DE112019005939T5

DE112019005939T5 - Substrat für nukleinsäurenanalyse, durchflusszelle für nukleinsäurenanalyse und bildanalyseverfahren

Info

Publication number: DE112019005939T5
Application number: DE112019005939.4T
Authority: DE
Inventors: Noriko Baba; Masatoshi Narahara; Naoshi Itabashi; Toru Yokoyama
Original assignee: Hitachi High Tech Corp
Current assignee: Hitachi High Tech Corp
Priority date: 2019-01-09
Filing date: 2019-12-24
Publication date: 2021-09-09
Also published as: JPWO2020145124A1; WO2020145124A1; CN113227342A; GB202108375D0; GB2594813A; US20210348227A1

Abstract

An den Positionen von Spots, die auf einem Substrat angeordnet sind, ist eine Bildausrichtung durch das Auftreten eines Erkennungsfehlers der Positionen von Spots, wobei die Spots in einer strukturierten Form einander benachbart sind, oder eine Verschiebung, die durch die Ausdehnung oder Verformung des Substrats aufgrund des Vorrichtungsbetriebs, Temperatursteuerung usw. verursacht wird, erschwert. Die vorliegende Erfindung schafft: ein Substrat zur Nukleinsäurenanalyse, auf dessen Oberfläche ein Bereich mit strukturierten Spots, der mit Spots ausgestattet ist, an denen ein Biopolymer anhaftet, und ein Bereich mit zufällig verteilten Spots gebildet sind; und ein Analyseverfahren.

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Substrat zur Nukleinsäurenanalyse, eine Durchflusszelle für Nukleinsäurenanalyse und ein Bildausrichtungsverfahren und bezieht sich auf eine Anordnung eines Bereichs mit strukturierten Spots und eines Bereichs mit zufällig verteilten Spots zur Analyse, um biologische Substanzen zu messen.
Stand der Technik
In letzter Zeit kann in einem Nukleinsäurenanalysator eine große Menge von Basensequenzinformationen gleichzeitig parallel sequenziert werden. Nukleinsäuren als ein Analyseobjekt werden auf einem Substrat immobilisiert, und eine Sequenzreaktion wird wiederholt. Eine Technik zum Integrieren eines fluoreszierenden Nukleotids zum Identifizieren einer Base in eine Basensequenz einer Nukleinsäure, um die Base basierend auf fluoreszierenden hellen Punkten, die aus dem fluoreszierenden Nukleotid emittiert werden, zu spezifizieren, wird verwendet. Bilder, die mehreren Basen von Nukleinsäuren entsprechen, werden aus einem Analysator bereitgestellt. In einer Sequenzeinheit, die als ein Zyklus bezeichnet ist, wird jeder der Abschnitte der immobilisierten Nukleinsäuren, die einer Base entsprechen, sequenziert. Durch Wiederholen dieses Zyklus können Basen jeder Nukleinsäure der Reihe nach sequenziert werden. Um eine große Menge von Basensequenzinformationen zu erfassen, ist es notwendig, die Dichte von immobilisierten Nukleinsäuren auf einem Substrat zu erhöhen. Beispiele für die Art des Substrats, auf dem Nukleinsäuren immobilisiert werden, enthalten ein Substrat, das zufällig verteilte Spots, auf denen Nukleinsäuren zufällig immobilisiert werden, und ein Substrat, das strukturierte Spots enthält, auf denen Nukleinsäuren in einer strukturierten Form geordnet sind und immobilisiert werden. Wenn immobilisierte Nukleinsäuren einander benachbart sind, können zufällig verteilte Spots nicht separat detektiert werden. Wenn Nukleinsäuren mit hoher Dichte angeordnet sind, sind strukturierte Spots effektiv. Beispielsweise in einem Substrat zur Analyse, das in PTL 1 offenbart ist, sind strukturierte Spots, wo Anlagerungsspots, an die Nukleinsäuren gebunden sind, in einer Gitterform auf einem Substrat angeordnet sind, gebildet sind, um hohe Dichte zu implementieren.
In einem Verfahren zum Analysieren von Nukleinsäuren auf diesem Substrat ist es notwendig, die Positionen individueller Spots in einem Fluoreszenzbild als helle Punkte genau zu identifizieren. Im Allgemeinen kann selbst in Fluoreszenzbildern, die durch Aufnehmen desselben Detektionsgesichtsfelds erhalten werden, falls eine Bewegung wie z. B. ein Objekttischantreiben oder dergleichen zum Ändern des Gesichtsfelds vorhanden ist, die aufgenommene Position aufgrund der Genauigkeit der Antriebssteuerung zu einer unterschiedlichen Position verschoben werden. Deshalb können Koordinatenpositionen eines Spots als unterschiedliche Koordinatenpositionen in den individuellen Bildern aufgenommen werden. Um die Positionen individueller Spots genau zu identifizieren, ist es notwendig, Koordinatenpositionen individueller Spots auf einem Substrat genau zu erfassen.
Selbst in einem Fall, in dem die strukturierten Spots so gebildet sind, dass sie eine hohe Dichte implementieren, wie in PTL 1 offenbart ist, ist es, wenn Verschiebung, die durch einen Erkennungsfehler verursacht ist, auftritt, schwierig, Positionen von Anlagerungsspots von Nukleinsäuren zu identifizieren, weil die Anlagerungsspots periodisch geordnet sind. Deshalb offenbart PTL 2 ein Analyseverfahren, das enthält: Löschen einiger Anlagerungsspots unter den strukturierten Anlagerungsspots auf dem Substrat; und Detektieren von Löschabschnitten, um die Verschiebung zu korrigieren.
Entgegenhaltungsliste
Patentliteratur

PTL 1: US2009/0270273A
PTL 2: US8774494B

Zusammenfassung der Erfindung
Technische Aufgabe
Um eine große Menge von Basensequenzinformationen zu erfassen, wenn die Anlagerungsspots strukturierter Proben auf einem Substrat zum Erhöhen der Dichte der Proben angeordnet sind, nimmt die Dichte der Proben zu. Da jedoch die Anlagerungsspots periodisch geordnet sind, besteht das Problem, dass es schwierig ist, zwischen Positionen von einander benachbarten Anlagerungsspots zu unterscheiden. Zusätzlich ändern sich, selbst wenn eine Sequenzreaktion auf Nukleinsäuren, die auf einem Substrat immobilisiert sind, wiederholt wird, Positionen der Nukleinsäuren, die auf dem Substrat immobilisiert sind, nicht. Jedoch kann ein Bild an der vollständig gleichen Position aufgrund der Antriebsgenauigkeit eines Objekttischs mit dem darauf platzierten Substrat, der Ausdehnung oder Verformung des Substrats, ist durch ein Temperatursteuersystem verursacht ist, oder dergleichen nicht pro Zyklus erfasst werden. Ferner variiert selbst in einem Bild die Aberration zwischen der Nähe zur Mitte des Bilds und der Nähe zu vier Ecken des Bilds, und somit ist die Bildausrichtung schwierig.
Beispiele für ein Verfahren zum Lösen der Aufgaben enthalten ein Verfahren zum Anordnen eines Referenzpunkts wie z. B. Markierungen auf einem Substrat. In diesem Fall ist es notwendig, eine Position unter Verwendung einer Kombination aus mehreren Punkten, die helle Punkte und Referenzpunkte enthalten, zu bestimmen. Um mit der durch verschiedene Faktoren verursachten Verschiebung umzugehen, sind typischerweise viele Referenzpunkte wie z. B. Markierungen erforderlich. Um diese Referenzpunkte zu detektieren und ihre Positionen zu bestimmen, neigt eine Last der Bildverarbeitung dazu, anzusteigen.
Zusätzlich ist in PTL 2, um die Aufgabe zu lösen, ein Spotbereich gelöscht, und dieser Spotbereich wird als Positionsinformationen verwendet, um die Verschiebung zu korrigieren. Es sind jedoch nicht an allen Anlagerungsspots Proben befestigt. Deshalb ist es schwierig, zwischen dem Löschbereich des Spots und einem Anlagerungsspot, an dem keine Probe angelagert ist, zu unterscheiden. Ferner führt das Vorhandensein des Löschabschnitts zu einer Verringerung der Probendichte.
Bei der Nukleinsäurenanalyse können 1.000.000 Nukleinsäuren in einem Bild angelagert sein, und nahezu 500.000 Bilder können in einer Analyse erfasst werden. Deshalb kann eine fehlerhafte Detektion von Probenpositionen für die Anordnungsanalyse das Auftreten einer großen Anzahl von Irreführungen verursachen. Deshalb werden ein Substrat zur Nukleinsäurenanalyse und eine Bildausrichtungstechnik, die zum schnellen Ausrichten von Bildern mit hoher Genauigkeit fähig ist, benötigt.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Substrat zur Nukleinsäurenanalyse, das zum Anordnen von Proben mit hoher Dichte und Ausrichten der erfassten Bilder mit hoher Genauigkeit fähig ist, eine Durchflusszelle zur Nukleinsäurenanalyse und ein Bildausrichtungsverfahren zu schaffen.
Lösung der Aufgabe
Um die Aufgabe zu lösen, werden ein Substrat zur Nukleinsäurenanalyse und eine Durchflusszelle zur Nukleinsäurenanalyse geschaffen, wobei das Substrat enthält: ein Substrat; und einen Bereich mit strukturierten Spots und einen Bereich mit zufällig verteilten Spots, die auf einer Oberfläche des Substrats vorgesehen sind und an die ein Biopolymer angelagert ist.
Zusätzlich ist zur Lösung der Aufgabe vorgesehen:

ein Analyseverfahren für ein Substrat, das Bereich mit strukturierten Spots und Bereichs mit zufällig verteilten Spots, die auf einer Oberfläche des Substrats vorgesehen sind und an die ein Biopolymer angelagert ist, wobei das Analyseverfahren enthält:
- Identifizieren der Positionen heller Punkte auf dem Substrat unter Verwendung Licht emittierender heller Punkte des Bereichs mit strukturierten Spots und Licht emittierender heller Punkte des Bereichs mit zufällig verteilten Spots auf der Oberfläche des Substrats.

