KR100832742B1 - 형광 링커를 포함하는 ｐｎａ 프로브, 및 이를 이용한ｐｎａ 마이크로어레이의 제조방법 및 품질관리방법 - Google Patents

형광 링커를 포함하는 ｐｎａ 프로브, 및 이를 이용한ｐｎａ 마이크로어레이의 제조방법 및 품질관리방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 자체적으로는 형광을 나타내지 않으나 공유결합을 통하여 지지체 표면에 고정화되면 형광을 나타내는 기능성 형광 링커를 포함하는 PNA (Peptide Nucleic Acid) 프로브 (probe), 및 이를 이용한 PNA 마이크로어레이의 제조방법 및 품질관리방법에 관한 것으로, 본 발명의 PNA 프로브, 및 이를 이용한 PNA 마이크로어레이의 제조방법 및 품질관리방법을 사용하면, 고정화와 동시에 고정화 효율을 추가적인 조작 없이 비파괴적으로 측정할 수 있다.

Description

형광 링커를 포함하는 ＰＮＡ 프로브, 및 이를 이용한 ＰＮＡ 마이크로어레이의 제조방법 및 품질관리방법 {PNA PROBE COMPRISING A FLUORESCENT LINKER, AND METHODS FOR THE PREPARATION AND QUALITY CONTROL OF A PNA MICROARRAY}
도 1은 본 발명에 따른 3-아지도쿠마린 유도체가 부착된 PNA 프로브와 아세틸렌 말단으로 개질된 기판 표면 사이의 고정화 반응을 보여주는 개략도이고,
도 2는 클릭반응을 이용하여 제조한 실시예 1-1의 화합물에 대한 형광 성질을 측정한 결과로, (a)는 UV 스펙트럼을 통하여 측정된 흡광도이고, (b)는 발광 스펙트럼을 통하여 측정된 형광도이고,
도 3은 본 발명에 따른 PNA 마이크로어레이의 고정화 상태를 측정한 것으로, (a)는 마이크로어레이 도식 (microarray scheme)이고, (b)는 고정화 후, 360 ㎚ 파장에서 여기시키고 460 ㎚ 파장의 형광 필터를 사용하여 스캐닝한 사진이며,
도 4는 실시예 2의 PNA 마이크로어레이에 대한 표적 DNA (3W DNA)의 혼성화 결과를 570 ㎚ 파장의 형광 필터를 사용하여 스캐닝한 사진이다.
본 발명은 자체적으로는 형광을 나타내지 않으나 지지체 표면에 공유결합을 통하여 고정화되면 형광을 나타내는 기능성 형광 링커를 포함하는 PNA 프로브, 및 이를 이용한 PNA 마이크로어레이의 제조방법 및 품질관리방법에 관한 것이다.
DNA 마이크로어레이란 표면 개질된 유리, 실리콘, 폴리프로필렌 등의 고분자 기판, 활성화 폴리아크릴아마이드와 같은 여러 가지 종류의 고체 표면에 수십 내지 수백 개 염기 길이의 서열이 알려진 올리고뉴클레오타이드 (oligonucleotide) 프로브 (probe)를 수십 내지 수만 개의 정해진 위치에 고밀도로 부착시켜 미세 집적 (microarray) 시킨 것을 통칭한다. 이러한 DNA 마이크로어레이로 구성된 DNA 칩에 분석하고자 하는 표적 DNA (target DNA)를 반응시키면 DNA 칩에 부착되어 있는 프로브와 표적 DNA의 염기서열의 상보적인 정도에 따라 각기 다른 혼성화 결합 (hybridization) 상태를 이루게 되며, 이를 광학적 방법 또는 방사능 화학적 방법으로 측정 및 해석함으로써 표적 DNA의 염기서열을 분석할 수 있다.
DNA 마이크로어레이를 이용하여 제조한 DNA 칩은 DNA 분석 시스템의 소형화를 이루어 극미량의 시료만으로도 유전자 분석이 가능하며, 표적 DNA상의 여러 부분의 염기서열을 동시에 규명할 수 있기 때문에 신속하고 저렴하게 유전정보를 해석할 수 있다. 또한 DNA 마이크로어레이를 이용하여 제조한 DNA 칩은 방대한 양의 유전정보를 짧은 시간 내에 동시에 분석할 수 있을 뿐만 아니라, 유전자간의 상호 연관성까지 분석할 수 있으므로, 유전병 및 암의 진단, 돌연변이의 탐색, 병원균의 검출, 유전자의 발현 분석 및 신약 개발 등의 다양한 분야에서 응용될 수 있다.
