DE112014007175B4 - Substrat zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure, Durchflusszelle zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure und Nucleinsäure-Analysenvorrichtung - Google Patents

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Abstract

Nucleinsäure-Analysenvorrichtung, umfassend:eine Durchflusszelle zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure, die ein Substrat zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure aufweist;wobei das Substrat zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure eine Mehrzahl von auf einem Substrat verteilten Analysenfeldern zur Durchführung einer Messung durch sequenzielles Wechseln der einzelnen Analysenfelder aufweist,wobei das Analysenfeld einen Absorptionsbereich, der zur Absorption eines DNA-Fragments oder eines Vektors, der das DNA-Fragment trägt, befähigt ist und einen Nichtabsorptionsbereich, der sich vom Absorptionsbereich unterscheidet, aufweist, undwobei mindestens ein Teil des Nichtabsorptionsbereichs mit einem Markerbereich mit einer vorbestimmten Gestalt zur Berechnung einer Position des Analysenfelds versehen ist;eine Zirkulationseinrichtung, in der eine Flüssigkeit in einer Durchflusspassage der Durchflusszelle zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure zirkuliert;eine Temperatursteuereinrichtung, die die Reaktionstemperatur des DNA-Fragments steuert;eine Bestrahlungseinrichtung, die einen Strahl von Anregungslicht auf ein Analysenfeld, das als Analysenziel dient, durch die lichtdurchlässige Abdeckung richtet;eine Erfassungseinrichtung, die die vom DNA-Fragment aufgrund der Bestrahlung mit dem Anregungslicht unter Verwendung der lichtdurchlässigen Abdeckung emittierte Fluoreszenz erfasst und eine Position des Markerbereichs im Analysenfeld aufgrund der festgestellten Fluoreszenz erfasst; undeine Transporteinrichtung, die die Durchflusszelle zur Analyse einer Nucleinsäure trägt und das Analysenfeld durch Transport der Durchflusszelle auf eine bestimmte Position in Bezug zum Markerbereich verschiebt.

Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Substrat zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure, eine Durchflusszelle zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure und eine Nucleinsäure-Analysenvorrichtung.
  • Stand der Technik
  • In den letzten Jahren wurde ein Verfahren zur Analyse von Basensequenzen einer Nucleinsäure entwickelt, bei dem gleichzeitig Basensequenzen von mehreren DNA-Fragmenten analysiert werden. Bei diesem Verfahren sind ein Absorptionsbereich, der zur Absorption von DNA-Fragmenten oder dergleichen befähigt ist, und ein Nichtabsorptionsbereich, der nicht zur Absorption des DNA-Fragments befähigt ist, auf einem Substrat beispielsweise durch Fotolithographie oder eine Ätztechnik ausgebildet. Anschließend werden DNA-Fragmente oder dergleichen, die ein Analysenziel darstellen, im Absorptionsbereich zur Durchführung der Analyse absorbiert (vergleiche beispielsweise PTL 1).
  • Beim vorstehend beschriebenen Analysenverfahren wird ein Strahl eines Anregungslichts auf das Analysenfeld, das mehrere DNA-Fragmente aufweist, gerichtet, wobei in diesen Bereich fluorochrommarkierte Matrices entsprechend den Basen eingeführt sind. Die von den einzelnen DNA-Fragmenten emittierte Fluoreszenz wird zur Bestimmung der Basen erfasst (vergleiche beispielsweise NPL 1).
  • Bei diesem Analysenverfahren wird typischerweise eine Mehrzahl von Analysenfeldern auf einem einzelnen Substrat bereitgestellt und die Analyse wird für die gesamten Analysenfelder durchgeführt, indem man das Analysenfeld jedes Mal ändert, wenn die Bestrahlung durchgeführt wird. Anschließend wird eine neue fluorochrommarkierte Matrix auf der Grundlage einer Polymerase-Erweiterungsreaktion eingeführt und die einzelnen Analysenfelder werden gemäß der vorerwähnten Vorgehensweise analysiert. Durch Wiederholung dieses Verfahrens ist es möglich, in wirksamer Weise die Basensequenz zu bestimmen.