Vorteilhafte Effekte der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung können aufgrund des Vorhandenseins des Bereichs mit strukturierten Spots und des Bereichs mit zufällig verteilten Spots Proben mit höherer Dichte angeordnet werden als in einem Substrat, das nur den Bereich mit zufällig verteilten Spots enthält.
Zusätzlich kann die Verbesserung der Ausrichtungsgenauigkeit und Geschwindigkeit, die mit dem Bereich mit zufällig verteilten Spots schwierig zu erreichen ist, erreicht werden. In dem Substrat, das nur den Bereichs mit strukturierten Spots enthält, sind die Anlagerungsspots periodisch angeordnet. Deshalb kann eine benachbarte Spotordnung irrtümlicherweise erkannt werden, und es kann eine große Verschiebung auftreten. Jedoch in dem Substrat, in dem der Bereich mit strukturierten Spots und der Bereich mit zufällig verteilten Spots vorhanden sind, funktionieren die zufällig verteilten hellen Punkte, die detektiert werden, als Markierungen oder dergleichen. Als ein Ergebnis können verschiedene Positionsbeziehungen wie z. B. eine Positionsbeziehung zwischen dem Bereich mit strukturierten Spots und dem Bereich mit zufällig verteilten Spots, eine Positionsbeziehung zwischen dem Bereich mit strukturierten Spots und zufällig verteilten hellen Punkten, eine Positionsbeziehung zwischen hellen Punkten in dem Bereich mit strukturierten Spots und hellen Punkten in dem Bereich mit zufällig verteilten Spots oder eine Positionsbeziehung zwischen zufällig verteilten individuellen hellen Punkten verwendet werden, ohne spezielle Markierungen zur Positionsdetektion bereitzustellen. Durch Verwenden einer oder einer Kombination von Positionsbeziehungen, die von den Verwendungszuständen abhängen, können Probenpositionsinformationen mit hoher Genauigkeit identifiziert werden. Als ein Ergebnis können beispielsweise Effekte zum Verbessern der Ausrichtungsgenauigkeit und der Verarbeitungsgeschwindigkeit erhalten werden.
Zusätzlich kann, da kein Schritt zum Bereitstellen spezieller Markierungen zur Positionsdetektion vorhanden ist, auch ein effizientes Herstellen des Substrats erwartet werden.
Ferner ist der Anlagerungsspotlöschabschnitt, der in PTL 2 beschrieben ist und der als ein Referenzpunkt zur Bildausrichtung funktioniert, nicht vorhanden. Deshalb können die Anlagerungsspots mit höhere Dichte als der in dem Fall, wenn der Spotlöschabschnitt vorhanden sind, angeordnet sein.
Auf diese Weise kann gemäß der vorliegenden Erfindung die Bildausrichtungsgenauigkeit verbessert werden, fehlerhaftes Lesen während der Sequenzanalyse unterschiedlicher einander benachbarter Nukleinsäuren kann verhindert werden, und die Sequenzierungsgenauigkeit und der Durchsatz der Analyse können verbessert sein.
Figurenliste

1 ist ein Diagramm, das ein schematisches Konfigurationsbeispiel eines Nukleinsäurenanalysators darstellt.
2 ist ein Diagramm, das das schematische Konfigurationsbeispiel des Nukleinsäurenanalysators darstellt.
3 ist eine Querschnittsansicht, die ein Substrat in einem Substratvorbereitungsverfahrensbeispiel darstellt.
4 ist ein Diagramm, das ein Konfigurationsbeispiel einer Durchflusszelle zur Nukleinsäurenanalyse darstellt.
5 ist ein Diagramm, das ein Beispiel eines Nukleinsäurenanalyseverfahrens unter Verwendung des Nukleinsäurenanalysators darstellt.
6 ist ein Diagramm, das ein Konzept eines Basensequenzbestimmungsverfahrens darstellt.
7 ist ein Diagramm, das ein Anordnungsbeispiel eines Bereichs mit strukturierten Spots und eines Bereichs mit zufällig verteilten Spots darstellt.
8 ist ein Diagramm, das ein Beispiel eines graphischen Gebiets des Bereichs mit zufällig verteilten Spots darstellt.
9 ist ein Diagramm, das ein Beispiel von vier Typen von Fluoreszenzbildern darstellt.
10 ist ein Diagramm, das ein Konzept der Verschiebung zwischen Zyklen darstellt.
11 ist ein Diagramm, das ein Beispiel eines Bildausrichtungsverfahrens darstellt.
12 ist ein Diagramm, das ein Anordnungsbeispiel des Bereichs mit zufällig verteilten Spots, wenn ein Bild in 64 Blöcke unterteilt ist, darstellt.
13 ist eine vergrößerte Ansicht, die vier Blöcke von 12 darstellt, wobei ein Bild in 64 Blöcke unterteilt ist,.
14 ist eine vergrößerte Ansicht, die vier Blöcke eines Bilds, wenn das Bild in 64 Blöcke unterteilt ist und jeder der Blöcke weiter in 16 Blöcke unterteilt ist, darstellt.
15 ist ein Diagramm, das ein Beispiel des Bildausrichtungsverfahrens darstellt.
16 ist ein Diagramm, das ein Anordnungsbeispiel eines Bereichs mit strukturierten Spots, eines Bereichs mit zufällig verteilten Spots und von Anlagerungsspots in dem Bereich mit zufällig verteilten Spots darstellt.
17 ist ein Diagramm, das das Bildausrichtungsverfahren darstellt.