DNA 마이크로어레이는 사용된 프로브의 종류에 따라 올리고 칩 (oligo-chip)과 cDNA 칩으로 분류하기도 하고, 제작방법에 따라 고체 표면에서 DNA 올리고뉴클레오타이드를 직접 합성하는 포토리쏘그래피 칩 (photolithography chip)과 미리 만들어진 DNA 올리고뉴클레오타이드를 고체 표면에 고정화시키는 스팟팅 칩 (spotting chip)으로 분류하기도 한다.
그러나, 고체 표면상에서 직접 올리고뉴클레오타이드를 합성하여 배치하는 방법은 고체 표면상에서 합성되어지는 올리고뉴클레오타이드의 수율이 낮고 일정하지 못하여 특히 정량분석에 적합하지 못한 문제점이 있다.
이에 비해 스팟팅 방법은 기존 방법으로 합성된 올리고뉴클레오타이드를 고체 표면에 직접적으로 배치할 수 있기 때문에 요구되는 농도로 일정하게 배치시킬 수 있다. 그러나, 이 방법 또한 고체 표면의 작은 면적에 극소량의 DNA 프로브가 고정화되기 때문에 부착된 프로브간의 정량적 변동 (spot to spot variation)과 칩간의 변동 (chip to chip variation)에 의해 상당한 오차가 발생되어 혼성화를 통하여 얻어지는 결과가 일관성이 없다는 것이 큰 단점으로 지적되고 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여 혼성화 결합에 들어가기 전에 DNA 칩을 품질관리하는 방법들이 연구되고 있다.
예를 들어, 에이센 (Eisen) 등은 (Eisen M. B. et al., Methods Enzymol. 303:179-205, 1999) 유리 표면에 스팟팅되는 DNA 프로브와 함께 존재하는 염에 의해 광선이 산란되는 것을 레이저 스캐너를 사용하여 포착함으로서 DNA 프로브 스팟 팅의 균일성과 유리 표면의 손상 유무를 검사하는 방법을 개발하였다. 이 방법은 스팟팅 직후에만 간단하게 DNA 스팟을 검사하는 방법으로 이용될 수는 있지만, 다음 작업인 고정화와 세척 이후에는 DNA 스팟에 존재하는 염이 제거되므로 DNA 칩 제작이 끝난 후의 DNA 스팟의 품질 (quality)은 검사할 수 없는 문제점이 있다.
또한, 바타글리아 (Battaglia)와 드 벨리스 (De Bellis) 등은 DNA 프로브에 잘 결합하는 형광물질을 이용하여 유리 표면 위에 고정화된 DNA 스팟을 형광 염색하는 방법을 보고하였다 (Battaglia, C. et al., Biotechniques, 29(1):78-81, 2000). 이것은 단일 가닥 DNA (ssDNA)에 높은 친화도로 결합하는 형광물질인 SYBR Green II를 DNA 칩에 처리하여 유리 표면에 고정화된 DNA 프로브를 레이저 스캐너를 사용하여 감지하는 방법이며, DNA 프로브에 결합된 형광물질은 세척에 의하여 완전히 제거할 수 있다고 보고되어 있다. 이 방법은 상기 에이센 (Eisen) 등의 방법과 비교하면 DNA 칩의 제작이 끝난 후에 DNA 프로브의 고정화 품질을 검사할 수 있는 장점은 있으나, 검사를 위하여 형광염색과 탈색의 조작을 하여야 하기 때문에 DNA 칩을 여러 차례 세척하는 작업이 필요한 단점이 있다. 또한 세척 후에도 유리 표면에 남을 수 있는 형광물질이 시료분석시 혼성화에 영향을 끼칠 수 있는 문제점이 있다.
조준형 등 (대한민국 특허 등록 제450817호)은 DNA 마이크로어레이 스팟 품질관리방법으로 고체 기판에 공유결합으로 부착할 수 있는 형광물질을 DNA 프로브와 함께 섞어서 스팟팅 용액을 제조한 후 스팟팅함으로서 DNA 칩을 제조하고 그 스팟으로부터 발생되는 형광 신호를 스캐닝하여 DNA 칩의 품질을 측정하는 방법을 보 고 하였다. 이 방법은 상기한 바타글리아 등의 방법과 비교하면 DNA 칩의 제작 후 DNA 칩의 품질검사를 위한 추가적인 염색과 탈색의 과정이 필요 없다는 장점이 있다. 그러나, 이 방법은 DNA 프로브와 품질검사용 형광물질이 한 분자 내에 있지 않고, 단지 두 물질을 물리적으로 섞어서 스팟팅하여 고정화한 것이기 때문에 DNA 칩 제작 후 스캐너를 통하여 분석된 형광 신호는 첨가된 형광물질 자체의 형광 신호일 뿐 이것이 실제 DNA 프로브의 고정화 정도를 나타내는 것이 아니다. 다시 말하자면, 이 방법 역시 실제 DNA 프로브의 고정화 품질을 직접적으로 측정하는 것이 아니라 간접적인 추정치 제공에 불과하다는 단점이 있다.
