘導体単分子層は、蛍光が付着されたCy3−DNAとのハイブリダイゼーションのために、先ず、ハイブリダイゼーション用チャンバを単分子層上に付着した後、表4に明示されたCy3−DNA(5nmol/ml)2μlをBMThyb−mixA(4×SSC、0.002%SDS、50%グリセロール、1×PBS)58μlと混合して、100℃の水で3分間加熱し、氷の上で3分間放置した後、マイクロピペットを用いて60μlずつ塗布し、その後、湿度が維持される恒温インキュベーターにおいて50℃で30分間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、アミノカリックスアレーン誘導体単分子層の洗浄のために、BMT Wa−B−1(4×SSC、0.1%SDS)で30℃で2分間洗浄した後、BMT Wa−B−2(4×SSC)で常温で2分間の洗浄を2回繰り返して乾燥し、蛍光スキャナ(GSI Lumonics、米国)を用いて、示される蛍光感度を分析した。実際の結果は、図12のとおりである。上記結果は、アミノカリックスアレーン誘導体単分子層上に多重分子認識によってオリゴ遺伝子が固定化されるとき、最小7個以上のグアニン塩基が必要であり、9個のグアニン塩基の場合が、もっとも高密度で固定化されることを示す結果である。
図14及び図15の最適空間配列による単一塩基変異(SNP;Single Nucleotide Polymorphism)の差別化確認実験
−アミノカリックスアレーン誘導体単分子層上におけるSNPの確認
アミノカリックスアレーン誘導体単分子層上におけるSNPの確認のための実験は、先ず、オリゴ遺伝子の固定化のために用意したアミノカリックスアレーン誘導体単分子層上に、表6の塩基配列が同じ位置で1個ずつだけ異なるそれぞれのオリゴ遺伝子(100pmol/μl)9.1μlと、BMTスポッティング溶液1の35.9μlとを混合した混合溶液を、マイクロアレイヤ(Genetix Qarray2)を用いて1−5nlずつ150−180μmの大きさで塗布した後、常温で3時間の間固定化用チャンバにおいて固定化した。固定化後に、アミノカリックスアレーン誘導体単分子層は、余分のオリゴ遺伝子を除去するために、BMT Wa−A−1(2×SSC、0.1%SDS)で常温で1分間洗浄した後、BMT Wa−A−2(0.1×SSC)で洗浄し、BMTブロッキング溶液(牛乳カゼイン5%水溶液)により常温で30分間ブロッキングを行った。処理されたアミノカリックスアレーン誘導体単分子層は、BMT Wa−B−1(4×SSC、0.1%SDS)で常温で3分間洗浄した後、BMT Wa−A−2(0.1×SSC)洗浄瓶で洗浄した後、乾燥した。
ハイブリダイゼーションのために、先ず、ハイブリダイゼーション用チャンバを単分子層上に付着した後、表6に明示されたそれぞれのc−DNA(5nmol/μl)2μlをBMThyb−mixA(4×SSC、0.002%SDS、50%グリセロール、1×PBS)28μlと混合して、100℃の水で3分間加熱し、氷の上で3分間放置して冷やした後、マイクロピペットを用いて30μlずつ塗布し、55℃の恒温インキュベーターにおいて30分間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、アミノカリックスアレーン誘導体単分子層の洗浄のために、BMT Wa−B−1(4×SSC、0.1%SDS)で30℃で2分間洗浄した後、BMT Wa−B−2(4×SSC)で常温で2分間の洗浄を2回繰り返して乾燥し、蛍光が付着されたDNA(Cy3−DNA)とハイブリダイゼーションが可能なオリゴ遺伝子単分子層を用意した。
C−DNAとのハイブリダイゼーションを終えた単分子層上において蛍光が付着されたCy3−DNAとのハイブリダイゼーションのために、先ず、ハイブリダイゼーション用チャンバを付着した後、表6のCy3−DNA(5nmol/ml)2μlをBMThyb−mixA(4×SSC、0.002%SDS、50%グリセロール、1×PBS)28μlと混合して、100℃の水で3分間加熱した後、氷の上で3分間放置して冷やし、マイクロピペットを用いて30μlずつ塗布した後、恒湿インキュベーターにおいて45℃で30分間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、アミノカリックスアレーン誘導体単分子層の洗浄のために、BMT Wa−B−1(4×SSC、0.1%SDS)で30℃で2分間洗浄した後、BMT Wa−B−2(4×SSC)で常温で2分間の洗浄を2回繰り返して乾燥し、蛍光スキャナ(GSI Lumonics、米国)を用いてSNP差別化の有無を蛍光感度で確認した。結果は、図14及び図15に示されたとおりであり、ハイブリダイゼーションにおいて、一つの差がある何らのオリゴ遺伝子が固定化された箇所にも他の遺伝子は結合しないという結果を見せており、本発明において開発された技術が、固定化されるオリゴ遺伝子を適切な水準の空間を確保して配列し、オリゴ遺伝子の間の最適の空間配列により、迅速かつ正確にSNPの差別化を具現することができる結果を示した。
図10及び図11の最高密度固定化実験
−オリゴ遺伝子の固定化