Beschreibung von Ausführungsformen
Nachstehend wird eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung mit Bezug auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben. Zum einfachen Verstehen der vorliegenden Erfindung wird eine spezifische Ausführungsform beschrieben, sie ist jedoch nicht dafür vorgesehen, die vorliegende Erfindung einzuschränken. Zusätzlich bezieht sich für die Beschreibung der Ausführungsform die Nukleinsäurenanalyse auf das Sequenzieren (die Basensequenzanalyse) von Nukleinsäuren, das heißt DNA-Fragmenten. Ursprünglich kann das Analyseobjekt ein Biopolymer sein wie z. B. DNA, RNA oder Protein und ist auf allgemeine bio-bezogene Materialien anwendbar.
Zuerst werden eine schematische Konfiguration eines Nukleinsäurenanalysators, ein Verfahren zum Vorbereiten eines Substrats zur Nukleinsäurenanalyse, eine Durchflusszellenkonfiguration und ein Sequenzierungsprozess einer Basensequenz von DNA, die der Ausführungsform gemeinsam sind, als ein Beispiel beschrieben.
Nukleinsäurenanalysator
Die Zusammenfassung des Nukleinsäurenanalysators, die in der vorliegenden Erfindung verwendet ist, wird als ein Beispiel mit Bezug auf 1 beschrieben.
Der Nukleinsäurenanalysator 100 enthält eine Durchflusszelle 109, eine optische Einheit, eine Temperatursteuereinheit, eine Flüssigkeitszuführungseinheit und einen Computer 119.
Die optische Einheit emittiert Anregungslicht zu der Durchflusszelle 109 und detektiert Fluoreszenz, die aus einer Basensequenz, die durch eine Nukleinsäurenverlängerungsreaktion integriert ist, emittiert wird. Die optische Einheit enthält eine Lichtquelle 107, eine Kondensorlinse 110, ein Anregungsfilter 104, einen dichroitischen Spiegel 105, ein Bandpassfilter 103, eine Objektivlinse 108, eine Bildaufnahmelinse 102 und einen zweidimensionalen Sensor 101. Das Anregungsfilter 104, der dichroitische Spiegel 105 und das Bandpassfilter 103 sind in einem Filterwürfel 106 enthalten. Die Temperatursteuereinheit ist in einem Objekttisch 117 vorgesehen, enthält ein Temperatursteuersubstrat 118, das beispielsweise ein Peltier-Element enthält und Erwärmen und Kühlen ausführen kann, und kann die Temperatur der Durchflusszelle 109 steuern. Die Flüssigkeitszuführungseinheit enthält: eine Reagensvorratseinheit 114, die mehrere Reagensbehälter 113 aufnimmt; eine Düse 111, die auf den Reagensbehälter 113 zugreift; ein Rohr 112, das jedes der Reagenzien in den mehreren Reagensbehältern 113 in eine Durchflusszelle 109 einleitet; einen Abfalllösungsbehälter 116, der eine Abfalllösung wie z. B. ein Reagens nach einer Reaktion in der Durchflusszelle 109 entsorgt; und ein Rohr 115, das die Abfalllösung in einen Abfalllösungsbehälter 116 einleitet.
In dem Nukleinsäurenanalysator ist die Durchflusszelle 109, in der Nukleinsäureproben im Voraus immobilisiert sind, auf den Objekttisch 117, der in einer XY-Richtung angetrieben wird, montiert. Die Durchflusszelle weist ein Fließwegloch auf und ist auf dem Objekttisch über eine Unterdruckspannvorrichtung befestigt. Als ein Ergebnis ist die Durchflusszelle mit einem Fließweg der Flüssigkeitszuführungseinheit, die mit dem Objekttisch verbunden ist und eine Lösung wie z. B. ein Reaktionsreagens zuführen kann, verbunden. Eine Reagensvorratseinheit 114 ist in einem Zustand untergebracht, in dem sie an einer kühlen Temperatur gehalten wird, und kann auf das Reagens zugreifen, wenn die Düse 111 in die Vorratseinheit eingeführt wird. Die Düse ist mit einem Fließweg verbunden. Während des Betriebs einer Spritzenpumpe wird das Reagens schließlich einem Abfalllösungstank 116 über die Durchflusszelle zugeführt. Mehrere Reagenzien werden verwendet, und ein Reagens, das zu verwenden ist, wird durch ein Fließwegumschaltventil ausgewählt. Das Temperatursteuersubstrat 118 ist auf einem XY-Objekttisch montiert, und eine Sequenzreaktion wird ausgeführt. In der optischen Einheit wird beispielsweise eine LED-Lichtquelle als die Lichtquelle 107 verwendet. Anregungslicht, das aus der Lichtquelle 107 emittiert wird, wird durch eine Kondensorlinse 110 kondensiert, so dass es auf den Filterwürfel 106 fällt. In dem Filterwürfel sind das Anregungsfilter 104, das Bandpassfilter 103 und der dichroitische Spiegel 105 vorgesehen, und eine spezifische Fluoreszenzwellenlänge wird durch das Anregungsfilter 104 und das Bandpassfilter 103 ausgewählt. Licht, das durch das Anregungsfilter hindurch läuft, wird von dem dichroitischen Spiegel 105 reflektiert, und das reflektierte Licht wird durch die Objektivlinse 108 zu der Durchflusszelle 109 emittiert. Unter fluoreszierenden Substanzen, die in Proben, die auf der Durchflusszelle 109 immobilisiert sind, integriert sind, wird eine fluoreszierende Substanz, die in einem Wellenlängenbereich des emittierten Anregungslichts angeregt werden soll, durch das Anregungslicht angeregt. Fluoreszenz, die aus der angeregten fluoreszierenden Substanz emittiert wird, durchläuft den dichroitischen Spiegel 105, nur Fluoreszenz in einem spezifischen Wellenlängenbereich durchläuft das Bandpassfilter 103, und die hindurch getretene Fluoreszenz wird als fluoreszierende Spots auf dem zweidimensionalen Sensor 101 durch die Bildaufnahmelinse 102 abgebildet. Selbst ein Typ oder mehrere Typen fluoreszierender Substanzen, die durch das Anregungslicht angeregt sind, können detektiert werden. Beispielsweise wenn ein Typ einer fluoreszierenden Substanz durch das Anregungslicht angeregt ist, kann die fluoreszierende Substanz durch Vorbereiten von vier Typen von Filterwürfeln 106, die Wellenlängenbereichen, die zu detektieren sind, entsprechen, um zwischen vier Typen von Fluoreszenz, die einer Basensequenz entsprechen, zu unterscheiden, und Umschalten zwischen den vier Filterwürfeln 106 detektiert werden. Zusätzlich zeigt 2 ein zusammenfassendes Beispiel eines Nukleinsäurenanalysators, wenn mehrere Typen fluoreszierender Substanzen gleichzeitig angeregt werden, beispielsweise wenn zwei Typen fluoreszierender Substanzen gleichzeitig angeregt werden. Ein Nukleinsäurenanalysator 200 enthält einen dichroitischen Spiegel 120, der die Fluoreszenz, die das Bandpassfilter 103 durchläuft, in zwei Typen von Fluoreszenz aufteilt, und kann Bildaufnahme unter Verwendung einer doppelten Sicht mit zwei zweidimensionalen Sensoren ausführen, wobei das Bandpassfilter 103 das Hindurchtreten von zwei Typen von Fluoreszenz in Zielwellenlängenbereichen erlaubt. Vier Typen von Fluoreszenz können durch Vorbereiten von zwei Typen von Filterwürfeln 106, die Wellenlängenbereichen, die zu detektieren sind, entsprechen, und Umschalten zwischen den Filterwürfeln 106 detektiert werden. In diesem Fall kann die Detektion innerhalb einer kürzeren Zeitspanne ausgeführt werden als in einem Fall, in dem die Detektion pro Typ ausgeführt wird, was zu einer Reduktion der Zeit, die erforderlich ist, um die Basensequenz einer Zielprobe zu analysieren, führt. In dem Computer 119 werden Vorrichtungssteuerung und Echtzeitbildverarbeitung ausgeführt.
Verfahren zum Vorbereiten eines Substrats zur Nukleinsäurenanalyse, dessen Konfiguration und Konfiguration der Durchflusszelle
Als Nächstes wird ein Beispiel für das Verfahren zum Vorbereiten des Substrats zur Nukleinsäurenanalyse, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, mit Bezug auf 3 beschrieben.
Zuerst wird Wärmebehandlung auf einem Siliziumwafer 302 ausgeführt, um eine Oxidschicht 301 auf einer Oberfläche des Siliziumwafers 302 zu bilden (3-A). Die Oxidschicht wird mit einer HMDS-Schicht (Hexamethyldisilizan-Schicht) 303, die hydrophob ist und die Adsorption von DNA oder dergleichen verhindert, beschichtet (3-B). Als nächstes wird eine Schutzschicht beschichtet, und eine Fotomaske 304, wo ein Bereich mit strukturierten oder zufällig verteilten Spots ausgeschnitten ist, wird platziert ( 3-C). Die Schutzschicht 305 wird leicht löslich durch Photolithographie hergestellt, und es wird ein Entwicklungsprozess ausgeführt (3-D). Ferner wird die HMDS-Schicht in dem Spotbereich durch Sauerstoffplasma entfernt, und Aminosilan 306 oder dergleichen wird auf den entfernten Bereich als ein Material zum Immobilisieren einer Probe aufgebracht (3-E). Schließlich wird die Schutzschicht durch Reinigen entfernt, und das Substrat ist vorbereitet ( 3-F).
Das für das Substrat verwendete Material ist nicht besonders eingeschränkt. Beispielsweise sind dann, wenn DNA mit Fluoreszenz analysiert wird oder wenn die Temperatur während der Analyse erhöht oder erniedrigt wird, Silizium, Glas, Quarz, SUS, Titan oder dergleichen, bei denen die Autofluoreszenz gering ist, der Wärmeausdehnungskoeffizient niedrig ist und die Widerstandsfähigkeit gegen eine Analyselösung hoch ist, besonders wünschenswert.
Als ein Material, das für den Probenanlagerungsbereich wie z. B. einen Anlagerungsspot verwendet wird, ist ein Material, in dem der Probenanlagerungsbereich auf dem Substrat durch eine kovalente Bindung gebildet werden kann, bevorzugt. Wenn ein anorganisches Material wie z. B. Silizium, Glas, Quarz, Saphir, Keramik, Ferrit oder Aluminiumoxid oder ein Metallmaterial wie z. B. Aluminium, SUS, Titan oder Eisen, das eine Oxidschicht auf der Oberfläche des Substrats enthält, als das Material verwendet wird, ist ein Silankopplungsmaterial besonders vorzuziehen. Zusätzlich ist es vorzuziehen, dass das Silankopplungsmaterial eine funktionale Gruppe aufweist, die ein hohes Reaktionsvermögen aufweist, mit dem eine Beschichtungsschicht, die eine Aminogruppe aufweist, durch eine kovalente Bindung gebildet werden kann. Beispielsweise sind Ethoxysilan oder Methoxysilan, die als diese funktionale Gruppe eine Vinylgruppe, eine Epoxygruppe, eine Styrylgruppe, eine Methacrylgruppe, eine Acrylgruppe, eine Aminogruppe, eine Ureidogruppe, eine Isocyanatgruppe, eine Isocyanuratgruppe oder eine Mercaptogruppe in dem Molekül aufweisen, vorzuziehen.
Als Nächstes wird die Konfiguration einer Durchflusszelle mit Bezug auf 4 beschrieben.
In der Durchflusszelle ist ein Substrat 403 zur Nukleinsäurenanalyse auf einer Unterseite vorgesehen, ein Glasabschnitt 401 ist auf einer Oberseite vorgesehen, und ein Zwischenmaterial 402, das einen Fließweg bildet, ist zwischen das Substrat 403 und den Glasabschnitt 401 eingeschoben. Ein Loch des Substrats auf der Unterseite funktioniert als eine Einlassöffnung und eine Auslassöffnung des zuzuführenden Reagens.
Sequenzierungsprozess der Basensequenz von DNA
