JP5310702B2 - 標識化合物及びこれを用いた検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、検査対象分子を検出するための標識化合物であり、特に、芳香族第三アミン
化合物が検査対象分子と結合可能に構成されてなる標識化合物及びこれを用いた検出方法
に関する。

核酸、タンパク質、糖、酵素、ホルモン、抗原、抗体等の各種の生体分子の検査対象分
子を蛍光標識し、蛍光を検出する生体分子の解析手法がある。この解析手法は、生命現象
の解析、遺伝子診断、再生医療等の分野において欠かせない手法であり、医用薬品のスク
リーニングにおいても欠かせない手法である。例えば、特定の遺伝子やタンパク質を蛍光
色素によって標識するによって、検体中の特定の遺伝子やタンパク質を高感度に検出する
ことが可能である。

例えば、オリゴヌクレオチドやペプチドの各種類を蛍光色素によって標識し、これをマ
イクロアレイに固定したＤＮＡチップやタンパク質チップを使用して、検体を網羅的に解
析することも行なわれている。また、特定の生体分子、例えば、糖、タンパク等を蛍光色
素によって標識して、蛍光を発生させて蛍光顕微鏡を用いて観察する免疫染色や分子イメ
ージングでは、細胞内や細胞間の生体分子の動態解析も可能となっている。

また、ＤＮＡ、ＤＮＡ塩基誘導体、ＤＮＡオリゴヌクレオチド等を蛍光色素によって標
識した標識プローブは、ノーザンブロッティング、サザンブロッティング、インサイチュ
ー（in situ）ハイブリダイゼーション、ＤＮＡ配列決定反応等に使用されている。蛍光
色素によって標識された抗体又は抗原は、抗体−抗原反応を利用したイムノアッセイに使
用されている。アビジン（ストレプトアビジン）−ビオチン間の結合を応用し、蛍光色素
で修飾されたアビジンを用いて酵素免疫測定法も知られている。

検出対象とする生体分子を標識するために、例えば、ＦＩＴＣ（Fluorescein isochioc
yanate）、ＴＲＩＴＣ（Tetramethylrhodamine isochiocyanate）、フルオレセイン、ロ
ーダミン、クマリン、シアニン色素等の芳香族色素化合物が、蛍光標識試薬として用いら
れている。

生体分子を検出に関する技術、生体分子を検出するために使用される種々の蛍光標識化
合物が知られており、以下の報告がある。

「生体分子の検出方法及びそれに用いる標識色素並びに標識キット」と題する後記の特
許文献１には、次の記載がある。

特許文献１の発明の生体分子の検出方法は、生体分子試料と有機ＥＬ色素とを反応させ
、該有機ＥＬ色素で標識された該生体分子試料の蛍光を測定することを特徴とし、有機Ｅ
Ｌ色素には、共役系を有する５員環化合物を含む化合物であって、その５員環化合物が１
種以上のヘテロ原子、セレン原子又はボロン原子を含む化合物を用いることができるとし
ている。さらに、その５員環化合物と共役系を有する６員環化合物とからなる縮合多環化
合物を用いることもでき、さらに、その５員環化合物には、アゾール誘導体又はイミダゾ
ール誘導体を用いることができるとしている。

また、生体分子と反応させるに先立って、有機ＥＬ色素に、イソシアネート基、エポキ
シ基、ハロゲン化アルキル基、トリアジン基、カルボジイミド基そして活性エステル化し
たカルボニル基から選択された何れか１種の官能基を導入することができるとしている。

また、特許文献１の発明の標識色素は、蛍光測定による生体分子の検出に用いる標識色
素であって、生体分子と結合する反応性基を有する有機ＥＬ色素から成ることを特徴とし
、その反応性基としては、カルボン酸基、イソシアネート基、エポキシ基、ハロゲン化ア
ルキル基、トリアジン基、カルボジイミド基そして活性エステル化したカルボニル基から
選択された何れか１種の官能基を用いることができるとしている。

また、有機ＥＬ色素には、共役系を有する５員環化合物を含む化合物であって、その５
員環化合物が１種以上のヘテロ原子、セレン原子又はボロン原子を含む化合物を用いるこ
とができ、さらに、その５員環化合物と共役系を有する６員環化合物とからなる縮合多環
化合物を用いることもでき、さらに、その５員環化合物には、アゾール誘導体又はイミダ
ゾール誘導体を用いることができるとしている。

なお、有機ＥＬ色素は、特許文献１に記載されるもの他に各種のものが知られており、
例えば、種々の構造を有するスチリル化合物からなる有機ＥＬ色素が報告されている（例
えば、後記の特許文献２〜特許文献２０を参照。）。

特開２００５−２０８０２６号公報（段落０００４〜００１１） 特許３８５２５１７号明細書（段落００１７〜００２０） 特許３８５２５１８号明細書（段落００１７〜００２０） 特許３８５２５２０号明細書（段落００１５〜００１８） 特許３５５５７３６号明細書（段落００１７〜００２０） 特許３８２０７５２号明細書（段落００１７〜００２０） 特開２０００−２３０１３２号公報（段落０００８〜００２１） 特開２００１−１０６６５７号公報（段落０００８〜００１９） 特開２００１−１０６６５８号公報（段落０００８〜００１２） 特許３８５２５５２号明細書（段落００１７〜００３７） 特開２００１−１３１１２８号公報（段落０００８〜００１２） 特開２００１−２８８３７７号公報（段落０００７〜００２０） 特開２００２−２２６７２２号公報（段落０００７〜００１４） 特開２００４−８７４６３号公報（段落００２１〜００２６） 特許４００１１１８号明細書（段落００１３〜００６５） 特開２００５−５２２６号公報（段落００１３〜００５７） 特開２００５−３５９２７号公報（段落００１３〜００４２） 特開２００６−１２４３３３号公報（段落００１１〜００５４） 特開２００６−１２８４３７号公報（段落０００９〜００２４） 特開２００６−２７３７３７号公報（段落０００９〜００２７）

蛍光色素によって標識された標的分子、例えば、生体分子を励起光によって励起して、
蛍光色素から放射された蛍光を光検出器で検出し生体分子の検出を行なう場合、一般に、
所望の波長域以外の光を遮断し、所望の波長域の蛍光を光検出器へ透過させるためのフィ
ルタが使用され、光検出器への励起光その他の迷光の入射を遮断するようになされる。励
起光が、フィルタによって十分に遮断されない場合には、フィルタによって遮断されなか
った励起光は、蛍光を測定するための光路における回折、反射によって生じる迷光の原因
となり、蛍光検出におけるノイズの原因となる。

蛍光検出におけるノイズを低減するためには、なるべく弱い励起光で蛍光色素を励起す
ることが望ましい。微量分子の検出するために、励起光の強度を高くして蛍光色素に照射
して、蛍光強度を高めて感度を大きくしようとすると、ノイズも同時に増大してしまうた
め、ＳＮ比を向上させることは困難となる。また、励起光の強度を高くして蛍光色素に照
射すると、蛍光色素によっては耐光性が十分ではなく光劣化を生じてしまうものもある。

一般に、蛍光色素によって標識された標的分子、例えば、生体分子の検出感度は、蛍光
色素を励起する励起光の波長（励起波長）と、蛍光色素から放射される蛍光の波長（蛍光
波長）の差（ストークスシフト：the Stokes shift）に依存し、ストークスシフトが大き
く、即ち、励起波長と蛍光波長の差が大きく、検出しようとする蛍光が励起光から離れた
波長域にある程、フィルタによって迷光の除去率が高まりノイズが減少する。ストークス
シフトが小さい場合には、励起光の散乱光によるバックグラウンドノイズや標的分子を含
むサンプル中に存在する共存物質の蛍光に由来するバックグラウンドノイズにより、蛍光
色素からの蛍光の検出が大きく妨害され、高感度の測定が困難となる。

本発明は、上述したような課題を解決するためになされたものであって、その目的は、
芳香族第三アミン化合物が検査対象分子と結合可能に構成されてなり、検査対象分子を高
感度、高ＳＮ比で検出することができる標識化合物及びこれを用いた検出方法を提供する
ことにある。

即ち、本発明は、下記一般式（１）で示された芳香族第三アミン化合物が検査対象分子
と結合可能なように構成されてなる標識化合物に係るものである。
一般式（１）：

但し、前記一般式（１）において、ｎは０又は１であり；、Ｓ¹、Ｓ²の一方は、主鎖部
に下記ＧＰ１から選択された二価の基を含んでもよいアルキル鎖を含む二価のスペーサに
、検査対象分子に結合可能な分子鎖が結合された分子鎖結合基、又は、下記ＧＰ３から選
択された反応性基を含み、Ｓ¹、Ｓ²の他方は下記Ｇｐ２から選択された基であり；、Ｒ¹
、Ｒ²は、同一又は異なってもよく、ヒドロ基、アルキル基、ヘテロ原子を含んでもよい
アリール基から選択された基であり；、Ｒ³は、ヒドロ基、下記Ｇｐ２から選択された基
を置換基として有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアリール基、置換基を有
してもよいビニル基から選択された基であり；、Ａｒ¹、Ａｒ²は二価の基であり、同一又
は異なってもよく、アリーレン基又はビニレン基であり、Ａｒ²は、アルキル基、アリー
ル基、シアノ基、トリフルオロメチル基、ハロ基から選択された置換基を少なくとも一箇
有し、ｎが１の場合、Ａｒ¹とＲ¹、又は／及び、Ａｒ²とＲ²が相同して環を形成していて
もよく；、Ｇｐ１は二価の基であり、ヘテロ原子を含んでもよいアリーレン基、ビ二レン
基、カルボニル基、オキシ基、オキシカルボニル基、チオ基、スルフィニル基、スルホニ
ル基、イミノ基、ウリレン基、アミド基、シリレン基であり；、Ｇｐ２は一価の基であり
、ヒドロ基、アルキル基、アリール基、置換基を含んでもよいビニル基、アミノ基、メル
カプト基、ヒドロキシ基、カルバモイル基、スルフィノ基、スルホ基、カルボキシ基、ハ
ロ基であり；、Ｇｐ３は一価の基であり、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、ヒ
ドロキシスルホスクシンイミドエステル基、イミドエステル基、イソチオシアネート基、
イソシアネート基、マレイミド基、カルボキシル基、アルデヒド基、グリオキザル基、イ
ミドエステル基（エポキシ基、グリシジルエーテル基）、オキシラン基、トリアジン基、
カルボジイミド基、アジリジン基）、ハロゲン化アシル基、ハロゲン化アルキル基、ハロ
ゲン化スルホニル基、ビニルスルホン基である。

また、本発明は、上記の標識化合物を、検査対象分子に結合させる工程と、光の照射に
よって、前記検査対象分子と結合した前記標識化合物から発する蛍光を検出する工程とを
有する標識化合物を用いた検査対象分子の検出方法に係るものである。

本発明によれば、ストークスシフトが大きく蛍光収率の高い骨格を有し、検査対象分子
を高感度、高ＳＮ比で検出することができる標識化合物を提供することができ、従来の標
識化合物に比べて耐光性が高く、標識化合物を光励起して微量分子を検出する際に励起光
の強度を高めても、標識化合物の光劣化によって生じるデータばらつきは殆んど生じない
。

また、本発明によれば、検査対象分子を、高感度、高ＳＮ比で検出することができる検
出方法を提供することができる。

本発明の標識化合物では、Ａｒ¹がフェニレン基であり、Ａｒ²が、フェニレン基、ナフ
チレン基、フェナントリレン基、アントリレン基の何れかであり、Ｒ¹、Ｒ²がヒドロ基で
あり、前記一般式（１）が下記一般式（２）で示される構成とするのがよい。このような
構成によれば、フェニルアミンのフィルスマイヤー反応（アルデヒド基導入反応）に続く
ヴィッティヒ反応（二重結合形成反応）などによって容易に一般式（２）の化合物を合成
することができる。一般式（２）の化合物はフェニレン基と（ＣＨ＝ＣＨ）_n部の平面性
が保たれることで共鳴構造が安定化され高い蛍光収率の化合物となる。また（ＣＨ＝ＣＨ
）部の回転自由度に由来して励起状態の分子構造は基底状態のそれから大きく変化し、そ
のためにストークスシフトが大きくなる。