  • Literaturverzeichnis
  • Patentliteratur
  • PTL 1: US 2009/0270273 A1
  • NPL 1: Science, 2005, Bd. 309, S. 1728-1732
  • Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
  • Technisches Problem
  • Wenn jedoch beim vorstehend beschriebenen Verfahren das gleiche Analysenfeld wiederholt analysiert wird, kann bei jedem Messzyklus eine Positionsabweichung im Analysenfeld auftreten. Diese Positionsabweichung erschwert es, die DNA-Fragmente bei jedem Messzyklus zu kartieren, so dass es schwierig ist, die richtige Basensequenz zu erhalten.
  • Angesichts der vorerwähnten Schwierigkeiten werden erfindungsgemäß ein Substrat zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure, eine Durchflusszelle zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure, wobei die Zelle mit diesem Substrat zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure versehen ist, sowie eine Nucleinsäure-Analysenvorrichtung bereitgestellt, die dazu befähigt sind, in reproduzierbarer Weise eine Position des Analysenfelds zu erhalten, selbst wenn die Positionierung wiederholt für das gleiche Analysenfeld vorgenommen wird.
  • Lösung der Aufgabe
  • Erfindungsgemäß wird zur Lösung dieser Aufgabe ein Substrat zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure mit einer Mehrzahl von auf einem Substrat verteilten Analysenfeldern zur Messdurchführung durch sequenzielles Austauschen der einzelnen Analysenfelder bereitgestellt,
    wobei das Analysenfeld einen Absorptionsbereich aufweist, der zur Absorption eines DNA-Fragments oder eines Vektors, der das DNA-Fragment trägt, befähigt ist, sowie einen Nichtabsorptionsbereich aufweist, der sich vom absorbierenden Bereich unterscheidet, und
    einen Markerbereich mit einer vorbestimmten Gestalt zur Berechnung einer Position des Analysenfelds in mindestens einem Teil des Nichtabsorptionsbereichs vorgesehen ist.
  • Gegenstand der Erfindung ist ferner eine Durchflusszelle zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure, die Folgendes umfasst:
    • das Substrat zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure;
    • eine lichtdurchlässige Abdeckung, die dem Substrat zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure zugewandt ist und Licht durchlässt;
    • eine Mehrzahl von Abstandshaltern, die zwischen dem Substrat zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure und der lichtdurchlässigen Abdeckung vorgesehen sind und im Wesentlichen parallel im Abstand voneinander angeordnet sind;
    • eine Durchflusspassage, die in einem Bereich im Zwischenraum von benachbarten Abstandshaltern zwischen dem Substrat zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure und der lichtdurchlässigen Abdeckung angeordnet ist und in der eine Flüssigkeit zirkuliert;
    • eine Einlassöffnung an einem Ende der Durchflusspassage, in die die Flüssigkeit eingespritzt wird; und
    • eine Auslassöffnung an dem der Einlassöffnung gegenüberliegenden Ende der Durchflusspassage, aus der die Flüssigkeit ausgetragen wird.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Nucleinsäure-Analysenvorrichtung, die Folgendes umfasst:
    • die Durchflusszelle zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure;
    • eine Zirkulationseinrichtung, in der eine Flüssigkeit in einer Durchflusspassage der Durchflusszelle zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure zirkuliert;
    • eine Temperatursteuereinrichtung, die die Reaktionstemperatur des DNA-Fragments steuert;
    • eine Bestrahlungseinrichtung, die einen Strahl von Anregungslicht auf ein Analysenfeld, das als Analysenziel dient, durch die lichtdurchlässige Abdeckung richtet;
    • eine Erfassungseinrichtung, die die von einem DNA-Fragment durch Bestrahlung mit dem Anregungslicht unter Verwendung der lichtdurchlässigen Abdeckung emittierte Fluoreszenz erfasst und eine Position des Markerbereichs im Analysenfeld aufgrund der festgestellten Fluoreszenz erfasst; und
    • eine Transporteinrichtung, die die Durchflusszelle zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure transportiert und den Analysenbereich an eine vorbestimmte Position in Bezug zur Markerposition verschiebt.