アミノカリックスアレーン誘導体単分子層上にオリゴ遺伝子を固定化する方法は、先ず、オリゴ遺伝子の固定化のために用意したアミノカリックスアレーン誘導体単分子層上に、表7のオリゴ遺伝子(100pmol/μl)9.1μlと、BMTスポッティング溶液1の35.9μlとの混合溶液を、マイクロアレイヤ(Genetix Qarray2)を用いて1−5nlずつ塗布した後、常温で3時間の間固定化用チャンバにおいて固定化した。固定化後に、アミノカリックスアレーン誘導体単分子層は、余分のオリゴ遺伝子を除去するために、BMT Wa−A−1(2×SSC、0.1%SDS)で常温で1分間洗浄した後、BMT Wa−A−2(0.1×SSC)で洗浄し、BMTブロッキング溶液(牛乳カゼイン5%水溶液)により常温で30分間ブロッキングを行った。処理されたアミノカリックスアレーン誘導体単分子層は、BMT Wa−B−1(4×SSC、0.1%SDS)で常温で3分間洗浄した後、BMT Wa−A−2(0.1×SSC)洗浄瓶で洗浄した後、乾燥した。
蛍光付着されたCy3−DNAとのハイブリダイゼーションのために、先ずハイブリダイゼーション用チャンバを付着した後、表7のCy3−DNA(5nmol/ml)2μlをBMThyb−mixA(4×SSC、0.002%SDS、50%グリセロール、1×PBS)28μlと混合して、100℃の水で3分間加熱し、氷の上で3分間放置して冷やした後、マイクロピペットを用いて30μlずつ塗布した後、50℃のインキュベーターにおいて30分間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、アミノカリックスアレーン誘導体単分子層の洗浄のために、BMT Wa−B−1(4×SSC、0.1%SDS)で30℃で2分間洗浄した後、BMT Wa−B−2(4×SSC)で常温で2分間の洗浄を2回繰り返して乾燥し、蛍光スキャナを用いて、示される蛍光感度を確認し、理論的な蛍光感度との比較分析をした。
アミノカリックスアレーン誘導体の上で、表7の蛍光が付着されたCy3−DNAを理論的な最大値の1/2(0.675fmol/nl)1−5nlを、マイクロアレイヤ(Genetix Qarray2)を用いて塗布し、乾燥した後、蛍光スキャナを用いて分析した。理論的な蛍光感度と実験的な蛍光感度とを比較した結果は図10及び図11に示されており、理論的な最大値の1/2水準の蛍光付着されたCy3−DNAを用いた結果が、ハイブリダイゼーションを介して固定化されたオリゴ遺伝子において現われる結果と同様に示され、理論的な最大値に近接した水準のオリゴ遺伝子が固定化されていることを示す結果となった。
図16の9A、9T、9G、9C−DNAとの競争反応を用いた9個のグアニン塩基のみの非可逆的固定化確認実験
競争反応のためのオリゴ遺伝子の準備は、表7のような組成で用意した。このとき、競争反応に用いられた他のDNAは表8に明示されており、濃度は、0倍、1倍、2倍、4倍で含まれるようにした。オリゴ遺伝子の固定化は、アミノカリックスアレーン誘導体単分子層上に、表7と同様の方法で製造されたそれぞれのオリゴ遺伝子混合溶液をマイクロピペットにより1μlずつ2mmの大きさでスポッティングし、常温で1時間の間固定化用チャンバにおいて固定化した。固定化後に、アミノカリックスアレーン誘導体単分子層は、余分のオリゴ遺伝子を除去するために、BMT Wa−A−1(2×SSC、0.1%SDS)で常温で1分間洗浄した後、BMT Wa−A−2(0.1×SSC)で洗浄し、BMTブロッキング溶液(牛乳カゼイン5%水溶液)により常温で30分間ブロッキングを行った。処理されたアミノカリックスアレーン誘導体単分子層は、BMT Wa−B−1(4×SSC、0.1%SDS)で常温で3分間洗浄した後、BMT Wa−A−2(0.1×SSC)洗浄瓶で洗浄し、乾燥した。
蛍光付着されたCy3−DNAとのハイブリダイゼーションのために、先ず、ハイブリダイゼーション用チャンバを付着した後、表8のCy3−DNA(10nmol/ml)10μlをBMThyb−mixA(4×SSC、0.002%SDS、50%グリセロール、1×PBS)590μlと混合して、マイクロピペットを用いて600μlずつ塗布した後、50℃のインキュベーターにおいて30分間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、アミノカリックスアレーン誘導体単分子層の洗浄のために、BMT Wa−B−1(4×SSC、0.1%SDS)で30℃で2分間洗浄した後、BMT Wa−B−2(4×SSC)で常温で2分間の洗浄を2回繰り返して乾燥し、蛍光スキャナ(GSI)を用いて、示される蛍光感度を確認した。上記結果は図16に示されており、この結果は、9個のグアニンだけが非可逆的な多重分子認識によって固定化され、実際に、他の塩基は、連続しているかしていないかに関係なく、固定化に大きな影響を及ばせないことを示す結果である。この結果は、ハイブリダイゼーションに用いられるべき塩基が固定化に参加せずに連続した特定の塩基配列のみが固定化に参加して、ハイブリダイゼーションに必須な塩基が常に一定の数を維持し、かつ再現性のあるハイブリダイゼーションの結果が得られる、オリゴ遺伝子チップの製造技術を示す実際の実験結果である。
Claims (12)