一般式（２）：

また、Ｓ²が前記分子鎖結合基である構成とするのがよい。このような構成によれば、
市販の試薬から少ない工程で容易に合成することができる。

また、Ｓ²が前記分子鎖結合基、Ｓ¹が４−アミノスチリル基であり、前記一般式（１）
が下記一般式（３）で示される構成とするのがよい。このような構成によれば、分子内に
アミノスチリル部が２箇所存在することになり、一箇所しかない場合に比べてモル吸光係
数が約２倍になるので励起光の利用効率が高いことになる。

一般式（３）：

但し、Ｒ⁴、Ｒ⁵は、同一又は異なってもよく、ヒドロ基、置換基を有してもよいアルキ
ル基、置換基を有してもよいアリール基から選択された基である。

また、Ｓ²が前記分子鎖結合基であり、前記分子鎖結合基は、Ｒ⁶、Ｒ⁷、Ｒ⁸、Ｒ⁹、Ｒ^1
0で置換されたフェニル基を含み、Ｒ⁶、Ｒ⁷、Ｒ⁸、Ｒ⁹、Ｒ¹⁰の何れか一つに前記Ｇｐ１
を介して前記スペーサが結合しており、前記スペーサに前記Ｇｐ１を介して前記分子鎖が
結合されてなり、Ｒ⁶、Ｒ⁷、Ｒ⁸、Ｒ⁹、Ｒ¹⁰の残りがヒドロ基であり、Ｒ³が、Ｒ¹¹、Ｒ^1
2、Ｒ¹³、Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵で置換されたフェニル基を含むアリール基であり、Ｒ¹¹、Ｒ¹²、Ｒ^1
3、Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵が前記Ｇｐ２から選択された基であり、これらのうち隣り合う基同士が相
同して環を形成していてもよく、前記一般式（２）が下記一般式（４）で示される構成と
するのがよい。このような構成によれば、アリールアミノ部周囲のかさ高さを増すことが
できるので、使用時に共存する他の化学物質との相互作用に由来する消光過程を減じ、結
果として高い蛍光収率の化合物を提供することができる。

一般式（４）：

また、Ｓ²が前記分子鎖結合基であり、前記分子鎖結合基は、Ｒ⁶、Ｒ⁷、Ｒ⁸、Ｒ⁹、Ｒ^1
0で置換されたフェニル基を含み、Ｒ⁶、Ｒ⁷、Ｒ⁸、Ｒ⁹、Ｒ¹⁰の何れか一つに前記Ｇｐ１
を介して前記スペーサが結合しており、前記スペーサに前記Ｇｐ１を介して前記分子鎖が
結合されてなり、Ｒ⁶、Ｒ⁷、Ｒ⁸、Ｒ⁹、Ｒ¹⁰の残りがヒドロ基であり、Ｒ³が、Ｒ¹¹、Ｒ^1
2、Ｒ¹³、Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵で置換されたフェニル基を含むアリール基であり、Ｒ¹¹、Ｒ¹²、Ｒ^1
3、Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵が前記Ｇｐ２から選択された基であり、これらのうち隣り合う基同士が相
同して環を形成していてもよく、Ｒ⁴が、Ｒ¹⁶、Ｒ¹⁷、Ｒ¹⁸、Ｒ¹⁹、Ｒ²⁰で置換されたフ
ェニル基を有するアリール基であり、Ｒ⁵が、Ｒ²¹、Ｒ²²、Ｒ²³、Ｒ²⁴、Ｒ²⁵で置換され
たフェニル基を有するアリール基であり、Ｒ¹¹、Ｒ¹²、Ｒ¹³、Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵、Ｒ¹⁶、Ｒ¹⁷、
Ｒ¹⁸、Ｒ¹⁹、Ｒ²⁰、Ｒ²¹、Ｒ²²、Ｒ²³、Ｒ²⁴、Ｒ²⁵が前記Ｇｐ２から選択された基であり
これらのうち隣り合う基同士が相同して環を形成していてもよく、前記一般式（３）が下
記一般式（５）で示される構成とするのがよい。このような構成によれば、分子内にアミ
ノスチリル部が２箇所存在することになり、一箇所しかない場合に比べてモル吸光係数が
約２倍になるので励起光の利用効率が高く、かつアリールアミノ部周囲のかさ高さを増す
ことができるので、使用時に共存する他の化学物質との相互作用に由来する消光過程を減
じ、結果として高い蛍光収率の化合物を提供することができる。

一般式（５）：

また、Ｓ¹が前記分子鎖結合基である構成とするのがよい。このような構成によれば、
疎水性であるフルオロフォア（蛍光色素骨格）を、親水性の生体分子から遠ざけることが
できるので、色素と生体分子との相互作用による消光や化学反応を減じることができる。

また、Ｓ²が、Ｒ²⁶、Ｒ²⁷、Ｒ²⁸、Ｒ²⁹、Ｒ³⁰で置換されたフェニル基を有するアリー
ル基であり、Ｒ³が、Ｒ³¹、Ｒ³²、Ｒ³³、Ｒ³⁴、Ｒ³⁵で置換されたフェニル基を有するア
リール基であり、Ｒ²⁶、Ｒ²⁷、Ｒ²⁸、Ｒ²⁹、Ｒ³⁰、Ｒ³¹、Ｒ³²、Ｒ³³、Ｒ³⁴、Ｒ³⁵が前記
Ｇｐ２から選択された基であり、これらのうち隣り合う基同士が相同して環を形成してい
てもよく、前記一般式（３）が下記一般式（６）で示される構成とするのがよい。このよ
うな構成によれば、アリールアミノ部周囲のかさ高さを増すことができるので、使用時に
共存する他の化学物質との相互作用に由来する消光過程を減じ、結果として高い蛍光収率
の化合物を提供することができる。

一般式（６）：

また、前記アルキル鎖の炭素数が３以上、２０以下である構成とするのがよい。このよ
うな構成によれば、疎水性であるフルオロフォア（蛍光色素骨格）と親水性の生体分子と
の距離が適度に保たれ、色素と生体分子との相互作用による消光や化学反応を減じること
ができる。一方、アルキル鎖が長すぎる場合には標識化合物として疎水性が高まり、検査
対象分子との相互作用が抑制されてしまうことがある。

また、前記検査対象分子が生体由来分子である構成とするのがよい。このような構成に
よれば、生体由来分子を高感度、高ＳＮ比で検出することができ、かつこれまで色素の光
に対する耐久性が十分でないために困難であったような繰り返し光照射や長時間光照射に
よる検出が可能となる。

また、前記分子鎖がオリゴヌクレオチドである構成とするのがよい。このような構成に
よれば、前記オリゴヌクレオチドと相補鎖結合（ハイブリダイゼーション）する相補鎖オ
リゴヌクレオチドを有する核酸を高感度、高ＳＮ比で検出することができる。

また、前記オリゴヌクレオチドの長さが５ｍｅｒ以上、４０ｍｅｒ以下である構成とす
るのがよい。このような構成によれば、前記オリゴヌクレオチドと前記相補鎖オリゴヌク
レオチドの間で安定な相補鎖結合を形成することができる。

また、前記オリゴヌクレオチドがその相補鎖配列を有する前記生体由来分子の相補鎖オ
リゴヌクレオチドを検出するためのプローブとして使用される構成とするのがよい。この
ような構成によれば、前記相補鎖オリゴヌクレオチドを高感度、高ＳＮ比で検出すること
ができる。

また、前記ＧＰ３がＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基であり、これが前記検査
対象分子に含まれるアミノ基と結合する構成とするのがよい。このような構成によれば、
アミノ基を含む前記検査対象分子を高感度、高ＳＮ比で検出することができる。

また、前記ＧＰ３がマレイミド基であり、これが前記検査対象分子に含まれるメルカプ
ト基と結合する構成とするのがよい。このような構成によれば、メルカプト基を含む前記
検査対象分子を高感度、高ＳＮ比で検出することができる。

また、Ｒ³が、フェニル基又はナフチル基である構成とするのがよい。このような構成
によれば、アリールアミノ部周囲のかさ高さを増すことができるので、使用時に共存する
他の化学物質との相互作用に由来する消光過程を減じ、結果として高い蛍光収率の化合物
を提供することができる。

また、Ａｒ¹が、フェニレン基又はナフチレン基である構成とするのがよい。このよう
な構成によれば、市販の試薬から少ない工程で容易に合成することができ、フェニルアミ
ノ部周囲のかさ高さを増すことができるので、使用時に共存する他の化学物質との相互作
用に由来する消光過程を減じ、結果として高い蛍光収率の化合物を提供することができる
。

また、Ａｒ²が、フェニレン基、ナフチレン基、アントリレン基、フェナントレン基の
何れかである構成とするのがよい。このような構成によれば、フルオロフォア（色素骨格
部）の共鳴構造が安定化され、高い蛍光収率を達成することができる。

また、前記一般式［I］におけるＡｒ¹−（ＣＲ¹＝ＣＲ²）_n−Ａｒ²（ｎは０又は１）は
、Ａｒ¹部の二重結合から（ＣＲ¹＝ＣＲ²）_nを経てＡｒ²の二重結合へと続く繰り返し単
位（Ｃ＝Ｃ−）を含むとみなすこともでき、この繰り返し単位の繰り返し数をｍとする時
、ｍ≧６であるＮ−（Ｃ＝Ｃ−）_mを有する構成とするのがよい。標識化合物の光励起に
よる蛍光の極大波長を所望の波長領域にすることができ、ストークスシフトを大きなもの
とすることができる。

本発明による標識（ラベル）化合物は、光励起によって蛍光を放射する蛍光標識化合物
であり、芳香族第三アミン化合物（単に、芳香族アミン化合物と呼ぶことがある。）が生
体分子と結合可能に構成されている。標識化合物は、検査対象分子、例えば、生体分子に
結合可能な分子鎖（例えば、オリゴヌクレオチド）が結合された分子鎖結合基、又は、生
体分子に含まれる反応性基（例えば、アミノ基、メルカプト基）と共有結合する反応性基
（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、マレイミド基）を含んでおり、この分子鎖
結合基、又は、反応性基は、直接的、又は、間接的にアミノＮ（窒素）に結合されている
。

本発明による蛍光標識化合物において、上記の分子鎖をオリゴヌクレオチドとすること
によって、このオリゴヌクレオチドを、その相補鎖配列を有する生体分子の相補鎖オリゴ
ヌクレオチドを検出するためのプローブとして使用することができ、この相補鎖オリゴヌ
クレオチドを高感度、高ＳＮ比で検出することができる。このようなプローブを、以下の
説明では、芳香族第三アミン蛍光プローブ（略して、芳香族アミン蛍光プローブ、蛍光プ
ローブ）、オリゴヌクレオチドプローブと呼ぶことがある。

本発明による蛍光標識化合物が、検査対象分子、例えば、生体分子に結合可能な反応性
基を有する芳香族第三アミン化合物として構成される場合、この芳香族第三アミン化合物
は、生体分子と結合可能な反応性基Ａを有している。生体分子が本来有している、又は、
生体分子に予め付加されている反応性基Ｂと、蛍光標識化合物が有する反応性基Ａが共有
結合を形成して、蛍光標識化合物と生体分子が結合される。生体分子に結合された蛍光標
識化合物を励起して放射された蛍光を検出することによって、標的とする生体分子を高感
度、高ＳＮ比で検出することができる。

本発明による標識化合物は、アミノＮに結合するフェニル基又はナフチル基、アミノＮ
に結合するフェニレン基又はナフチレン基、及び、アミノＮに結合するフェニレン基又は
ナフチレン基に直接的又は間接的に結合されるフェニレン基、ナフチレン基、アントリレ