Als Nächstes wird ein Beispiel eines DNA-Sequenzierungsverfahrens unter Verwendung des Nukleinsäurenanalysators mit Bezug auf 5 beschrieben. Zuerst wird die Durchflusszelle, auf der DNA als ein Analyseobjekt immobilisiert ist, auf den Nukleinsäurenanalysator 501 montiert. Als Nächstes wird ein Reaktionsreagens, das fluoreszenzmarkierte Nukleotide oder DNA-Polymerasen enthält, wobei vier Typen von Basen mit vier unterschiedlichen Typen fluoreszierender Substanzen markiert sind, der Durchflusszelle zugeführt, die Temperatur der Durchflusszelle wird gesteuert, und das Reagens wird zur Reaktion gebracht 502. Als ein Ergebnis wird aufgrund des Vorhandenseins der Basensequenz, die als ein Primer bezeichnet ist, die im Voraus an eine Probe gebunden ist, das Nukleotid, an das komplementäre fluoreszierende Substanzen angelagert sind, in eine Sequenz der Proben-DNA integriert, und es wird eine Verlängerungsreaktion ausgeführt. In dem Nukleinsäurenanalysator kann der Typ der integrierten Base durch vier Typen von Fluoreszenz detektiert werden. Die vier Basen A (Adenin), T (Thymin), G (Guanin) und C (Cytosin), die der Sequenz der Proben-DNA als ein Analyseobjekt entsprechen, können voneinander unterschieden werden. Während der Fluoreszenzdetektion, die der Basensequenz entspricht, werden vier Typen von Fluoreszenzbildern durch Aufnehmen nach dem Reinigen immer dann, wenn eine Base verlängert wird, erfasst 503. Als Nächstes wird die abgebildete fluoreszierende Substanz einer Base durch ein Reagens, das ein Enzym oder dergleichen enthält, entfernt 504. Nach dem Reinigen werden, um die nächste Base zu detektieren, das vorhergehende Reaktionsreagens, das fluoreszenzmarkierte Nukleotide enthält, wobei fluoreszierende Substanzen markiert sind, der Durchflusszelle zugeführt, die Temperatur der Durchflusszelle wird gesteuert, ein Basenreagens, an das fluoreszierende Substanzen angelagert sind, wird zur Reaktion gebracht 505. Nach dem Reinigen wird Bildaufnahme ausgeführt 506. Das Entfernen des fluoreszierenden Farbstoffs, die Verlängerung einer Base und die Bildaufnahme 506 sind als ein Zyklus eingestellt, und dieser Zyklus wird (N-1)-mal wiederholt. Als ein Ergebnis können N Basen sequenziert werden. 6 zeigt ein Beispiel dieses Sequenzierungsverfahrens. In einem Fall, in dem Cy3-dATP, Cy5-dTTP, TxR-dGTP und FAM-dCTP als die fluoreszenzmarkierten Nukleotide verwendet sind, wobei fluoreszierende Substanzen markiert sind, wird beispielsweise, wenn eine Base durch eine chemische Behandlung in einem Zyklus (Nr. M) in jedem der Anlagerungsspots (beispielsweise in einem DNA-Fragment (601), das eine Basensequenz von TATACG aufweist), Cy3-dATP als die fluoreszierende Substanz integriert. Dieses fluoreszenzmarkierte Nukleotid wird als ein heller Punkt beobachtet und wird als ein Spot auf dem Fluoreszenzbild von Cy3 während der Bildaufnahme detektiert. Wenn das Cy3-dATP integriert ist, wird die Base des entsprechenden DNA-Fragments als T (Thymin) bestimmt. Ähnlich wird in einem Zyklus (Nr. M+1) das fluoreszenzmarkierte Nukleotid als ein heller Punkt beobachtet und wird als ein Spot in dem Fluoreszenzbild der fluoreszierenden Substanz Cy5 detektiert. Wenn das Cy5-dTTP integriert ist, wird die Base des entsprechenden DNA-Fragments als A (Adenin) bestimmt. Ähnlich wird in einem Zyklus (Nr. M+2) das fluoreszenzmarkierte Nukleotid als ein heller Punkt beobachtet und wird als ein Spot in dem Fluoreszenzbild der fluoreszierenden Substanz TxR detektiert. Wenn das TxR-dGTP integriert ist, wird die Base des entsprechenden DNA-Fragments als C (Cytosin) bestimmt. Ähnlich wird in einem Zyklus (Nr. M+3) das fluoreszenzmarkierte Nukleotid als ein heller Punkt beobachtet und wird als ein Spot in dem Fluoreszenzbild der fluoreszierenden Substanz FAM detektiert. Wenn das FAM-dCTP integriert ist, wird die Base des entsprechenden DNA-Fragments als G (Guanin) bestimmt. In einer Zyklusbehandlung von dem Zyklus Nr. M bis zum Zyklus Nr. M+3 wird die Basensequenz dieses Spots als TACG bestimmt. Auf diese Weise wird die Basensequenz des DNA-Fragments als eine Probe sequenziert.
Ausführungsform 1
Ein Beispiel eines Substrats für Nukleinsäurenanalyse, das einen Bereich mit strukturierten Spots und einen Bereich mit zufällig verteilten Spots, an die Nukleinsäuren angelagert sind, auf einer Oberfläche des Substrats enthält, wird mit Bezug auf 7 beschrieben.
7 ist eine vergrößerte Ansicht, die einen Teil des Substrats darstellt. Auf dem Substrat sind ein Bereich mit strukturierten Spots 701 als ein Gebiet, in dem Nukleinsäurenanlagerungsspots mit einer gewissen Regelmäßigkeit angeordnet sind, und ein Bereich mit zufällig verteilten Spots 702 als ein Gebiet, in dem Nukleinsäuren unregelmäßig angelagert sind, vorhanden. In 6-A repräsentiert ein Bereich, in dem runde Abschnitte angeordnet sind, den Bereich mit strukturierten Spots 701, und der runde Abschnitt repräsentiert einen Anlagerungsspot, an dem eine Probe angelagert ist. Ein dreieckiger Bereich repräsentiert den Bereich mit zufällig verteilten Spots 702. Jeder Spotbereich weist einen Bereich auf, an den eine Nukleinsäure, die aus einer Beschichtungsschicht, die eine Aminogruppe aufweist, angelagert ist, und die Oberfläche eines Gebiets, an das keine Nukleinsäure angelagert ist, ist mit hydrophobem HDMS beschichtet. In dem Bereich mit strukturierten Spots sind Nukleinsäuren an die geordneten runden Abschnitte angelagert, in der Nähe der runden Abschnitte ist keine Nukleinsäure angelagert, und die Oberfläche ist mit hydrophobem HMDS beschichtet. Der dreieckige Bereich mit zufällig verteilten Spots ist aus einer Beschichtungsschicht gebildet, die eine Aminogruppe aufweist, an die eine Nukleinsäure angelagert ist.
Hier ist die strukturierte Form der Spotfläche, wo die Spots in einer strukturierten Form angeordnet sind, eine Anordnungsstruktur, wie z. B. eine rhombische Gitterstruktur, eine rechteckige Gitterstruktur, eine zentrierte rechteckige Struktur, eine hexagonale Gitterstruktur oder eine quadratische Gitterstruktur. Insbesondere ist es wünschenswert, dass Anlagerungsspots in einer hexagonalen Struktur, die zum Erhöhen der Dichte der Anlagerungsspots fähig ist, angeordnet sind. Zusätzlich ist es, wenn die Grafik des Bereichs mit zufällig verteilten Spots eine Grafik ist, die Seiten aufweist, wünschenswert, dass jede der Seiten der Grafik des Bereichs mit zufällig verteilten Spots parallel zu eine Spotordnung einer äußeren strukturierten Form der Grafik ist. Beispielsweise wenn die Grafik des Bereichs mit zufällig verteilten Spots ein Dreieck ist, wie in 7 dargestellt, ist es wünschenswert, dass jede Seite des Dreiecks des Bereichs mit zufällig verteilten Spots nicht mit einer strukturierten Anordnung von Anlagerungsspots, der in der Nähe der Seite positioniert ist, überlappt, wie in 7-A dargestellt ist, im Vergleich zu einem Fall, in dem ein Teil der Seiten des Dreiecks des Bereichs mit zufällig verteilten Spots eine strukturierte Anordnung von Anlagerungsspots, die in der Nähe der Seite positioniert ist, überlappt, wie in 7-B dargestellt. Alternativ ist es wünschenswert dass jede Seite des Dreiecks des Bereichs mit zufällig verteilten Spots parallel ist zu einer strukturierten Anordnung von Anlagerungsspots, die in der Nähe der Seite positioniert ist. Das liegt daran, dass ein Abnehmen der Anzahl von Spots auf einem detektierbaren Fluoreszenzbild, die durch das Überlappen zwischen den strukturierten Anlagerungsspots und dem Bereich mit zufällig verteilten Spots verursacht sind, vermieden werden kann. Zusätzlich kann die Bildausrichtung auch durch Verwenden einer parallelen Anordnung von Spots auf der Außenseite der Grafik oder Spots auf dem äußeren Umfang der Grafik als einen Index ausgeführt werden. Beispielsweise kann ein Gebiet, das auszurichten ist, basierend auf einer Gebietspositionsbeziehung zwischen dem Bereich mit strukturierten Spots und dem Bereich mit zufällig verteilten Spots ausgewählt werden, und das Ausrichten kann durch Überprüfen einer kleinen Anzahl von Spotpositionen ausgeführt werden. Als ein Ergebnis können beispielsweise Effekte zum Verbessern der Ausrichtungsgenauigkeit und der Verarbeitungsgeschwindigkeit erhalten werden.
Zusätzlich ist es, wenn die Grafik des Bereichs mit zufällig verteilten Spots eine Grafik ist, die einen runden Abschnitt aufweist, auch wünschenswert, dass die Grafik die strukturierte Anordnung von Anlagerungsspots nicht überlappt. Wenn die Grafik die strukturierte Anordnung von Anlagerungsspots nicht überlappt, ist es leicht, den Grafikabschnitt des Bereichs mit zufällig verteilten Spots zu bestimmen.
Zusätzlich können, wie in den Beispielen der 8-A, B, C, D, E und F dargestellt, als die Form des Bereichs mit zufällig verteilten Spots eine polygonale Form wie z. B. eine dreieckige Form oder eine viereckige Form, eine runde Form, eine elliptische Form oder eine Grafik, die irgendeine Kombination davon enthält, in Erwägung gezogen werden. Insbesondere weist ein Diagramm, das eine Kombination aus mehreren Dreiecken enthält, einen Vorteil auf, dass es leicht ist, zwischen dem strukturierten Bereich und dem zufällig verteilten Bereich zu unterscheiden und es zur Grafikausrichtung zu verwenden.
Zusätzlich kann der Bereich mit zufällig verteilten Spots als eine Markierung aufgrund einer zufälligen Positionsbeziehung von Proben, die an dem Bereich mit zufällig verteilten Spots angelagert sind, verwendet werden. Deshalb ist es wünschenswert, dass mehrere Proben angelagert sind, ohne einander zu überlappen. Deshalb kann die Größe des Bereichs mit zufällig verteilten Spots nicht festgelegt sein, weil sie abhängig von der Größe der Proben variiert. Die Größe des Bereichs mit zufällig verteilten Spots kann irgendein Wert sein, solange mehrere Proben, deren Positionen basierend auf der Form des Gebiets oder Spotpositionen in wenigstens jedem Bereich mit zufällig verteilten Spots voneinander unterschieden werden können, in der Größe angelagert sind können.
In dem Bereich mit strukturierten Spots werden, wenn mehrere Typen von Nukleinsäureproben an einem Anlagerungsspot angelagert sind, fluoreszierende Farbstoffe aus den mehreren Typen von Nukleinsäureproben detektiert, und es tritt fehlerhafte Detektion auf. Deshalb kann, wenn die Größe der Anlagerungsspots übermäßig groß ist, eine fehlerhafte Detektion auftreten. Andererseits nimmt, wenn die Größe der Anlagerungsspots übermäßig klein ist, die Wahrscheinlichkeit eines Kontakts mit Nukleinsäureproben ab, die Anzahl von Anlagerungsspots, an die keine Nukleinsäureprobe angelagert ist, nimmt zu, und der Durchsatz der Analyse nimmt ab. Deshalb ist es unter Berücksichtigung des Durchmessers der strukturierten Anlagerungsspots oder der Anordnung der Anlagerungsspots wünschenswert, dass die Größe oder die Position so bestimmt ist, dass nur eine Nukleinsäureprobe an einen Anlagerungsspot angelagert ist und die Größe des Anlagerungsspots 1/2 oder größer und weniger als das 2-Fache in Bezug auf die Größe einer Probe ist. In diesem Fall kann ein exzellentes Ergebnis erhalten werden. Beispielsweise ist es, wenn die Nukleinsäureprobe eine Größe von 50 nm aufweist, wünschenswert, dass die Größe des Anlagerungsspots 25 nm oder größer und kleiner als 100 nm ist.
Ausführungsform 2
Ein Beispiel für Bilderfassung und ein Ausrichtungsverfahren unter Verwendung des Substrats zur Nukleinsäurenanalyse, das den Bereich mit strukturierten Spots und den Bereich mit zufällig verteilten Spots enthält, wird beschrieben.
Nukleinsäureproben als Analyseobjekte werden in dem Bereich mit strukturierten Spots und dem Bereich mit zufällig verteilten Spots, die in dem Substrat auf der Durchflusszelle angeordnet sind, immobilisiert. Durch eine Verlängerungsreaktion werden Nukleotide, an die fluoreszierende Substanzen angelagert ist, integriert, vier Typen von Fluoreszenzbildern, die vier Typen von DNA-Basen entsprechen, werden durch Bildaufnahme erfasst. In jedem Zyklus der Verlängerung einer Base werden vier Typen von Fluoreszenzbildern als helle Punkte pro Gesichtsfeld beobachtet. 9 stellt ein Beispiel der vier Typen von Fluoreszenzbildern dar. Weiße Kreise repräsentieren die hellen Punkte. Die hellen Punkte können als Spots auf den Fluoreszenzbildern detektiert werden. Die Positionen heller Punkte eines Bilds 905, das durch Kombinieren der Bilder (901, 902, 903 und 904), die den vier Typen A, T, G und C entsprechen, erhalten wird, repräsentieren Positionen, an denen Nukleinsäureproben pro Bild immobilisiert sind.