- 下記化学式5のアミノカリックスアレーン誘導体:
- 下記化学式6のアミノカリックスアレーン誘導体:
- 下記化学式7のアミノカリックスアレーン誘導体:
- 下記化学式8のアミノカリックスアレーン誘導体:
- 下記化学式6又は下記化学式8のアミノカリックスアレーン誘導体のうち、チオール基が付着されたアミノカリックスアレーン誘導体を金基質に付着して製造した自己組織化単分子層の固体基質。
- アミン作用基が付着されているガラス、シリコンウエハ及び水晶結晶からなる群より選択される固体基質に、下記化学式6又は下記化学式8のアミノカリックスアレーン誘導体のうち、アルデヒド作用基が末端基に付着されたアミノカリックスアレーン誘導体を利用してイミン結合及びこれを還元したアミン結合を通じて付着して製造した自己組織化単分子層の固体基質。
- アミン作用基が付着されているガラス、シリコンウエハ及び水晶結晶からなる群より選択される固体基質に、下記化学式6又は下記化学式8のアミノカリックスアレーン誘導体のうち、アルデヒド作用基が末端基に付着されたアミノカリックスアレーン誘導体を利用して、エステル、エーテル及びアミド結合からなる群より選択される化学結合を通じて付着して製造した自己組織化単分子層の固体基質。
- 請求項5乃至7のうちいずれか一項の自己組織化単分子層の固体基質に、7個以上の連続したグアニン塩基が付着されたオリゴ遺伝子を多重分子認識によって固定化して製造されるオリゴ遺伝子チップ。
- 請求項5乃至7のうちいずれか一項の自己組織化単分子層の固体基質に、7個以上の連続したグアニン塩基が付着されたオリゴ遺伝子を多重分子認識によって固定化してオリゴ遺伝子チップを製造する方法。
- 請求項10の自己組織化単分子層の固体基質に、7個以上の連続したグアニン塩基が付着されたオリゴ遺伝子を多重分子認識によって固定化して製造されるオリゴ遺伝子チップ。
- 請求項10の自己組織化単分子層の固体基質に、7個以上の連続したグアニン塩基が付着されたオリゴ遺伝子を多重分子認識によって固定化してオリゴ遺伝子チップを製造する方法。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020050096322A KR100748082B1 (ko) | 2005-10-13 | 2005-10-13 | 신규한 이민캘릭스아렌 유도체, 이의 제조방법, 및 상기제조방법에 의해 제조된 자기조립 단분자층, 상기 자기조립단분자층을 이용한 올리고dna 고정화 방법 및 이에의해 제조된 올리고dna 칩 |
KR10-2005-0096322 | 2005-10-13 | ||
KR1020050105340A KR100786577B1 (ko) | 2005-11-04 | 2005-11-04 | 신규한 아미노캘릭스아렌 유도체, 이의 제조방법, 및상기의 제조방법에 의해 제조된 자기조립단분자층, 상기자기조립 단분자층에 자발적인 올리고유전자의 비가역적인분자인식에 의한 올리고유전자 고정화 방법 및 이에 의해제조된 올리고유전자 칩 |
KR10-2005-0105340 | 2005-11-04 | ||
PCT/KR2006/001753 WO2007043736A1 (en) | 2005-10-13 | 2006-05-11 | Novel iminecalixarene derivatives and aminocalixarene derivatives, method of preparation thereof, and self-assembled monolayer prepared by the method, fixing method of oligo-dna by using the self-assembled monolayer, and oligo-dna chip prepared by the method |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2009515822A JP2009515822A (ja) | 2009-04-16 |
JP5111382B2 true JP5111382B2 (ja) | 2013-01-09 |
Family
ID=37942944
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008535434A Active JP5111382B2 (ja) | 2005-10-13 | 2006-05-11 | 新規なイミンカリックスアレーン誘導体とアミノカリックスアレーン誘導体、その製造方法及び該製造方法によって製造された自己組織化単分子層、該自己組織化単分子層を利用したオリゴ遺伝子の固定化方法及びこれによって製造されたオリゴ遺伝子チップ |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US8013188B2 (ja) |
EP (3) | EP1934170A4 (ja) |
JP (1) | JP5111382B2 (ja) |