ン基、フェナントレン基の何れかを有し、上述の一般式（１）におけるＡｒ¹−（ＣＲ¹＝
ＣＲ²）_n−Ａｒ²（ｎは０又は１）は、繰り返し単位（Ｃ＝Ｃ−）を含み、この繰り返し
単位の繰り返し数をｍとする時、ｍ≧６であるＮ−（Ｃ＝Ｃ−）_mを有する。

なお、上記の分子鎖結合基、又は、反応性基は、アミノＮに結合するフェニル基又はナ
フチル基、或いは、アミノＮに結合するフェニレン基又はナフチレン基に直接的又は間接
的に結合されるフェニレン基、ナフチレン基、アントリレン基、フェナントレン基の何れ
かに結合されている。

上記の繰り返し単位（Ｃ＝Ｃ−）を有しているため、標識化合物の光励起による蛍光の
極大波長を所望の波長領域にすることができ、ストークスシフトを大きなものとすること
ができ、かつ耐光性を十分なものとすることができる。生体分子と結合した標識化合物を
、光照射によって励起して放射された蛍光を検出することによって、標的とする生体分子
を高感度、高ＳＮ比で検出することができる。

本発明の標識化合物による蛍光プローブ、又は、検査対象分子と共有結合する蛍光標識
化合物を使用する検査方法では、検出しようとする検査対象分子（標的分子）は、例えば
、生体由来分子、生理活性分子等の生体分子であり、生体分子を高感度、高いＳＮ比で検
出することができる。

生体分子は、例えば、酵素、タンパク質、糖、核酸、オリゴヌクレオチド、脂肪類、ア
ミノ酸等である。タンパク質は、例えば、抗体及びその誘導体、抗原及びその誘導体、ア
ビジン（ストレプトアビジンを含む）、血清アルブミン、ハプテン、ホルモン等である。
また、診断用薬品や治療用薬品等の化学物質、アレルギー等の疾病の原因となる環境物質
等の検出にも適用することができる。

以下、図面を参照しながら本発明による実施の形態について詳細に説明する。

実施の形態
図１は、本発明の実施の形態における、標識化合物の構成を説明する図であり、図１（
Ａ）は、Ｓ¹、又は、Ｓ²が、生体分子に結合可能な分子鎖が結合された分子鎖結合基、或
いは、生体分子の有する反応性基に共有結合する反応性基を有する標識化合物の構成、図
１（Ｂ）は、Ｓ¹がスペーサ（リンカー）Ｚ¹に生体分子に結合可能な分子鎖１０が結合さ
れた分子鎖結合基である標識化合物（プローブ）の構成、図１（Ｃ）は、Ｓ²がスペーサ
（リンカー）Ｚ²に生体分子に結合可能な分子鎖１０が結合された分子鎖結合基である標
識化合物（プローブ）の構成を示す図である。

図１（Ａ）に示す標識化合物において、ｎは０又は１であり、Ｓ¹、Ｓ²の一方は、主鎖
部に下記ＧＰ１から選択された二価の基を含んでもよいアルキル鎖を含む二価のスペーサ
に、生体分子に結合可能な分子鎖が結合された分子鎖結合基、又は、下記ＧＰ３から選択
された反応性基を含み、Ｓ¹、Ｓ²の他方は下記Ｇｐ２から選択された基である。

Ｒ¹、Ｒ²は、同一又は異なってもよく、ヒドロ基、アルキル基、ヘテロ原子を含んでも
よいアリール基から選択された基であり、Ｒ³は、ヒドロ基、下記Ｇｐ２から選択された
基を置換基として有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアリール基、置換基を
有してもよいビニル基から選択された基である。

Ａｒ¹、Ａｒ²は二価の基であり、同一又は異なってもよく、アリーレン基又はビニレン
基であり、Ａｒ²は、アルキル基、アリール基、シアノ基（−ＣＮ）、トリフルオロメチ
ル基（−ＣＦ₃）、ハロ基から選択された置換基を少なくとも一箇有し、ｎが１の場合、
Ａｒ¹とＲ¹、又は／及び、Ａｒ²とＲ²が相同して環を形成していてもよい。

例えば、Ｒ³が、フェニル基（phenyl基、−Ｃ₆Ｈ₅）又はナフチル基（naphthyl基、−
Ｃ₁₀Ｈ₇）であり、Ａｒ¹が、フェニレン基（phenylene基、−Ｃ₆Ｈ₄−）又はナフチレン
基（naphthylene基、−Ｃ₁₀Ｈ₆−）であり、Ａｒ²が、フェニレン基、ナフチレン基、ア
ントリレン基（anthrylene基、−Ｃ₁₄Ｈ₈−）、フェナントレン基（phenanthrylene基、
−Ｃ₁₄Ｈ₈−）の何れかであり、Ｒ¹、Ｒ²がヒドロ基（−Ｈ）である。

Ｇｐ１は二価の基であり、ヘテロ原子を含んでもよいアリーレン基（アリール基から１
個の水素原子を引き抜いて形成された基、単環又は多環芳香環の芳香族化合物、複素芳香
族化合物から１個の水素原子を引き抜いて形成された基である。）、ビ二レン基（−ＣＨ
＝ＣＨ−）、カルボニル基（−ＣＯ−）、オキシ基（−Ｏ−）、オキシカルボニル基（−
Ｏ−ＣＯ−）、チオ基（−Ｓ−）、スルフィニル基（−ＳＯ−）、スルホニル基（−ＳＯ
₂−）、イミノ基（−ＮＨ−）、ウリレン基（−ＮＨＣＯＮＨ−）、アミド基（Ｈ₂ＮＣ（
＝ＮＨ）−）、シリレン基（−ＳｉＨ₂−）である。Ｇｐ１は、好ましくは、アリーレン
基、ビニレン基、カルボニル基である。

Ｇｐ２は一価の基であり、ヒドロ基（−Ｈ）、アルキル基（−Ｃ_nＨ_2n+1）、アリール
基、置換基を含んでもよいビニル基（−ＣＨ＝ＣＨ₂）、アミノ基（−ＮＨ₂）、メルカプ
ト基（−ＳＨ）、ヒドロキシ基（−ＯＨ）、カルバモイル基（Ｈ₂ＮＣＯ−）、スルフィ
ノ基（−ＳＯ₂Ｈ）、スルホ基（−ＳＯ₃Ｈ）、カルボキシ基（−ＣＯＯＨ）、ハロ基（ハ
ロゲン基、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ）である。Ｇｐ２は、好ましくは、ヒドロ基、ア
ルキル基、ビニル基である。

Ｇｐ３は一価の基であり、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、ヒドロキシスル
ホスクシンイミドエステル基、イミドエステル基、イソチオシアネート基、イソシアネー
ト基、マレイミド基、カルボキシル基、アルデヒド基、グリオキザル基、イミドエステル
基、オキシラン基（エポキシ基、グリシジルエーテル基）、トリアジン基、カルボジイミ
ド基、アジリジン基、ハロゲン化アシル基、ハロゲン化アルキル基、ハロゲン化スルホニ
ル基、ビニルスルホン基である。Ｇｐ３は、好ましくは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
エステル基、マレイミド基である。

図１（Ｂ）に示す標識化合物は、図１（Ａ）に示す標識化合物において、−Ｓ¹を、−
Ｚ¹−（生体分子に結合可能な分子鎖１０）に置き換えた蛍光プローブであり、Ｚ¹は、主
鎖部に上記ＧＰ１から選択された二価の基を含んでもよいアルキル鎖を含む二価のスペー
サ（リンカー）である。

図１（Ｃ）に示す標識化合物は、図１（Ａ）に示す標識化合物において、−Ｓ²を、−
Ｚ²−（生体分子に結合可能な分子鎖１０）に置き換えた蛍光プローブであり、Ｚ²は、主
鎖部に上記ＧＰ１から選択された二価の基を含んでもよいアルキル鎖を含む二価のスペー
サ（リンカー）である。

図１（Ｂ）、図１（Ｃ）に示すように、蛍光プローブは、生体分子に結合可能な分子鎖
１０が結合されてなる芳香族第三アミン化合物であり、生体分子に結合可能な分子鎖１０
は、リンカー基Ｚ¹又はＺ²に結合されている。

図１（Ｂ）、図１（Ｃ）に示す構造を有する標識化合物おいて、生体分子に結合可能な
分子鎖１０は、例えば、長さが５ｍｅｒ以上、４０ｍｅｒ以下のヌクレオチドからなる。

図１（Ａ）に示す標識化合物において、Ｓ¹、Ｓ²の一方が、反応性基Ａを含む場合、生
体分子が反応性基Ａと結合し得る反応性基Ｂを本来的に有するか、又は、生体分子に反応
性基Ｂが導入されていればよい。検査対象とする生体分子、例えば、タンパク質又は核酸
と結合させるために必要な反応性基Ａを、標識化合物が有しており、反応性基Ａと反応す
る反応性基Ｂが、生体分子が本来有しているものか、生体分子に予め付加されているもの
である構成とすることによって、生体分子と標識化合物が、公知の方法に従って共有結合
を形成して結合される。

共有結合を形成できる反応性基Ａと反応性基Ｂの組み合わせとして、例えば、アミノ基
／カルボキシル基、アミノ基／ハロゲン化アシル基、アミノ基／Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドエステル基、アミノ基／アルデヒド基、メルカプト基／マレイミド基、メルカプト
基／ビニルスルホン基、水酸基／カルボキシル基等が可能である。反応性基Ｂ／反応性基
Ａの組み合わせは、好ましくは、アミノ基／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、
メルカプト基／マレイミド基である。

図１に示す構造を有する標識化合物は、Ａｒ¹−（ＣＲ¹＝ＣＲ²）_n−Ａｒ²（ｎは０又
は１）は、繰り返し単位（Ｃ＝Ｃ−）を含み、この繰り返し単位の繰り返し数をｍとする
時、ｍ≧６であるＮ−（Ｃ＝Ｃ−）_mを有している。

以下、図１（Ａ）に示す標識化合物が蛍光プローブ（図１（Ｂ）、図１（Ｃ）に示す。
）として構成された場合について、説明する。

図２、図３は本発明の実施の形態における芳香族アミン蛍光プローブ（第１の蛍光プロ
ーブ）の例を示す図である。

図２の左側に示す第１の蛍光プローブは、図１（Ｂ）に示す標識化合物である。この第
１の蛍光プローブでは、ｎが１であり、Ｓ²はオキシ基が結合したフェニル基を含み、オ
キシ基にオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏ）が間接的に結合されている。Ｒ³はフェニル
基又はナフチル基、Ａｒ¹はフェニレン基である。Ａｒ²は、フェニレン基、ナフチレン基
、アントリレン基、フェナントリレン基の何れかの骨格を有し、無置換であるか置換基Ｓ
¹を有しており、Ｓ¹はメチル基又は／及びシアン基である。Ｒ¹及びＲ²はヒドロ基である
。

図２の右側に示す第１の蛍光プローブは、図１（Ｃ）に示す標識化合物である。この第
１の蛍光プローブでは、ｎが１であり、Ｓ²はオキシ基が結合したフェニル基を含み、Ｒ³
がフェニル基又はナフチル基、Ａｒ¹はフェニレン基である。Ａｒ²は、フェニレン基、ナ
フチレン基、アントリレン基、フェナントリレン基の何れかの骨格を有し、無置換である
か置換基としてシアン基を有し、且つ、オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏ）が間接的に結
合される二価の基−ＣＨ₂Ｏ−（オキシメチレン基）又はオキシ基を有している。また、
Ｒ¹及びＲ²がヒドロ基である。

図３に示す第１の蛍光プローブは、図１（Ｂ）に示す標識化合物である。この第１の蛍
光プローブでは、ｎが１であり、Ｓ²はオキシ基が結合したフェニル基を含み、オキシ基
にオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏ）が間接的に結合されている。Ｒ³はフェニル基又は
ナフチル基、Ａｒ¹はフェニレン基である。Ａｒ²は、フェニレン基、ナフチレン基、アン
トリレン基、フェナントリレン基の何れかの骨格を有し、無置換であるか置換基としてシ
アン基を有しており、且つ、Ａｒ²に−ＣＨ＝ＣＨ−が結合されこれに更に、アミノＮに
結合するフェニル基、或いは、フェニル基及びナフチル基を有する芳香族第三アミン化合
物のフェ二ル基が結合されている。Ｒ¹及びＲ²がヒドロ基である。

