JP3872762B2 - Ｄｎａチップの品質管理方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＤＮＡチップに係り、より具体的には、ＤＮＡチップの品質管理方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡチップとは、通常、シリコン、表面改質ガラス、ポリプロピレン、活性化ポリアクリルアミドなどからなる固体表面上の数百ないし数十万個の定まった位置に、ヌクレオチドの数個ないし数百個の既知の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを固定させて微細集積化させたものである。このようなＤＮＡチップに分析しようとする標的ＤＮＡを接触させれば、ＤＮＡチップに固定されているプローブと標的ＤＮＡ断片上の塩基配列との相補の度合いによってそれぞれ相異なるハイブリッド結合状態をなし、このハイブリッド結合状態を光学的な方法または放射能化学的な方法などを通じて検出、解析することにより、標的ＤＮＡの塩基配列を分析することができる。
【０００３】
ＤＮＡチップは、ＤＮＡ分析システムを小型化し、極少量の試料でも遺伝子の分析を可能にした。さらに、標的ＤＮＡ上の幾つかの塩基配列を同時に検出できることにより、低コストで迅速に遺伝情報を提供することができる。また、ＤＮＡチップは、膨大な量の遺伝情報を短時間内に分析できるだけではなく、遺伝子間の相互関連性まで分析できる。ゆえに、ＤＮＡチップは遺伝病及び癌の診断、突然変異ならびに病原体の検出、遺伝子発現分析および新薬の開発などの幅広い分野において応用可能であると期待されている。また、ＤＮＡチップを微生物や環境汚染の感知器として用い解毒物質に対する遺伝子を捜し出して、遺伝子組み換え技術を適用することにより、解毒物質を大量生産したり、医薬用の農作物、低脂肪含有の肉類の生産にも応用できる。ＤＮＡチップは、ほとんどの生物関連産業に用いられ、革命的な発展をもたらすことができる。
【０００４】
ＤＮＡチップは、用いられたプローブの種類によってオリゴチップとｃＤＮＡチップとに大別できる。また、製造方法によってフォトリソグラフィチップとピン方式のスポッティングチップ、インクジェット方式のスポッティングチップに分類される。ＤＮＡチップの製造方法は、固定化されるプローブの種類によって様々で且つ複雑な化学的過程を経る。ガラス表面の狭い面積に極少量のＤＮＡプローブが固定されるため、固定されたプローブ間の定量的な変動とチップ間の変動とにより相当の誤差が発生し、ハイブリッドを通じて得られる結果に一貫性がないという致命的な短所が指摘されてきた。
【０００５】
このような問題点を解決するために、ハイブリッド結合に入る前にＤＮＡチップの品質を管理する方法が開発され、用いられている。スタンフォード大学のブラウンらは、ガラスの表面にスポッティングされるＤＮＡプローブと共存する塩により、光線が散乱されることをレーザースキャナにより検出し、ＤＮＡプローブスポッティングの均一性及びガラス表面の損傷の有無を検査する方法を開発した。この方法は、スポッティング直後にのみ簡単にＤＮＡスポットを検査する方法として用いられるのに対し、次の作業である固定化及び洗浄後にはＤＮＡスポットに存在する塩が除去されるため、ＤＮＡチップの製造が終わった後のＤＮＡスポットの品質を検査できないという問題点がある。
【０００６】
最近では、ＤＮＡプローブに結合し得る蛍光物質を用いてガラス表面上のＤＮＡスポットを染色する方法が開発された（非特許文献１）。これは、単一ストランドのＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に高い親和性をもって結合する蛍光物質であるSYBR Green IIでＤＮＡチップを処理してガラス表面上に固定されたＤＮＡプローブを、レーザースキャナによって感知する方法である。ＤＮＡプローブに結合された蛍光物質は洗浄によって完全に除去されると報告している。この方法は、ブラウンらにより開発された前記方法に比べて、ＤＮＡチップの製造が終わった後にＤＮＡチップを検査できるという長所はあるが、検査のために染色及び脱色の操作をしなければならず、ＤＮＡチップを数回に亘って洗浄する作業が必要である。また、洗浄後にガラスの表面に残留しうる蛍光物質がハイブリッドに影響を及ぼす可能性がある。
【０００７】
【非特許文献１】
Battaglia C, Salani G, Consolandi C, Rossi Bernardi L, De Bellis G. 「Analysis of DNA Microarrays by Non-Destructive Fluorescent Staining Using SYBR Green II, Biotechniques」, 2000 Jul; 29, P.78-81
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の主な目的は、染色及び脱色の過程を経ることなく、ＤＮＡスポットの品質及び大きさを、非破壊的な方法により検査することのできるＤＮＡチップの品質管理方法を提供するところにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明は、ＤＮＡチップ基板にスポットするＤＮＡスポッティング溶液を調製する際に蛍光物質を添加し、スポッティングすることにより、ＤＮＡチップのスポットから発っせられる蛍光シグナルを検出することを含むＤＮＡチップの品質管理方法を提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明のＤＮＡチップの品質管理方法は、特定の波長において励起／放出される第１の蛍光物質を含有するＤＮＡスポッティング溶液を調製する段階と、前記ＤＮＡスポッティング溶液を基板にスポッティングしてＤＮＡチップを製造する段階と、前記ＤＮＡスポットから発せられる蛍光シグナルを検出する段階と、を含むＤＮＡチップの品質管理方法である。
【００１１】
本発明は、ピン方式のスポッティングチップに関するものであるが、ＤＮＡチップ基板にＤＮＡスポッティング溶液をスポッティングした後に蛍光物質を固定してチップの品質を管理する従来の方法とは異なって、ＤＮＡチップ基板にスポットするＤＮＡスポッティング溶液にＤＮＡプローブと共に第１の蛍光物質を含む点に特徴がある。具体的な調製方法としては、ゲルマトリックス、ＤＭＳＯなどの溶媒に、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）等により予め調製したＤＮＡプローブ、および第１の蛍光物質を添加するものである。また第１の蛍光物質は該溶液中に均一に分散、または溶解していることが好ましく、ボルテックスミキサーなどにより均一に撹拌して調製する。