WO (1) | WO2007043736A1 (ja) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8013188B2 (en) * | 2005-10-13 | 2011-09-06 | Biometrix Technology Inc. | Iminecalixarene derivatives and aminocalixarene derivatives, method of preparation thereof, and self-assembled monolayer prepared by the method, fixing method of oligo-DNA by using the self-assembled monolayer, and oligo-DNA chip prepared by the method |
US20080194798A1 (en) * | 2005-11-01 | 2008-08-14 | Tae Sun Kim | Novel Iminecalixarene Derivatives, Method for Preparing the Same, Self-Assembled Monolayer Prepared by Using the Iminecalixarene Derivatives or Aminocalixarene, and Protein Chip Using the Self-Assembled Monolayer |
KR100883763B1 (ko) * | 2007-11-15 | 2009-02-25 | (주)바이오메트릭스 테크놀로지 | 아미노캘릭스아렌 유도체와 이민캘릭스아렌 유도체의단분자층으로 변성된 유리섬유 및 그의 제조방법과, 변성된유리섬유에 유전자를 고정화한 유리섬유 및 그의제조방법, 그리고 유전자 고정화된 유리섬유를 이용한유전자 형분석용 스트립 제조방법 |
KR100924243B1 (ko) | 2007-11-19 | 2009-10-29 | (주)바이오메트릭스 테크놀로지 | 상온 교잡반응이 가능한 유전자칩 및 칩 제조를 위한 탐침 유전자 디자인 신기술 |
JP5093661B2 (ja) * | 2007-12-06 | 2012-12-12 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 生体関連物質センシングのための基板及びこれを用いたタンパク、金属イオン等の回収方法もしくは検出方法 |
WO2009104926A1 (ko) * | 2008-02-21 | 2009-08-27 | (주)차바이오메드 | Hpv 지노타이핑용 칩 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2863883B2 (ja) * | 1992-01-27 | 1999-03-03 | 科学技術振興事業団 | 流動複屈折性を示すカリックスアレーン誘導体 |
US6033773A (en) * | 1997-04-18 | 2000-03-07 | The Regents Of The University Of California | Polar self-assembled thin films for non-linear optical materials |
KR100698763B1 (ko) * | 2000-10-23 | 2007-03-26 | (주)바이오메트릭스 테크놀로지 | 신규한 아미노캘릭스아렌 유도체, 그의 제조방법, 그를이용하여 제조된 (자기조립)단분자층, 이를 이용한올리고dna 고정화방법 및 이에 의해 제조된 dna칩 |
US6951690B2 (en) * | 2002-04-04 | 2005-10-04 | The Regents Of The University Of California | Immobilized calixarenes and related compounds and process for their production |
KR100786577B1 (ko) | 2005-11-04 | 2007-12-21 | (주)바이오메트릭스 테크놀로지 | 신규한 아미노캘릭스아렌 유도체, 이의 제조방법, 및상기의 제조방법에 의해 제조된 자기조립단분자층, 상기자기조립 단분자층에 자발적인 올리고유전자의 비가역적인분자인식에 의한 올리고유전자 고정화 방법 및 이에 의해제조된 올리고유전자 칩 |
US8013188B2 (en) * | 2005-10-13 | 2011-09-06 | Biometrix Technology Inc. | Iminecalixarene derivatives and aminocalixarene derivatives, method of preparation thereof, and self-assembled monolayer prepared by the method, fixing method of oligo-DNA by using the self-assembled monolayer, and oligo-DNA chip prepared by the method |