図４は本発明の実施の形態における芳香族アミン蛍光プローブ（第２の蛍光プローブ）
の例を示す図である。

図４の左側上部に示す２個の第２の蛍光プローブは、図１（Ｂ）に示す標識化合物であ
る。この第２の蛍光プローブでは、ｎが０であり、Ｓ²はオキシ基が結合したフェニル基
を含み、オキシ基にオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏ）が間接的に結合されている。Ｒ³
はナフチル基、Ａｒ¹はナフチレン基である。Ａｒ²はアントリレン基又はフェナントリレ
ン基であり、置換基Ｓ¹を有しており、Ｓ¹がメチル基又は／及びシアン基である。

図４の右側上部に示す２個の第２の蛍光プローブは、図１（Ｃ）に示す標識化合物であ
る。この第２の蛍光プローブでは、ｎが０であり、Ｓ²はオキシ基が結合したフェニル基
を含み、Ｒ³はナフチル基、Ａｒ¹はナフチレン基である。Ａｒ²はアントリレン基又はフ
ェナントリレン基であり、置換基としてシアン基を有し、且つ、オキシ基にオリゴヌクレ
オチド（ｏｌｉｇｏ）が間接的に結合される二価の基−ＣＨ₂Ｏ−（オキシメチレン基）
又はオキシ基を有している。

図４の左側下部に示す２個の第２の蛍光プローブは、図１（Ｂ）に示す標識化合物であ
る。この第２の蛍光プローブでは、ｎが０であり、Ｓ²はオキシ基が結合したフェニル基
を含み、オキシ基にオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏ）が間接的に結合されている。Ｒ³
はナフチル基、Ａｒ¹はナフチレン基である。Ａｒ²はアントリレン基又はフェナントリレ
ン基であり、置換基としてシアン基を有し、且つ、アミノＮに結合するフェニル基及びナ
フチル基を有する芳香族第三アミン化合物のナフチル基が結合されている。

図２、図３、図４では、図中に示すアルファベット文字及び数字からなる略号によって
芳香族アミン化合物の名称を表わすと共に、蛍光プローブの名称にこの略号を取込んで使
用し、蛍光プローブに用いられている芳香族アミン化合物の構造を示している（図２、図
３、図４以外の後述する各図とこれらに関する説明においても同様とする。）。

また、図２、図３、図４において、Ｒ³⁶〜Ｒ⁵¹は、ヒドロ基、アルキル基、アリール基
、置換基を含んでもよいビニル基、アミノ基、メルカプト基（チオール基）、ヒドロキシ
基、カルバモイル基、スルフィノ基、スルホ基、カルボキシ基、ハロ基から選択される置
換基である。

図２、図３に示す蛍光プローブの例では、一般式（１）に示すＡｒ¹はフェニレン基、
Ｒ³はフェニル基、ナフチル基、Ｒ¹、Ｒ²はヒドロ基、Ａｒ²はフェニレン基、ナフチレン
基、フェナントリレン基、アントリレン基である。また、図４に示す蛍光プローブの例で
は、一般式（２）に示すＡｒ³はナフチレン基、Ｒ⁴はナフチル基、Ａｒ⁴はフェナントリ
レン基、アントリレン基である。

図２、図３、図４において、ｏｌｉｇｏは、生体分子が結合可能な分子鎖であるオリゴ
ヌクレオチドを示し、ｏｌｉｇｏの５’端又は３’端が、芳香族アミン化合物のＳ₁又は
Ｓ₂に結合されている。

次に、上記の略号について説明する。図２、図３、図４において、略号の第１番目の文
字がＢで始まる場合はジアミンであることを示し、それ以外はモノアミンであることを示
している。

図２、図３に使用している略号において、Ｓはトリフェニルアミン（triphenylamine、
（Ｃ₆Ｈ₅）₃Ｎ）骨格において、第１のフェニル基（phenyl基、−Ｃ₆Ｈ₅）の１箇のヒド
ロ基（−Ｈ）がオキシ基（−Ｏ−）によって置換され、第２のフェニル基の１箇のヒドロ
基がビニレン基（vinylene基、−ＣＨ＝ＣＨ−）によって置換された構造を示している。
このトリフェニルアミン骨格の第３のフェニル基は、ナフチル基（naphthyl基、−Ｃ₁₀Ｈ
₇）で置換されていてもよく、これはトリフェニルアミン誘導体とみなせるので、上記と
同様に、トリフェニルアミン骨格と呼ぶものとする。蛍光プローブは、上記のビニレン基
に結合された次に説明するＢ、Ｎ、Ａ、Ｐを有する構造を備えている。

Ｂはスチリレン基（styrylene基、−Ｃ₆Ｈ₄ＣＨ＝ＣＨ−）、Ｎは置換基を有するナフ
チル基（naphthyl基、−Ｃ₁₀Ｈ₇）、Ａは置換基を有してもよいアントリル基（anthryl基
、−Ｃ₁₄Ｈ₉）、Ｐは置換基を有するフェナントリル基（phenanthryl基、−Ｃ₁₄Ｈ₉）を
それぞれ示す。

図４に示す芳香族アミン蛍光プローブは、トリフェニルアミン（（Ｃ₆Ｈ₅）₃Ｎ）にお
いて、第１のフェニル基の１箇のヒドロ基（−Ｈ）がオキシ基（−Ｏ−）に置換され、第
２のフェニル基がナフチル基（naphthyl基、−Ｃ₁₀Ｈ₇）に置換され、第３のフェニル基
がナフチレン基（naphthylene基、−Ｃ₁₀Ｈ₆−）に置換された構造を有し、生体分子に結
合可能な分子鎖（オリゴヌクレオチド、ｏｌｉｇｏ）が付加（結合）されている第三アミ
ン化合物である。この第三アミン化合物のナフチレン基に結合されたアントリレン基を有
する蛍光プローブをＡＮＮＰＡ、また、ナフチレン基に結合されたフェナントリレン基を
有する蛍光プローブをＤＮＰＡによって示している。

図２、図３、図４に示すように、ベンゼン環のヒドロ基が置換されたオキシ基或いはオ
キシメチレン基（−ＣＨ₂Ｏ−）、又は、ナフタレン環のヒドロ基が置換されたオキシメ
チレン基（−ＣＨ₂Ｏ−）、又は、アントラセン環のヒドロ基が置換されたオキメチレン
基（−ＣＨ₂Ｏ−）、又は、フェナントレン環のヒドロ基が置換されたオキシ基の何れか
にアルキル基が結合され、これにｏｌｉｇｏが結合されている。

図２、図３、図４に示す蛍光プローブは、繰り返し単位（Ｃ＝Ｃ−）を含むが、この繰
り返し単位の繰り返し数ｍは、蛍光プローブの構造によって異なっている。

図２に示す芳香族モノアミン蛍光プローブおいて、略号ＳＢを有する蛍光プローブは、
ビニレン基が結合されたトリフェニルアミン骨格のビニレン基にベンゼン環が結合された
骨格を備え、繰り返し単位（Ｃ＝Ｃ−）の繰り返し数ｍは６である。

略号ＳＮを有する蛍光プローブは、ビニレン基が結合されたトリフェニルアミン骨格の
ビニレン基にナフタレン環が結合された骨格を備え、繰り返し単位（Ｃ＝Ｃ−）の繰り返
し数ｍは７である。

略号ＳＡを有する蛍光プローブは、ビニレン基が結合されたトリフェニルアミン骨格の
ビニレン基にアントラセン環が結合された骨格を備え、ＳＡ−１、ＳＡ−２、ＳＡ−５、
ＳＡ−６では、繰り返し単位（Ｃ＝Ｃ−）の繰り返し数ｍは９であり、ＳＡ−３、ＳＡ−
４では、繰り返し単位（Ｃ＝Ｃ−）の繰り返し数ｍは１０である。

略号ＳＰを有する蛍光プローブは、ビニレン基が結合されたトリフェニルアミン骨格の
ビニレン基にフェナントレン環が結合された骨格を備え、繰り返し単位（Ｃ＝Ｃ−）の繰
り返し数ｍは９である。

図３に示す芳香族アミン蛍光プローブおいて、ＢＳＢ、ＢＳＮは、ビニレン基が結合さ
れた２個のトリフェニルアミン骨格のビニレン基にそれぞれ、ベンゼン環、ナフタレン環
が結合された骨格を備え、ＢＳＢ、ＢＳＮはそれぞれ、繰り返し単位（Ｃ＝Ｃ−）の繰り
返し数ｍは８、１０である。

略号ＢＳＡを有する蛍光プローブは、ビニレン基が結合された２個のトリフェニルアミ
ン骨格のビニレン基にアントラセン環が結合された骨格を備え、繰り返し単位（Ｃ＝Ｃ−
）の繰り返し数ｍは１１である。

蛍光プローブＢＳＰ−１は、ビニレン基が結合された２個のトリフェニルアミン骨格の
ビニレン基にフェナントレン環が結合された骨格を備え、繰り返し単位（Ｃ＝Ｃ−）の繰
り返し数ｍは１２である。

図４に示す芳香族モノアミン蛍光プローブおいて、略号ＡＮＮＰＡは、２個のベンゼン
環がナフチル環に置換されたトリフェニルアミン骨格とこれにアントラセン環が結合され
た骨格を備え、繰り返し単位（Ｃ＝Ｃ−）の繰り返し数ｍは９である。

略号ＤＮＰＡを有する蛍光プローブは、２個のベンゼン環がナフチル環に置換されたト
リフェニルアミン骨格とこれにフェナントレン環が結合された骨格を備え、繰り返し単位
（Ｃ＝Ｃ−）の繰り返し数ｍは９である。

蛍光プローブＢＡＮＮＰＡは、２個のベンゼン環がナフチル環に置換された２個のトリ
フェニルアミン骨格の間にアントラセン環が結合された骨格を備え、繰り返し単位（Ｃ＝
Ｃ−）の繰り返し数ｍは１１である。

蛍光プローブＢＤＮＰＡは、２個のベンゼン環がナフチル環に置換された２個のトリフ
ェニルアミン骨格の間にフェナントレン環が結合された骨格を備え、繰り返し単位（Ｃ＝
Ｃ−）の繰り返し数ｍは１２である。

図５は、本発明の実施の形態における、芳香族アミン蛍光プローブの例を示す図であり
、３’−アミノ−５’−ＳＰ−１−オリゴヌクレオチドプローブを説明する図である。

図５に示す蛍光プローブは図１（Ａ）の構造を有し、芳香族第三アミン化合物に、生体
分子に結合可能な分子鎖１０が結合された、図２に示すＳＰ−１であり、後述する図１０
に示すＡ１７である。

この分子鎖１０はｎ個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含み、このオリゴ
ヌクレオチドは、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃから選択されたＢａｓｅ（塩基）を有するヌクレオチド
（アナログヌクレオチドであってもよい。）が結合されたものである。なお、図５におい
て、（ｎ−２）は、Ｎ（＝２，３，…，（ｎ−１））番目のヌクレオチド（塩基Ｎ（＝２
，３，…，（ｎ−１）））を示している（後述する図６〜図１２に関しても同様である。
）。

オリゴヌクレオチドはその５’端に−（ＰＯ^4-）(ＣＨ₂)₆ＮＨ−を有し、３’端に−（
ＰＯ^4-）(ＣＨ₂)₁₂（ＰＯ^4-）(ＣＨ₂)ＣＨ(ＣＨ₂ＯＨ)（ＣＨ₂）₄ＮＨ₂を有している。分
子鎖１０のオリゴヌクレオチドの５’端側のＮＨ−は芳香族第三アミン化合物ＳＰ−１に
結合され、３’端側はＮＨ₂で終端している。