Zusätzlich variiert die Anzahl von Detektionsgesichtsfeldern, wo Fluoreszenzbilder des Substrats detektiert werden, abhängig von der Größe des Substrats oder der Auflösung des Analysators und kann mehrere hundert betragen. Beispielsweise wird, wenn die Anzahl der Detektionsgesichtsfelder 800 ist, der Objekttisch in jedem Zyklus um 800 Gesichtsfelder zur Bildaufnahme bewegt. Wie in 10 dargestellt kann eine Verschiebung zwischen einem Zyklus N(1001) und einem Zyklus N+1(1002) aufgrund der Bewegung des Objekttischs vorhanden sein. Diese Verschiebung tritt aufgrund verschiedener Faktoren auf, wie z. B. der Steuergenauigkeit des Objekttischantriebs oder der Verzerrung des Substrats, die durch Wärme verursacht wird.
Um Nukleinsäureproben zu analysieren ist es notwendig, die Schritte zum Integrieren von Nukleotiden, an die fluoreszierende Substanzen durch eine Verlängerungsreaktion angelagert sind, und Erfassen von Bildern heller Punkte, um Positionsinformationen für helle Punkte zu erhalten, unter Verwendung des Substrats, wo die Nukleinsäureproben immobilisiert sind, zu wiederholen. Um Nukleinsäuren unter Verwendung mehrerer Bilder zu analysieren, ist es notwendig, die mehreren Bilder genau auszurichten.
Ein Beispiel für das Bildausrichtungsverfahren wird unter Verwendung von 11 beschrieben. Zuerst werden alle Spots auf den Fluoreszenzbildern als helle Punkte detektiert 1101. Als Nächstes wird ein Referenzbild als eine Referenz zum Ausrichten erzeugt 1102. Hier bezieht sich das Referenzbild auf ein Bild von Positionen von Spots als eine Referenz, die zum Ausrichten von Positionskoordinaten von Spots auf Fluoreszenzbildern als helle Punkte verwendet werden. Die Positionen der Spots als helle Punkte des Analyseobjektbilds und des Referenzbilds werden in Bezug auf die Positionen der Spots als helle Punkte des Referenzbilds ausgerichtet 1103.
Das Referenzbild (K1) wird basierend auf dem erfassten tatsächlichen Bild erzeugt. Beispielsweise werden in dem Fall von Nukleinsäurenanalyse vier Bilder heller Punkte basierend auf den Basentypen aus vier Typen von Nukleobasen ATCG pro Gesichtsfeld in jedem Zyklus erfasst. Initial werden vier Bilder in dem ersten Zyklus kombiniert, um das Referenzbild (K1) zu erzeugen. In den vier Bildern, die pro Gesichtsfeld in dem ersten Zyklus erfasst werden, wenn keine Bewegung des Objekttischs vorhanden ist, ist keine Verschiebung, die durch die Bewegung des Objekttischs verursacht sein kann, vorhanden. Deshalb ist es leichter, die Bilder zu überlagern, im Vergleich zu einem Fall, in dem eine Bewegung des Objekttischs vorhanden ist.
Sofern nicht mehrere Proben an Spots auf einem Fluoreszenzbild angelagert sind, überlappen die Spots auf den entsprechenden Fluoreszenzbildern als helle Punkte auf den vier Bildern einander nicht. Deshalb werden die Bilder überlagert, so dass die Spots auf den entsprechenden Fluoreszenzbildern einander nicht überlappen. Beispielsweise wenn die Bilder von 9 die Fluoreszenzbilder (901, 902, 903 und 904) sind, die den vier Typen A, T G und C entsprechen, die in dem ersten Zyklus erfasst wurden, ist das kombinierte Bild 905 das Referenzbild (K1).
Zusätzlich kann, wenn ein spezieller Primer, mit dem alle hellen Punkte durch Bildaufnahme detektiert werden können, verwendet wird, auch ein Fluoreszenzbild, in dem alle hellen Punkte detektiert werden können, als das Referenzbild verwendet werden.
Zusätzlich kann das Referenzbild (K1) durch Kombinieren von Fluoreszenzbildern, die in mehreren Zyklen erfasst werden, erzeugt werden. In diesem Fall sind Abschnitte, an die Proben angelagert sind, helle Punkte, die den Basensequenzen der jeweiligen Proben entsprechen, und die hellen Punkte werden als Spots auf dem Fluoreszenzbild detektiert. Deshalb können, um die Positionen heller Punkte auszurichten, während Drehung, Skalierung und Verschiebung der Bilder wiederholt werden, die Spots auf den jeweiligen Fluoreszenzbildern unter Verwendung eines Verfahrens, das zum Minimieren des Quadrats des Abstands zwischen Spots auf den jeweiligen Fluoreszenzbildern fähig ist, ausgerichtet werden. Wenn dieselben Spots identifiziert werden, kann durch Kombinieren von mehreren Bildern, die in mehreren Zyklen erfasst werden, die Genauigkeit verbessert werden, und fehlerhafte Detektion kann verhindert werden. Sogar wenn mehrere Proben an einem Spot angelagert sind, können die Proben voneinander unterschieden werden. Wenn jedoch die Anzahl von Bildern, die zu verwenden sind, übermäßig groß ist, ist eine lange Zeitspanne erforderlich, um das Ausrichten zu berechnen, und der Durchsatz nimmt ab.
Zusätzlich kann das Referenzbild, das basierend auf den vier Bildern in dem ersten Zyklus erzeugt wird, basierend auf vier Bildern, die in dem nächsten Zyklus erfasst werden, korrigiert werden, oder kann basierend auf Bildern, die in mehreren Zyklen erfasst werden, korrigiert werden. Beispielsweise wird durch Ausrichten von Bildern in dem zweiten Zyklus bis zum zehnten Zyklus und des initialen Referenzbilds (K1) das Referenzbild (K1) korrigiert, um ein Referenzbild (K2) zu erzeugen. Bilder in dem elften Zyklus können unter Verwendung dieses Referenzbilds (K2) ausgerichtet werden.
Zusätzlich kann das Referenzbild korrigiert werden, wenn der Fehler der Bildausrichtung zunimmt, oder in regelmäßigen Zeitabständen. Durch Korrigieren des Referenzbilds kann eine Abweichung des Objekttischantriebs, die durch die Bildaufnahme in mehreren Zyklen oder mehrere Gesichtsfelder verursacht ist, oder eine zeitliche Änderung wie z. B. eine Verzerrung des Substrats, die durch Wärme oder dergleichen verursacht ist, gehandhabt werden.
Ferner werden während der Vorbereitung des Referenzbilds oder des Ausrichtens des Referenzbilds und des Analyseobjektbilds die hellen Punkte des Bereichs mit strukturierten Spots leicht ausgerichtet, weil die Anlagerungsspots regelmäßig angeordnet sind. Andererseits kann, wenn die hellen Punkte fälschlicherweise als eine benachbarte Anordnung erkannt werden, eine Verschiebung auftreten. Andererseits sind die Koordinaten der Positionen der hellen Punkte in dem Bereich mit zufällig verteilten Spots zufällig. Deshalb können die hellen Punkte als Positionsmarkierungen basierend auf einer Positionsbeziehung zwischen den mehreren hellen Punkten verwendet werden und sind zum Ausrichten heller Punkte nützlich. Deshalb kann durch Korrigieren der hellen Punkte in dem Bereich mit zufällig verteilten Spots nach dem Ausrichten der hellen Punkte in dem Bereich mit strukturierten Spots eine Verschiebung vermieden werden. Zusätzlich ist, wenn die hellen Punkte mit dem Ausrichtungsverfahren unter Verwendung der hellen Punkte in dem Bereich mit zufällig verteilten Spots ausgerichtet werden, das Gebiet des Bereichs mit zufällig verteilten Spots gemäß der vorliegenden Erfindung kleiner als dasjenige eines Substrats, das nur zufällig verteilte Spots enthält, und somit kann das Ausrichten innerhalb einer kurzen Zeitspanne ausgeführt werden. Auf diese Weise kann mit dem Substrat, das sowohl den Bereich mit strukturierten Spots als auch den Bereich mit zufällig verteilten Spots enthält, durch Ausführen der Detektion zum Ausrichten unter Verwendung einer Kombination aus überlegenen Eigenschaften des Bereichs mit strukturierten Spots und überlegenen Eigenschaften des Bereich mit zufällig verteilten Spots das Ausrichten leicht ausgeführt werden, und der Durchsatz der Analyse kann verbessert werden. Zusätzlich können durch Bereitstellen beider Gebiete aus dem Bereich mit strukturierten Spots und dem Bereich mit zufällig verteilten Spots die Positionen der Gebiete basierend auf der Anordnung der jeweiligen Gebiete geschätzt werden. Zusätzlich können die Positionen der hellen Punkte auch einfach durch Ausrichten der Positionen der hellen Punkte des Bereichs mit zufällig verteilten Spots identifiziert werden.
Zusätzlich können, wenn die Ausrichtung zwischen Bildern ausgeführt wird, Bilder in Einheiten von Blöcken durch Unterteilen eines Bilds in mehrere Blöcke ausgerichtet werden, um die Ausrichtungsgenauigkeit oder die Geschwindigkeit zu verbessern. Durch Unterteilen des Bereichs, der auszurichten ist, in kleine Blöcke und Ausführen des Ausrichtens in Einheiten von Blöcken wird die Anzahl heller Punkte zum Ausführen der Ausrichtung reduziert, und die Ausrichtungsgeschwindigkeit nimmt zu. In diesem Fall bezieht sich ein Abnehmen der Anzahl heller Punkte auf ein Abnehmen der Anzahl heller Punkte als Markierungen zum Ausrichten, und es kann schwierig sein, die Blockeinheiten zu identifizieren. Die Positionen der Blockeinheiten können basierend auf den Positionsinformationen heller Punkte umgebender Blöcke identifiziert werden. In diesem Fall ist es wünschenswert, dass wenigstens ein Bereich mit strukturierten Spots und wenigstens ein Bereich mit zufällig verteilten Spots in jedem der Blöcke vorhanden ist. Wenn jedoch jede der Blockpositionen basierend auf einer Positionsbeziehung umgebender Blöcke unterschieden werden kann, kann ein Block, der keinen Bereich mit zufällig verteilten Spots enthält, vorhanden sein.
Die Anzahl von Blöcken, die aus einem Bild aufgeteilt werden, ist nicht begrenzt. Beispielsweise wenn die Bereiche mit zufällig verteilten Spots die gleiche Positionsbeziehung periodisch auf dem Substrat aufweisen, ist es wünschenswert, dass die Größe von Einheitsblöcken größer ist als die Größe der Bildverschiebung, die während der Beobachtung auftritt.
Wenn die Größe von Einheitsblöcken größer ist als die Größe der Bildverschiebung, kann durch Durchsuchen von Blöcken, die in der Nähe eines Zielblocks, der auszurichten ist, in Übereinstimmung gebracht werden können, die Position des Zielblocks identifiziert werden. Wenn andererseits die Größe der Einheitsblöcke kleiner ist als die Größe der Bildverschiebung, ist es notwendig, die Anzahl von Blöcken, die zu durchsuchen sind, gemäß der Größe der Bildverschiebung zu erhöhen.
Zusätzlich variiert in einem Bild, das durch Bildaufnahme erfasst ist, die Aberration zwischen der Mitte des Bildschirms und vier Ecken des Bildschirms. Deshalb variiert, wenn Bildausrichtung ausgeführt, die Größe der Verschiebung ebenfalls. Deshalb nimmt die Ausrichtungsgenauigkeit zu, wenn die Anzahl von Bereichen mit zufällig verteilten Spots zunimmt. Durch zufälliges Anordnen von Bereichen mit zufällig verteilten Spots auf dem Substrat kann nicht nur den Positionen der hellen Punkte zufällig verteilter Spots, sondern auch einer Anordnungsstruktur Bereiche mit zufällig verteilten Spots Eindeutigkeit verliehen werden, was ebenfalls zum Ausrichten in einer bekannten Anordnung beitragen kann.
Wenn die Größe von Einheitsblöcken größer ist als die Größe der Bildverschiebung, die während der Beobachtung auftritt, wird ein Beispiel der Anordnungsstruktur der Bereiche mit zufällig verteilten Spots und der aufgeteilten Blöcke nachstehend beschrieben. Beispielsweise stellt 12 einen Fall dar, in dem ein Bild in 64 Blöcke unterteilt ist unter der Annahme, dass die Größe eines Bilds etwa 1 mm² ist und die Größe der Bildverschiebung innerhalb von etwa 0,1 mm ist. 12 stellt ein Bild dar, das in 64 Blöcke unterteilt ist. Zur Vereinfachung der Beschreibung sind den jeweiligen Einheitsblöcken die Zahlen 1 bis 64 zugewiesen, die Zahlen können jedoch entfernt werden. Die jeweiligen Blöcke sind so angeordnet, dass die Anordnungen der Bereiche mit zufällig verteilten Spots in wenigstens den Blöcken, die einander benachbart sind, unterschiedlich sind. Zusätzlich müssen, um das Substrat einfach zu konstruieren oder herzustellen, beispielsweise die Anordnungen der Bereiche mit zufällig verteilten Spots in allen 64 Blöcken nicht voneinander verschieden sein, und die gleiche Anordnung kann für jeweils vier Einheitsblöcke verwendet sein. 13 ist eine vergrößerte Ansicht, die die Blöcke 1, 2, 9 und 10 von 12 als ein Beispiel für die vier Einheitsblöcke darstellt. Die vier Einheitsblöcke weisen unterschiedliche Anordnungen der Bereiche mit zufällig verteilten Spots auf. Durch Anordnen von 16 Blockeinheiten für jeden der vier Einheitsblöcke können insgesamt 64 Blöcke angeordnet werden. Mit diesem Anordnungsverfahren können Effekte zur einfachen Herstellung des Substrats und Reduzieren der Kosten erhalten werden.