US20080194798A1 (en) * | 2005-11-01 | 2008-08-14 | Tae Sun Kim | Novel Iminecalixarene Derivatives, Method for Preparing the Same, Self-Assembled Monolayer Prepared by Using the Iminecalixarene Derivatives or Aminocalixarene, and Protein Chip Using the Self-Assembled Monolayer |
KR100869916B1 (ko) | 2007-11-12 | 2008-11-21 | (주)바이오메트릭스 테크놀로지 | 신규한 아미노캘릭스아렌 유도체, 이의 제조방법, 및상기의 제조방법에 의해 제조된 자기조립단분자층, 상기자기조립 단분자층에 자발적인 올리고유전자의 비가역적인분자인식에 의한 올리고유전자 고정화 방법 및 이에 의해제조된 올리고유전자 칩 |
-
2006
- 2006-05-11 US US11/816,022 patent/US8013188B2/en active Active
- 2006-05-11 EP EP06757689A patent/EP1934170A4/en not_active Withdrawn
- 2006-05-11 EP EP11175573.2A patent/EP2404898A3/en not_active Withdrawn
- 2006-05-11 EP EP15162182.8A patent/EP2966059B1/en active Active
- 2006-05-11 WO PCT/KR2006/001753 patent/WO2007043736A1/en active Application Filing
- 2006-05-11 JP JP2008535434A patent/JP5111382B2/ja active Active
-
2011
- 2011-07-27 US US13/192,268 patent/US8501996B2/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2009515822A (ja) | 2009-04-16 |
EP2404898A3 (en) | 2014-01-15 |
EP1934170A4 (en) | 2010-05-26 |
EP1934170A1 (en) | 2008-06-25 |
US8501996B2 (en) | 2013-08-06 |
US20120202711A1 (en) | 2012-08-09 |
EP2966059B1 (en) | 2018-07-25 |
EP2404898A2 (en) | 2012-01-11 |
US8013188B2 (en) | 2011-09-06 |
EP2966059A1 (en) | 2016-01-13 |
US20080305477A1 (en) | 2008-12-11 |
WO2007043736A1 (en) | 2007-04-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5111382B2 (ja) | 新規なイミンカリックスアレーン誘導体とアミノカリックスアレーン誘導体、その製造方法及び該製造方法によって製造された自己組織化単分子層、該自己組織化単分子層を利用したオリゴ遺伝子の固定化方法及びこれによって製造されたオリゴ遺伝子チップ | |
JP3448287B2 (ja) | 高分子光酸発生剤を用いたペプチド核酸プローブの製造方法 | |
KR100786577B1 (ko) | 신규한 아미노캘릭스아렌 유도체, 이의 제조방법, 및상기의 제조방법에 의해 제조된 자기조립단분자층, 상기자기조립 단분자층에 자발적인 올리고유전자의 비가역적인분자인식에 의한 올리고유전자 고정화 방법 및 이에 의해제조된 올리고유전자 칩 | |
KR100748082B1 (ko) | 신규한 이민캘릭스아렌 유도체, 이의 제조방법, 및 상기제조방법에 의해 제조된 자기조립 단분자층, 상기 자기조립단분자층을 이용한 올리고dna 고정화 방법 및 이에의해 제조된 올리고dna 칩 | |
US6660479B2 (en) | Process for preparing peptide nucleic acid probe using polymeric photoacid generator | |
US20040235032A1 (en) | PCR amplification method, PCR primer set, PCR amplification product, and method for detection of nucleic acid using the amplification method | |