【００１２】
次に、ＤＮＡスポッティング溶液を基板にスポッティングしてＤＮＡチップを製造する段階では、ＤＮＡプローブをＤＮＡチップ基板に固定する際、第１の蛍光物質も基板の表面に共有結合により固定することで、ＤＮＡチップを製造する。
【００１３】
さらに、前記ＤＮＡスポットから発せられる蛍光シグナルを検出する段階において、スポットから発せられる蛍光シグナルを検出することにより、ＤＮＡスポットの均一度を非破壊的に測定することができる。
【００１４】
ＤＮＡスポットの均一度とは、上記のように検出した蛍光シグナルから、ＤＮＡスポットのスポット径及び形状、ならびに蛍光シグナルの蛍光強度等を測定した後、各スポット間のスポット径及び形状、ならびに蛍光シグナルの蛍光の強度等を比較することにより判断するものである。前記ＤＮＡスポットの均一度は、シグナルの蛍光強度の標準偏差が小さく、さらにスポット径及び形状が一定であるものが好ましい。これは、スポット径および形状が一定でないとシグナル強度にバラツキが生じ、信頼性の低いデータとなるためである。
【００１５】
上述のように、前記ＤＮＡスポットの均一度の差が任意の許容可能なレベル内であるか管理することにより、ＤＮＡチップの品質管理を行う。
【００１６】
本発明において用いられる第１の蛍光物質は、図１に示すような、蛍光シグナルを発する蛍光グループＦと、固体基板と単独または他のものを介して共有結合し得る官能基Ｒとを含む。
【００１７】
蛍光グループＦとしては、フルオレセイン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、テキサスレッド、ＴＡＭＲＡ、およびこれらの１価以上の基が挙げられる。また官能基Ｒとしては、アミノ、活性化エステル、イソチオシアナート、またはアルデヒドなどが挙げられる。
【００１８】
蛍光グループＦと官能基Ｒとは、直接結合してもよいが、エチレン、メチレン等の二価の基とを介して結合してもよい。また図１において、ＦとＲの結合を波線で示す。
【００１９】
前記ＤＮＡスポッティング溶液中の第１の蛍光物質の濃度は、１〜１０μＭであり、これは前記ＤＮＡスポッティング溶液に含有するＤＮＡプローブの濃度によって変化しうる。
【００２０】
蛍光シグナルを発する第１の蛍光物質に含まれる蛍光グループＦとしては、ＤＮＡチップの製造後、標的ＤＮＡのラベリングに用いられる第２の蛍光物質に含まれる蛍光グループの励起／放出波長における相互干渉がないものであって、好ましくは、フルオレセイン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、テキサスレッド、またはＴＡＭＲＡなどの蛍光グループが用いられる。
【００２１】
本発明において、ＤＮＡプローブの固定は、第１の蛍光物質の基板への固定と共に行い、ＤＮＡプローブおよび第１の蛍光物質は共に固体基板と共有結合をする官能基を有し、該官能基はＤＮＡチップの類型によってアミン、アルデヒド、ポリ−ライシンなど固体基板の表面の官能基と共有結合をし得るものでなければならず、上記のようにアミン、イソチオシアナート、活性化エステルなどの官能基が用いられる。
【００２２】
なお、本発明はＤＮＡスポッティング溶液に上記第１の蛍光物質を含む点に特徴があり、該溶液に使用するＤＮＡプローブや溶媒の種類、ＤＮＡプローブの溶液中の濃度等は上述の通りである。
【００２３】
前記方法により製造されたＤＮＡチップの品質管理方法において、蛍光シグナルの検出方法は蛍光物質の種類によって適宜選択でき、当該分野に公知の方法を広く採用でき、特に制限されるものではない。例えば、蛍光グループとしてフルオレセイン、または蛍光物質としてＦＩＴＣを用いた場合、アルゴンイオンレーザーにより４８８ｎｍ波長において励起し、５２０ｎｍ波長のフィルターを用いて蛍光シグナルを検出することができる。
【００２４】
本発明の方法によるＤＮＡチップの品質管理方法は、ＤＮＡチップだけではなく、ＲＮＡチップ及び蛋白質チップなど、他の類型にも適用可能である。
【００２５】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであるため、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されると解釈されてはならない。
【００２６】
【実施例】
下記実施例において、ＤＮＡチップの製造時にＤＮＡプローブと共に固定した蛍光物質が、ＤＮＡチップ上で蛍光標識した標的ＤＮＡとハイブリッドした後に生成される蛍光の強度に影響を及ぼすか否かを調べた。
【００２７】
オリゴヌクレオチドプローブを固定させたＤＮＡチップとｃＤＮＡを固定したＤＮＡチップの二つのタイプのＤＮＡチップを用いた。
【００２８】
実施例１：オリゴヌクレオチドプローブを固定したＤＮＡチップの品質管理
Ａ．ゲルマトリックスを用いたＤＮＡオリゴヌクレオチドチップの製造
２種類のオリゴヌクレオチドプローブ（ＰＭ（perfect match）：５’−ＴＧＴＡＧＡＣＡＣＧＣＡＣＣＴＣＣＧＴＧ−３’（配列番号１）、ＭＭ（mismatch）：５’−ＴＧＴＡＧＡＣＡＣＣＣＡＣＣＴＣＣＧＴＧ−３’（配列番号２））及び蛍光物質である４’−（アミノメチル）フルオレセイン（０μＭ、１μＭ、２μＭ）をゲルマトリックス溶液に添加して撹拌し、３７℃において１４時間放置することによりマトリックス−ＤＮＡ共役を製造した後、これをスポッティング溶液として用いた。前記スポッティング溶液を、アミノ基を有するように表面処理したガラス表面上にスポッティングした後、３７℃の湿式チャンバに４時間放置した。次に、バックグラウンドノイズの制御に必要な工程、すなわち標的核酸をガラス表面に固定させないために、スポッティングされていない位置のガラス表面のアミノ基が負電荷を帯びるように下記工程を経た。５ｇの無水コハク酸を３１５ｍｌの１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）に溶かした後、３５ｍｌのホウ酸ナトリウムを添加及び撹拌して得られた溶液によりガラスを処理した後、蒸留水を用いて洗浄し、乾燥器に保管した。
【００２９】
前記実験において用いられた蛍光物質である４’−（アミノメチル）フルオレセインの構造式は、下記の通りである：