Zusätzlich wird ein Beispiel für weiteres Unterteilen der vorstehend beschriebenen Einheitsblöcke in kleinere Blöcke unter Verwendung von 14 beschrieben. In 14 ist durch Erhöhen der Typen und der Anzahl der Bereiche mit zufällig verteilten Spots die Eindeutigkeit der Blockeinheiten verbessert. 14 stellt ein Beispiel dar, in dem ein Bild in 64 Blöcke unterteilt ist, und jeder der 64 Blöcke weiter in 16 Blöcke unterteilt ist. 4/64 Blöcke eines Bilds sind dargestellt. Um die Positionen der Blöcke basierend auf den Anordnungen der umgebenden Bereiche mit zufällig verteilten Spots zu identifizieren, ist es vorzuziehen, dass wenigstens ein Bereich mit zufällig verteilten Spots in jedem der unterteilten Blöcke angeordnet ist. Zusätzlich kann, wenn die Blockpositionen in der Anordnung des Bereichs mit zufällig verteilten Spots basierend auf den Anordnungen der umgebenden Bereiche mit zufällig verteilten Spots identifiziert werden können, ein Block, der keinen Bereich mit zufällig verteilten Spots aufweist, unter den aufgeteilten Blöcken vorhanden sein.
Die 12, 13 und 14 stellen nur den Bereich mit zufällig verteilten Spots dar, ohne den Bereich mit strukturierten Spots darzustellen.
Ausführungsform 3
15 stellt ein Beispiel des Bildausrichtungsverfahrens dar.
Das Referenzbild wird basierend auf den Substrat-Designinformationen 1501 erzeugt. Beispielsweise kann das Referenzbild durch Simulation oder dergleichen erzeugt werden. Hier bezieht sich das Referenzbild auf ein Bild von Positionen von Spots als eine Referenz, die zum Ausrichten von Positionskoordinaten von Spots auf Fluoreszenzbildern als helle Punkte verwendet werden. Wenn nur Spotpositionsinformationen kombiniert werden, muss das Bild nicht erzeugt werden. Das Referenzbild kann im Voraus erzeugt werden, abhängig von dem zu verwendenden Substrat. Das im Voraus erzeugte Referenzbild kann aus einem Speichermedium gelesen werden, abhängig von dem zu verwendenden Substrat. Das initiale Referenzbild, das basierend auf den Substrat-Designinformationen erzeugt ist, zeigt die Positionen der Anlagerungsspots in dem Bereich mit strukturierten Spots. Abhängig von den Verwendungsbedingungen kann das initiale Referenzbild ein Gebiet des Bereichs mit strukturierten Spots oder Gebietsinformationen des Bereichs mit zufällig verteilten Spots enthalten. Als Nächstes werden die hellen Punkte auf dem Substrat detektiert 1502. Die hellen Punkte auf dem Substrat werden als Spots auf dem Fluoreszenzbild detektiert. Als Nächstes werden die Positionen der strukturierten Spots in dem Analyseobjektbild in Bezug auf die Positionen der Spots in dem Bereich mit strukturierten Spots des Referenzbilds ausgerichtet 1503. Das Ausrichten des Bereichs mit strukturierten Spots weist einen Vorteil auf, dass das Referenzbild, dessen Positionsinformationen bereits bekannt sind, vorhanden ist. Deshalb kann Ausrichten mit hohem Durchsatz implementiert werden. Beim Ausrichten der Bereiche mit strukturierten Spots werden jedoch die Spots periodisch ausgerichtet. Deshalb kann eine benachbarte Spotanordnung fälschlicherweise erkannt werden. Deshalb wird die Bildausrichtung unter Verwendung der Spots auf dem Fluoreszenzbild als die hellen Punkte des Bereichs mit zufällig verteilten Spots, das heißt unter Verwendung der zufällig verteilten Spots, korrigiert 1504. In Bezug auf die zufällig verteilten Spots ist der Abstand zwischen benachbarten Spots ungleichmäßig. Deshalb ist es einfacher, die Positionen aller zufällig verteilten Spots als in dem Bereich mit strukturierten Spots zu bestimmen. Die Positionsinformationen der hellen Punkte des Bereichs mit zufällig verteilten Spots sind nicht in dem Referenzbild der Positionsinformationen des Bereichs mit strukturierten Spots, das basierend auf den Substrat-Designinformationen erzeugt ist, enthalten. Deshalb wird das Referenzbild unter Verwendung der Informationen über die hellen Punkte, die in jedem Zyklus erfasst werden, korrigiert.
Ausführungsform 4
Ein weiteres Beispiel, das von Ausführungsform 1 verschieden ist und das ein Substrat zur Nukleinsäurenanalyse betrifft, das den Bereich mit strukturierten Spots und den Bereich mit zufällig verteilten Spots, an die Nukleinsäuren angelagert sind, auf der Oberfläche des Substrats enthält, wird mit Bezug auf 16 beschrieben.
16 ist eine vergrößerte Ansicht, die einen Teil des Substrats darstellt. Auf dem Substrat sind Bereich mit strukturierten Spots 1601 als ein Gebiet, in dem Nukleinsäurenanlagerungsspots mit einer gewissen Regelmäßigkeit geordnet sind, und ein Bereich mit zufällig verteilten Spots 1602, in dem Anlagerungsspots, an die Nukleinsäuren angelagert sind, unregelmäßig angeordnet sind, vorhanden. Der Bereich mit zufällig verteilten Spots 1602 enthält Anlagerungsspots 1603, die in dem Bereich mit zufällig verteilten Spots unregelmäßig angeordnet sind. Jeder der Anlagerungsspots ist aus einer Beschichtungsschicht, die eine Aminogruppe aufweist, gebildet, und eine Nukleinsäure kann daran angelagert sind. Die Oberfläche eines Gebiets, in dem keine Nukleinsäure angelagert ist, ist mit hydrophobem HMDS beschichtet. In dem Bereich mit strukturierten Spots sind Nukleinsäuren an geordnete runde Abschnitte angelagert. In dem Bereich mit zufällig verteilten Spots sind auf ähnliche Weise Nukleinsäuren an runde Abschnitten angelagert. In der Nähe des runden Abschnitts ist keine Nukleinsäure angelagert, und die Oberfläche des runden Abschnitts ist mit hydrophobem HMDS beschichtet. Die Anlagerungsspots in dem Bereich mit zufällig verteilten Spots werden während der Vorbereitung der Fotomaske 304, die in dem vorstehend beschriebenen Beispiel des Verfahrens zum Vorbereiten des Substrats zur Nukleinsäurenanalyse beschrieben ist, angeordnet. Die Anordnung der Anlagerungsspots in dem Bereich mit zufällig verteilten Spots ist eine Anordnung, in der die Spots nicht in Kontakt miteinander sind, und ist von derjenigen eines umgebenden Bereichs mit strukturierten Spots verschieden. Die Anordnung, in der die Anlagerungsspots unregelmäßig angeordnet sind, repräsentiert, dass die Anordnung von der regelmäßigen Anordnung des umgebenden Bereichs mit strukturierten Spots verschieden ist, und repräsentiert, dass die Anordnung von der Anordnung der umgebenden strukturierten Anlagerungsspots verschieden ist, wenn ein Anlagerungsspot oder mehrere Anlagerungsspots mit den umgebenden strukturierten Anlagerungsspots verglichen werden. Zusätzlich können, obwohl sie von der Anzahl oder der Dichte der Anlagerungsspots, die anzuordnen sind, abhängen, die jeweiligen Spotpositionen basierend auf den Spotpositionen auf dem Fluoreszenzbild in dem Bereich mit zufällig verteilten Spots und den Spotpositionen in dem Bereich mit zufällig verteilten Spots oder basierend auf den Spotpositionen in dem Bereich mit zufällig verteilten Spots und den Spotpositionen in dem Bereich mit strukturierten Spots identifiziert werden. 16-(A) stellt ein Beispiel dar, in dem die Anlagerungsspots allein zufällig in dem Bereich mit zufällig verteilten Spots angeordnet sind. 16-(B) stellt ein Beispiel dar, in dem Aggregate der Anlagerungsspots, die eine Positionsbeziehung aufweisen, die von derjenigen der Anlagerungsspots in dem Bereich mit strukturierten Spots verschieden sind, zufällig angeordnet sind. 16-(B) stellt das Beispiel dar, in dem mehrere Aggregate aus vier Anlagerungsspots angeordnet sind. Die Aggregate der Anlagerungsspots können irgendeine Anzahl oder irgendeine Anordnung einsetzen, können jedoch wünschenswerterweise von wenigstens dem Bereich mit strukturierten Spots unterschieden werden, damit sie als Positionsmarkierungen verwendet werden können.
Ausführungsform 5
17 stellt ein Ausrichtungsverfahren dar, das sich auf Bilder bezieht, wenn das Substrat gemäß Beispiel 4 verwendet wird.
Ein Referenzbild von Positionsinformationen jedes Spotbereichs wird basierend auf den Substrat-Designinformationen erzeugt 1701. Beispielsweise kann das Referenzbild durch Simulation oder dergleichen erzeugt werden. Hier bezieht sich das Referenzbild auf ein Bild von Positionen von Spots als eine Referenz, die zum Ausrichten von Positionskoordinaten von Spots auf Fluoreszenzbildern als helle Punkte verwendet werden. Wenn nur mit Spotpositionsinformationen ausgerichtet wird, muss das Bild nicht erzeugt werden. Das Referenzbild kann im Voraus erzeugt werden, abhängig von dem zu verwendenden Substrat. Das im Voraus erzeugte Referenzbild kann aus einem Speichermedium gelesen werden, abhängig von dem zu verwendenden Substrat. Das initiale Referenzbild, das basierend auf den Substrat-Designinformationen erzeugt wird, wird basierend auf den Positionen der Anlagerungsspots in dem Bereich mit strukturierten Spots und den Positionen der Anlagerungsspots in dem Bereich mit zufällig verteilten Spots erzeugt. Um die erfassten Bilder auszurichten, kann das initiale Referenzbild ein Gebiet des Bereichs mit strukturierten Spots oder Gebietsinformationen des Bereichs mit zufällig verteilten Spots enthalten. Als Nächstes werden die hellen Punkte auf dem Substrat detektiert 1702. Die hellen Punkte auf dem Substrat werden als Spots auf dem Fluoreszenzbild detektiert. Als Nächstes werden die Positionen der Spots in dem Bereich mit zufällig verteilten Spots des Referenzbilds und die Positionen der Spots in dem Bereich mit zufällig verteilten Spots des Analyseobjektbilds ausgerichtet 1703. Das Ausrichten des Bereichs mit zufällig verteilten Spots weist dadurch einen Vorteil auf, dass das Referenzbild, dessen Positionsinformationen bereits bekannt sind, vorhanden sind, und der Bereich, der auszurichten ist, klein ist. Deshalb kann Ausrichten mit hohem Durchsatz implementiert werden. Zusätzlich ist in Bezug auf die zufällig verteilten Spots der Abstand zwischen benachbarten Spots ungleichmäßig. Deshalb ist es einfacher, die Positionen aller zufällig verteilten Spots als in dem Bereich mit strukturierten Spots zu bestimmen. Als Nächstes werden die Spots des Bereichs mit strukturierten Spots und die strukturierten Spots des Analyseobjektbilds ausgerichtet 1704. Da das Ausrichten des Bereichs mit zufällig verteilten Spots ausgeführt ist, ist ein vorteilhafter Effekt dadurch vorhanden, dass die Spots des Bereichs mit strukturierten Spots leicht ausgerichtet werden können.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die vorstehend beschriebene Ausführungsform beschränkt und enthält verschiedene Modifikationsbeispiele. Beispielsweise sind die Ausführungsformen genau beschrieben worden, um die vorliegende Erfindung zu verstehen, und die vorliegende Erfindung muss nicht notwendigerweise alle vorstehend beschriebenen Konfigurationen enthalten. Zusätzlich kann Hinzufügen, Löschen und Ersetzen einer weiteren Konfiguration für einen Teil der Konfiguration jeder der Ausführungsformen vorgenommen werden.
Bezugszeichenliste