한편, DNA 칩의 또 하나의 커다란 단점은 DNA 칩에 프로브로 사용되는 기본 재료인 DNA 올리고뉴클레오타이드가 데옥시라이보스-포스페이트 (deoxyribose-phosphate)의 기본 골격구조로 되어 있기 때문에 효소들에 대한 안정성이나 화학적 열적 안정성이 낮고, 또한 이것으로 만들어진 DNA 칩 자체도 안정성이 떨어지므로 장기 보관이 어려운 단점이 있다.
또한, DNA 칩이 표적 DNA와 효과적인 혼성 결합을 이루기 위해서는 프로브 DNA의 염기 길이도 최소 수십 개 이상이 되어야 하고, 그 이하의 염기 길이의 프로브를 사용하면 시료 분석에 있어서 민감도 (sensitivity)와 표적 DNA와의 특이성 (specificity)이 저하되는 단점이 있다. 그러므로, DNA 칩은 많은 응용 가능성에도 불구하고 상기한 바와 같은 DNA 소재 자체가 갖는 한계성 때문에 상업화에 어려움을 겪고 있다.
이러한 DNA 소재의 단점을 극복할 수 있는 신소재의 하나로 최근 PNA (peptide nucleic acid)가 각광을 받고 있다 (Demidov, V. V. Drug Data Today 7:153-155, 2002; 및 Brandt, O. et al., TRENDS in Biotechnology 22:617-622, 2004).
PNA는 1991년에 덴마크의 P. Nielsen 등에 의해서 최초로 개발된 천연 DNA 유사체로 인공으로 합성된 물질이다. 구조적으로 PNA는 DNA와는 달리 기본 골격 구조가 폴리아마이드 (polyamide)로 구성되어 있으나, 천연 DNA와 동일한 염기 (아데닌, 구아닌, 사이토신, 티미딘, 우리딘)를 가지고 있기 때문에 상보적 염기서열을 가지고 있는 DNA 또는 RNA 등의 핵산과 결합하여 이중 나선 구조를 형성할 수 있다. PNA는 DNA에 비해 우수한 생물학적, 화학적, 열적 안전성을 갖고 있을 뿐 아니라 상보적 염기서열에 대하여 강한 친화도와 탁월한 특이성을 갖는다.
본 발명자들은 PNA 마이크로어레이를 제작함에 있어서 상기 종래기술들의 문제점을 극복하기 위하여 연구 노력한 결과, PNA 프로브를 기능성 형광 링커를 사용하여 기판 표면에 공유결합을 통하여 고정화함으로써 고정화 품질을 염색과 탈색 등의 추가적인 조작 과정을 거치지 않고 직접적이고 비파괴적인 방법으로 측정할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 기능성 형광 링커가 부착된 PNA 프로브를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 PNA 프로브를 고체 기판 위에 스팟팅하여 고정화하는 단계를 포함하는, PNA 마이크로어레이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 PNA 마이크로어레이의 스팟의 품질과 크기를 직접적이고 비파괴적인 방법으로 검사할 수 있는 PNA 칩의 품질관리방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 형광 링커로서 하기 화학식 1 또는 2의 3-아지도쿠마린 유도체가 PNA의 N-말단에 부착된 PNA 프로브를 제공한다.
Figure 112007017303016-pat00001
상기 식에서,
m은 0 내지 4이고, n은 1 내지 4이다.
Figure 112007017303016-pat00002
상기 식에서,
p는 0 내지 3, q는 0 또는 1, r은 1 내지 5 이며,
X는 O 또는 NH이다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 PNA 프로브를 구리촉매를 포함하는 스팟팅 용액을 이용하여 아세틸렌 말단을 갖도록 개질된 고체 기판 위에 스팟팅하여 고정화하는 단계를 포함하는, PNA 마이크로어레이의 제조방법을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기와 같이 고정화된 PNA 프로브의 스팟으로부터 방출되는 형광 신호를 검출하여 고정화 효율을 측정하는 단계를 포함하는, PNA 마이크로어레이의 품질관리방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 PNA 프로브는 자체적으로는 형광을 나타내지 않으나, 아세틸렌 말단을 갖도록 개질된 기판에 고정화가 되면 강한 형광을 나타내는 것을 특징으로 한다.