【００３０】
【化１】
【００３１】
ガラス表面のアミノ基と、ゲルマトリックスがリンカの役割を果たしてアミノメチルフルオレセインとにより結合する。
【００３２】
Ｂ．Ｃｙ３の蛍光によるハイブリッド敏感度の測定
前記ＤＮＡチップにハイブリッドした蛍光標識標的物質により放射された蛍光シグナルをスキャンアレイスキャナを用いて解像度１０μｍピクセルにて検出し（GSI Lunonics）、プローブアレイ細胞の強度、ヌクレオチド塩基−コール、配列の測定及びリポートをＧｅｎｅＰｉｘチップソフトウェア（アクソン）上において使用可能な機能により示した。
【００３３】
前記方法により行われたゲルマトリックスを用いたＤＮＡチップの標的核酸とハイブリッドする前のＤＮＡチップ製造後のスキャニング結果（品質管理過程、ＱＣテスト）、及び標的核酸とのハイブリッド後のスキャニング結果（Ｕｓｅテスト）を図２に示す。
【００３４】
図２において、ＤＮＡチップのＱＣテストのスキャニングはアルゴン−イオンレーザーによって４８８ｎｍ波長において励起させ、５２０ｎｍ波長のフィルターを用いて放出信号を得たものであり、Ｕｓｅテストのスキャニングは５５０ｎｍ波長において励起させ、５７０ｎｍ波長のフィルターを用いて放出信号を得たものである。Ｕｓｅテストにおいて用いられた標的核酸はＨＮＦ−１α遺伝子エクソン４区間のコドン２６３に該当するヌクレオチドＣ（シトシン）ベースが中央に位置し、５’末端にＣｙ３が固定した２０ヌクレオチドシーケンスである（５’−Ｃｙ３−ＣＡＣＧＧＡＧＧＴＧＣＧＴＧＴＣＴＡＣＡ−３’（配列番号３））。
【００３５】
図２に示したように、完全マッチに該当するプローブとミスマッチに該当するプローブとをそれぞれ９スポットずつスポッティングし、スポット径は１７０±１５μｍであり、スポット間の間隔は３７５μｍに調節した。
【００３６】
Ｃ．結果
表１から見られるように、Ｕｓｅテストにおいて４’−（アミノメチル）フルオレセインと共に固定化したスポットの蛍光強度は蛍光物質のないスポットの蛍光強度と大差なかった。これは、４’−（アミノメチル）フルオレセインの蛍光物質が標的核酸とのハイブリッドに影響を及ぼさないということを示す。
【００３７】
【表１】
【００３８】
実施例２：ｃＤＮＡを固定させたＤＮＡチップの品質管理
Ａ．重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）によるプローブとして用いる遺伝子増幅
グリセルアルデヒド−３−ホスファートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を生産する組換え遺伝子をＤＮＡ核酸抽出キット（ＱＡＩＧＥＮ）を用いて分離した。分離した組換え遺伝子を用いて多量のＧＡＰＤＨ遺伝子のみを増幅するために、全ての重合酵素連鎖反応は最終体積が１００μｌになるようにして行った。
【００３９】
純粋な組換えＧＡＰＤＨ ＤＮＡ ５０ｎｇ、熱安定性ＤＮＡポリマラーゼ；２．５Ｕ、２００μＭ ｄＮＴＰ：（ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ）、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、４０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１００ｐｍｏｌのセンスプライマ（５’−ＣＴＧＧＴＡＡＧＴＴＴＡＧＴＣＴＴＴＴＴＧＴＣ−３’（配列番号４））と１００ｐｍｏｌのアンチセンスプライマ（５’−ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴ−３’（配列番号５））を用いた。全てのＰＣＲ条件は９４℃変性を３０秒；５５℃アニーリングを６０秒；７２℃における伸張を９０秒とするものを１周期として３５回繰り返し行い、予備変性及び最終伸張はそれぞれ９４℃において５分、７２℃において５分間行った。この時に合成された増幅物はＤＮＡ核酸抽出キット（ＱＡＩＧＥＮ）を用いて精製し、ガラス基板上に固定するプローブとして用いた。
【００４０】
Ｂ．増幅されたＧＡＰＤＨ遺伝子のスポッティング：ｃＤＮＡチップの製造
２本のチューブのそれぞれにおいて前記増幅された遺伝子の最終濃度が０．２５ｍｇ／ｍｌになるように５０％のＤＭＳＯに混合し、１本のチューブにはＦＩＴＣ蛍光物質を混ぜて最終濃度を８μＭにした。それぞれのチューブについて、前記増幅された遺伝子とＤＭＳＯ、及びＦＩＴＣ蛍光物質をボルテックスミキサー（Voltex mixer）により均一に混合した。次に、よく混ぜられた試薬を３８４ウェルプレートに移し、スポッティング溶液を用意した。前記スポッティング溶液をアミノ基を有するように表面処理したガラス表面上に２０×４の配列にてスポッティングした後、８０℃において４時間加熱した。次に、バックグラウンドノイズの制御に必要な工程、すなわち標的核酸がガラス表面に固定しないようにするためにスポッティングしていない位置のガラス表面のアミノ基が負電荷を帯びるように下記工程を経た。５ｇの無水コハク酸を３１５ｍｌの１−メチル−２−ピロリジノンに溶解した後、３５ｍｌのホウ酸ナトリウムを付加及び撹拌して得られた溶液により、ガラスを処理した後に蒸留水を用いて洗浄し、乾燥器に保管した。
【００４１】
前記実験において用いられた蛍光物質であるＦＩＴＣの構造式は、下記の通りである：
【００４２】
【化２】
【００４３】
Ｃ．重合酵素連鎖反応による蛍光標識標的物質の製造
蛍光標識標的物質を製造するために、前記ＤＮＡ核酸抽出キットを用いて分離したグリセルアルデヒド−３−ホスファートジハイドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）生産組換え遺伝子を用い、多量のグリセルアルデヒド−３−ホスファートジハイドロゲナーゼ遺伝子のみを増幅するために全ての重合酵素連鎖反応は下記のように５０μｌにて行った。
【００４４】