  • Dabei bezieht sich eine „vorbestimmte Gestalt“ auf eine vorher festgelegte Gestalt (zum Beispiel eine Kreuzform), die aus dem Grundriss ersichtlich ist und die zur Festlegung einer Position im Innern des Analysenfelds verwendet wird. Ferner bezieht sich der Ausdruck „eine vorgegebene Position“ auf eine vorher festgelegte Position, in die das Analysenfeld als Analysenziel verschoben wird. Ferner umfasst der hier verwendete Ausdruck „eine Mehrzahl von Abstandshaltern“ nicht nur einen Abstandshalter, der aus einer Mehrzahl von Bestandteilen zusammengesetzt ist, sondern auch einen Abstandshalter, der aus einem einzigen Element zusammengesetzt ist, zum Beispiel aus einer durch einen Stanzvorgang hergestellten Platte mit Hohlräumen, wobei auch eine Mehrzahl von derartigen Platten in Frage kommt.
  • Vorteilhafte Wirkungen der Erfindung
  • Erfindungsgemäß ist es möglich, ein Substrat zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure, eine Durchflusszelle zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure mit diesem Substrat sowie eine Nucleinsäure-Analysenvorrichtung bereitzustellen, mit denen in reproduzierbarer Weise eine Position des Analysenfelds erhalten wird, selbst wenn die Positionierung in wiederholter Weise für das gleiche Analysenfeld vorgenommen wird.
  • Figurenliste
    • [1] 1 ist ein schematischer Grundriss, der ein Substrat zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure gemäß einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt.
    • [2] 2 ist ein schematischer Grundriss, der ein Substrat zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure gemäß einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt.
    • [3] 3(a) ist ein schematischer Grundriss, der ein Substrat zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure gemäß einer dritten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt; und 3(b) ist eine schematische Darstellung einer beispielhaften Fluoreszenzabbildung.
    • [4] 4 ist ein schematischer Grundriss, der ein Substrat zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure gemäß einer vierten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt, wobei ein einzelnes Analysenfeld vergrößert dargestellt ist.
    • [5] 5 (a) bis 5 (c) sind schematische Darstellungen, die einen Zustand zeigen, bei dem das vom Substrat zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure gemäß 4 verzerrt ist. 5 (a) zeigt einen deformierten Zustand der Fluoreszenzabbildung. 5 (b) zeigt einen rotierten Zustand der Fluoreszenzabbildung und 5 (c) zeigt einen weiteren rotierten Zustand der Fluoreszenzabbildung.
    • [6] 6 (a) bis 6 (f) zeigen in schematischer Weise ein Verfahren zur Herstellung des Substrats zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure gemäß 1. 6 (a) zeigt einen Zustand vor der Bildung einer hydrophilen Membran. 6 (b) zeigt den Zustand nach Bildung der hydrophilen Membran. 6 (c) zeigt den Zustand nach Bildung eines Resistfilms. 6 (d) zeigt den Zustand nach der Entwicklung. 6 (e) zeigt den Zustand nach dem Ätzen. 6 (f) zeigt den Zustand nach Entfernung des Resistfilms.
    • [7] 7 zeigt eine schematische perspektivische Darstellung einer beispielhaften Durchflusszelle zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die lichtdurchlässige Abdeckung teilweise weggelassen ist.
    • [8] 8 zeigt in schematischer Weise eine beispielhafte Nucleinsäure-Analysenvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung.
    • [9] 9 ist ein Ablaufdiagramm zur Erläuterung des Steuerungsvorgangs der Nucleinsäure-Analysenvorrichtung von 8.
    • [10] 10 (a) bis 10 (c) zeigen in schematischer Weise ein beispielhaftes Analysenverfahren unter Verwendung der erfindungsgemäßen Nucleinsäure-Analysenvorrichtung. 10 (a) zeigt die Positionsbeziehung des Markerbereichs in der fluoreszierenden Abbildung vor der Bewegung. 10 (b) zeigt die Positionsbeziehung zwischen dem Zielpositionsbereich und dem Markerbereich vor der Bewegung. 10 (c) zeigt die Positionsbeziehung zwischen dem Zielpositionsbereich und dem Markerbereich nach der Bewegung.