図５において、図１（Ａ）に示すＳ¹、Ａｒ²、Ａｒ¹、Ｒ³、Ｓ²は、次に示す通りであ
る。（Ａｒ²−Ｓ¹）は−Ｃ₁₄Ｈ₆（ＣＮ）₂ＣＨ₃、Ａｒ¹は−Ｃ₆Ｈ₄−、Ｒ³は−Ｃ₁₀Ｈ₇、
Ｓ²は−Ｃ₆Ｈ₄Ｏ（ＣＨ₂）₄ＣＯ−である。

図５に示す３’−アミノ−５’−ＳＰ−１−オリゴヌクレオチドプローブの合成につい
ては、図８、図９、図１０によって後述する。

図６は、本発明の実施の形態における、芳香族アミン蛍光プローブの例を示す図であり
、５’−ＤＮＰＡ−オリゴヌクレオチドプローブを説明する図である。

図６に示す蛍光プローブは、図１（Ｄ）の構造を有し、芳香族アミン化合物（図４に示
すＤＮＰＡ−２、但し、−ＯＲ⁴³を−Ｈに置き換えている。）に、生体分子に結合可能な
分子鎖１０が結合されたものである。

この分子鎖１０は、図５と同様に、ｎ個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを
含んでいる。オリゴヌクレオチドはその５’端に−（ＰＯ^4-）(ＣＨ₂)₆ＮＨ−を有し、３
’端は−ＯＨである。分子鎖１０のオリゴヌクレオチドの５’端側のＮＨ−は芳香族アミ
ン化合物ＤＮＰＡ−２に結合され、３’端側はＯＨで終端している。

図６において、図１（Ｄ）に示すＳ⁴、Ｒ⁴、Ａｒ³、Ａｒ⁴、Ｓ³は、次に示す通りであ
る。Ｓ⁴は−Ｃ₆Ｈ₅、Ｒ⁴は−Ｃ₁₀Ｈ₇、Ａｒ³は−Ｃ₁₀Ｈ₆−、Ａｒ⁴は−Ｃ₁₄Ｈ₆（ＣＮ）₂
−、Ｓ³は−ＣＯ（ＣＨ₂）₄ＣＯ−である。

図７は、本発明の実施の形態における、芳香族アミン蛍光プローブの例を示す図であり
、３’−ＢＳＡ−２−５’−チオ−オリゴヌクレオチドプローブを説明する図である。

図７に示す蛍光プローブは、図１（Ａ）の構造を有し、芳香族アミン化合物（図３に示
すＢＳＡ−２、但し、Ｒ⁴⁷＝ＣＨ₃である。)に、生体分子に結合可能な分子鎖１０が結合
されたものである。芳香族アミン化合物ＢＳＡ−２は、アントリレン基（anthrylene基、
−Ｃ₁₄Ｈ₈−）の両端に−（Ｃ₆Ｈ₄）Ｎ（Ｃ₆Ｈ₅）（Ｃ₆Ｈ₄）−が結合された構造を有し
ている。

この分子鎖１０は、図５と同様に、ｎ個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを
含んでいる。オリゴヌクレオチドはその３’端に−（ＰＯ^4-）(ＣＨ₂）₁₂（ＰＯ^4-）(Ｃ
Ｈ₂）ＣＨ(ＣＨ₂ＯＨ）（ＣＨ₂）₄ＮＨ−を有し、５’端に−（ＰＯ^4-）(ＣＨ₂）₆ＳＨ−
有している。分子鎖１０のオリゴヌクレオチドの３’端側のＮＨ−は芳香族アミン化合物
ＢＳＡ−２に結合され、５’端側はＳＨで終端している。

図７において、図１（Ａ）に示すＳ¹、Ａｒ²、Ａｒ¹、Ｒ³、Ｓ²は、次に示す通りであ
る。Ｓ¹は−ＣＨＣＨＣ₆Ｈ₄Ｎ（Ｃ₆Ｈ₅）（Ｃ₆Ｈ₄ＯＣＨ₃）、Ａｒ²は−Ｃ₁₄Ｈ₈−、Ａｒ
¹は−Ｃ₆Ｈ₄−、Ｒ³は−Ｃ₆Ｈ₅−、Ｓ²は−Ｃ₆Ｈ₄Ｏ（ＣＨ₂）₄ＣＯＮＨ−である。

図８、図９、図１０は、本発明の実施の形態における、芳香族アミン蛍光プローブの合
成スキーム例を示す図であり、３’−アミノ−５’−ＳＰ−１−オリゴヌクレオチドプロ
ーブの合成スキームを説明する図である。図９は、図８に示す合成スキームに続く図であ
り、図１０は、図９に示す合成スキームに続く図である。

以下の反応は一般的にはＤＮＡ固相合成装置によって行う。

先ず、図８に示すように、反応｛Ａ１＋Ａ２→Ａ３｝から始める。Ａ１は 3'-Amino-mo
difier C7 CPG（図１４（Ａ）を参照。）、Ａ２はスペーサホスホンアミダイト（グレン
リサーチ社製、Spacer C12 CE Phosphoramidite）である。

次に、反応｛Ａ３＋Ａ４→Ａ５｝を行ない、１番目のヌクレオチドをＡ３に結合する。
Ａ４（以下のＡ６、Ａ８も同じである。）６は dN-CE Phosphoramidite（グレンリサーチ
社製）であり、Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣである。続いて、反応｛Ａ５＋Ａ６→Ａ７｝を行な
い、同様に２番目のヌクレオチドをＡ５に結合する。以下、同様の反応｛Ａ７＋Ａ８→Ａ
９｝を繰り返して行ない、所望の塩基種の順に所望の数ｎ番目までのヌクレオチドを結合
する。

次に、反応｛Ａ９＋Ａ１０→Ａ１１｝を行なう。Ａ９は5'-Amino-modifier C6（図１４
（Ｄ）を参照。）である。続いて、反応｛Ａ１１＋Ａ１２→Ａ１３｝を行ない、５'アミ
ノを脱保護して５'側末端をＮＨ₂とする。以上のようにして、固相ＣＰＧに所望の塩基配
列を有し、５'側末端がＮＨ₂であるオリゴヌクレオチドが形成される。

次に、反応｛Ａ１３＋Ａ１４→Ａ１５｝を行ない、Ａ１３とＳＰ−１−ＯＳｕ（中間体
（活性化エステル化合物）Ａ１４、図１５を参照。）を結合させる。続いて、反応｛Ａ１
５＋Ａ１６→Ａ１７｝を行ない、３'アミノの脱保護及びＣＰＧからの分離を行なって、
５'側末端にＳＰ−１が結合され、３'側末端がＮＨ₂であるＡ１７、即ち、図５に示す３
’−アミノ−５’−ＳＰ−１−オリゴヌクレオチドプローブが得られる。

なお、Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミド（N-hydroxysuccinimide、Ｃ₄Ｈ₅ＮＯ₃）をＨＯ
Ｓｕと表わし、−ＯＳｕによって、−Ｃ₄Ｈ₄ＮＯ₃を表わしている（以下の各図に関する
説明においても同様である。）。

なお、３’−アミノ−５’−ＳＰ−１−オリゴヌクレオチドプローブの３'側末端に、
５'側末端に結合されたものと異なる色素を結合して修飾することも可能であり、５'及び
３'側末端が異なる色素によって修飾されたオリゴヌクレオチドプローブを得ることもで
きる。このような構成によれば、例えば、アクセプタ色素とドナー色素が所定の間隔を置
いて結合され、共鳴による励起エネルギーの移動（ＦＲＥＴ：Fluorescence Resonance E
nergy Transfer）が生じるプローブを得ることができ、各種のアッセイに使用することが
できる。

図１１、図１２は、本発明の実施の形態における、芳香族アミン蛍光プローブの合成ス
キーム例を示す図であり、３’−ＢＳＡ−２−５’−チオ−オリゴヌクレオチドプローブ
の合成スキームを説明する図である。図１２は、図１１に示す合成スキームに続く図であ
る。

先ず、図１１に示すように、反応｛Ｂ１＋Ｂ２→Ｂ３｝を行なう。Ｂ１は図８において
得られたＡ９と同じものであり、Ｂ２は 5'-Amino-modifier C6（図１４（Ｃ）を参照。
）であり。続いて、反応｛Ｂ３＋Ｂ４→Ｂ５｝を行ない、３'アミノの脱保護及びＣＰＧ
からの分離を行なって、５'側末端にＳＴ（Ｔはトリフェニルメチル基である。）が結合
され、３'側末端がＮＨ₂であるＢ５が得られる。

続いて、反応｛Ｂ５＋Ｂ６→Ｂ７｝を行なう。Ｂ６は、芳香族アミン化合物ＢＳＡ−２
（図３に示すＢＳＡ−２、但し、Ｒ⁴⁷＝ＣＨ₃である。）と、ＨＯＳｕ（Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミド、Ｃ₄Ｈ₅ＮＯ₃）の反応によって予め調製された中間体（活性化エステル
化合物）ＢＳＡ−２−ＯＳｕである。

次に、反応｛Ｂ７＋Ｂ８→Ｂ９｝を行ない、５'チオールの酸化的脱保護を行なって、
５'側末端がＳＨであり、３'側末端にＢＳＡ−２が結合されたＢ９、即ち、図７に示す３
’−ＢＳＡ−２−５’−チオ−オリゴヌクレオチドプローブが得られる。

図８〜図１２において使用可能な固相支持体、試薬の例として、図１３、図１４にグレ
ンリサーチ社製のものを示す。

図１３は、本発明の実施の形態における、オリゴヌクレオチドプローブの合成に使用さ
れる固相支持体の例を説明する図である。

図１３に示すように、オリゴヌクレオチドの合成に必要な化合物は、ポリスチレン微小
ビーズ、ＣＰＧに担持された形で入手することができる。図１３（Ａ）、図１３（Ｃ）に
示す固相支持体を使用すれば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃの任意のものを有するヌクレオチドをオリ
ゴヌクレオチドの１番目のヌクレオチドとすることができる。

また、図１３（Ｂ）、図１３（Ｄ）に示す固相支持体を使用すれば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃの
うち特定のものを有するヌクレオチドをオリゴヌクレオチドの１番目のヌクレオチドとす
ることができる。なお、図１３（Ｂ）ではＩｃａａが結合されているＣＰＧは図示してい
ない。なお、図１３において、ＣＰＧ（Controlled Porou Glass）は多孔性ガラスビー
ズであり、Ｍｅはメチル基、protected baseは保護基によって保護された塩基、ＤＭＴは
ジメトキシトチリル基、Ｉｃａａは長鎖アルキルアミノ（long chain alkylamino）基で
ある。

図１４は、本発明の実施の形態における、オリゴヌクレオチドプローブの合成に使用さ
れる固相支持体、試薬の例を説明する図である。

図１４（Ａ）及び図１４（Ｂ）は固相支持体の例を示し、図１４（Ａ）、図１４（Ｂ）
は３’末端側のアミノ修飾に使用される。図１４（Ｃ）及び図１４（Ｄ）は試薬の例を示
し、図１４（Ｃ）は５’末端側のチオール修飾、図１４（Ｄ）は５’末端側のアミノ修飾
にそれぞれ使用される。なお、Ｆｍｏｃは９−フルオレニルメトキシ基、ＤＭＴはジメト
キシトチリル基、Ｉｃａａは長鎖アルキルアミノ（long chain alkylamino）基、ＣＰＧ
は多孔性ガラスビーズ、Ｐｒiはイソプロピル基、ＳＴはＳ−トチリル基、ＭＭＴはモノ
メトキシトチリル基である。

先述したように、オリゴヌクレオチドプローブは、固相支持体を使用したオリゴヌクレ
オチドの調製、ＢＳＡ−２−ＯＳｕ、ＳＰ−１−ＯＳｕ等の中間体化合物の調製、及び、
これら調整された２つ分子の結合反応によって合成される。