일반적으로 쿠마린 (coumarin) 화합물들은 강한 형광성을 가지고 있지만, 쿠마린의 3-위치에 아지도기 (azido group)를 갖는 3-아지도쿠마린 (3-azidocoumarin) 화합물은 아지도기의 전자주게 효과에 의한 형광 상쇄 효과 (quenching) 때문에 형광을 나타내지 않는다. 그러나, 3-아지도쿠마린 화합물을 아세틸렌 (acetylene) 화합물과 구리촉매 존재 하에 반응을 시키면, (2+3) 고리화 반응 (클릭반응)에 의해 아지도기가 트라이아졸 (triazole)기로 쉽게 변하면서 두 물 질이 결합되어 (고정화) 쿠마린 화합물의 형광 상쇄 효과가 없어지고 강한 형광을 나타내게 된다 (Sivakumar, K. et al., Org. Lett. 6:4603-4606, 2004).
Figure 112007017303016-pat00003
본 발명에서는 상기 원리를 이용하여, O-벤조트라이아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HBTU)/N,N-다이아이소프로필에틸아민 (DIEA) 또는 당분야에서 통상적으로 사용하는 다른 종류의 결합 시약 (coupling agent)을 사용하여 프로브로 사용할 PNA 올리고머의 N-말단에 화학식 1 또는 2의 3-아지도쿠마린 유도체, 바람직하게는 카복시산 기능기를 가진 3-아지도쿠마린 유도체, 예를 들어 7-카복시메톡시-3-아지도쿠마린, 7-{(카복시메톡시)-에톡시}-3-아지도쿠마린, 7-[{(카복시메톡시)-에톡시}-에톡시]-3-아지도쿠마린, 7-{(카복시메톡시)-아세틸옥시}-3-아지도쿠마린 또는 7-[{(카복시메톡시)-에톡시}-아세틸옥시]-3-아지도쿠마린) 등을 도입하여 3-아지도쿠마린 유도체가 부착된 PNA 프로브를 합성한다. 이때, PNA 올리고머와 3-아지도쿠마린 유도체 사이에 링커로서 O-링커 (예: 8-아미노-3,6-다이옥사옥탄산) 또는 다른 종류의 적당한 크기, 바람직하게는 원자수가 5 내지 10인 스페이서 (spacer)를 넣어서 합성할 수도 있다.
본 발명에서 사용가능한 PNA 올리고머 (oligomer)는 당분야의 통상의 방법에 따라 제조될 수 있으며, 예를 들어 대한민국 특허 제0555204호에 기재된 방법에 따라 고체상 합성법으로 합성될 수 있다
본 발명에서는 또한 상기 PNA 프로브를, 구리촉매를 포함하는 스팟팅 용액을 이용하여 아세틸렌 말단을 갖도록 개질된 고체 기판, 바람직하게는 유리 기판 위에 마이크로어레이 스팟터 (Microarray Spotter)를 이용하여 미세 배열시키고 고정화하는 단계 (도 1 참조)를 포함하는 PNA 마이크로어레이의 제조방법을 제공한다. 상기에서 구리촉매로는 CuI, CuBr, CuCl 등의 구리 1가염 또는 CuSO4와 같은 구리 2가염과 아스코르빈산 (Ascorbic acid)의 나트륨 또는 칼륨염의 혼합물을 사용할 수 있다. 스팟팅 용액은, 예를 들어, 상기 PNA 프로브; 구리촉매; 및 물, C1-C5 알콜 또는 물/알콜, 물/DMSO, 물/다이옥산 (dioxane) 등의 물/유기용매 혼합물을 포함할 수 있다.
또한, 상기 개질된 유리 기판은 예를 들어, 카복시산 기능기를 가진 페닐아세틸렌 화합물, 예를 들어, [(3-에티닐-l-페닐카바모일)-메톡시]-아세트산, [(4-에티닐-l-페닐카바모일)-메톡시]-아세트산, [(3-에티닐-l-벤질옥시카보닐)-메톡시]-아세트산, [(4-에티닐-l-벤질옥시카보닐)-메톡시]-아세트산) 등을 HBTU/DIEA 또는 당분야에서 통상적으로 사용하는 다른 종류의 결합 시약을 사용하여 아민 작용기가 있는 유리 기판에 부착시킴으로써 제조될 수 있다.