    • [11] 11 zeigt in schematischer Weise eine beispielhafte Fluoreszenzabbildung unter Verwendung des Substrats zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure gemäß 1.
  • Beschreibung der Ausführungsformen
  • Substrat zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure
  • Ein Substrat zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung weist eine Mehrzahl von auf einem Substrat verteilten Analysenfeldern auf, so dass die Messung durch sequenzielles Verändern der einzelnen Analysenfelder durchgeführt wird. Das Analysenfeld umfasst einen Absorptionsbereich, der zur Absorption eines DNA-Fragments oder eines Vektors, der das DNA-Fragment trägt (nachstehend werden das DNA-Fragment und der Vektor zusammen als „Analysenprobe“ bezeichnet), befähigt ist, und einen Nichtabsorptionsbereich, der sich vom Absorptionsbereich unterscheidet. Der Nichtabsorptionsbereich weist einen Markerbereich mit einer vorbestimmten Gestalt auf, um eine Position des Analysenfelds in mindestens einem Teil davon zu erhalten.
  • Substrate zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure gemäß der ersten bis vierten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden nachstehend unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben. Die vorliegende Erfindung ist aber nicht auf die erste bis vierte Ausführungsform und die entsprechenden Zeichnungen beschränkt.
  • Erste Ausführungsform
  • 1 zeigt in schematischer Weise, das Substrat zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure gemäß der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Wie in 1 dargestellt, umfasst das Substrat 100 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure gemäß dieser Ausführungsform im Wesentlichen folgende Bestandteile: ein Substrat 10, ein Reaktionsfeld 11, ein Analysenfeld 12, einen Absorptionsbereich 13 und einen Nichtabsorptionsbereich 14. In 1 sind das Reaktionsfeld 11, der Analysenbereich 12 und ein Magerbereich 15 (nachstehend beschrieben) auf dem Substrat 10 in hierarchischer Weise vergrößert darstellt.
  • Beim Substrat 10 handelt es sich um ein plattenartiges Grundmaterial mit einem auf einer Oberfläche ausgebildeten Reaktionsfeld 11. Dieses Substrat 10 kann eine Platte mit einem hydrophoben Dünnfilm auf ihrer Oberfläche umfassen, zum Beispiel eine Quarzplatte, eine Siliciumplatte und eine Kunstharzplatte. Das Reaktionsfeld 11 ist in eine Mehrzahl von Analysenfeldern 12 unterteilt, wie nachstehend ausgeführt wird. Bei dieser Ausführungsform ist das Reaktionsfeld 11 in 140 Analysenfelder 12 unterteilt.
  • Beim Analysenfeld 12 handelt es sich um ein Feld zur Absorption einer Analysenrobe s. Das Analysenfeld 12 umfasst eine Mehrzahl von Absorptionsbereichen 13, die zur Absorption der Analysenprobe s befähigt sind, und einen Nichtabsorptionsbereich 14, der sich von den Absorptionsbereichen 13 unterscheidet.
  • Der Absorptionsbereich 13 ist aus einer hydrophilen Membran oder dergleichen gebildet, die auf das Substrat 10 laminiert ist, und befindet sich auf der Oberfläche, um eine Absorption der Analysenproben s zu ermöglichen. Diese hydrophile Membran kann beispielsweise ein Film aus einem anorganischen Oxid oder dergleichen umfassen, in die eine funktionelle Gruppe, die zum Fixieren der Analysenprobe s befähigt ist (zum Beispiel eine Aminogruppe), eingeführt ist. Dieses spezielle anorganische Oxid kann beispielsweise ein Aminosilan umfassen.
  • Wie in 1 dargestellt, weist jedes Analysenfeld 12 eine Mehrzahl von Absorptionsbereichen 13 auf, die gemäß der Grundrissansicht eine kreisförmige Gestalt aufweisen. Die einzelnen Absorptionsbereiche 13 sind gitterartig angeordnet. Da auf diese Weise jedes Analysenfeld 12 eine Mehrzahl von Absorptionsbereichen 13 aufweist und die einzelnen Absorptionsbereiche 13 gitterartig angeordnet sind, ist es möglich, in einfacher und zuverlässiger Weise Positionen der Absorptionsbereiche 13 innerhalb des Analysenfeldes 12 zu erkennen.