次に、中間体化合物としてＳＰ−１−ＯＳｕを例にとりその合成方法及びその結果につ
いて説明し、３’−アミノ−５’−ＳＰ−１−オリゴヌクレオチドプローブの合成につい
て説明する。

実施例
中間体ＳＰ−１−ＯＳｕの合成
図１５は、本発明の実施例における、オリゴヌクレオチドプローブ（３’−アミノ−５
’−ＳＰ−１−オリゴヌクレオチドプローブ）の合成に使用される中間体ＳＰ−１−ＯＳ
ｕを説明する図である。

（１）化合物１の合成
アルゴン雰囲気下で、p-anisidine（Ｃ１（図１５）、ｐ‐メトキシアニリン、ＣＨ₃Ｏ
Ｃ₆Ｈ₄ＮＨ₂）５０５ｇ（４．１２ｍｏｌ）、1-iodonaphthalene（Ｃ２（図１５）、１‐
ヨードナフタレン、Ｃ₁₀Ｈ₇Ｉ）１０５ｇ（０．４１ｍｏｌ）、Ｐｄ（ＯＡｃ）₂（二酢酸
パラジウム（II）、Ｐｄ（ＯＣＯＣＨ₃）₂）１．８５ｇ（８．２４ｍｍｏｌ）、tri-tert
-butylphosphine（トリ‐ｔｅｒｔ‐ブチルホスフィン、（ＰＣ（ＣＨ₃）₃）₃）５．００
ｇ（２４．７ｍｍｏｌ）、sodium tert-butoxide（tri-tert-butylphosphinesodium tert
-butoxide、ナトリウムｔｅｒｔ‐ブトキシド、Ｃ₄Ｈ₉ＯＮａ）４７．５ｇ（０．４９ｍ
ｏｌ）の、脱水キシレン５００ｍＬ懸濁溶液を２１時間穏やかに還流した。冷却後、塩酸
を加え、酢酸エチルにて抽出した。有機層を希塩酸で洗浄し無水硫酸マグネシウムで乾燥
後、減圧乾燥した。濃縮残渣をシリカゲルカラム精製（トルエン）し粗体をメタノールで
洗浄し、無色の化合物１ ６８．９ｇ（収率６６％）を得た。

（２）化合物２の合成
アルゴン雰囲気下で、化合物１ １９．６ｇ（７８．６ｍｍｏｌ）、2-(p-bromophenyl)
-1,3-dioxolane（Ｃ３（図１５）、２‐（４‐ブロモフェニル）‐１，３‐ジオキソラン
、Ｃ₉Ｈ₉ＢｒＯ₂））１９．７ｇ（８６．４ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＯＡｃ）₂ ０．３５ｇ（
１．５７ｍｍｏｌ）、tri-tert-butylphosphine ０．９５ｇ（４．７ｍｍｏｌ）、sodium
tert-butoxide ９．０６ｇ（９４．３ｍｍｏｌ）、の脱水キシレン７８ｍＬ懸濁溶液を
１９時間穏やかに還流した。冷却後、水に注ぎ、トルエンにて抽出した。有機層を水洗し
無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下で濃縮した。濃縮残渣をシリカゲルカラム精製（
トルエン）し黄色粘性液体の化合物２ ２５．２ｇ（収率８０％）を得た。

（３）化合物３の合成
化合物２ １４．５ｇ（３６．５ｍｍｏｌ）と３０％ＨＢｒ−ＨＯＡｃ（酢酸、ＣＨ₃Ｃ
ＯＯＨ）１４５ｇの混合溶液を３時間還流した。冷却後、水と塩化メチレンを加え、不溶
物をろ別した。ろ液を分液し、有機層を水洗し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下
で濃縮した。濃縮残渣をシリカゲルカラム精製（塩化メチレン〜酢酸エチル／ヘキサン＝
１／２）し、黄色アモルファスの化合物３ ３．７１ｇ（収率３０％）を得た。

（４）化合物４の合成
アルゴン雰囲気下で、p-xylyl cyanide（Ｃ４（図１５）、ｐ‐キシレンジシアニド、
Ｃ₁₀Ｈ₈Ｎ₂）５０．２ｇ（０．３８ｍｏｌ）の脱水エーテル溶液７６０ｍＬに、ヨウ素
９７．１ｇ（０．３８ｍｏｌ）を加え、水冷しながら sodium methoxide（ナトリウムメ
トキシド、ＣＨ₃ＯＮａ）１４８ｇ（０．７７ｍｏｌ ２８％ in ＭｅＯＨ）を１５分間に
て滴下した。室温で３０分攪拌後、減圧下で溶媒を溜去した。濃縮残渣をメタノールで数
回洗浄し、深緑色結晶の化合物４ ４０．５ｇ（収率８２％）を得た。

（５）化合物５の合成
化合物４ １５．０ｇ（５８．１ｍｍｏｌ）のトルエン溶液４．５Ｌを高圧水銀灯の照
射の下で、酸素をバブリングしながら７時間攪拌した。減圧下で、反応混合液を濃縮し、
スラリー状態となって析出した固体をろ過した。得られた粗体をトルエンで洗浄し、淡山
吹色結晶の化合物５ １３．３ｇ（収率８９％）を得た。

（６）化合物６の合成
化合物５ １１．０ｇ（４２．９ｍｍｌ）のクロロホルム溶液８５８ｍＬに、ＮＢＳ（2
-nitrobenzenesulfenyl chloride、２‐ニトロベンゼンスルフェニルクロリド、Ｃ₆Ｈ₄Ｎ
Ｏ₂ＳＣｌ）２２．９ｇ（１２９ｍｍｏｌ）とＡＩＢＮ（azobisisobutyronitrile, azobi
sisobutylonitrile、アゾビスイソブチロニトリル、ＮＣＣ（ＣＨ₃）₂ＮＮ（ＣＨ₃）ＣＣ
Ｎ））１．０５ｇ（６．４５ｍｍｏｌ）をそれぞれ、３時間毎に１／５ずつ加え、合計１
５時間還流した。減圧下で濃縮し、スラリー状態となって析出した固体をろ過した。得ら
れた粗体をエタノールとヘキサンで洗浄し、淡褐色結晶の化合物６を含む混合物１４．１
ｇを得た。

（７）化合物７の合成
化合物６を含む混合物 １３．５ｇと亜リン酸トリエチル（トリエトキシホスフィン、
Ｐ（ＯＣ₂Ｈ₅)₃）４０．５ｇの混合物を１４５℃にて２４時間攪拌した。減圧下で、余剰
の亜リン酸トリエチルを溜去し、ヘキサンで洗浄した。得られた残渣をシリカゲルカラム
精製（塩化メチレン〜ＴＨＦ／塩化メチレン＝１／８）し、鮮黄色結晶の化合物７ ６．
５８ｇを得た。化合物５からの２段階収率は３９％であった。

（８）化合物８の合成
アルゴン雰囲気下で、６０％油性水素化ナトリウム（ヒドリドナトリウム、ＨＮａ）０
．６４ｇ（１５．９ｍｍｏｌ）からオイル除去した後、脱水ＴＨＦ１００ｍＬと化合物７
２．１９ｇ（５．５７ｍｍｏｌ）を加えた。室温にて１０分攪拌した後、０℃以下にて
化合物３ １．８０ｇ（５．３０ｍｍｏｌ）の脱水ＴＨＦ溶液５０ｍＬを２０分かけて滴
下した。同温にて４時間攪拌後、過剰の水素化ナトリウムをエタノール、続いて、水でク
エンチさせ、有機層を食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した。
濃縮残渣をメタノールで数回洗浄し、赤色結晶の化合物８ ２．６８ｇ（収率８７％）を
得た。

（９）化合物９の合成
アルゴン雰囲気下で、６０％油性水素化ナトリウム ０．１５０ｇ（３．７４ｍｍｏｌ
）からオイル除去した後、脱水ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド、（ＣＨ₃）₂ＮＣＨＯ）２
５ｍＬを加え、攪拌しつつ化合物８ ０．９０ｇ（１．５６ｍｍｏｌ）の脱水ＴＨＦ １０
０ｍＬ溶液を滴下した。５℃以下にてEthyl 5-bromopentanoate（Ｃ５（図１５）、Ethyl
5-bromovalerate、エチル５‐ブロモバレラート、ＣＨ₂Ｂｒ（ＣＨ₂）₃ＣＯＯＣ₂Ｈ₅）
１．９５ｇ（９．３３ｍｍｏｌ）を加え、室温にて３０分間攪拌後、６５℃にて１５時間
攪拌した。過剰の水素化ナトリウムをエタノール、続いて水でクエンチさせ、有機層をト
ルエンに溶解して水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下で、濃縮した。濃
縮残渣をメタノールで数回洗浄し、オレンジ結晶の化合物９ １．０６ｇ（収率９６％）
を得た。

（１０）化合物１０の合成
化合物９ ０．９８ｇ（１．３９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液 ２０ｍＬに１０％水酸化ナト
リウム水溶液（４．１６ｍｍｏｌ）を加え、５０℃にて１時間攪拌した。さらに、ＴＨＦ
２０ｍＬ、エタノール ４ｍＬ、１０％水酸化ナトリウム水溶液（１１．１ｍｍｏｌ）を
加え、６０℃にて３時間攪拌した。析出結晶をろ別し、ＴＨＦで洗浄した。得られた固体
にＴＨＦと塩酸を加えて溶解し、不溶物をろ過にて除去した。ろ液を減圧下で濃縮し、こ
げ茶色結晶の化合物１０ ０．６９ｇ（収率７３％）を得た。この化合物１０は、第三ア
ミン化合物ＳＰ−１である（より正確に言えば、図２に示す蛍光プローブＳｐ−１におい
て、分子鎖ｏｌｉｇｏ（オリゴヌクレオチド）が結合される前の状態の芳香族第三アミン
化合物である。）。

（１１）ＳＰ−１−ＯＳｕの合成
化合物１０ ０．６９ｇ（１．０２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液 ２０ｍＬに N,N'-dicycloh
exylcarbodiimide（Ｎ，Ｎ’‐ジシクロヘキシルカルボジイミド、ＤＣＣ、Ｃ（ＮＣ₆Ｈ_1
1）₂）０．４３ｇ（２．０４ｍｍｏｌ）、N-hydroxysuccinimide（Ｎ‐ヒドロキシスクシ
ンイミド、ＨＯＳｕ、Ｃ₄Ｈ₅ＮＯ₃)０．２４ｇ（２．０４ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１
６時間攪拌した。減圧下で溶媒を除去し、濃縮残渣にメタノールを加えて洗浄し、赤色結
晶のＳＰ−１−ＯＳｕ ０．７０ｇ（収率８８％、純度９７．２％、ＨＰＬＣ（High perf
ormance liquid chromatography、高速液体クロマトグラフィー））を得た。

以上のように、中間体ＳＰ−１−ＯＳｕは、反応｛（第三アミン化合物ＳＰ−１）＋Ｈ
ＯＳｕ→ＳＰ−１−ＯＳｕ＋Ｈ₂Ｏ｝によって、合成することができる。より正確に言え
ば、図２に示す蛍光プローブＳｐ−１において、分子鎖ｏｌｉｇｏ（オリゴヌクレオチド
）が結合される前の状態の第三アミン化合物をＤｙ−ＯＨとする時、反応｛（Ｄｙ−ＯＨ
＋ＨＯＳｕ→Ｄｙ−ＯＳｕ＋Ｈ₂Ｏ）によって、中間体化合物Ｄｙ−ＯＳｕを合成するこ
とができる。

図１２において使用されるＢ６、即ち、ＢＳＡ−２−ＯＳｕも、ＳＰ−１−ＯＳｕの合
成と同様にして、分子鎖ｏｌｉｇｏが結合される前の状態のアミン化合物ＢＳＡ−２（図
３に示すＢＳＡ−２、Ｒ⁴⁷＝ＣＨ₃である。）と、ＨＯＳｕ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミド）の反応によって、合成することができる。