본 발명의 고정화 방법을 이용하여 PNA 마이크로어레이를 제작하면, PNA 프로브를 공유결합에 의하여 유리 기판 위에 강하게 고정화시킬 수 있으므로 고정화 안정도가 높다.
또한, 본 발명에서는 상기와 같이 고정화된 PNA 프로브의 스팟으로부터 방출 되는 형광 신호를 검출하여 고정화 효율을 측정하는 단계를 포함하는, PNA 마이크로어레이의 품질관리방법을 제공한다.
본 발명의 품질관리방법은 DNA 마이크로어레이 기판에 DNA 프로브를 스팟팅한 후 형광물질을 별도로 추가하여 DNA 마이크로어레이의 품질을 간접적으로 검증한 후 다시 형광물질을 제거하는 종래의 방법들과는 달리, 고정화 후 형광 신호를 방출할 수 있는 형광 전구물질이 PNA 프로브의 말단에 부착된 PNA 프로브를 사용함으로써, PNA 마이크로어레이 기판에 고정화 반응을 진행하면 공유결합을 통하여 기판에 고정화된 PNA 프로브만 형광 신호를 방출하게 되므로, PNA 마이크로어레이를 제작한 후 추가적인 조작 없이 단지 스팟에서 발생되는 형광 신호만을 스캐닝하여 PNA 프로브의 고정화 여부 및 PNA 마이크로어레이의 품질을 직접적이고 비파괴적으로 검사할 수 있으며, 이때 상기 스팟으로부터 발생하는 형광 신호의 품질 정도는 형광 신호의 균일 정도, 예를 들어 스팟의 모양, 직경 또는 형광의 강도 등을 레이저 스캐너 등을 이용하여 확인할 수 있다.
본 발명의 PNA 마이크로어레이를 이용한 진단시에 중요하게 고려하여야 할 사항은 고정화된 PNA 프로브에서 발생되는 형광 신호의 파장이 표적 시료에 표지된 형광 염료에 의한 형광 신호의 파장과 겹치거나 간섭을 일으키지 않아야 한다는 것이다. 그러므로, 표적 시료의 표지에 가장 많이 사용되는 형광 염료인 cy3 다이 (dye) (약 570 ㎚) 또는 cy5 다이 (약 670 ㎚)의 파장과 적어도 100 ㎚ 이상 차이가 나도록 약 470 ㎚ 이하에서 형광을 나타내는 형광링커를 고안하였다.
실제로, 본 발명의 일 실시예에서는, 상기와 같은 방법으로 제조된 PNA 마이 크로어레이와 표적 시료와의 혼성화 여부를 확인하기 위하여, cy3 다이 또는 cy5 다이로 형광 표지된 표적 시료를 함유하는 혼성화 용액을 제조한 다음, 이를 PNA 마이크로어레이와 혼합하여 혼성화시킨 후, 레이저 스캐너를 이용하여 PNA 마이크로어레이의 혼성화 여부와 스팟의 상태를 측정하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 형광 고정화를 거친 PNA 프로브가 상보적인 표적 DNA와 혼성화를 잘 이루는 것을 확인할 수 있었다. 그리고, PNA 프로브 고정화시 사용된 형광 링커는 이후에 표적 시료에 표지된 cy3 또는 cy5 다이의 형광 측정에 아무런 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 형광 고정화된 PNA 마이크로어레이는 표적 DNA 시료와의 혼성화를 성공적으로 잘 수행할 수 있으며, 형광물질이 PNA 프로브의 고정화에 영향을 끼칠 위험이 있는 기존 방법의 문제점도 극복한 것이다.
또한, 본 발명의 PNA 마이크로어레이의 품질관리방법을 사용하면 염색을 이용하거나 고정화 과정에 형광물질을 별도로 추가하여 DNA 마이크로어레이의 품질을 간접적으로 검증하는 종래의 방법들과는 달리, PNA 마이크로어레이를 제작한 후 염색 및 탈색 등의 추가적인 조작없이 단지 스팟에서 발생되는 형광 신호를 스캐닝하여 PNA 마이크로어레이의 품질을 직접적이고 비파괴적으로 검사할 수 있다.
또한, 본 발명의 PNA 마이크로어레이의 제작 및 품질관리방법에 따르면, 프로브 고정화 후 표면 블록킹 (blocking) 과정을 거치지 않아도 혼성화 반응시 특별한 노이즈 신호가 나타나지 않으므로 종래의 방법과는 달리 고정화 후 추가적인 표면 블록킹 과정을 거칠 필요가 없다. 따라서, 본 발명의 방법을 사용하면, 제조된 마이크로어레이의 고정화 효율을 PNA 프로브의 고정화와 동시에 측정할 수 있다.