100:: Nukleinsäureanalysator
101:: zweidimensionaler Sensor
102:: Bildaufnahmelinse
103:: Bandpassfilter
104:: Anregungsfilter
105:: dichroitischer Spiegel
106:: Filterwürfel
107:: Lichtquelle
108:: Objektivlinse
109:: Durchflusszelle
110:: Kondensorlinse
111:: Düse
112:: Rohr
113:: Reagensbehälter
114:: Reagensvorratseinheit
115:: Rohr
116:: Abfalllösungsbehälter
117:: Objekttisch
118:: Temperatursteuersubstrat
119:: Computer
120:: dichroitischer Spiegel
200:: Nukleinsäureanalysator
301:: Oxidschicht
302:: Siliziumwafer
303:: HMDS
304:: Fotomaske
305:: Schutzschicht
306:: Aminosilan
401:: Glasplatte
402:: Zwischenmaterial
403:: Substrat
501:: montierte Durchflusszelle
502:: Reagensreaktion: Verlängerung einer Base
503:: Bildaufnahme
504:: Reagensreaktion: Fluoreszenzentfernung
505:: Reagensreaktion: Verlängerung einer Base
506:: Bildaufnahme
601:: Basensequenz eines DNA-Fragments
701:: Bereich mit strukturierten Spots
702:: Bereich mit zufällig verteilten Spots
901:: Bild, das aus fluoreszierendem Nukleotid, das A (Adenin) entspricht, emittiert wird
902:: Bild, das aus fluoreszierendem Nukleotid, das T (Thymin) entspricht, emittiert wird
903:: Bild, das aus fluoreszierendem Nukleotid, das G (Guanin) entspricht, emittiert wird
904:: Bild, das aus fluoreszierendem Nukleotid, das C (Cytosin) entspricht, emittiert wird
905:: Bild, das durch Überlagerung von 901 bis 904 erhalten wird
1001:: Objekttischposition in Zyklus N
1002:: Verschiebung verursacht durch Objekttischbewegung in Zyklus N+1
1101:: helle Punkte der Spots detektieren
1102:: Referenzbild erzeugen
1103:: Positionen heller Punkte des Analyseobjektbilds und des Referenzbilds ausrichten
1501:: Referenzbild basierend auf Substrat-Designinformationen erzeugen
1502:: helle Punkte auf dem Substrat detektieren
1503:: Positionen der strukturierten Spots des Referenzbilds und strukturierten Spots des Analyseobjektbilds ausrichten
1504:: Bildausrichtung unter Verwendung zufällig verteilter Spots korrigieren
1601:: Bereich mit strukturierten Spots
1602:: Bereich mit zufällig verteilten Spots
1603:: Anlagerungsspot
1701:: Referenzbild basierend auf Substrat-Designinformationen erzeugen
1702:: helle Punkte auf dem Substrat detektieren
1703:: Positionen zufällig verteilter Spots des Referenzbilds und Positionen zufällig verteilter Spots des Analyseobjektbilds ausrichten
1704:: Positionen der strukturierten Spots des Referenzbilds und strukturierten Spots des Analyseobjektbilds ausrichten