  • Der Absorptionsbereich 13 weist typischerweise einen Durchmesser von 0,01 bis 10 µm auf, wie aus der Draufsicht ersichtlich ist. Die Untergrenze dieses Durchmessers beträgt vorzugsweise 0,05 µm, insbesondere 0,1 µm und ganz besonders 0,2 µm, und zwar im Hinblick auf die einfache Bildung des Absorptionsbereichs 13 und auf die Verbesserung der Absorption der Analysenprobe. Die Obergrenze des Durchmessers wird vorzugsweise auf 5 µm, insbesondere 1 µm und ganz besonders 0,5 µm festgelegt, und zwar im Hinblick auf die Verbesserung der Anordnungsdichte der Absorptionsbereiche 13.
  • Der Durchmesser des Absorptionsbereichs 13 wird gemäß der Grundrissdarstellung vorzugsweise in Abhängigkeit von der räumlichen Auflösung (Pixelabmessung) einer Erfassungseinrichtung der Nucleinsäure-Analysenvorrichtung, die zusammen mit diesem Substrat 100 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure vorgesehen ist, festgelegt. Dabei wird der Durchmesser vorzugsweise auf 1 Pixel festgelegt, und zwar im Hinblick auf die Verbesserung der Anordnungsdichte der Absorptionsbereiche 13.
  • Der Abstand der Absorptionsbereiche 13 wird typischerweise auf 0,05 bis 50 µm festgelegt. Die Untergrenze des Abstands wird vorzugsweise auf 0,1 µm, insbesondere 0,5 µm und ganz besonders 1 µm festgelegt, und zwar im Hinblick auf eine Verhinderung einer gegenseitigen Störung der Absorptionsbereiche 13, die bei der Analyse benachbart sind. Die Obergrenze für den Abstand wird vorzugsweise auf 10 µm, insbesondere auf 5 µm und ganz besonders auf 2 µm festgelegt, und zwar im Hinblick auf eine Verbesserung der Anordnungsdichte der Absorptionsbereiche 13.
  • Ähnlich wie der Durchmesser wird auch der Abstand der Absorptionsbereiche 13 in Abhängigkeit von der räumlichen Auflösung (Pixelabmessung) einer Nachweiseinrichtung der Nucleinsäure-Analysenvorrichtung festgelegt. Dabei wird der Abstand vorzugsweise auf 4 bis 5 Pixel und insbesondere auf 5 Pixel eingestellt, und zwar im Hinblick auf die Fluoreszenzauflösung und die Verbesserung der Anordnungsdichte der Absorptionsbereiche 13.
  • Der Nichtabsorptionsbereich 14 umfasst eine hydrophobe Membran, die auf das Substrat 10 laminiert ist, um eine Absorption der Analysenprobe s zu verhindern. Eine Verbindung zur Bildung dieser hydrophoben Membran kann beispielsweise eine mehrwertige organische Verbindung, eine Carbonsäureverbindung, eine Phosphatverbindung, eine Sulfatverbindung, eine Nitrilverbindung und Salze davon umfassen. Die Verbindung kann allein oder in Form einer Kombination aus zwei oder mehr Verbindungen verwendet werden.
  • Der Nichtabsorptionsbereich 14 weist einen Markerbereich 15 mit kreuzförmiger Gestalt auf, um eine Position des Analysenfelds 12 in diesem Teil zu indizieren. Da ein DNA-Fragment, das zur Emission von Fluoreszenz befähigt ist, nicht leicht in diesem Markerbereich 15 absorbiert wird, kann die Markerposition 15 leicht unter Verwendung einer Fluoreszenzabbildung des Analysenfelds 12 vom Absorptionsbereich 13 unterschieden werden.
  • Nachstehend wird die Positionierung des Analysenfelds 12 unter Verwendung des Substrats 100 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure gemäß der ersten Ausführungsform beschrieben.