본 발명의 PNA 마이크로어레이 고정화 방법 및 품질관리방법은 PNA 마이크로어레이뿐만 아니라 DNA 마이크로어레이, RNA 마이크로어레이 및 단백질 마이크로어레이와 같은 다른 유형의 칩에도 적용될 수 있다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
실시예 1 : 3-아지도쿠마린 유도체와 아세틸렌의 클릭반응을 통한 형광물질의 제조 및 이에 대한 형광 측정
<1-1> 3-[4-(4-아세톡시메틸페닐)-[1,2,3]트라이아졸-1-일]-2-옥소-2 H -크로멘-7-일옥시}-아세트산 tert -부틸에스터
동량의 아세트산 4-에티닐벤질에스터와 7-카복시메톡시-3-아지도쿠마린 tert-부틸에스터를 에탄올/물 혼합 용액 (1:1) 5 ㎖에 각각 0.2 M이 되도록 혼합하였다. 혼합된 상기 반응물에 20%의 아스코르빈산나트륨과 5%의 황산구리를 첨가하고, 빛을 차단한 후 실온에서 12시간 동안 교반 하였다. 12시간 반응 후 감압 진공 하에서 에탄올을 제거하고, 남은 물질을 5 ㎖의 물을 사용하여 희석하였다. 생성된 침전물을 여과하고 물로 세척 후 건조하여 목적 화합물을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 9.04 (s, 1H), 8.72 (s, 1H), 7, 99 (d, 2H, J=8.1 Hz), 7.89 (d, 1H, J=8.7 Hz), 7.50 (d, 2H, J=8.1 Hz), 7.16 (s, 1H), 7.11 (d, 1H, J=8.7 Hz), 5.12 (s, 2H), 4.88 (s, 2H), 2.09 (s, 3H), 1.45 (s, 9H).
얻어진 화합물의 형광 성질을 UV 분광기 (UV-2450, Shimadzu 사)와 발광 분광기 (photo luminescence spectroscopy) (LS-50, Perkin Elmer 사)를 이용하여 각각 조사한 결과, 흡광 파장은 350 ㎚이고 형광 파장은 422 ㎚이었다 (도 2의 (a) 및 (b)).
<1-2> {3-[1-(7- tert -부톡시카보닐메톡시-2-옥소-2 H -크로멘-3-일)-1 H -[1,2,3]-트라이아졸-4-일]-페닐카바모일}-메톡시)-아세트산
[(3-에티닐-l-페닐카바모일)-메톡시]-아세트산과 7-카복시메톡시-3-아지도쿠마린 tert-부틸에스터를 사용한 것을 제외하고는 상기 <1-1>과 동일한 방법을 사용하여 목적 화합물을 얻은 다음, 형광 성질을 확인하였다.
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.28 (s, 1H), 8.93 (s, 1H), 8.72 (s, 1H), 8.34 (s, 1H), 7.95 (d, 1H, J=8.7 Hz), 7.72 (dd, 2H), 7.49 (t, 1H, J=8.1, 7.8 Hz), 7.22(s, 1H), 7.17 (d, 1H, J=8.7 Hz), 4.94 (s, 2H), 4.37 (s, 2H), 4.24 (q, 2H, J=7.2 Hz), 1.45 (s, 9H), 1.28 (t, 3H, J=7.2 Hz).
얻어진 화합물의 흡광 파장은 350 ㎚이고 형광 파장은 439 ㎚이었다.
실시예 2 : PNA 마이크로어레이의 제조
단계 1: 아세틸렌 말단으로 개질된 기판의 제조
카복시산이 부착된 페닐아세틸렌인 [(4-에티닐-l-벤질옥시카보닐-메톡시)-아세트산] 1 ㎎/㎖, O-벤조트라이아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HBTU) 1 ㎎/㎖ 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (DIEA) 2 ㎎/㎖을 다이메틸폼아마이드 (DMF) 20 ㎖에 첨가하였다. 아민으로 개질된 유리 기판 (누리셀 사)을 상기 용액에 넣고 상온에서 12시간 동안 반응시킨 다음, 기판을 꺼내 초음파기 (Bransonic-2510R, Branson 사)에 넣고 세척하였다.
단계 2: 3-아지도쿠마린 유도체가 부착된 PNA 프로브의 제조
고체상 합성법 (대한민국 특허 제0555204호)을 이용하여 하기 표 1에 기재된 염기서열을 갖는 PNA 올리고머를 고체상 레진 (resin)에서 합성하였다. PNA 합성이 완료된 후, 다음과 같은 방법으로 스페이서 (8-아미노-3,6-다이옥사옥탄산) 및 3-아지도쿠마린 유도체를 도입하여 PNA 프로브를 제작하였다.
