JPWO2020145124A1 - 核酸分析用基板、核酸分析用フローセル、及び画像解析方法 - Google Patents
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Abstract
Description
基板表面上に生体高分子が付着するパターン状のスポット部とランダム状のスポット部を備える基板の解析方法であって、
前記基板表面のパターン状のスポット部の発光する輝点とランダム状のスポット部の発光する輝点を用いて、前記基板上の輝点位置を同定することを特徴とする解析方法を提供する。
本発明で使用する核酸分析装置の概要を、図1に一例を示し説明する。
核酸分析装置100は、フローセル109と、光学系ユニット、温調系ユニット、送液ユニット、コンピュータ119を装備している。
次に、本発明で使用する核酸分析用基板の作製方法の一例を図3に示し説明する。
次に、核酸分析装置を用いたDNAシーケンス方法の一例を図5に示し説明する。まず、分析対象のDNAを固定したフローセルを核酸分析装置に搭載する501。次に、4種類の塩基の種類毎に異なる種類の蛍光体が標識された蛍光標識ヌクレオチドやDNAポリメラーゼを含む反応試薬をフローセルに送液し、フローセルの温度を調整し、試薬を反応させる502。その結果、あらかじめ試料に結合したプライマと呼ばれる塩基配列の存在によって、試料DNAの配列に相補的な蛍光体が付いたヌクレオチドが取り込まれ、伸長反応が行われる。本核酸分析装置では、取り込まれた塩基の種類を4種類の蛍光によって検出することが可能である。分析対象となる試料DNAの配列に対応するA(アデニン)、T(チミン)、G(グアニン)、C(シトシン)の4塩基の判別が可能である。塩基配列に対応する蛍光検出は、1塩基伸長する毎に、洗浄後、撮像により4種類の蛍光画像を取得する503。次に、撮像された1塩基の蛍光体は、酵素等を含む試薬によって蛍光体を除去する504。洗浄後、次の1塩基を検出するために、蛍光体が標識された蛍光標識ヌクレオチドを含む先の反応試薬をフローセルに送液し、フローセルの温度を調整し、蛍光体が付いた塩基試薬を反応させ505、洗浄後、撮像する506。この蛍光色素除去、1塩基伸長、撮像506を1サイクルとして、(N−1)回繰り返すことにより、N塩基分のシーケンスが可能となる。図6に、このシーケンス方法の例を示す。蛍光体が標識された蛍光標識ヌクレオチドをCy3−dATP、Cy5−dTTP、TxR−dGTP、FAM−dCTPを用いた場合、個々の付着スポット(例えば塩基配列-TATACG-を持つDNA断片(601))において、あるサイクル(#M)のケミストリ処理によって一塩基分伸長させると、例えば蛍光体のCy3−dATPが取り込まれる。この蛍光標識ヌクレオチドは、輝点として観察され、撮像処理において、Cy3の蛍光画像上のスポットとして検出される。このCy3−dATPが取り込まれる場合、対応するDNA断片の塩基はT(チミン)であると判断される。同様に、サイクル(#M+1)では、輝点として観察され、蛍光体Cy5の蛍光画像上のスポットとして検出される。このCy5−dTTPが取り込まれたる場合、対応するDNA断片の塩基はA(アデニン)であると判断される。同様に、サイクル(#M+2)では、輝点として観察され、蛍光体TxRの蛍光画像上のスポットとして検出される。このTxR−dGTPが取り込まれる場合、対応するDNA断片の塩基はC(シトシン)であると判断される。同様に、サイクル(#M+3)では、輝点として観察され、蛍光体FAMの蛍光画像上のスポットとして検出される。このFAM−dCTPが取り込まれる場合、対応するDNA断片の塩基はG(グアニン)であると判断される。以上のサイクル#Mから、サイクル#M+3までのサイクル処理によって、このスポットにおける塩基配列はTACGと決定される。この様にして、サンプルとなるDNA断片の塩基配列はシーケンスされる。
そして、1つの蛍光画像上のスポットに複数サンプルが付着していなければ、輝点である各蛍光画像上のスポットは4枚の画像で重複しない。そのため、各蛍光画像上のスポットが重ならないようにして、画像の重ね合わせを行うことになる。例えば、図9の画像が、1サイクル目で撮像した4種類のA、T、G、Cに対応する蛍光画像(901、902、903、904)の場合、合わせた画像905が基準画像(K1)となる。
これは、画像ずれサイズより単位ブロックのサイズが大きい場合、位置合わせを行う対象ブロック周辺で一致するブロックを探索することで、対象ブロックの位置を特定することが可能である。一方、画像ずれサイズより単位ブロックのサイズが小さい場合、位置ずれサイズに応じて探索するブロック数を増加させる必要がある。
101 2次元センサ
102 結像レンズ
103 バンドパスフィルタ
104 励起フィルタ
105 ダイクロイックミラー
106 フィルタキューブ
107 光源
108 対物レンズ
109 フローセル
110 コンデンサレンズ
111 ノズル
112 配管
113 試薬容器
114 試薬ラック
115 配管