純粋な組換えＧＡＰＤＨ ＤＮＡ ５０ｎｇ、熱安定性ＤＮＡポリマラーゼ；２．５Ｕ、２００μＭ ｄＮＴＰ：ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、６５μＭ ｄＴＴＰ、１３０μＭ Ｃｙ３−ｄＵＴＰ、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ ８．３の４０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１００ｐｍｏｌのセンスプライマー（５’−ＣＴＧＧＴＡＡＧＴＴＴＡＧＴＣＴＴＴＴＴＧＴＣ−３’（配列番号６））と１００ｐｍｏｌのアンチセンスプライマー（５’−ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴ−３’（配列番号７））を用いた。全てのＰＣＲは前記条件下で行った。この時、合成された増幅物はゲルエキストラクション抽出キット（ＱＡＩＧＥＮ）を用いて純粋に分離した。精製したＧＡＰＤＨ ＤＮＡは分光光度計を用いて濃度を測定し、ハイブリッド実験が効率よく行えるように濃度を５０ｎｇ／μｌに一定に調節した。蛍光標識の標的ＤＮＡはＧＡＰＤＨ遺伝子を前記ＰＣＲ反応中にＣｙ３−ｄＵＴＰを付加してＣｙ３−ラベリングしたものであって、６００ｂｐより構成されている。
【００４５】
Ｄ．ｃＤＮＡチップと蛍光標識標的物質とのハイブリッド
ハイブリッド反応のために前記製造されたｃＤＮＡチップを４×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、１０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ溶液を用いて５０℃において４５分間あらかじめハイブリッドし、イソプロパノール及び純水を用いて洗浄した。次に、前記ＤＮＡチップを遠心分離器に入れ、５００ｒｐｍにおいて３分間遠心分離して水気を除去した。
【００４６】
次に、前記製造された蛍光標識標的ＤＮＡ１μｇを９５℃において５分間変性した後、３分間氷中に放置し、３×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、０．５ｍｇ／ｍｌイーストｔＲＮＡ、３０μｇ／ｍｌのニシンの精液ＤＮＡ）と混合して前記チップに落とした。次に、カバーガラスを覆って溶液をよく拡散させた後、５０℃において一晩中ハイブリッドした。スライドは０．１×ＳＳＣ（１．５ｍＭクエン酸ナトリウム、１５ｍＭ ＮａＣｌ， ｐＨ ７．０）、０．１％ ＳＤＳ溶液にて５分間１回、０．１×ＳＳＣにて５分間２５℃において２回洗浄した。前記過程が終了すれば、前記の方法と同様に遠心分離器を用いて水気を除去した。
【００４７】
Ｅ．Ｃｙ３の蛍光によるハイブリッドの敏感度の測定
前記実施例１における方法と同様にしてハイブリッド感度を測定した。 前記方法により行ったｃＤＮＡチップのスポットの標的核酸とハイブリッドする前のＤＮＡチップの製造後のスキャニング結果（品質管理過程、ＱＣテスト）及び標的核酸によるハイブリッド後のスキャニング結果（Ｕｓｅテスト）を図３に示す。
【００４８】
図３において、ＱＣテストのスキャニングはアルゴン−イオンレーザーにより４８８ｎｍ波長において励起し、５２０ｎｍ波長のフィルターを用いて放出信号を得たものであり、Ｕｓｅテストのスキャニングは５５０ｎｍ波長において励起させ、５７０ｎｍ波長のフィルターを用いて放出信号を得たものである。
【００４９】
図３に示されたＤＮＡスポットは８０スポットずつスポッティングしたものであり、スポット径は１７０±１５μｍとし、スポット間の間隔は３７５μｍに調節した。
【００５０】
Ｆ．実験の結果
前記図３の実験の結果をまとめて下記表２に、蛍光物質としてＦＩＴＣを用いた場合と蛍光物質を用いていない場合とに対する蛍光強度を示す。
【００５１】
表２に見られるように、ＵｓｅテストにおいてＦＩＴＣと共に固定化したスポットの強度は蛍光物質のないスポットの強度と大差なかった。これは、ＦＩＴＣ蛍光物質が標的核酸によるハイブリッドに影響を及ぼさないということを示す。
【００５２】
【表２】
【００５３】
【発明の効果】
上述したように、本発明のＤＮＡマイクアレイの品質管理方法によれば、ＤＮＡチップのＤＮＡスポットにおいてＤＮＡプローブ と共にＤＮＡチップの固体基板に共有結合により固定させた蛍光物質からの信号を感知することによりＤＮＡチップの品質管理をするので、既存の染色方法による品質管理方法に比べて染色及び脱色の操作を経る必要がない。
【００５４】
また、ＤＮＡプローブと共にＤＮＡチップの固体基板に共有結合させた蛍光物質が以降にＤＮＡチップの蛍光標識標的物質とのハイブリッド後に測定する蛍光の強度に影響をほとんど及ぼさないので、蛍光物質がハイブリッドに影響を及ぼし得る既存の方法の問題点が解決された。
【００５５】
従って、上記方法により製造したＤＮＡチップはいかなる染色段階が無くても正確に品質管理を行うことができ、そのようにして製造されたＤＮＡチップは以降のハイブリッドなどの使用に関して安定した結果を出すことができる。
【００５６】
また、既存の品質管理方法とは異なって、蛍光物質がＤＮＡプローブと共にガラス表面の反応基と共有結合をするので、ＤＮＡプローブのシーケンス及び長さに関係なく同じ大きさの蛍光シグナルが発せられる。これにより、正確なＤＮＡスポットの相対的な比較分析が可能である。
【００５７】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 蛍光グループＦと官能基Ｒとを含む蛍光物質を示すものである。
【図２】 実施例１において、オリゴヌクレオチドプローブを固定したＤＮＡチップが標的核酸とハイブリッドする前のスキャニング結果（品質管理過程、ＱＣテスト）、及び標的核酸によるハイブリッド後のスキャニング結果（Ｕｓｅテスト）を示すものである。
【図３】 実施例２において、ｃＤＮＡを固定したＤＮＡチップが標的核酸とハイブリッドする前のスキャニング結果（品質管理過程、ＱＣテスト）及び標的核酸によるハイブリッド後のスキャニング結果（Ｕｓｅテスト）を示すものである。
【発明の属する技術分野】
本発明はＤＮＡチップに係り、より具体的には、ＤＮＡチップの品質管理方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡチップとは、通常、シリコン、表面改質ガラス、ポリプロピレン、活性化ポリアクリルアミドなどからなる固体表面上の数百ないし数十万個の定まった位置に、ヌクレオチドの数個ないし数百個の既知の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを固定させて微細集積化させたものである。このようなＤＮＡチップに分析しようとする標的ＤＮＡを接触させれば、ＤＮＡチップに固定されているプローブと標的ＤＮＡ断片上の塩基配列との相補の度合いによってそれぞれ相異なるハイブリッド結合状態をなし、このハイブリッド結合状態を光学的な方法または放射能化学的な方法などを通じて検出、解析することにより、標的ＤＮＡの塩基配列を分析することができる。