  • Wenn das Substrat 100 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure eingesetzt wird und ein Strahl eines Anregungslichts, das eine Emission in einer bestimmten Wellenlänge aufweist, auf das Analysenfeld 12, das den Absorptionsbereich 13 mit dem daran absorbierten DNA-Fragment (Analysenprobe) umfasst, wobei eine fluorochrommarkierte Matrix entsprechend der Base eingeführt ist, gerichtet wird, wird Fluoreszenz von einem Absorptionsbereich 13, an dem ein durch dieses Anregungslicht angeregter spezieller Farbstoff vorliegt (nachstehend auch als „spezieller Absorptionsbereich“ bezeichnet), emittiert. Im Fall einer Vierfarben-Fluoreszenzerfassung (Erfassung von vier verschiedenen Fluoreszenztypen, entsprechend den vier Basentypen) beträgt die Wahrscheinlichkeit einer Fluoreszenz, die durch Bestrahlung mit Anregungslicht mit einer bestimmten Wellenlänge in einem beliebigen Absorptionsbereich 13 hervorgerufen wird, etwa 25%.
  • Da ein Markerbereich 15 mit einer vorbestimmten Gestalt, um eine Position des Analysenfelds 12 (nichtfluoreszierender Bereich) zu erhalten, zumindest in einem Teil des Nichtabsorptionsbereichs 14 vorgesehen ist, wird die Position des Analysenfelds 12 durch Auffinden des Markerbereichs 15 festgestellt, indem man das erhaltene Fluoreszenzbild absucht. Anschließend wird das Substrat 100 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure auf der Grundlage der ermittelten Position des Analysenfelds 12 so verschoben, dass dieses Analysenfeld 12 mit dem Fluoreszenzbildbereich übereinstimmt. Infolgedessen ist es möglich, ein Fluoreszenzbild des Analysenfelds 12, das als Analysenziel dient, zu erhalten.
  • Auf diese Weise weist auf dem Substrat 100 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure mindestens ein Teil des Nichtabsorptionsbereichs 14 des Analysenfelds 12 den Markerbereich mit einer vorbestimmten Gestalt, um eine Position des Analysenfelds 12 zu erhalten, auf. Selbst wenn die Positionierung wiederholt wird, ist es möglich, in reproduzierbarer Weise die Position des Analysenfelds 12 zu erhalten. Infolgedessen ist es in zuverlässiger und rascher Weise möglich, Basensequenzen von DNA-Fragmenten zu analysieren.
  • Zweite Ausführungsform
  • 2 zeigt in schematischer Weise den Grundriss eines Substrats zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure gemäß einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Wie in 2 dargestellt, umfasst das Substrat 200 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure gemäß der zweiten Ausführungsform im Wesentlichen folgende Bestandteile: ein Substrat 10, ein Reaktionsfeld 11, ein Analysenfeld 12, einen Absorptionsbereich 13 und einen Nichtabsorptionsbereich 14. Das Substrat 200 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure gemäß der zweiten Ausführungsform unterscheidet sich von der ersten Ausführungsform dadurch, dass die Gestalt des Markerbereichs 15 des Nichtabsorptionsbereichs 14 in Abhängigkeit vom Analysenbereich 12 einen anderen Grundriss aufweist. Das Substrat 10, das Reaktionsfeld 11, der Analysenbereich 12 und der Absorptionsbereich 13 sind ähnlich wie bei der ersten Ausführungsform beschaffen. Gleiche Bezugszeichen bezeichnen gleiche Elemente wie bei der ersten Ausführungsform und werden daher nicht erneut beschrieben.
  • Gemäß dieser Ausführungsform ist die Gestalt des Markers 15 im Grundriss zumindest zwischen benachbarten Analysenfeldern 12 unterschiedlich. Speziell weist gemäß Darstellung in 2 das Substrat 200 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure zwei Typen von Analysenfeldern 12a und 12b auf, die unterschiedliche Gestalten der Markerbereiche 15 aufweisen, wie aus der Draufsicht ersichtlich ist. Die verschiedenen Typen von Analysenfeldern 12a und 12b sind abwechselnd angeordnet (die Gestalt des Markerbereichs 15 ist unterschiedlich zwischen dem Analysenfeld 12a mit ungerader Nummerierung und dem Analysenfeld 12b mit gerader Nummerierung). Während bei dieser Ausführungsform das Analysenfeld 12a einen Markerbereich 15a aufweist, weist das Analysenfeld 12b einen Markerbereich 15b auf (vergleiche die Gestalten der Markerbereiche 15 in 2).