116 廃液容器
117 ステージ
118 温調基板
119 コンピュータ
120 ダイクロイックミラー
200 核酸分析装置
301 酸化膜
302 シリコンウエハ
303 HMDS
304 フォトマスク
305 保護膜
306 アミノシラン
401 ガラス板
402 中間材
403 基板
501 フローセル搭載
502 試薬反応:1塩基伸長
503 撮像
504 試薬反応:蛍光除去
505 試薬反応:1塩基伸長
506 撮像
601 DNA断片の塩基配列
701 パターン状のスポット部
702 ランダム状のスポット部
901 A(アデニン)に相当する蛍光ヌクレオチドが発光した画像
902 T(チミン)に相当する蛍光ヌクレオチドが発光した画像
903 G(グアニン)に相当する蛍光ヌクレオチドが発光した画像
904 C(シトシン)に相当する蛍光ヌクレオチドが発光した画像
905 901〜904を重ね合わせた場合の画像
1001 サイクルNのステージ位置
1002 サイクルN+1のステージの移動に伴う位置ずれ
1101 スポットの輝点を検出する
1102 基準画像を作成する
1103 解析対象画像と基準画像の輝点同士の位置を合わせる
1501 基板の設計情報から基準画像を作成する
1502 基板上の輝点を検出する
1503 基準画像のパターン状のスポットと解析対象画像のパターン状のスポットの位置を合わせる
1504 ランダム状のスポットを用いて画像の位置合わせの補正を行なう
1601 パターン状のスポット部
1602 ランダム状のスポット部
1603 付着スポット
1701 基板の設計情報から基準画像を作成する
1702 基板上の輝点を検出する
1703 基準画像のランダム状のスポットと、解析対象画像のランダム状のスポットの位置を合わせる
1704 基準画像のパターン状のスポットと、解析対象画像のパターン状のスポットの位置を合わせる
Claims (14)
- 基板と、前記基板表面上に生体高分子が付着するパターン状のスポット部とランダム状のスポット部を備えることを特徴とする核酸分析用基板。
- 請求項1の核酸分析用基板において、
前記ランダム状のスポット部は図形形状の領域で構成され、複数のサンプルがランダムに配置されることを特徴とする核酸分析用基板。 - 請求項1の核酸分析用基板において、
前記パターン状のスポット部はサンプルが付着するスポットが規則的に配置されることを特徴とする核酸分析用基板。 - 請求項2の核酸分析用基板において、
前記ランダム状のスポット部の図形形状領域は、サンプルが付着可能なコーティング膜で形成されていることを特徴とする核酸分析用基板。 - 請求項2の核酸分析用基板において、
前記ランダム状のスポット部の図形形状領域に、サンプルが付着するスポットが不規則的に配置されることを特徴とする核酸分析用基板。 - 請求項3の核酸分析用基板において、
前記パターン状のスポット部は、サンプルが付着するスポットの配列が六方格子状のパターン配列を持つことを特徴とする核酸分析用基板。 - 請求項2の核酸分析用基板において、
前記ランダム状のスポット部の図形形状の領域がパターン状のスポットに、重ならないで配置されることを特徴とする核酸分析用基板。 - 基板表面上に生体高分子が付着するパターン状のスポット部とランダム状のスポット部を備える基板と、基板上面をカバーするガラス部材と流路を形成する中間材のシートを備える、
ことを特徴とする核酸分析用フローセル。 - 基板表面上に生体高分子が付着するパターン状のスポット部とランダム状のスポット部を備える基板の解析方法であって、
前記基板表面のパターン状のスポット部の発光する輝点とランダム状のスポット部の発光する輝点を用いて、前記基板上の輝点位置を同定することを特徴とする解析方法。 - 請求項9の解析方法において、
基準画像を作成し、前記基準画像とパターン状のスポット部の輝点の画像を用いて、画像の位置合わせを行い、
ランダム状のスポット部の輝点を用いて画像位置合わせの補正を行なう工程を含むことを特徴とする解析方法。 - 請求項9の解析方法において、
前記基準画像が、核酸塩基種類に基づく4枚の輝点画像を用いて作製される工程を含み、複数の画像を用いて基準画像を補正する工程を含むことを特徴とする解析方法。 - 請求項9の解析方法において、
前記基準画像が、前記基板の作製時のサンプル付着用の各スポットの位置情報を用いて作製される工程を含むことを特徴とした解析方法。 - 請求項9の解析方法において、
また、基準画像と解析対象画像の位置合わせの工程において、解析対象画像と基準画像の対応するスポット上の輝点が、各画像上の輝点同士の距離の二乗が最小となるような数値を用いて位置合わせを行う工程を含むことを特徴とする解析方法。 - 請求項9の解析方法において、
少なくとも一つのパターン状のスポット部とランダム状のスポット部が存在するように、一つの画像を複数のブロックに分割する工程を含むことを特徴とする解析方法。
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