【０００３】
ＤＮＡチップは、ＤＮＡ分析システムを小型化し、極少量の試料でも遺伝子の分析を可能にした。さらに、標的ＤＮＡ上の幾つかの塩基配列を同時に検出できることにより、低コストで迅速に遺伝情報を提供することができる。また、ＤＮＡチップは、膨大な量の遺伝情報を短時間内に分析できるだけではなく、遺伝子間の相互関連性まで分析できる。ゆえに、ＤＮＡチップは遺伝病及び癌の診断、突然変異ならびに病原体の検出、遺伝子発現分析および新薬の開発などの幅広い分野において応用可能であると期待されている。また、ＤＮＡチップを微生物や環境汚染の感知器として用い解毒物質に対する遺伝子を捜し出して、遺伝子組み換え技術を適用することにより、解毒物質を大量生産したり、医薬用の農作物、低脂肪含有の肉類の生産にも応用できる。ＤＮＡチップは、ほとんどの生物関連産業に用いられ、革命的な発展をもたらすことができる。
【０００４】
ＤＮＡチップは、用いられたプローブの種類によってオリゴチップとｃＤＮＡチップとに大別できる。また、製造方法によってフォトリソグラフィチップとピン方式のスポッティングチップ、インクジェット方式のスポッティングチップに分類される。ＤＮＡチップの製造方法は、固定化されるプローブの種類によって様々で且つ複雑な化学的過程を経る。ガラス表面の狭い面積に極少量のＤＮＡプローブが固定されるため、固定されたプローブ間の定量的な変動とチップ間の変動とにより相当の誤差が発生し、ハイブリッドを通じて得られる結果に一貫性がないという致命的な短所が指摘されてきた。
【０００５】
このような問題点を解決するために、ハイブリッド結合に入る前にＤＮＡチップの品質を管理する方法が開発され、用いられている。スタンフォード大学のブラウンらは、ガラスの表面にスポッティングされるＤＮＡプローブと共存する塩により、光線が散乱されることをレーザースキャナにより検出し、ＤＮＡプローブスポッティングの均一性及びガラス表面の損傷の有無を検査する方法を開発した。この方法は、スポッティング直後にのみ簡単にＤＮＡスポットを検査する方法として用いられるのに対し、次の作業である固定化及び洗浄後にはＤＮＡスポットに存在する塩が除去されるため、ＤＮＡチップの製造が終わった後のＤＮＡスポットの品質を検査できないという問題点がある。
【０００６】
最近では、ＤＮＡプローブに結合し得る蛍光物質を用いてガラス表面上のＤＮＡスポットを染色する方法が開発された（非特許文献１）。これは、単一ストランドのＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に高い親和性をもって結合する蛍光物質であるSYBR Green IIでＤＮＡチップを処理してガラス表面上に固定されたＤＮＡプローブを、レーザースキャナによって感知する方法である。ＤＮＡプローブに結合された蛍光物質は洗浄によって完全に除去されると報告している。この方法は、ブラウンらにより開発された前記方法に比べて、ＤＮＡチップの製造が終わった後にＤＮＡチップを検査できるという長所はあるが、検査のために染色及び脱色の操作をしなければならず、ＤＮＡチップを数回に亘って洗浄する作業が必要である。また、洗浄後にガラスの表面に残留しうる蛍光物質がハイブリッドに影響を及ぼす可能性がある。
【０００７】
【非特許文献１】
Battaglia C, Salani G, Consolandi C, Rossi Bernardi L, De Bellis G. 「Analysis of DNA Microarrays by Non-Destructive Fluorescent Staining Using SYBR Green II, Biotechniques」, 2000 Jul; 29, P.78-81
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の主な目的は、染色及び脱色の過程を経ることなく、ＤＮＡスポットの品質及び大きさを、非破壊的な方法により検査することのできるＤＮＡチップの品質管理方法を提供するところにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明は、ＤＮＡチップ基板にスポットするＤＮＡスポッティング溶液を調製する際に蛍光物質を添加し、スポッティングすることにより、ＤＮＡチップのスポットから発っせられる蛍光シグナルを検出することを含むＤＮＡチップの品質管理方法を提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明のＤＮＡチップの品質管理方法は、特定の波長において励起／放出される第１の蛍光物質を含有するＤＮＡスポッティング溶液を調製する段階と、前記ＤＮＡスポッティング溶液を基板にスポッティングしてＤＮＡチップを製造する段階と、前記ＤＮＡスポットから発せられる蛍光シグナルを検出する段階と、を含むＤＮＡチップの品質管理方法である。
【００１１】
本発明は、ピン方式のスポッティングチップに関するものであるが、ＤＮＡチップ基板にＤＮＡスポッティング溶液をスポッティングした後に蛍光物質を固定してチップの品質を管理する従来の方法とは異なって、ＤＮＡチップ基板にスポットするＤＮＡスポッティング溶液にＤＮＡプローブと共に第１の蛍光物質を含む点に特徴がある。具体的な調製方法としては、ゲルマトリックス、ＤＭＳＯなどの溶媒に、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）等により予め調製したＤＮＡプローブ、および第１の蛍光物質を添加するものである。また第１の蛍光物質は該溶液中に均一に分散、または溶解していることが好ましく、ボルテックスミキサーなどにより均一に撹拌して調製する。
【００１２】
次に、ＤＮＡスポッティング溶液を基板にスポッティングしてＤＮＡチップを製造する段階では、ＤＮＡプローブをＤＮＡチップ基板に固定する際、第１の蛍光物質も基板の表面に共有結合により固定することで、ＤＮＡチップを製造する。
【００１３】
さらに、前記ＤＮＡスポットから発せられる蛍光シグナルを検出する段階において、スポットから発せられる蛍光シグナルを検出することにより、ＤＮＡスポットの均一度を非破壊的に測定することができる。
【００１４】
ＤＮＡスポットの均一度とは、上記のように検出した蛍光シグナルから、ＤＮＡスポットのスポット径及び形状、ならびに蛍光シグナルの蛍光強度等を測定した後、各スポット間のスポット径及び形状、ならびに蛍光シグナルの蛍光の強度等を比較することにより判断するものである。前記ＤＮＡスポットの均一度は、シグナルの蛍光強度の標準偏差が小さく、さらにスポット径及び形状が一定であるものが好ましい。これは、スポット径および形状が一定でないとシグナル強度にバラツキが生じ、信頼性の低いデータとなるためである。
【００１５】
上述のように、前記ＤＮＡスポットの均一度の差が任意の許容可能なレベル内であるか管理することにより、ＤＮＡチップの品質管理を行う。
【００１６】
本発明において用いられる第１の蛍光物質は、図１に示すような、蛍光シグナルを発する蛍光グループＦと、固体基板と単独または他のものを介して共有結合し得る官能基Ｒとを含む。
【００１７】
蛍光グループＦとしては、フルオレセイン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、テキサスレッド、ＴＡＭＲＡ、およびこれらの１価以上の基が挙げられる。また官能基Ｒとしては、アミノ、活性化エステル、イソチオシアナート、またはアルデヒドなどが挙げられる。
【００１８】
蛍光グループＦと官能基Ｒとは、直接結合してもよいが、エチレン、メチレン等の二価の基とを介して結合してもよい。また図１において、ＦとＲの結合を波線で示す。
【００１９】
前記ＤＮＡスポッティング溶液中の第１の蛍光物質の濃度は、１〜１０μＭであり、これは前記ＤＮＡスポッティング溶液に含有するＤＮＡプローブの濃度によって変化しうる。
【００２０】
蛍光シグナルを発する第１の蛍光物質に含まれる蛍光グループＦとしては、ＤＮＡチップの製造後、標的ＤＮＡのラベリングに用いられる第２の蛍光物質に含まれる蛍光グループの励起／放出波長における相互干渉がないものであって、好ましくは、フルオレセイン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、テキサスレッド、またはＴＡＭＲＡなどの蛍光グループが用いられる。
【００２１】
本発明において、ＤＮＡプローブの固定は、第１の蛍光物質の基板への固定と共に行い、ＤＮＡプローブおよび第１の蛍光物質は共に固体基板と共有結合をする官能基を有し、該官能基はＤＮＡチップの類型によってアミン、アルデヒド、ポリ−ライシンなど固体基板の表面の官能基と共有結合をし得るものでなければならず、上記のようにアミン、イソチオシアナート、活性化エステルなどの官能基が用いられる。
【００２２】
なお、本発明はＤＮＡスポッティング溶液に上記第１の蛍光物質を含む点に特徴があり、該溶液に使用するＤＮＡプローブや溶媒の種類、ＤＮＡプローブの溶液中の濃度等は上述の通りである。
【００２３】
前記方法により製造されたＤＮＡチップの品質管理方法において、蛍光シグナルの検出方法は蛍光物質の種類によって適宜選択でき、当該分野に公知の方法を広く採用でき、特に制限されるものではない。例えば、蛍光グループとしてフルオレセイン、または蛍光物質としてＦＩＴＣを用いた場合、アルゴンイオンレーザーにより４８８ｎｍ波長において励起し、５２０ｎｍ波長のフィルターを用いて蛍光シグナルを検出することができる。
【００２４】
本発明の方法によるＤＮＡチップの品質管理方法は、ＤＮＡチップだけではなく、ＲＮＡチップ及び蛋白質チップなど、他の類型にも適用可能である。
【００２５】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであるため、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されると解釈されてはならない。
【００２６】
【実施例】
下記実施例において、ＤＮＡチップの製造時にＤＮＡプローブと共に固定した蛍光物質が、ＤＮＡチップ上で蛍光標識した標的ＤＮＡとハイブリッドした後に生成される蛍光の強度に影響を及ぼすか否かを調べた。
【００２７】
オリゴヌクレオチドプローブを固定させたＤＮＡチップとｃＤＮＡを固定したＤＮＡチップの二つのタイプのＤＮＡチップを用いた。
【００２８】
実施例１：オリゴヌクレオチドプローブを固定したＤＮＡチップの品質管理
Ａ．ゲルマトリックスを用いたＤＮＡオリゴヌクレオチドチップの製造
２種類のオリゴヌクレオチドプローブ（ＰＭ（perfect match）：５’−ＴＧＴＡＧＡＣＡＣＧＣＡＣＣＴＣＣＧＴＧ−３’（配列番号１）、ＭＭ（mismatch）：５’−ＴＧＴＡＧＡＣＡＣＣＣＡＣＣＴＣＣＧＴＧ−３’（配列番号２））及び蛍光物質である４’−（アミノメチル）フルオレセイン（０μＭ、１μＭ、２μＭ）をゲルマトリックス溶液に添加して撹拌し、３７℃において１４時間放置することによりマトリックス−ＤＮＡ共役を製造した後、これをスポッティング溶液として用いた。前記スポッティング溶液を、アミノ基を有するように表面処理したガラス表面上にスポッティングした後、３７℃の湿式チャンバに４時間放置した。次に、バックグラウンドノイズの制御に必要な工程、すなわち標的核酸をガラス表面に固定させないために、スポッティングされていない位置のガラス表面のアミノ基が負電荷を帯びるように下記工程を経た。５ｇの無水コハク酸を３１５ｍｌの１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）に溶かした後、３５ｍｌのホウ酸ナトリウムを添加及び撹拌して得られた溶液によりガラスを処理した後、蒸留水を用いて洗浄し、乾燥器に保管した。
【００２９】
前記実験において用いられた蛍光物質である４’−（アミノメチル）フルオレセインの構造式は、下記の通りである：
【００３０】
【化１】
ガラス表面のアミノ基と、ゲルマトリックスがリンカの役割を果たしてアミノメチルフルオレセインとにより結合する。
【００３２】
Ｂ．Ｃｙ３の蛍光によるハイブリッド敏感度の測定
前記ＤＮＡチップにハイブリッドした蛍光標識標的物質により放射された蛍光シグナルをスキャンアレイスキャナを用いて解像度１０μｍピクセルにて検出し（GSI Lunonics）、プローブアレイ細胞の強度、ヌクレオチド塩基−コール、配列の測定及びリポートをＧｅｎｅＰｉｘチップソフトウェア（アクソン）上において使用可能な機能により示した。
【００３３】
前記方法により行われたゲルマトリックスを用いたＤＮＡチップの標的核酸とハイブリッドする前のＤＮＡチップ製造後のスキャニング結果（品質管理過程、ＱＣテスト）、及び標的核酸とのハイブリッド後のスキャニング結果（Ｕｓｅテスト）を図２に示す。
【００３４】