KR100698763B1 (ko) | 신규한 아미노캘릭스아렌 유도체, 그의 제조방법, 그를이용하여 제조된 (자기조립)단분자층, 이를 이용한올리고dna 고정화방법 및 이에 의해 제조된 dna칩 | |
JP2005233955A (ja) | 生体分子を固体基板上に非共有的に固定化する方法及びそれによって製造されるマイクロアレイ | |
KR100869916B1 (ko) | 신규한 아미노캘릭스아렌 유도체, 이의 제조방법, 및상기의 제조방법에 의해 제조된 자기조립단분자층, 상기자기조립 단분자층에 자발적인 올리고유전자의 비가역적인분자인식에 의한 올리고유전자 고정화 방법 및 이에 의해제조된 올리고유전자 칩 | |
JP4706074B2 (ja) | 生体分子固定化用の三脚型機能性界面分子とこれを用いた遺伝子検出デバイス | |
JP4267208B2 (ja) | 蛍光インターカレータおよび相補性核酸断片の検出方法 | |
US7321831B2 (en) | Nucleic acid fragment-fixed electrode and its use | |
US20080194798A1 (en) | Novel Iminecalixarene Derivatives, Method for Preparing the Same, Self-Assembled Monolayer Prepared by Using the Iminecalixarene Derivatives or Aminocalixarene, and Protein Chip Using the Self-Assembled Monolayer | |
JP4309037B2 (ja) | 酸化還元活性を有する縫い込み型インターカレータ | |
JP4635532B2 (ja) | 生体分子の分析および回収方法 | |
JP2001165894A (ja) | 縫い込み型インターカレータ、核酸断片の検出方法、及び核酸断片の検出キット | |
JP3857075B2 (ja) | 反応性固相担体及びdna断片検出用具 | |
KR100832742B1 (ko) | 형광 링커를 포함하는 pna 프로브, 및 이를 이용한pna 마이크로어레이의 제조방법 및 품질관리방법 | |
JP4358579B2 (ja) | ミスマッチ検出分子およびミスマッチ検出方法、並びにその利用 | |
JP3807781B2 (ja) | 化学発光性基含有カルボジイミド化合物 | |
KR100681943B1 (ko) | 브루스터 앵글 현미경을 이용한 혼성화된 핵산의 검출방법 | |
JP2004325074A (ja) | ミスマッチ検出分子及びそれを用いたミスマッチの検出方法 | |
KR20070047093A (ko) | 신규한 이민캘릭스아렌 유도체, 그의 제조방법, 그를이용하여 제조된 자기조립단분자층 및 그의 자기조립단분자층을 이용하는 단백질 단분자층 제조방법 | |
JP2002281978A (ja) | Dnaプローブアレイを用いた標的dnaのノンラベル検出法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20101222 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20101224 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110324 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110708 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20111007 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20111017 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20111108 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20120309 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120709 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20120815 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20120907 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20121009 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20151019 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5111382 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |