KR100794698B1 - 생화학 물질 미세 배열 칩의 품질 검사 방법 - Google Patents

생화학 물질 미세 배열 칩의 품질 검사 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생화학 물질을 미세 배열시킨 칩의 품질 검사 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 DNA, RNA, 단백질과 같은 생화학 물질과의 반응성이 없으면서 빛 또는 열을 발생시키는 화합물과 생화학적 탐침자를 혼합하여 미세 배열 칩을 제작하고, 그 칩의 각 점적들의 발광도 또는 발열도와 배열 양상을 측정하여 미세 배열된 점적들의 배열의 균일성 및 정확성을 미리 제어함으로써, 생화학 물질 미세 배열 칩을 이용한 각종 검사의 정확도를 제고하기 위한 생화학 물질 미세 배열 칩의 품질 검사 방법에 대한 것이다.
DNA 칩

Description

생화학 물질 미세 배열 칩의 품질 검사 방법{Quality control method for biological chip}
도 1은 미세 배열의 품질을 제어하여 최종 단계에서 결과를 표준화시키는 과정에 대한 흐름도이다.
도 2는 올리고뉴클레오티드를 일정배율로 희석된 로다민과 혼합하여 미세배열한 것이다.
도 3은 로다민과 30개 올리고뉴클레오티드(30mer)를 동량 혼합하여 칩 상에 미세배열한 것이다.
도 4는 로다민을 이용한 칩의 제어과정이 혼성화 실험에 미치는 영향을 보여주기 위한 실시예이다.
도 5는 올리고뉴클레오티드와 로다민을 혼합하여 2배씩 2차례 희석한 후 미세 배열한 것이다.
도 6은 미세배열 후와 혼성화 후의 형광값에 대한 회귀식을 추정한 결과이다.
본 발명은 생화학 물질을 미세 배열시킨 칩의 품질 검사 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 DNA, RNA, 단백질과 같은 생화학 물질과의 반응성이 없으면서 빛 또는 열을 발생시키는 화합물과 생화학적 탐침자를 혼합하여 미세 배열 칩을 제작하고, 그 칩의 각 점적들의 발광도 또는 발열도와 배열 양상을 측정하여 미세 배열된 점적들의 배열의 균일성 및 정확성을 미리 제어함으로써, 생화학 물질 미세 배열 칩을 이용한 각종 검사의 정확도를 제고하기 위한 생화학 물질 미세 배열 칩의 품질 검사 방법에 대한 것이다.
생화학 물질 미세 배열 칩이란, 다수의 DNA, RNA, 또는 단백질 조각을 작은 기판상에 고밀도로 고정시킨 유전자 또는 단백질 검색용 장치를 말한다. 이러한 칩 기술은 DNA의 변이와 RNA의 발현 양상 및 단백질 기능에 대한 대량 분석 연구와 유전자의 기능을 파악하기 위한 연구에 사용되고 있다.
따라서, 생화학 물질 미세 배열 칩(이하, 바이오칩이라 약칭한다)은 고정시키는 생화학 물질의 크기에 따라 cDNA 칩과 올리고뉴클레오티드 칩 (oligonucleotide chip), 단백질 칩 등으로 나누어 질 수 있으며, 상기 cDNA 칩에는 최소한 500개의 염기쌍 이상의 길이를 갖는 유전자 (full-length open leading frame 또는 Expressed sequence tag, EST)가 붙여져 있고, 올리고뉴클레오티드 칩(oligonucleotide chip)에는 약 15내지 25개의 염기쌍들로 이루어진 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 고정되어 있다.
따라서, 생화학 물질 미세 배열 칩의 기판 상에서 고밀도로 미세 배열되는 탐침자(probe)들은 주로 플라스미드 데옥시리보핵산(plasmid DNA) 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 그리고 단백질의 형태이며, 이들은 주로 유전자의 발현 양상과 단백질의 활성 그리고 DNA의 변이를 탐지하는데 이용되고 있다.
현재 DNA칩을 이용하여 가장 보편적으로 행해지는 연구는 정상 세포와 비정상 세포간의 RNA의 발현 양상을 보는 것이다. 예를 들어 인간의 정상 세포와 암세포 간에 RNA 발현 양상 분석이 대표적인 경우이고, 전체 유전체에 대한 정보가 파악된 효모(Saccharomyces cerevisea)의 경우에는 6,000개 유전자 전체에 대한 발현 양상과 발현 체계 분석을 고밀도의 올리고뉴클레오티드 칩(oligonuclotide chip)을 이용하여 동시에 파악하고자 하는 연구가 행해지고 있다.
DNA 칩 상에 미세 배열되는 탐침자는 주로 상보 DNA (cDNA)를 포함하는 플라스미드 데옥시리보핵산(plasmid DNA)과 중합효소연쇄반응(PCR;polymerase chain reaction)산물 및 합성 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)의 형태이다. 탐침자를 기판 상에 배열시키는 방법은 기판위에 광학적 식각(photolithography ; Affy metrix Inc.)방식에 의하거나, 잉크젯(Ink-Jet) 분사 방식을 이용한 비접촉 분사 (Piezoeletric printing ; Packard Instrument Inc., Syringe-solenoid printing ; Cartesian Technologies) 또는 접촉방식(Quill and Splite Pin ; Telechem International Inc., Pin and Ring ; Genetic Microsystem, Capillary pin ; Bioneer Corp.)등이 있다.
그러나, 어떠한 방식의 미세 배열 방법도 기판으로 사용되는 슬라이드 글라스(slide glass)의 종류에 의한 영향과 파장의 측정시에 생기는 전기적인 노이즈(noise)와 점적(spot)의 증발과 같은 문제로 인하여, 미세 배열된 점적들간 또는 이들을 포함하는 칩간의 배열된 탐침자 양이 균일하지 아니하며, 또한, 점적 배열들의 모양 (feature)이 일정하게 되도록 생산할 수 없다.
특히, 광식각법을 이용하여 기판위에서 직접 올리고(oligo)형태의 탐침자를 합성하는 경우에는 합성 반응 실패에 의하여 올리고(oligo)분자들이 하나의 적내에서도 균질(homogeneous)하지 않다는 치명적인 문제점을 보이고 있다.
또한, 미세 배열되는 탐침자의 양과 양상의 변이는, RNA 발현 양상의 차이를 보고자 하는 연구에 있어서 최종 결과를 해석하는데 오류를 초래할 수 있는 요인으로 작용하고, DNA의 변이를 탐지하기 위하여 사용되는 칩의 경우도 보다 정교한 결과의 해석을 위하여는 미세 배열되는 탐침자의 균일도가 전제되어야 한다.
또한, 서로 다른 칩상에 존재하는 동일한 탐침자들을 이용하여 DNA 변이나 RNA 발현양상을 반복적으로 측정하는 경우에는 그 균일도에 대한 제어가 매우 중요한 의미를 갖는다.
따라서, 칩 제작 단계에서 탐침자의 양과 균일도를 제어하는 공정이 반드시 추가 되어야하며, 미세 배열된 점적들간의 차이는 수치화 하여 최종 사용자에게 공급되어 결과를 보정할 수 있도록 하기위한 DNA 칩의 품질 검사 방법이 요청되고 있다.
따라서, 본 발명은 생화학 물질을 미세 배열시킨 칩의 품질 검사 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 DNA, RNA, 단백질과 같은 생화학 물질과의 반응성이 없으며 빛 또는 열을 발생시키는 화합물과 생화학적 탐침자를 혼합하여 미세 배열 칩을 제작하고, 그 칩의 각 점적들의 발광도 또는 발열도와 배열 양상을 측정하여 미세 배열된 점적들의 배열의 균일성 및 정확성을 미리 제어함으로써, 생화학 물질 미세 배열 칩을 이용한 각종 검사의 정확도를 제고하기 위한 생화학 물질 미세 배열 칩의 품질 검사 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 탐침자와, 상기 탐침자와 반응하지 아니하면서 빛 또는 열을 내는 화합물의 혼합물이 기판상에 미세 배열되어 있는 생화학 물질 미세 배열 칩을 제공하는 것이다.
상기의 본 발명의 목적은,
1) 탐침자와 반응성이 없으며 빛 또는 열을 발생시키는 화합물과 탐침자를혼합하는 단계;
2) 상기 혼합물을 기판에 미세 배열시키는 단계;
3) 상기 미세 배열된 혼합물의 점적들을 스캐닝하여 형광도를 측정하는 단계를 포함하는 방법을 제공함으로써 달성된다.
또한, 선택적으로는
4) 상기 형광이나 열의 측정을 통해 혼성화 이후의 형광이나 열을 산정하는 단계를 추가로 더 포함할 수 있으며,
생화학 물질 미세 배열 칩의 사용자는 상기 단계를 통해 얻어진 수치를 이용하여
5) 탐침자와 타겟을 혼성화 하여 형광이나 열을 측정하는 단계;
6) 혼성화 이후의 형광이나 열의 측정값을 사용하여 보정 계수를 구하고 점 적간 오차를 표준화시키는 단계를 추가로 더 수행하여 생화학 물질 미세 배열 칩을 이용한 검사에서 보다 정확한 결과를 도출할 수 있는 방법을 제공함으로써 본 발명의 또 다른 목적을 달성한다.
본 발명의 또 다른 목적은 탐침자와, 상기 탐침자와 반응성이 없으면서 빛 또는 열을 내는 화합물의 혼합물이 기판상에 미세 배열되어 있는 생화학 물질 미세 배열 칩을 제공하는 것이다.
본 발명에 사용되는 탐침자는 핵산(nucleic acid), 아미노산(amino acid)을 포함하는 펩타이드(peptied), 다당류(polysaccharide)및 인지질(phospholipid)등의 단량체가 선형 또는 원형으로 결합되어 있는 생체 고분자들 중에서 선택된다.
또한, 본 발명에 사용되는 상기 DNA와 반응하지 않으며 빛 또는 열을 내는 화합물로(이하, 표준 표지 물질)는 형광을 발하는 물질(fluorescent material)과 화학적 발광 물질(chemi-luminescent material)과 생물학적 발광물질(bio-luminescent material)과 열량 측정 가능물질(calorimetric material) 또는 빛 산란물질 (light-scattering mateial)에서 선택되는 것이 바람직하며, 특히 상기 중합체가 핵산의 연속적인 서열인 경우에는 플루오레세인(Fluorescein), 쿠마린(Coumarin), 4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레세인(JOE;4',5'-Dichloro-2',7'-dimethoxy fluorescein), 테트라메틸로다민(TAMRA;Tetramethyl rhodamine), X-로다민(ROX;X- rhodamine), 에오신(Eosin), 오레곤 그린(Oregon Green), 로다민 그린 (Rhodamine Green), 로다민 레드(Rhodamine Red), 텍사스 레드(Texas Red), 로다민등의 로다민 계열, 플루오레세인 계열의 유도체에서 선택하 여 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 사용된 하기의 구조식을 갖는 두가지 형태의 로다민(6-carboxyrhodamine 6 G ; 6-CR6G, 5-carboxyrhodamine 6 G ; 5-CR6G)은 520 nm에서 활성화되고 545 nm의 파장을 갖는 형광을 방출한다. 또한 이들은 DNA, RNA, 단백질들과는 반응하지 않고 미세 배열의 균일도 측정 후 쉽게 물 또는 기타 수용액으로 수세할 수 있으므로 미세 배열의 균일도를 측정하기 위하여 별도의 추가 장비가 필요없이 일반적으로 사용되는 칩 스캐너를 사용할 수 있다는 장점과, 간편한 수세와 DNA와의 비반응성으로 인하여 추후에 행해지는 혼성화등의 과정에 영향을 미치지 않는다는 장점을 가지고 있다.
<구조식>
Figure 112001015857180-pat00001
로다민 6 G를 이용하여 생산되는 칩의 균일도를 측정하여 미세배열의 품질을 제어하는 과정에 대한 흐름도는 도 1에 나타낸 바와 같다. 보다 상세하게는 일정양의 로다민과 탐침자를 혼합하여 미세 배열하고 칩 스캐너를 이용하여 그 균일도를 검사하고 형광도를 측정하여 수치화하여 표준화한 후 최종 사용자에게 칩(chip)과 함께 공급함으로써 DNA 칩 연구에 보다 정확한 결과의 해석을 유도하는 것이다.
이하 본 발명을 바람직한 실시예를 통하여 더욱 구체적으로 설명하지만 본 발명의 범위가 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시 예1>
미세 배열 균일도를 측정하기 위한 로다민 6 G의 적정 농도 결정
미세 배열된 점적간의 균일도와 표준화 자료의 생성을 위하여 사용되는 로다민은 다음과 같은 조건을 만족시켜야 한다. 우선, 로다민의 농도는 형광도가 너무 약하여 탐지되지 않거나 너무 강하여 포화(saturation)되지않도록 스캐너 (scanner)의 탐지 가능 범위내에 있어야 한다. 두 번째로, 사용된 로다민이 상기의 조건을 만족시키면서 쉽게 수세 되어야 하는 농도 조건이어야 한다. 세 번째로 수세 후 연결되어 행해지는 혼성화등의 과정에 전혀 영향을 미치지 않는 농도이어야 한다. 따라서 하기의 실시예는 3 가지의 조건을 만족하는 로다민 6 G의 최적 농도를 결정하기 위하여 수행되었다.
가. 로다민 6 G의 준비
10 mM의 로다민 6G를 메틸알콜에 녹인 후 10 ㎕를 취하여 990 ㎕의 나트륨보레이트 완충용액 (pH 9.0 ; SB 버퍼)에 희석하여 100 pmol/㎕의 농도가 되도록 하였다. 100 pmol/㎕의 용액을 SB 버퍼에 순차적으로 희석하여 11 종류의 농도로 제 작하였다. (도 2참조).
나. 로다민과 올리고뉴클레오티드 혼합액의 미세 배열
각각의 희석액은 동량의 10 pmol/㎕의 올리고뉴클레오티드와 혼합하였다. 각각의 혼합액을 14번씩 반복하여 아크릴아마이드 겔 패드에 HT-ArrayerTM ((주)바이오니아사 제품, 대한민국)을 이용하였으며 미세 배열하였다. 겔 패드는 0.1 % 글리시딜 메타크릴레이트(glycidyl metacrylate), 8 % 아크릴아마이드(acrylamide), 1/20 과황산염 암모늄(ammonium persulfate)과 1/100 N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민 (N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine;TEMED)으로 조성된 용액 30 ㎕를 수세된 슬라이드 그라스위에 도말하여 제작하였다.