図２において、ＤＮＡチップのＱＣテストのスキャニングはアルゴン−イオンレーザーによって４８８ｎｍ波長において励起させ、５２０ｎｍ波長のフィルターを用いて放出信号を得たものであり、Ｕｓｅテストのスキャニングは５５０ｎｍ波長において励起させ、５７０ｎｍ波長のフィルターを用いて放出信号を得たものである。Ｕｓｅテストにおいて用いられた標的核酸はＨＮＦ−１α遺伝子エクソン４区間のコドン２６３に該当するヌクレオチドＣ（シトシン）ベースが中央に位置し、５’末端にＣｙ３が固定した２０ヌクレオチドシーケンスである（５’−Ｃｙ３−ＣＡＣＧＧＡＧＧＴＧＣＧＴＧＴＣＴＡＣＡ−３’（配列番号３））。
【００３５】
図２に示したように、完全マッチに該当するプローブとミスマッチに該当するプローブとをそれぞれ９スポットずつスポッティングし、スポット径は１７０±１５μｍであり、スポット間の間隔は３７５μｍに調節した。
【００３６】
Ｃ．結果
表１から見られるように、Ｕｓｅテストにおいて４’−（アミノメチル）フルオレセインと共に固定化したスポットの蛍光強度は蛍光物質のないスポットの蛍光強度と大差なかった。これは、４’−（アミノメチル）フルオレセインの蛍光物質が標的核酸とのハイブリッドに影響を及ぼさないということを示す。
【００３７】
【表１】
実施例２：ｃＤＮＡを固定させたＤＮＡチップの品質管理
Ａ．重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）によるプローブとして用いる遺伝子増幅
グリセルアルデヒド−３−ホスファートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を生産する組換え遺伝子をＤＮＡ核酸抽出キット（ＱＡＩＧＥＮ）を用いて分離した。分離した組換え遺伝子を用いて多量のＧＡＰＤＨ遺伝子のみを増幅するために、全ての重合酵素連鎖反応は最終体積が１００μｌになるようにして行った。
【００３９】
純粋な組換えＧＡＰＤＨ ＤＮＡ ５０ｎｇ、熱安定性ＤＮＡポリマラーゼ；２．５Ｕ、２００μＭ ｄＮＴＰ：（ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ）、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、４０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１００ｐｍｏｌのセンスプライマ（５’−ＣＴＧＧＴＡＡＧＴＴＴＡＧＴＣＴＴＴＴＴＧＴＣ−３’（配列番号４））と１００ｐｍｏｌのアンチセンスプライマ（５’−ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴ−３’（配列番号５））を用いた。全てのＰＣＲ条件は９４℃変性を３０秒；５５℃アニーリングを６０秒；７２℃における伸張を９０秒とするものを１周期として３５回繰り返し行い、予備変性及び最終伸張はそれぞれ９４℃において５分、７２℃において５分間行った。この時に合成された増幅物はＤＮＡ核酸抽出キット（ＱＡＩＧＥＮ）を用いて精製し、ガラス基板上に固定するプローブとして用いた。
【００４０】
Ｂ．増幅されたＧＡＰＤＨ遺伝子のスポッティング：ｃＤＮＡチップの製造
２本のチューブのそれぞれにおいて前記増幅された遺伝子の最終濃度が０．２５ｍｇ／ｍｌになるように５０％のＤＭＳＯに混合し、１本のチューブにはＦＩＴＣ蛍光物質を混ぜて最終濃度を８μＭにした。それぞれのチューブについて、前記増幅された遺伝子とＤＭＳＯ、及びＦＩＴＣ蛍光物質をボルテックスミキサー（Voltex mixer）により均一に混合した。次に、よく混ぜられた試薬を３８４ウェルプレートに移し、スポッティング溶液を用意した。前記スポッティング溶液をアミノ基を有するように表面処理したガラス表面上に２０×４の配列にてスポッティングした後、８０℃において４時間加熱した。次に、バックグラウンドノイズの制御に必要な工程、すなわち標的核酸がガラス表面に固定しないようにするためにスポッティングしていない位置のガラス表面のアミノ基が負電荷を帯びるように下記工程を経た。５ｇの無水コハク酸を３１５ｍｌの１−メチル−２−ピロリジノンに溶解した後、３５ｍｌのホウ酸ナトリウムを付加及び撹拌して得られた溶液により、ガラスを処理した後に蒸留水を用いて洗浄し、乾燥器に保管した。
【００４１】
前記実験において用いられた蛍光物質であるＦＩＴＣの構造式は、下記の通りである：
【００４２】
【化２】
Ｃ．重合酵素連鎖反応による蛍光標識標的物質の製造
蛍光標識標的物質を製造するために、前記ＤＮＡ核酸抽出キットを用いて分離したグリセルアルデヒド−３−ホスファートジハイドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）生産組換え遺伝子を用い、多量のグリセルアルデヒド−３−ホスファートジハイドロゲナーゼ遺伝子のみを増幅するために全ての重合酵素連鎖反応は下記のように５０μｌにて行った。
【００４４】
純粋な組換えＧＡＰＤＨ ＤＮＡ ５０ｎｇ、熱安定性ＤＮＡポリマラーゼ；２．５Ｕ、２００μＭ ｄＮＴＰ：ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、６５μＭ ｄＴＴＰ、１３０μＭ Ｃｙ３−ｄＵＴＰ、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ ８．３の４０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１００ｐｍｏｌのセンスプライマー（５’−ＣＴＧＧＴＡＡＧＴＴＴＡＧＴＣＴＴＴＴＴＧＴＣ−３’（配列番号６））と１００ｐｍｏｌのアンチセンスプライマー（５’−ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴ−３’（配列番号７））を用いた。全てのＰＣＲは前記条件下で行った。この時、合成された増幅物はゲルエキストラクション抽出キット（ＱＡＩＧＥＮ）を用いて純粋に分離した。精製したＧＡＰＤＨ ＤＮＡは分光光度計を用いて濃度を測定し、ハイブリッド実験が効率よく行えるように濃度を５０ｎｇ／μｌに一定に調節した。蛍光標識の標的ＤＮＡはＧＡＰＤＨ遺伝子を前記ＰＣＲ反応中にＣｙ３−ｄＵＴＰを付加してＣｙ３−ラベリングしたものであって、６００ｂｐより構成されている。
【００４５】
Ｄ．ｃＤＮＡチップと蛍光標識標的物質とのハイブリッド