  • Nachstehend wird die Positionierung des Analysenfelds 12 unter Einsatz des Substrats 200 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure gemäß der zweiten Ausführungsform beschrieben.
  • Bei Verwendung des Substrats 200 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure werden die Gestalten der Markerbereiche 15a und 15b des Analysenfelds 12a mit ungerader Nummerierung und des Analysenfelds 12b mit geradzahliger Nummerierung vorher in einem externen Computer (nicht dargestellt) gespeichert. Anschließend wird ähnlich wie bei der Positionierung der ersten Ausführungsform die Positionierung für das erste Analysenfeld 12 vorgenommen.
  • Anschließend wird die Erfassung der Fluoreszenz durch Bestrahlung mit Anregungslicht vorgenommen. Bei der Fluoreszenzerfassung wird die Gestalt des Markerbereichs 15 erkannt, wenn das Fluoreszenzbild des Zielanalysenfelds 12 erhalten wird. Auf der Grundlage der erhaltenen Gestalt wird festgestellt, ob es sich bei dem Analysenfeld 12 um das Analysenfeld 12a mit ungerader Nummerierung oder um das Analysenfeld 12b mit geradzahliger Nummerierung handelt. Wenn beispielsweise das erste Analysenfeld 12 eine ungerade Nummer aufweist, erkennt das nächste Analysenfeld 12, das nach der Analyse des Analysenfelds 12a verschoben worden ist, die geradzahlig nummerierten Markerbereiche 15b, sofern nicht ein Fehler aufgetreten ist, zum Beispiel eine fehlerhafte Ausrichtung in einer Transporteinrichtung (nachstehend beschrieben) des Substrats 200 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure. Wenn der Markerbereich 15a mit ungerader Nummer anstelle des Markerbereichs 15b mit gerader Nummer erkannt wird oder wenn keine Fluoreszenz aus dem erhaltenen Fluoreszenzbild erfasst wird, bedeutet dies, dass es sich beim entsprechenden Feld nicht um das Zielanalysenfeld 12 handelt.
  • Auf diese Weise unterscheidet sich die Gestalt des Markerbereichs 15 auf dem Substrat 200 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure, wie aus der Draufsicht ersichtlich, zumindest zwischen den benachbarten Analysenbereichen 12. Daher ist es möglich, die einzelnen Analysenfelder 12 auf der Grundlage der Gestalt des Markerbereichs 15 zu unterscheiden und in zuverlässiger Weise das Zielanalysenfeld 12 zu analysieren.
  • Die planare Gestalt des Markerbereichs 15 ist vorzugsweise für sämtliche Analysenfelder 12 unterschiedlich. Speziell kann die Gestalt des Markerbereichs 15 beispielsweise eine Zifferngestalt, eine durch Bilden eines unterscheidbaren Symbols erhaltene Gestalt oder dergleichen aufweisen (nicht dargestellt).
  • Da auf diese Weise die planare Gestalt des Markerbereichs 15 für sämtliche Analysenfelder 12 unterschiedlich ist, ist es möglich, klar zwischen den einzelnen Analysenfeldern 12 auf der Grundlage der Gestalt des Markerbereichs 15 zu unterscheiden und mit höherer Zuverlässigkeit das Zielanalysenfeld 12 zu analysieren.