다. 스캐닝과 수세
미세 배열된 점적들은 칩 스캐너(GenePix4000, Axon Instrument Inc, USA)를 이용하여 532 nm에서 로다민을 활성화시켜 PMT 600(Photomultipler 600)에서 스캐닝하여 그 형광도에 대한 영상 자료를 얻은 후 물로 5 분간 상온에서 수세하였다. 수세한 칩은 동일한 파장과 PMT에서 재스캐닝하여 그 결과를 도2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 것과 같이 10 pmol/ul의 올리고뉴클레오티드(oligo nucleotide)를 일정배율로 희석된 로다민 6G와 혼합하여 미세배열한 것으로서, 30 개의 단량체로 구성된 올리고(30mer oligo)와 혼합하는 로다민의 양을 늘리면서, a는 532nm 에서 로다민 6G를 활성화 시키고, b는 미세배열을 상온에서 5분간 물로 수세하는등 상이한 조건으로 스캐닝(scanning)한 결과이다. Lane 1은 1 fmol/㎕l, 2는 5 fmol/㎕, 3은 10 fmol/㎕, 4는 50 fmol/㎕, 5는 100 fmol/㎕, 6은 500 fmol/㎕, 7은 1 pmol/㎕, 8은 5 pmol/㎕, 9는 10 pmol/㎕, 10은 50 pmol/㎕ 그리고 11 dms 100 pmol/㎕의 로다민을 동량의 10 pmol/㎕의 30 개의 단량체로 구성된 올리고(30 mer oligo)와 혼합하여 14번 반복하여 미세 배열하였다. 적의 평균 직경은 180 ㎛이고 중심간의 거리(center to center ; CTC)는 150 ㎛이었다.
도 2에 나타낸 바와 같이 포화된 형광 강도가 500 fmol/㎕의 농도 이상일 경우 나타났다. 또한, 1pmol/㎕의 농도부터는 수세 후 여전히 형광 강도가 검출되어 간단한 수세에 의해서는 충분히 제거되지 않았다. 이상의 결과를 바탕으로 100 fmol/㎕의 농도가 포화된 형광강도를 내지 않으며 5분간의 간단한 수세에도 충분히 제거되는 적정 농도로 선정되었다.
라. 수세조건확립
상기에서 선정된 100fmol/㎕의 로다민이 겔 패드 칩에서 일상적으로 적용되는 차단(blocking) 용액(10% 에탄올아민)의 처리에 의해서 쉽게 제거되는지 조사하였다.
도 3에 나타낸 것과 같이 100 fmol/ul의 로다민과 10 pmol/ul의 30 개의 단량체로 구성된 올리고를 동량 혼합하여 칩상에 미세 배열하였다. a는 배열 후 그대로 532 nm에서 b는 배열 후 10 %의 에탄올아민 (ethanolamine)으로 상온에서 5분간 수세하여 600의 피엠티(photon multiplier tubes;PMT) 에서 c는 900의 PMT에서 스캐닝 한 것이다.
즉, 도 3에 나타낸 바와 같이 100 fmol/㎕의 로다민은 10 %의 에탄올아민으 로 상온에서 5 분간 수세하였을 때 완벽히 제거되었다. 일반적으로 적용되는 PMT 600과 이 보다 높은 PMT 900에서도 어떠한 형광 강도가 감지되지 않았다. 이는 별도의 수세 과정을 인위적으로 추가하지 않고 겔 패드 칩의 사용 과정에 간단히 수세해 낼 수 있어 실험 시간을 단축할 수 있다는 장점을 나타낸다.
이상의 결과로 100 fmol/㎕의 최적 농도와 물 또는 10 % 에탄올 아민으로 5분간 상온에서의 수세 조건을 확립하였다.
<실시 예2>
혼성화 (Hybridization) 단계에 미치는 로다민 6 G의 영향
실시 예 1에서 확립된 최적농도와 수세조건이 적절히 선정되었는가를 확인하기 위하여 혼성화 실험을 수행하였다.
가. 로다민과 올리고뉴클레오티드 혼합액의 준비
두 종류의 올리고 10 pmol/㎕ 씩과 100 fmol/㎕의 로다민을 동량 혼합하고 이 두종의 혼합액을 1:0부터 1.5:8.5의 비율로 순차적으로 혼합하였다(도 4참조).