(1) N-말단의 보호기가 제거된 PNA 올리고머가 부착된 레진과 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 보호기가 도입된 스페이서 ({2-[2-(9H-플루오렌-9-일-메톡시카보닐아미노)-에톡시]-에톡시}-아세트산)/다이아이소프로필카보다이이미드 (DIC)/1-하이드록시벤조트라이아졸 (HOBt) (10 당량/20 당량/10당량)을 DMF 용매 하에서 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후, 얻어진 레진을 DMF로 3회 세척하였다.
(2) 상기에서 얻은 레진을 5 부피%의 무수 아세트산 및 6 부피%의 루티딘을 포함하는 DMF 용액에서 상온에서 3분 동안 반응시킨 후, DMF로 5회 세척하였다.
(3) 상기에서 얻은 레진을 10 부피%의 피페리딘을 포함하는 DMF 용액에서 상온에서 20분 동안 반응시켜 Fmoc 보호기를 제거한 후, DMF로 5회 세척하였다.
(4) (1) 에서 (3)의 과정을 2회 반복하였다.
(5) 7-카복시메톡시-3-아지도쿠마린/HBTU/DIEA (1.0 당량/0.9 당량/1.8 당량)를 DMF 용매 하에서 상온에서 10분 동안 반응시켜 활성화시켰다.
(6) 상기 (5)의 용액 10 당량과 (4)의 레진 1 당량을 상온에서 1시간 동안 반응시켰다.
(7) 상기에서 얻은 레진을 DMF로 5회, 염화메틸렌으로 5회 세척한 후 건조하였다.
(8) 상기에서 얻은 레진을 m-크레졸/트라이플루오로아세트산 (1/4)의 용액에서 상온에서 1시간 동안 처리하여 하기 표 1의 PNA 프로브들을 레진으로부터 분리하고 HPLC로 정제하였다.
Figure 112007017303016-pat00004
단계 3: PNA 프로브의 고정화
에탄올과 물 (1:1)의 혼합 용액에 3-아지도쿠마린 유도체가 부착된 상기 단계 2의 PNA 프로브를 400 μM의 농도가 되도록 녹인 후, 아스코르빈산나트륨 및 황산구리 용액을 각각 800 μM이 되도록 상기 용액에 첨가하여, PNA 프로브의 스팟팅 용액을 제조하였다.
제조된 스팟팅 용액을 마이크로어레이 스팟터 (Microarray Spotter: QArrayMini, Genetics 사)에 탑재하고, 단계 1에서 제조된 아세틸렌 말단으로 개질된 유리 기판의 표면상에 도 3의 (a)와 같이 스팟팅한 후, 빛이 차단된 장소에서 24시간 동안 반응시켜 PNA 프로브를 유리 기판에 고정화하였다. PNA 프로브가 고정된 유리 기판을 에탄올과 물 (1:1)의 혼합 용액 및 증류수로 각각 순차적으로 세척한 다음, 건조시켜 PNA 마이크로어레이를 제작하였다.
실시예 3 : PNA 마이크로어레이의 고정화 상태 측정
상기 실시예 2에서 제조된 각각의 PNA 마이크로어레이의 고정화 여부와 스팟의 상태를 레이저 스캐너 (Genepix-4000B, Molecular Device 사)를 이용하여, 360 ㎚ 파장에서 여기시키고 460 ㎚ 파장의 형광 필터를 사용하여 확인하였다.
그 결과, 도 3의 (b)에 나타난 바와 같이, PNA 프로브가 찍힌 곳에서만 형광 신호를 확인할 수 있어, 프로브의 고정화가 성공적으로 잘 이루어졌음을 알 수 있었다.