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

US 2009/0270273 A [0004]
US 8774494 B [0004]

Claims

Substrat zur Nukleinsäurenanalyse, das Folgendes umfasst: ein Substrat; und einen Bereich mit strukturierten Spots und einen Bereich mit zufällig verteilten Spots, die auf einer Oberfläche des Substrats vorgesehen sind und an die ein Biopolymer angelagert ist.
Substrat zur Nukleinsäurenanalyse nach Anspruch 1, wobei der Bereich mit zufällig verteilten Spots mit einem grafischen Gebiet konfiguriert ist, und mehrere Proben in dem Bereich mit zufällig verteilten Spots zufällig angeordnet sind.
Substrat zur Nukleinsäurenanalyse nach Anspruch 1, wobei in dem Bereich mit zufällig verteilten Spots Spots, an die eine Probe angelagert ist, regelmäßig angeordnet sind.
Substrat zur Nukleinsäurenanalyse nach Anspruch 2, wobei das grafische Gebiet des Bereichs mit zufällig verteilten Spots aus einer Beschichtungsschicht, an die eine Probe angelagert sind kann, gebildet ist.
Substrat zur Nukleinsäurenanalyse nach Anspruch 2, wobei Spots, an die eine Probe angelagert ist, in dem grafischen Bereich des Bereichs mit zufällig verteilten Spots unregelmäßig angeordnet sind.
Substrat zur Nukleinsäurenanalyse nach Anspruch 3, wobei der Bereich mit strukturierten Spots eine strukturierte Anordnung aufweist, wo Spots, an die eine Probe angelagert ist, in einer hexagonalen Gitterstruktur angeordnet sind.
Substrat zur Nukleinsäurenanalyse nach Anspruch 2, wobei das grafische Gebiet des Bereichs mit zufällig verteilten Spots so angeordnet ist, dass es die strukturierten Spots nicht überlagert.
Durchflusszelle zur Nukleinsäurenanalyse, die Folgendes umfasst: ein Substrat, das einen Bereich mit strukturierten Spots und einen Bereich mit zufällig verteilten Spots enthält, die auf einer Oberfläche des Substrats vorgesehen sind und an die ein Biopolymer angelagert ist; ein Glaselement, das eine Oberseite des Substrats bedeckt; und eine Platte als ein Zwischenmaterial, das einen Fließweg bildet.
Analyseverfahren für ein Substrat, das einen Bereich mit strukturierten Spots und einen Bereich mit zufällig verteilten Spots, die auf einer Oberfläche des Substrats vorgesehen sind und an die ein Biopolymer angelagert ist, enthält, wobei das Analyseverfahren umfasst: Identifizieren der Positionen heller Punkte auf dem Substrat unter Verwendung Licht emittierender heller Punkte des Bereichs mit strukturierten Spots und Licht emittierender heller Punkte des Bereichs mit zufällig verteilten Spots auf der Oberfläche des Substrats.
Analyseverfahren nach Anspruch 9, das die folgenden Schritte umfasst: Erzeugen eines Referenzbilds, um Bildausrichtung unter Verwendung des Referenzbilds und von Bildern heller Punkte des Bereichs mit strukturierten Spots auszuführen; und Korrigieren der Bildausrichtung unter Verwendung heller Punkte des Bereichs mit zufällig verteilten Spots.
Analyseverfahren nach Anspruch 9, das Folgendes umfasst: einen Schritt zum Erzeugen des Referenzbilds unter Verwendung von vier Bildern heller Punkte basierend auf Nukleobasentypen; und einen Schritt zum Korrigieren des Referenzbilds unter Verwendung mehrerer Bilder.
Analyseverfahren nach Anspruch 9, das einen Schritt zum Erzeugen des Referenzbilds unter Verwendung von Positionsinformationen jedes Spots, an den eine Probe angelagert sind soll, während der Vorbereitung des Substrats umfasst.
Analyseverfahren nach Anspruch 9, das einen Schritt zum Ausrichten des Referenzbilds und eines Analyseobjektbilds unter Verwendung eines numerischen Werts, mit dem ein Quadrat eines Abstands zwischen hellen Punkten auf jedem aus dem Analyseobjektbild und Spots, die dem Referenzbild entsprechen, das Minimum ist, umfasst.
Analyseverfahren nach Anspruch 9, das einen Schritt zum Unterteilen eines Bilds in mehrere Blöcke, so dass wenigstens ein Bereich mit strukturierten Spots und wenigstens ein Bereich mit zufällig verteilten Spots vorhanden sind, umfasst.