나. 로다민 올리고뉴클레오티드 혼합액의 미세 배열
각각의 혼합액을 19번 반복하여 아크릴아마이드 겔 패드에 HT-ArrayerTM ((주)바이오니아사 제품, 대한민국)을 이용하여 미세배열하였다. 겔 패드는 0.1 % 글리시딜 메타크릴레이트(glycidyl metacrylate), 8 % 아크릴아마이드 (acrylamide), 1/20 과황산염 암모늄(ammonium persulfate)과 1/100 N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민 (N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine;TEMED)으로 조성된 용액 30 ㎕를 수세된 슬라이드 그라스(slide glass)위에 도말하여 제작하였다.
다. 스캐닝과 수세
미세 배열된 적들은 칩 스캐너(GenePix4000, Axon Instrument Inc, USA)를 이용하여 532 nm에서 로다민을 활성화시켜 PMT 600에서 스캐닝하여 그 형광도에 대한 영상자료를 얻은 후 10 % 에탄올아민으로 5 분간 상온에서 수세하였다.
라. 혼성화
미세 배열된 두 종류의 올리고와 100 % 상보적인 염기서열을 갖고 5' 말단이 cy3 또는 cy5로 표지된 타겟을 이용하여 혼성화 하였다. 1 pmols의 형광으로 표지된 타겟을 20 ㎕의 혼성화 버퍼 (1M NaCl, 1mM EDTA, 1 % Twween 20과 5 mM sodium phosphate)에 섞어 40℃ 에서 1 시간동안 반응한 후 0.1 배의 혼성화 용액을 이용하여 65℃에서 15 분간 수세하여 반응하지 않은 타겟들과 비특이적 혼성화물을 제거하였다.
마. 스캐닝
혼성화물들의 형광도는 칩 스캐너(GenePix4000, Axon Instrument Inc, USA)를 이용하여 532 nm에서 cy3를 650 nm에서 cy5를 동시에 활성화 시킨 후 형광도에 대한 영상 자료를 얻었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, a는 두종의 올리고(comp-cy3과 comp-cy5) 10 pmol/ul을 혼합한 혼합물에 100 pmol/㎕의 로다민을 혼합하고 미세 배열한 그림이다. b는 이 미세 배열을 532 nm에서 활성화 제어과정을 거친 후 에탄올아민으로 상온에서 5분간 수세한 후, 상기 두종의 올리고와 100% 상보적으로 결합할 수 있 는, cy3와 cy5가 표지된 타겟 올리고(target oligo)을 이용하여 혼성화하여 cy3는 532 nm에서 cy5는 635 nm에서 활성화 시켜 형광도를 측정한 결과이다. 여기서 녹색은 cy3로부터 적색은 cy5로부터 유래된 형광이며 황색의 경우는 두가지 형광의 혼합을 의미한다. 그림에서 레인 1 내지 레인 18은 10 pmol/㎕ 농도를 갖는 comp-cy3와 comp-cy5를 1:0부터 1.5:8.5의 비율로 순차적으로 혼합하여 10 pmol/㎕의 로다민과 섞은 후 미세 배열한 것이다.
즉, 녹색은 cy3로부터 적색은 cy5로부터 기인한 것이며 황색은 두 형광강도의 혼합으로 그 양상이 혼합된 2 종류의 탐침자 올리고의 혼합비율과 일치하는 것으로 나타났다. 이는 미세배열의 균일도 파악을 위하여 사용한 로다민이 혼성화 단계에 어떠한 영향도 미치지 않는다는 것을 나타내며 특히 2 종의 형광물질이 달리 표식된 타겟(target)이 하나의 점적(spot)에 혼성화물을 만드는 경쟁적 혼성화에도 아무런 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다.
즉, 이로써 로다민 6 G는 유전자 분석을 위한 측정과정에 실험의 오차를 주는 어떤 영향도 미치지 않음으로서, 칩 스캐너 미세 배열의 균일도를 측정하기 위한 재료로써 충분히 활용될 수 있음을 나타내었다.
<실시 예 3>
미세 배열된 점적간의 변이 표준화
본 실시 예에서는 미세 배열된 점적들의 변이를 보정할 수 있는 보정계수의 간단한 산출 예를 보여주기 위하여 실시하였다. 그러나 보정계수 산출방법은 본 실시예에만 한정되지는 아니한다.
가. 로다민과 올리고뉴클레오티드 혼합액의 준비
한 종류의 올리고뉴클레오티드 100 pmol/㎕와 로다민 6 G 100 fmol/㎕를 동량 혼합하고 이를 다시 두배와 네배 SB 버퍼로 희석하여 각 농도를 3개씩 미세배열 하였다 (그림 5a).
도 5에서 레인1, 2, 3은 희석하지 않은 것이며, 4, 5, 6은 2배, 7, 8, 9는 4배 희석한 후 미세배열 한 것이다.
나. 스캐닝과 수세
미세 배열된 점적들은 칩 스캐너(GenePix4000, Axon Instrument Inc, USA)를 이용하여 532 nm에서 로다민을 활성화시켜 PMT 600에서 스캐닝하여 형광도에 대한 영상자료를 얻은 후 10 % 에탄올아민으로 5분간 상온에서 수세하였다.