ハイブリッド反応のために前記製造されたｃＤＮＡチップを４×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、１０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ溶液を用いて５０℃において４５分間あらかじめハイブリッドし、イソプロパノール及び純水を用いて洗浄した。次に、前記ＤＮＡチップを遠心分離器に入れ、５００ｒｐｍにおいて３分間遠心分離して水気を除去した。
【００４６】
次に、前記製造された蛍光標識標的ＤＮＡ１μｇを９５℃において５分間変性した後、３分間氷中に放置し、３×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、０．５ｍｇ／ｍｌイーストｔＲＮＡ、３０μｇ／ｍｌのニシンの精液ＤＮＡ）と混合して前記チップに落とした。次に、カバーガラスを覆って溶液をよく拡散させた後、５０℃において一晩中ハイブリッドした。スライドは０．１×ＳＳＣ（１．５ｍＭクエン酸ナトリウム、１５ｍＭ ＮａＣｌ， ｐＨ ７．０）、０．１％ ＳＤＳ溶液にて５分間１回、０．１×ＳＳＣにて５分間２５℃において２回洗浄した。前記過程が終了すれば、前記の方法と同様に遠心分離器を用いて水気を除去した。
【００４７】
Ｅ．Ｃｙ３の蛍光によるハイブリッドの敏感度の測定
前記実施例１における方法と同様にしてハイブリッド感度を測定した。 前記方法により行ったｃＤＮＡチップのスポットの標的核酸とハイブリッドする前のＤＮＡチップの製造後のスキャニング結果（品質管理過程、ＱＣテスト）及び標的核酸によるハイブリッド後のスキャニング結果（Ｕｓｅテスト）を図３に示す。
【００４８】
図３において、ＱＣテストのスキャニングはアルゴン−イオンレーザーにより４８８ｎｍ波長において励起し、５２０ｎｍ波長のフィルターを用いて放出信号を得たものであり、Ｕｓｅテストのスキャニングは５５０ｎｍ波長において励起させ、５７０ｎｍ波長のフィルターを用いて放出信号を得たものである。
【００４９】
図３に示されたＤＮＡスポットは８０スポットずつスポッティングしたものであり、スポット径は１７０±１５μｍとし、スポット間の間隔は３７５μｍに調節した。
【００５０】
Ｆ．実験の結果
前記図３の実験の結果をまとめて下記表２に、蛍光物質としてＦＩＴＣを用いた場合と蛍光物質を用いていない場合とに対する蛍光強度を示す。
【００５１】
表２に見られるように、ＵｓｅテストにおいてＦＩＴＣと共に固定化したスポットの強度は蛍光物質のないスポットの強度と大差なかった。これは、ＦＩＴＣ蛍光物質が標的核酸によるハイブリッドに影響を及ぼさないということを示す。
【００５２】
【表２】
【発明の効果】
上述したように、本発明のＤＮＡマイクアレイの品質管理方法によれば、ＤＮＡチップのＤＮＡスポットにおいてＤＮＡプローブ と共にＤＮＡチップの固体基板に共有結合により固定させた蛍光物質からの信号を感知することによりＤＮＡチップの品質管理をするので、既存の染色方法による品質管理方法に比べて染色及び脱色の操作を経る必要がない。
【００５４】
また、ＤＮＡプローブと共にＤＮＡチップの固体基板に共有結合させた蛍光物質が以降にＤＮＡチップの蛍光標識標的物質とのハイブリッド後に測定する蛍光の強度に影響をほとんど及ぼさないので、蛍光物質がハイブリッドに影響を及ぼし得る既存の方法の問題点が解決された。
【００５５】
従って、上記方法により製造したＤＮＡチップはいかなる染色段階が無くても正確に品質管理を行うことができ、そのようにして製造されたＤＮＡチップは以降のハイブリッドなどの使用に関して安定した結果を出すことができる。
【００５６】
また、既存の品質管理方法とは異なって、蛍光物質がＤＮＡプローブと共にガラス表面の反応基と共有結合をするので、ＤＮＡプローブのシーケンス及び長さに関係なく同じ大きさの蛍光シグナルが発せられる。これにより、正確なＤＮＡスポットの相対的な比較分析が可能である。
【００５７】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 蛍光グループＦと官能基Ｒとを含む蛍光物質を示すものである。
【図２】 実施例１において、オリゴヌクレオチドプローブを固定したＤＮＡチップが標的核酸とハイブリッドする前のスキャニング結果（品質管理過程、ＱＣテスト）、及び標的核酸によるハイブリッド後のスキャニング結果（Ｕｓｅテスト）を示すものである。
【図３】 実施例２において、ｃＤＮＡを固定したＤＮＡチップが標的核酸とハイブリッドする前のスキャニング結果（品質管理過程、ＱＣテスト）及び標的核酸によるハイブリッド後のスキャニング結果（Ｕｓｅテスト）を示すものである。
Claims (6)
- 特定の波長において励起／放出される蛍光グループおよび固体基板と共有結合しうる官能基を有する第１の蛍光物質、ならびにＤＮＡプローブを含有し、前記第１の蛍光物質および前記ＤＮＡプローブは互いに共有結合しない、ＤＮＡスポッティング溶液を調製する段階と、
前記ＤＮＡスポッティング溶液を前記固体基板にスポッティングして、前記第１の蛍光物質が前記固体基板上に共有結合されたＤＮＡスポットが形成されたＤＮＡチップを製造する段階と、
前記ＤＮＡスポットから発せられる蛍光シグナルを検出する段階と、
を含むＤＮＡチップの品質管理方法。 - 前記第１の蛍光物質は、ハイブリッド後に検出に用いられる第２の蛍光物質の励起／放出波長とは相互干渉がないことを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡチップの品質管理方法。
- 前記蛍光シグナルの均一度を測定する段階をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡチップの品質管理方法。
- 前記蛍光シグナルの均一度は、ＤＮＡスポットのスポット径及び形状、ならびに蛍光シグナルの蛍光の強度によって測定されることを特徴とする請求項３に記載のＤＮＡチップの品質管理方法。
- 前記蛍光グループは、ＦＩＴＣ、フルオレセイン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、テキサスレッド、またはＴＡＭＲＡであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＡチップの品質管理方法。
- 前記官能基は、アミノ、活性エステル、イソチオシアネート、またはアルデヒドであることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のＤＮＡチップの品質管理方法。
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