図２、図３、図４に示す蛍光プローブにおいて、分子鎖ｏｌｉｇｏ（オリゴヌクレオチ
ド）が結合される前の状態の芳香族第三アミン化合物をＤｙ−ＯＲと表わし、Ｒを、−Ｈ
、又は、アルキル基、例えば、−ＣＨ₃とする時、反応｛（Ｄｙ−ＯＲ＋ＨＯＳｕ→Ｄｙ
−ＯＳｕ＋ＲＯＨ）によって、中間体化合物Ｄｙ−ＯＳｕを合成することができる。

図１６は、本発明の実施例において、合成された中間体ＳＰ−１−ＯＳｕの¹Ｈ ＮＭＲ
（核磁気共鳴）スペクトルを説明する図である。

図１６において、横軸はケミカルシフト（ｐｐｍ）、縦軸は核磁気共鳴信号強度を示し
、各信号ピークのケミカルシフト値を上部に示し、信号ピークの近傍に信号強度を示して
いる。なお、ＮＭＲスペクトルは、日本電子株式会社の型番ＪＮＭ−ＡＬ４００ ＦＴ
ＮＭＲ装置を用いて測定した。

δｐｐｍ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）；１．９８（ｍ，４Ｈ），２．７１（ｍ，５Ｈ
），２．８４（ｍ，２Ｈ），３．９８（ｍ，２Ｈ），６．８４（ｍ，４Ｈ），７．１４−
７．４９（ｍ，１０Ｈ），７．６５（ｄ，１Ｈ），７．７９（ｄ，１Ｈ），７．８９−８
．００（ｍ，３Ｈ），８．７２−８．２９（ｍ，２Ｈ），８．５４（ｓ，１Ｈ），８．６
２（ｓ，１Ｈ）
１．９〜４．０ｐｐｍに脂肪族水素が１５個、６．８〜８．６ｐｐｍに芳香族水素が２
３個観測されており、ＳＰ−１−ＯＳｕの分子構造と一致する。

図１７は、本発明の実施例において、合成された中間体ＳＰ−１−ＯＳｕのＭＳスペク
トルを説明する図である。

図１７に示すＭＳスペクトルは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（Matrix Assisted Laser
Desorption Ionization−Time Of Flight−Mass Spectrometer、マトリックス支援レーザ
ー脱離イオン化法−飛行時間型−質量分析計）によって測定されたスペクトルであり、島
津製作所製の型番ＫＲＡＴＯＳ ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲの装置を用いて測定した。

図１７に示すように、中間体ＳＰ−１−ＯＳｕ（化学式Ｃ₅₀Ｈ₃₈Ｎ₄Ｏ₅）の分子量の計
算値７７４．２８に対して、測定された各ピークに関するｍ／ｚ（ｍ：分子量、ｚ：電荷
数）とパターン係数（出現頻度係数）から求めた分子量は７７４．８６であった。

図１６、図１７に示したＮＭＲスペクトル、ＭＳスペクトルは、合成された中間体化合
物ＳＰ−１−ＯＳｕが所望のものであることを示していた。

中間体化合物ＳＰ−１−ＯＳｕの吸収、発光特性
次に、合成された中間体化合物ＳＰ−１−ＯＳｕの吸収、発光特性について説明する。
吸収スペクトル、発光スペクトルは、日立製作所製の型番Ｕ−３３１０分光光度計および
ＦＬ―４５００蛍光光度計を用いて測定した。

図１８は、本発明の実施例において、中間体ＳＰ−１−ＯＳｕの吸収及び蛍光スペクト
ルを説明する図であり、図１８（Ａ）は溶液状態でのスペクトル、図１８（Ｂ）は乾燥状
態でのスペクトルを示す図である。

図１８において、横軸は波長（ｎｍ）、縦軸は、吸収及び蛍光スペクトルの極大値を１
．０に規格化した強度を示す。

先ず、中間体ＳＰ−１−ＯＳｕの溶液状態における吸収スペクトル（図１８（Ａ）中（
ａ））、蛍光スペクトル（図１８（Ａ）中（ｂ））について説明する。

１０％ＥｔＯＨ：５ｘＳＳＣバッファーを溶媒とする中間体ＳＰ−１−ＯＳｕ溶液の吸
収スペクトルの極大位置は４７４ｎｍであり、モル吸光係数は１２０，０００Ｍ^-1ｃｍ^-1
であった。また、蛍光スペクトルの極大位置は６５０ｎｍであり、蛍光収率は０．００８
１であった。吸収及び蛍光スペクトルの極大位置から求めたストークスシフトは、１７６
ｎｍであった。なお、蛍光収率は、基準物質としてローダミン１０１（絶対蛍光収率が０
．９６）を用いて、次式によって相対蛍光収率を算出する相対蛍光収率測定によった。
ＱＹ_f（ｓ）／ＱＹ_f（ｒ）＝［Ａｒｅａ（ｓ）／Ａｂｓ（ｓ）］／［Ａｒｅａ（ｒ）／Ａ
ｂｓ（ｒ）］
ＱＹ_f（ｓ）：サンプルの相対蛍光収率
ＱＹ_f（ｒ）：標準物質の絶対蛍光収率、文献値
Ａｒｅａ（ｓ）：サンプルの蛍光スペクトル面積
Ａｒｅａ（ｒ）：標準物質の蛍光スペクトル面積
Ａｂｓ（ｓ）：サンプルの吸光度
Ａｂｓ（ｒ）：標準物質の吸光度

次に、中間体ＳＰ−１−ＯＳｕの乾燥状態における吸収スペクトル（図１８（Ｂ）中（
ａ））、蛍光スペクトル（図１８（Ｂ）中（ｂ））について説明する。

オゾン処理したガラス基板上にエポキシ樹脂ＳＵ−８（ＳＵ−８−３０３５−Ｎ−０２
、化薬マイクロケム製）をシクロペンタノンで５０％に希釈して、スピンコート（まず、
５００ｒｐｍで１５秒、次に、１５００ｒｐｍで３０秒保持）した後に、２分間１００℃
で乾燥した。５０ｍＷ／ｃｍ²のキセノンランプで６秒紫外線照射して光硬化させ、１５
０℃で１０分アニールした。エポキシ樹脂付き基板を、３−アミノプロピルトリエトキシ
シランと共に１２０℃のオーブン中で加熱し、基板上にアミノ基を導入した。ＤＭＦに１
０ｍＭの濃度でＳＰ−１−ＯＳｕを溶解し、アミノ基付き基板を２時間浸漬して基板上に
ＳＰ−１−Ｏｓｕを担持させた。基板上の乾燥状態にあるフイルム状中間体ＳＰ−１−Ｏ
Ｓｕの励起スペクトルの極大位置は４８４ｎｍであった。また、蛍光スペクトルの極大位
置は５５６ｎｍであった。吸収及び蛍光スペクトルの極大位置から求めたストークスシフ
トは、７２ｎｍであった。

以上のように、中間体ＳＰ−１−ＯＳｕは、溶液状態、乾燥状態の何れにおいても、大
きなストークスシフトを示した。このことは、所望の領域外の光を遮断し所望の領域内の
光を透過させ試料に照射される励起光を通過させる励起フィルタの光通過波長領域が、蛍
光スペクトルが存在する波長領域と重畳しないように、且つ、励起光を遮断すると共に蛍
光スペクトルが存在する波長領域の大部分からの光を透過させるような蛍光フィルタの設
計が、容易となる。即ち、励起フィルタの光通過波長領域と、蛍光フィルタの光通過波長
領域が十分に分離するようにできるので、試料から放射された蛍光とその他の不要な迷光
等とを分離することが容易となる。

図１９は、本発明の比較例における吸収及び蛍光スペクトルを説明する図であり、図１
９（Ａ）は、５ｘＳＳＣバッファー液で測定されたＩＣ３−ＯＳｕ（Ｃｙ３）に関するス
ペクトル、図１９（Ｂ）は、ＴＨＦ液中で測定されたＦＩＴＣ−Ｉに関するスペクトルで
ある。

図１９（Ａ）、図１９（Ｂ）において、（ａ）は励起スペクトルと励起フィルタを示し
、（ｂ）は蛍光スペクトルと蛍光フィルタを示す。図１９（Ａ）、図１９（Ｂ）に示す例
では、励起フィルタと蛍光フィルタは非常に近接した波長域の通過帯域をもつものとなっ
ている。励起フィルタと蛍光フィルタの透過率データはセムロック社公開のデータである
。

ＩＣ３−ＯＳｕ（Ｃｙ３）は、同仁同化学研究所製のラベル化剤であり、ＧＥヘルスケ
アバイオサイエンス社製のＣｙ３に類似するものである。ＦＩＴＣ−Ｉは、フルオロセイ
ンにイソチオシオナート基を結合させたものである。

式（ａ）：ＩＣ３−ＯＳｕの分子構造

式（ｂ）：ＦＩＴＣ−Ｉの分子構造

図１９（Ａ）に示すようにＩＣ３−ＯＳｕでは、ストークスシフトは約１０ｎｍであり
、図１９（Ｂ）に示すようにＦＩＴＣ−Ｉでは、ストークスシフトは約２５ｎｍである。

図１８と図１９の比較から明らかなように、中間体ＳＰ−１−ＯＳｕは、乾燥状態、溶
液状態の何れにおいても、ＩＣ３−ＯＳｕ、ＦＩＴＣ−Ｉよりもはるかに大きなストーク
スシフトを有している。

なお、Ｃｙ３、ＳＰ−１の各色素溶液をガラス容器に保存し、蛍光灯下に放置したとこ
ろ、Ｃｙ３は１ヶ月で色が消失したが、ＳＰ−１では変化が生じなく、耐光性に優れてい
ることが確認された。

Ｃｙ３やフルオロセインの誘導体は、例えば、レーザやハイパワーの光源で容易に劣化
して、再現性のある繰り返し測定を困難なものするが、ＳＰ−１はこのよう劣化をせず、
再現性のある繰り返しの測定にも使用可能である。

次に、色素の分子構造とスペクトルとの関係、光酸化耐性の違いを、分子軌道計算によ
って検討した結果について説明する。

オレフィン（エチレン）二重結合を２個有し、分子式Ｃ₂₅Ｈ₂₆Ｎ₂Ｃｌで示される色素
Ｃｙ３（上述の式（ａ）において、Ｎ⁺−Ｃ₁₀Ｈ₁₄Ｏ₄Ｎの部分をＮ−ＣＨ₃と変更し、Ｎ
Ｃ₂Ｈ₅の部分をＮ−ＣＨ₃と変更した色素である。）と、分子式Ｃ₄₂Ｈ₂₉Ｎ₃で示される色
素ＳＰ（図１５に示す化学式８において−ＯＨを−ＣＨ₃で置換された構造を有する色素
である。）を検討の対象とした。

色素Ｃｙ３、色素ＳＰのそれぞれについて、分子軌道計算によって、基底状態の構造最
適化を行い基底状態におけるＨＯＭＯ（Highest occupied molecular orbital、最高被占
分子軌道）、ＬＵＭＯ（Lowest occupied molecular orbital、最低被占分子軌道）のエ
ネルギー準位を求め、次に、基底状態におけるＨＯＭＯから１電子をそのスピンを反転さ
せてＬＵＭＯに移して励起状態の始状態として、励起状態の構造最適化がなされた核再安
定化後におけるＨＯＭＯ、ＬＵＭＯのエネルギー準位を求めた。また、基底状態と励起状
態における構造の変化を調べた。

色素Ｃｙ３では、分子軌道計算によって求められた基底状態及び励起状態におけるＨＯ
ＭＯとＬＵＭＯのエネルギー準位ギャップはそれぞれ、６．２６ｅＶ、２．５６ｅＶであ
り、ストークスシフトは３．７ｅＶであった。

色素ＳＰでは、分子軌道計算によって求められた基底状態及び励起状態におけるＨＯＭ
ＯとＬＵＭＯのエネルギー準位ギャップはそれぞれ、７．２２ｅＶ、２．３９ｅＶであり
、ストークスシフトは４．８３ｅＶである。色素ＳＰのストークスシフトは、色素Ｃｙ３
のストークスシフトよりも大きな値である。