다. 혼성화
미세 배열된 올리고뉴클레오티드와 100 % 상보적인 염기서열을 가지며 5' 말단이 cy3 표지된 타겟을 이용하여 혼성화 하였다. 1 pmols의 형광 표지된 타겟을 20 ㎕의 혼성화 버퍼 ( 1M NaCl, 1mM EDTA, 1 % Twween 20과 5 mM sodium phosphate)에 혼합하여 40℃에서 1 시간동안 반응시킨 후 0.1 배의 혼성화 용액을 이용하여 65℃에서 15 분간 수세하여 반응하지 않은 타겟들과 비특이적 혼성화물을 제거하였다.
라. 스캐닝
혼성화물들의 형광도는 칩 스캐너(GenePix4000, Axon Instrument Inc, USA)를 이용하여 532 nm에서 cy3를 동시에 활성화 시킨 후 영상자료를 얻었다 (도 5b).
표 1은 그림 5에 보여진 각각의 적에 대한 미세배열 후 그리고 혼성화 후 얻어진 평균 형광 강도이며 사용된 면적은 50 ㎛의 반경을 갖는 원의 면적(7850 ㎛2)으로부터 얻어진 것이다. 미세 배열 후 로다민의 형광강도는 미세배열된 올리고의 농도에 따라 형광도가 직선적으로 비례하였으며 (y = 541,63x - 12861) 신뢰도 R2는 0,9453 이었다. 또한 미세 배열 후 로다민 6G로부터 얻어진 형광강도는 혼성화 후 얻어진 cy3로 부터의 형광도와 높은 상관도 (상관계수 0.9096)를 보였다. 즉 이는 미세 배열된 양의 변이가 최종적으로 혼성화 결과에 영향을 직접적으로 미친다는 것을 나타내고 실제 칩 제작시 이러한 변이가 존재한다면 반드시 수치화하여 보정할 수 있도록 제공되어야 할 것이다. 표1은 도 5에 보여진 각각의 점적에 대한 미세 배열한 후와 혼성화한 후 얻어진 평균 형광 강도값이다.
도 6은 각각의 점적에 대한 형광의 강도를 532 nm에서 활성화 시켜 얻은 후 7850 ㎛2의 면적에 존재 형광강도의 평균값을 이용하여 미세배열 후와 혼성화 후의 형광값에 대한 회귀식을 추정한 결과이다. 추정된 회귀식은 Y(혼성화 후 강도) =2836.6Ln(X;미세배열후 강도) - 18970이며 신뢰도는 0.9646인 로그 함수이었다.
이를 이용하여 로다민 6G의 형광도 1000부터 100,000에 대응하는 cy3의 형광도를 유추한 결과이다. 여기서 로다민 6G의 형광도는 미세 배열되는 탐침자 예를 들어 oligo의 양적인 차이를 의미하며 형광도 1000부터 100,000의 형광도는 100 fmol/ul의 농도를 이용한 경우 거의 대부분의 가능한 변이의 범주를 포함한다. 보정계수는 미세배열 후의 형광강도들의 산술평균을 구하고 이를 혼성화 후의 형광강도(11749.61)로 전환한 후, 이 값(11749.61)에서 혼성화 후 형광강도 값들을 감하였다. 이로부터 얻은 수치를 보정 계수로 사용하였으며 보정 계수와 실제 형광도 값을 더하면 그 값은 항상 일정한 11749.61로 표준화 되었다.
즉, 이를 보다 상세히 설명하면 일정한 농도의 탐침자를 100 fmol/㎕의 로다민과 희석하여 미세 배열하였을 경우 적간의 양적인 변이는 로다민의 형광강도의 변이로 나타나며 궁극적으로 혼성화 후 형광강도에 영향을 미치게 된다. 예를 들면, 점적 A가 미세 배열 후 1000의 형광도를 혼성화 후 1000의 형광도를 보였고 다른 점적 B는 미세 배열 후 2000의 형광도를 보이고 혼성화 후 1500의 형광도를 보였다고 가정하면, 실제 혼성화 후의 절대 형광 강도로 보았을 경우 점적 B에 더 많은 타겟이 혼성화 되었다고 보여 질 수 있다.
그러나 이러한 형광 강도의 차이는 미세배열된 탐침자의 양에 의해서 기인된 부분을 보정해 주어야 정확한 비교를 할 수 있다. 해당 보정계수 1125.07과 9158.89를 각 각 점적A와 B의 형광도에 더하면 A는 1225.07이 되고 B는 11158.89로 표준화되어 실제 동일한 양의 탐침자가 적내에 존재한다면 실제 A적에 더 많은 타겟이 혼성화 되었다는 결론을 내릴 수 있다.