실시예 4 : 클릭반응을 이용하여 제조된 PNA 마이크로어레이의 혼성화 반응
상기 실시예 2에서 제조된 PNA 프로브의 PNA 마이크로어레이를 SSPET (sodium phosphate+EDTA+triton) 완충액 (1×)과 표적 DNA로서 5′말단에 cy3가 부착된 cy3-링커(8-아미노-3,6-다이옥사옥탄산)-5′-AAATTAGTGAGGAAACTAAA (서열번호: 9)-3′ (바이오니아 사) (100 μM)을 9:1로 희석한 혼성화 용액에 첨가한 후, 빛이 차단된 장소에서 37℃에서 12시간 동안 혼성화시켰다. 반응 후에 상기 PNA 마이크로어레이를 SSPET 완충액과 물로 각각 세척하고 건조시킨 다음, 레이저 스캐너 및 570 ㎚ 방출 파장의 형광 필터를 사용하여 PNA 마이크로어레이의 혼성화 여부와 스팟의 상태를 확인하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 형광 고정화된 PNA 프로브 (3W)가 상보적인 표적 DNA와 혼성화를 이루는 것을 확인하였으며, 결과적으로 형광 고정화된 PNA마이크로어레이가 성공적으로 표적 DNA와 혼성화를 잘 수행함을 알 수 있었다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 PNA 마이크로어레이의 제조방법 및 품질관리방법은 고정화 후 형광 신호를 방출할 수 있는 형광 전구물질이 PNA 프로브의 말단에 부착된 PNA 프로브를 사용함으로써, PNA 프로브를 공유결합에 의하여 유리 기판 위에 강하게 고정화시킬 수 있으므로 고정화 안정도가 높을 뿐 아니라, 기판에 고정화된 PNA 프로브만 형광 신호를 방출하게 되므로, PNA 마이크로어레이를 제 작한 후 추가적인 조작 없이 단지 스팟에서 발생되는 형광 신호만을 스캐닝하여 PNA 프로브의 고정화 여부 및 PNA 마이크로어레이의 품질을 직접적이고 비파괴적으로 검사할 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (12)

  1. 형광 링커로서 하기 화학식 1 또는 2의 3-아지도쿠마린 유도체가 PNA (Peptide Nucleic Acid)의 N-말단에 부착된 PNA 프로브.
    <화학식 1>
    Figure 112007017303016-pat00005
    상기 식에서,
    m은 0 내지 4이고, n은 1 내지 4이다.
    <화학식 2>
    Figure 112007017303016-pat00006
    상기 식에서,
    p는 0 내지 3, q는 0 또는 1, r은 1 내지 5 이며,
    X는 O 또는 NH이다.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 PNA 프로브는 자체적으로는 형광을 나타내지 않으나, 아세틸렌 말단을 갖도록 개질된 기판에 고정화가 되면 형광을 나타내는 것을 특징으로 하는, PNA 프로브.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 3-아지도쿠마린 유도체가 카복시산 기능기를 갖는 것을 특징으로 하는, PNA 프로브.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 카복시산 기능기를 갖는 3-아지도쿠마린 유도체가 7-카복시메톡시-3-아지도쿠마린, 7-{(카복시메톡시)-에톡시}-3-아지도쿠마린, 7-[{(카복시메톡시)-에톡시}-에톡시]-3-아지도쿠마린, 7-{(카복시메톡시)-아세틸옥시}-3-아지도쿠마린 및 7-[{(카복시메톡시)-에톡시}-아세틸옥시]-3-아지도쿠마린으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, PNA 프로브.
  5. 제 1 항에 따른 PNA 프로브를, 구리촉매를 포함하는 스팟팅 용액을 이용하여 아세틸렌 말단을 갖도록 개질된 고체 기판 위에 스팟팅하여 고정화하는 단계를 포함하는, PNA 마이크로어레이의 제조방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 고체 기판이 유리 기판인 것을 특징으로 하는, PNA 마이크로어레이의 제조방법.
  7. 제 5 항에 있어서,
    상기 구리촉매가 구리 1가염 또는 구리 2가염과 아스코르빈산 (Ascorbic acid)의 나트륨 또는 칼륨염의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, PNA 마이크로어레이의 제조방법.
  8. 제 5 항에 있어서,
    상기 스팟팅 용액이 물, C1-C5 알콜, 또는 물/알콜, 물/DMSO 및 물/다이옥산 (dioxane)으로 이루어진 군에서 선택되는 물/유기용매 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는, PNA 마이크로어레이의 제조방법.
  9. 제 1 항에 따른 PNA 프로브를 아세틸렌 말단을 갖도록 개질된 고체 기판 위에 스팟팅하여 마이크로어레이를 제조한 다음, PNA 프로브의 스팟으로부터 방출되는 형광 신호를 검출하여 고정화 효율을 측정하는 것을 포함하는, PNA 마이크로어레이의 품질관리방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 스팟으로부터 발생되는 형광 신호의 균일 정도로부터 PNA 마이크로어레이의 품질을 판정하는 것을 특징으로 하는, PNA 마이크로어레이의 품질관리방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 형광 신호의 균일 정도는 스팟의 모양, 직경 또는 형광의 강도로부터 판정하는 것을 특징으로 하는, PNA 마이크로어레이의 품질관리방법.
  12. 제 5 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조되는 PNA 마이크로어레이.
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