色素Ｃｙ３では、ＨＯＭＯ、ＬＵＭＯは共に、中心のオレフィン二重結合のπ電子共役
が関係しており、励起に伴う構造の変化、即ち、基底状態と励起状態における構造の変化
は小さい。色素Ｃｙ３は、励起されても電子雲の広がりが基底状態とあまり変わらないの
で、構造の変化が小さくストークスシフトが小さい。

また、色素Ｃｙ３においては、ＨＯＭＯでは電子がオレフィン二重結合部に局在し、る
オレフィン二重結合の電子密度が高いので、求電子反応を起し易く、酸素の攻撃を受け酸
化され易い。

色素ＳＰにおける、励起に伴う構造の変化、即ち、基底状態と励起状態における構造の
変化は、（１）フェナントレン環の上面から見た時、フェナントレン環とフェニル環を結
ぶオレフィン（エチレン）二重結合周りの捩れ角が異なっている点、（２）上記のオレフ
ィン二重結合の軸方向から見た時、アミン窒素（Ｎ）周りの角度が異なっている点、（３
）アミン窒素（Ｎ）と上記のオレフィン二重結合の間のフェニル環の側面から見た時、フ
ェンアントレン環とフェニル環（アミン窒素（Ｎ）と上記のオレフィン二重結合の間の環
）がそれぞれなす平面間の角度が異なり、フェナントレン環の平面性、即ち、フェニル環
のなす平面に対するフェナントレン環のなす平面の位置関係が異なっている点に認められ
た。

色素ＳＰにおいては、ＨＯＭＯでは電子供与性のアミン部に電子が局在し、ＬＵＭＯで
は電子吸引性のフェナントレン部に電子が局在しており、基底状態から励起状態への遷移
は電荷移動型であり、上記のオレフィン二重結合の電子密度は小さい。ＨＯＭＯとＬＵＭ
Ｏでは電子分布の状態が異なる結果、上記（２）及び（３）に示した構造的相違が生じて
いる。

色素ＳＰでは、励起によって、電子は、アミン部からフェナントレン部へ移動し、上記
のオレフィン二重結合が大きく捩れて構造変化するため、励起状態の構造と基底状態の構
造の差は大きく、ストークスシフトが大きくなる。また、上記のオレフィン二重結合の電
子密度は小さいので、求電子反応を起し難く、酸素の攻撃を受け酸化され難い。

本発明による標識化合物は、スチリル部のオレフィン（エチレン）二重結合に、電荷の
偏りを大きくするアミン部（例えば、アミン窒素にフェニル環、ナフチル環が結合してな
るアミン部であり、電子を押出すドナー部である。）と、シアノアレーン（例えば、シア
ノ基で置換されたフェナントレン環であり、電子を吸引するアクセプタ部である。）が結
合されているため、分子内に電荷の偏りが生じ分子内の電荷移動に由来する吸収帯を長波
長側に生じ、このため、蛍光波長は長波長化される。

この長波長化された蛍光を感度よく検出するためには、長波長域、例えば、５００ｎｍ
以上の波長域で検出感度が改善された光電子増倍管（ＰＭＴ）、例えば、光電陰極にＧａ
ＡｓＰを使用したＰＭＴ等を使用すればよい。

以上説明したように、本発明の標識化合物は、従来の標識化合物に比べて、ストークス
シフトが大きく、しかも、耐光性が高い。従って、励起フィルタの光通過波長領域と、蛍
光フィルタの光通過波長領域が十分に分離することができるので、試料から放射された蛍
光とその他の不要な迷光等とを分離することができ、検査対象分子を高感度、高ＳＮ比で
検出することができる。また、耐光性が優れているので、微量分子を検出する際に励起光
の強度を高めても、標識化合物の光劣化によって生じるデータばらつきは殆んど生じなく
、安定した繰り返し測定が可能であり、繰り返し測定の再現性を改善することができる。

３’−アミノ−５’−ＳＰ−１−オリゴヌクレオチドプローブの合成
上記の中間体化合物ＳＰ−１−ＯＳｕ（Ａ１４）と、ＤＮＡ固相合成機を使用して合成
されたオリゴヌクレオチド（塩基数はｎ＝３０である。）（Ａ１３）を、図９、図１０に
示したスキームに従って反応させて、３’アミノ基の脱保護を行い、３’−アミノ−５’
−ＳＰ−１オリゴヌクレオチドプローブ（Ａ１７）を合成した。

３’−アミノ−５’−ＳＰ−１オリゴヌクレオチドプローブの合成結果は、ＨＰＬＣ、
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによってその純度、構造を確認した。

なお、中間体ＳＰ−１−ＯＳｕは、図５に示す３’−アミノ−５’−ＳＰ−１−オリゴ
ヌクレオチドプローブの合成スキーム（図８〜図１０を参照。）に使用される化合物であ
るが、この中間体ＳＰ−１−ＯＳｕを、生体分子と共有結合可能である化合物、即ち、先
述した蛍光標識化合物として使用することもできる。

なお、中間体ＳＰ−１−ＯＳｕは、活性エステル化したカルボニル基（Ｎ−ヒドロキシ
−スクシンイミドエステル基、（ＮＨＳ基、ＯＳｕ基のように呼ばれている。）を有して
いるエステルであり、アミノ酸、タンパク質におけるアミノ基との間で共有結合を生じる
。従って、中間体ＳＰ−１−ＯＳｕを蛍光標識化合物として使用することができる。

例えば、ＳＰ−１−ＯＳｕを、アミノ酸、タンパク質のようにアミノ基を有する生体分
子に結合させて標識し、光励起によって蛍光を発生させることができ、生体分子を検出す
ることができるので、生体分子のための蛍光標識化合物として使用することができる。

以上、本発明を実施の形態について説明したが、本発明は上述の実施の形態に限定され
るものではなく、本発明の技術的思想に基づいて各種の変形が可能である。

例えば、本発明による標識化合物を、抗原分子、リガンド分子、糖タンパク分子にそれ
ぞれ結合させて、これら分子にそれぞれ結合する抗体分子、レセプタ分子、レクチン分子
を検出することもできる。

以上説明したように、本発明は、生体由来分子を高感度、高ＳＮ比で検出することがで
きる標識化合物を提供することができる。

本発明の実施の形態における、芳香族アミン蛍光プローブの構成を説明する図である。 同上、芳香族アミン蛍光プローブ（第１の蛍光プローブ）の例を示す図である。 同上、芳香族アミン蛍光プローブ（第１の蛍光プローブ）の例を示す図である。 同上、芳香族アミン蛍光プローブ（第２の蛍光プローブ）の例を示す図である。 同上、芳香族アミン蛍光プローブの例を示す図であり、３’−アミノ−５’−ＳＰ−１−オリゴヌクレオチドプローブを説明する図である。 同上、芳香族アミン蛍光プローブの例を示す図であり、５’−ＤＮＰＡ−オリゴヌクレオチドプローブを説明する図である。 同上、芳香族アミン蛍光プローブの例を示す図であり、３’−ＢＳＡ１−５’−チオ−オリゴヌクレオチドプローブを説明する図である。 同上、芳香族アミン蛍光プローブの合成スキーム例を示す図であり、３’−アミノ−５’−ＳＰ−１−オリゴヌクレオチドプローブの合成スキームを説明する図である。 同上、図８に示す合成スキームに続く図である。 同上、図９に示す合成スキームに続く図である。 同上、芳香族アミン蛍光プローブの合成スキーム例を示す図であり、３’−ＢＳＡ−２−５’−チオ−オリゴヌクレオチドプローブの合成スキームを説明する図である。 同上、図１１に示す合成スキームに続く図である。 同上、オリゴヌクレオチドプローブの合成に使用される固相支持体の例を説明する図である。 同上、オリゴヌクレオチドプローブの合成に使用される固相支持体、試薬の例を説明する図である。 本発明の実施例において、オリゴヌクレオチドプローブの合成に使用される中間体ＳＰ−１−ＯＳｕの吸収及び蛍光スペクトルを説明する図である。 同上、合成された中間体ＳＰ−１−ＯＳｕの1Ｈ ＮＭＲスペクトルを説明する図である。 同上、合成された中間体ＳＰ−１−ＯＳｕのＭＳスペクトルを説明する図である。 同上、合成された中間体ＳＰ−１−ＯＳｕの吸収及び蛍光スペクトルを説明する図である。 同上、比較例における吸収及び蛍光スペクトルを説明する図である。

１０…生体分子に結合可能な分子鎖

Claims (10)

1. 下記一般式［Ｉ］で示された芳香族第三アミン化合物からなり、酵素、タンパク質、糖、核酸、オリゴヌクレオチド、脂肪類又はアミノ酸からなる検査対象分子と結合可能な分子鎖を有している標識化合物。
   一般式［Ｉ］：
   （但し、前記一般式［Ｉ］において、
   ｎは０又は１であり、
   Ｓ¹は、主鎖部に下記ＧＰ１から選択された二価の基を含んでもよいアルキル鎖を含む二価のスペーサに、前記分子鎖が結合された分子鎖結合基を含み、Ｓ²は下記Ｇｐ２から選択された基であり、
   Ｒ¹、Ｒ²は、同一又は異なってもよく、ヒドロ基、アルキル基、ヘテロ原子を含んでもよいアリール基から選択された基であり、
   Ｒ³は、ヒドロ基、下記Ｇｐ２から選択された基を置換基として有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよいビニル基から選択された基であり、
   Ａｒ ¹ はナフチレン基であり、Ａｒ² はアリーレン基又はビニレン基であってアルキル基、アリール基、シアノ基、トリフルオロメチル基、ハロ基から選択された置換基を少なくとも一箇有し、ｎが１の場合、Ａｒ¹とＲ¹、又は／及び、Ａｒ²とＲ²が相同して環を形成していてもよく、
   Ｇｐ１は二価の基であり、ヘテロ原子を含んでもよいアリーレン基、ビニレン基、カルボニル基、オキシ基、オキシカルボニル基、チオ基、スルフィニル基、スルホニル基、イミノ基、ウリレン基、アミド基、シリレン基であり、
   Ｇｐ２は一価の基であり、ヒドロ基、アルキル基、アリール基、置換基を含んでもよいビニル基、アミノ基、メルカプト基、ヒドロキシ基、カルバモイル基、スルフィノ基、スルホ基、カルボキシ基、ハロ基である。）
2. 前記アルキル鎖の炭素数が３以上、２０以下である、請求項１に記載の標識化合物。
3. 前記検査対象分子が生体由来分子である、請求項１に記載の標識化合物。
4. 前記分子鎖がオリゴヌクレオチドである、請求項３に記載の標識化合物。
5. 前記オリゴヌクレオチドの長さが５ｍｅｒ以上、２０ｍｅｒ以下である、請求項４に記載の標識化合物。
6. 前記オリゴヌクレオチドがその相補鎖配列を有する前記生体由来分子の相補鎖オリゴヌクレオチドを検出するためのプローブとして使用される、請求項４に記載の標識化合物。
7. Ｒ³が、フェニル基又はナフチル基である、請求項１に記載の標識化合物。
8. Ａｒ²が、フェニレン基、ナフチレン基、アントリレン基、フェナントレン基の何れかである、請求項１に記載の標識化合物。
9. 前記一般式［Ｉ］におけるＡｒ¹−（ＣＲ¹＝ＣＲ²）_n−Ａｒ²（ｎは０又は１）は、繰り返し単位（Ｃ＝Ｃ−）を含み、この繰り返し単位の繰り返し数をｍとする時、ｍ≧６であるＮ−（Ｃ＝Ｃ−）_mを有する、請求項１に記載の標識化合物。
10. 請求項１から請求項９の何れか１項に記載の標識化合物を、前記検査対象分子に結合させる工程と、
    光の照射によって、前記検査対象分子と結合した前記標識化合物から発する蛍光を検出する工程と、
    を有する、標識化合物を用いた検査対象分子の検出方法。