이와 같이 보정계수는 최종 단계에서 결과 해석에 보다 정확도를 높이는데 매우 긴요하게 쓰일 수 있다. 표2는 회귀식(Y(혼성화 후 강도) =2836.6Ln(X;미세배열후 강도) - 18970)으로부터 추정된 보정 계수를 나타낸다,
점적하여 혼성화한 후에 올리고머의 각각의 농도에 따른 평균 형광 강도값
점적 번호 점적된 올리고머의 농도 (pmole/ul) 점적후 532nm에서의 평균 형광 강도값 혼성화후의 532nm에서의 평균형광강도값
1 100 50308 11889
2 100 38592 10630
3 100 38254 10848
4 50 12190 8069
5 50 9338 6322
6 50 11395 7952
7 25 3576 5497
8 25 2534 3090
9 25 2423 2232
회귀식(Y=2836.6Ln(x)-18970)으로부터 추론된 보정 계수
점적후의 532nm에서의 형광 강도값 혼성화후의532nm에서의 평균형광강도값 보정계수 혼성화후의532nm에서의 표준화된 평균형광강도값
1000 624.5386244 11125.07138 11749.61
2000 2590.719917 9158.890083 11749.61
3000 3740.862242 8008.747758 11749.61
4000 4556.901209 7192.708791 11749.61
5000 5189.870207 6559.739793 11749.61
6000 5707.043535 6042.566465 11749.61
7000 6144.307353 5605.302647 11749.61
8000 6523.082501 5226.527499 11749.61
9000 6857.18586 4892.42414 11749.61
10000 7156.051499 4593.558501 11749.61
11000 7426.408355 4323.201645 11749.61
12000 7673.224827 4076.385173 11749.61
13000 7900.273972 3849.336028 11749.61
14000 8110.488646 3639.121354 11749.61
15000 8306.193825 3443.416175 11749.61
16000 8489.263794 3260.346206 11749.61
17000 8661.231596 3088.378404 11749.61
18000 8823.367153 2926.242847 11749.61
19000 8976.734233 2772.875767 11749.61
20000 9122.232792 2627.377208 11749.61
21000 9260.630971 2488.979029 11749.61
22000 9392.589648 2357.020352 11749.61
23000 9518.681517 2230.928483 11749.61
24000 9639.40612 2110.20388 11749.61
25000 9755.201789 1994.408211 11749.61
26000 9866.455264 1883.154736 11749.61
27000 9973.509478 1776.100522 11749.61
28000 10076.66994 1672.940062 11749.61
29000 10176.20998 1573.400024 11749.61
30000 10272.37512 1477.234883 11749.61
31000 10365.38673 1384.223271 11749.61
32000 10455.44509 1294.164914 11749.61
33000 10542.73197 1206.878027 11749.61
34000 10627.41289 1122.197112 11749.61
35000 10709.63894 1039.971064 11749.61
36000 10789.54845 960.0615548 11749.61
37000 10867.26838 882.3416246 11749.61
38000 10942.91553 806.694475 11749.61
39000 11016.59759 733.0124102 11749.61
40000 11088.41408 661.1959161 11749.61
41000 11158.45715 591.1528512 11749.61

42000 11226.81226 522.7977364 11749.61
43000 11293.55887 456.0511275 11749.61
44000 11358.77094 390.8390601 11749.61
45000 11422.51744 327.0925572 11749.61
46000 11484.86281 264.7471904 11749.61
47000 11545.86731 203.7426886 11749.61
48000 11605.58741 144.0225881 11749.61
49000 11664.07608 85.53391802 11749.61
50000 11721.38308 28.22691844 11749.61
51000 11777.55521 -27.94521415 11749.61
52000 11832.63656 -83.02655649 11749.61
53000 11886.66867 -137.0586663 11749.61
54000 11939.69077 -190.0807708 11749.61
55000 11991.73994 -242.1299376 11749.61
56000 12042.85123 -293.2412303 11749.61
57000 12093.05785 -343.4478507 11749.61
58000 12142.39127 -392.7812681 11749.61
59000 12190.88134 -441.2713377 11749.61
60000 12238.55641 -488.9464096 11749.61
61000 12285.44343 -535.8334275 11749.61
62000 12331.56802 -581.958021 11749.61
63000 12376.95459 -627.3445892 11749.61
64000 12421.62638 -672.0163786 11749.61
65000 12465.60555 -715.9955541 11749.61
66000 12508.91327 -759.3032656 11749.61
67000 12551.56971 -801.9597085 11749.61
68000 12593.59418 -843.9841809 11749.61
69000 12635.00514 -885.3951353 11749.61
70000 12675.82023 -926.210228 11749.61
71000 12716.05636 -966.4463636 11749.61
72000 12755.72974 -1006.119738 11749.61
73000 12794.85588 -1045.245875 11749.61
74000 12833.44967 -1083.839668 11749.61
75000 12871.52541 -1121.915407 11749.61
76000 12909.09682 -1159.486817 11749.61
77000 12946.17708 -1196.567084 11749.61
78000 12982.77888 -1233.168882 11749.61
79000 13018.9144 -1269.304403 11749.61
80000 13054.59538 -1304.985376 11749.61
81000 13089.8331 -1340.223097 11749.61
82000 13124.63844 -1375.028441 11749.61
83000 13159.02189 -1409.411892 11749.61
84000 13192.99356 -1443.383556 11749.61
85000 13226.56318 -1476.953179 11749.61
86000 13259.74016 -1510.130165 11749.61

87000 13292.53359 -1542.923594 11749.61
88000 13324.95223 -1575.342232 11749.61
89000 13357.00455 -1607.394551 11749.61
90000 13388.69874 -1639.088735 11749.61
91000 13420.0427 -1670.432701 11749.61
92000 13451.0441 -1701.434102 11749.61
93000 13481.71035 -1732.100347 11749.61
94000 13512.0486 -1762.438604 11749.61
95000 13542.06582 -1792.455815 11749.61
96000 13571.7687 -1822.158704 11749.61
97000 13601.16379 -1851.553786 11749.61
98000 13630.25737 -1880.647374 11749.61
99000 13659.05559 -1909.445591 11749.61
100000 13687.56437 -1937.954374 11749.61
상기한 바와 같이, 본 발명은 대량의 칩(chip) 생산 공정에 본 발명과 같은 품질 검사 제어 과정을 도입함으로써 소비자에게 균일도가 높은 고품질의 칩(chip)을 공급할 수 있다. 또한, 본 발명을 통하여 품질 제어 단계에서 얻어진 점적들의 양적인 차이에 대한 자료는 생산된 칩(chip)과 함께 사용자에게 공급함으로써 이를 이용한 연구가 최종 단계에서 미세 배열시킨 탐침자의 양에 의한 변이를 보정할 수 있는 기회를 부여함으로써 사용자가 결과에 대하여 보다 정확히 해석할 수 있도록 하는 효과가 있다.

Claims (7)

1) 탐침자(probe)와 반응성이 없으면서 빛 또는 열을 내는 화합물과 상기 탐침자를 혼합하는 단계;
2) 상기 혼합물을 기판에 미세 배열시키는 단계;
3) 상기 미세 배열된 혼합물의 점적들을 스캐닝하여 형광 또는 열을 측정하는 단계를 포함하는 생화학 물질 미세 배열 칩의 품질 검사 방법.
제 1항에 있어서, 단계 3)에서 측정된 형광 또는 열을 통해 혼성화 이후의 형광이나 열을 산정하는 단계를 추가로 더 포함하는 생화학 물질 미세 배열 칩의 품질 검사 방법.
제 2항에 있어서, 탐침자와 타겟을 혼성화하여 형광이나 열을 측정하는 단계 및 혼성화 이후의 형광이나 열의 측정값을 사용하여 보정 계수를 구하고 점적간의 오차를 표준화시키는 단계를 추가로 더 포함하는 생화학 물질 미세 배열 칩의 품질 검사 방법.
제 1항에 있어서, 상기 탐침자는 핵산(nucleic acid), 아미노산(amino acid)을 포함하는 펩타이드(peptide), 다당류(polysaccharide) 및 인지질(phospholipid)로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 생화학 물질 미세 배열 칩의 품질 검사 방법.
제 1항에 있어서, 상기 탐침자와 반응성이 없으면서 빛 또는 열을 내는 화합물은 형광을 발하는 물질(fluorescent material)과 화학적 발광 물질(chemi-luminescent material)과 생물학적 발광물질(bio-luminescent material)과 열량 측정 가능물질(calorimetric material) 및 빛 산란물질 (light-scattering mateial)로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 생화학 물질 미세 배열 칩의 품질 검사 방법.
제 4항에 있어서, 상기 탐침자가 핵산인 경우, 상기 탐침자와 반응성이 없으면서 빛 또는 열을 내는 화합물은 플루오레세인 (Fluorescein), 쿠마린(Coumarin), 4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레세인 (JOE;4',5'-Dichloro-2',7'-dimethoxyfluorescein), 테트라메틸로다민(TAMR; Tetra methylrhodamine), X-로다민(ROX;X-rhodamine), 에오신(Eosin), 오레곤 그린 (Oregon Green), 로다민 그린 (Rhodamine Green), 로다민 레드(Rhodamine Red), 텍사스 레드(Texas Red) 및 로다민으로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하 는 생화학 물질 미세 배열 칩의 품질 검사 방법.
탐침자와, 상기 탐침자와 반응성이 없으면서 빛 또는 열을 내는 화합물의 혼합물이 기판상에 미세 배열되어 있는 생화학 물질 미세 배열 칩.
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