  • Dritte Ausführungsform
  • 3 (a) und 3 (b) zeigen in schematischer Weise ein Substrat zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure gemäß einer dritten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Wie in 3 (a) dargestellt, umfasst das Substrat 300 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure gemäß der dritten Ausführungsform im Wesentlichen folgende Bestandteile: ein Substrat 10, ein Reaktionsfeld 11, ein Analysenfeld 12, einen Absorptionsbereich 13 und einen Nichtabsorptionsbereich 14. Das Substrat 300 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure gemäß der dritten Ausführungsform unterscheidet sich von der ersten Ausführungsform in Bezug auf den Absorptionsbereich 13 und den Nichtabsorptionsbereich 14. Das Substrat 10, das Reaktionsfeld 11 und das Analysenfeld 12 sind ähnlich wie bei der ersten Ausführungsform. Gleiche Bezugszeichen bezeichnen gleiche Elemente wie bei der ersten Ausführungsform und werden daher nicht erneut beschrieben. Ferner ist die Positionierung des Analysenfelds 12 unter Einsatz des Substrats 300 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure gemäß der dritten Ausführungsform ähnlich wie bei der ersten Ausführungsform und wird daher nicht erneut beschrieben.
  • Gemäß dieser Ausführungsform handelt es sich bei der gesamten Fläche des Nichtabsorptionsbereichs 14 um den Markerbereich 15. Die verbleibende Fläche des Analysenfelds 12, die sich vom Markerbereich 15 unterscheidet, stellt den Absorptionsbereich 13 dar. Speziell wird gemäß Darstellung in 3 (a) der Nichtabsorptionsbereich 14, der eine kreuzförmige Gestalt aufweist und als Markerbereich 15 dient, annähernd in der Mitte des Analysenfelds 12 gebildet. Die gesamte restliche Fläche dieses Analysenfelds 12, die sich vom Nichtabsorptionsbereich 14 (Markerbereich 15) unterscheidet, stellt den Absorptionsbereich 13 dar. 3 (b) zeigt ein beispielhaftes Fluoreszenzbild k, das mit dem Substrat 300 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure gemäß dieser Ausführungsform erhalten worden ist. In dieser Abbildung bedeuten weiße Punkte Bereiche, die den Fluoreszenz emittierenden Analysenproben s entsprechen.
  • Dabei stellt im Substrat zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure 300 die gesamte Fläche des Nichtabsorptionsbereichs 14 den Markerbereich 15 dar und die restliche Fläche des Analysenfelds 12, die sich vom Markerbereich 15 unterscheidet, stellt den Absorptionsbereich 13 dar. Daher ist es möglich, die Analysenproben s dicht anzuordnen und auf einmal eine Anzahl von Bildern zu analysieren.
  • Vierte Ausführungsform
  • 4 zeigt in schematischer Weise ein Substrat 400 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure gemäß einer vierten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, wobei ein einzelnes Analysenfeld 12 vergrößert dargestellt ist. Das Substrat 400 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure gemäß der vierten Ausführungsform umfasst im Wesentlichen Folgendes: ein Substrat 10, ein Reaktionsfeld 11, ein Analysenfeld 12, einen Absorptionsbereich 13 und einen Nichtabsorptionsbereich 14. Wie in 4 dargestellt, unterscheidet sich das Substrat 400 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure gemäß der vierten Ausführungsform von dem Substrat der ersten Ausführungsform darin, dass der Markerbereich 15 jeweils in den vier Ecken zusätzlich zur Mitte des Analysenfelds 12 angeordnet ist. Da das Substrat 10, das Reaktionsfeld 11 und das Analysenfeld 12 ähnlich wie bei der ersten Ausführungsform sind, werden sie nicht erneut beschrieben. Ferner ist der Absorptionsbereich 13 ähnlich wie bei der ersten Ausführungsform. Eine Mehrzahl von Absorptionsbereichen 13 ist in 4 aus Einfachheitsgründen nicht dargestellt.
  • Gemäß dieser Ausführungsform wird der Markerbereich 15 bei der Positionskorrektur der einzelnen Absorptionsbereiche 13 im Analysenfeld 12 verwendet. Speziell umfasst das Substrat 400 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure einen Markerbereich 15c, der in der Mitte des Analysenfelds 12 platziert ist, sowie L-förmige Markerbereiche 15d, die jeweils in den vier Ecken des Analysenfelds 12 vorgesehen sind. Ferner sind die in den vier Ecken platzierten Markerbereiche 15d so angeordnet, dass Geraden, die durch Verbinden der benachbarten Markerbereiche 15c der einzelnen Ecken erhalten werden, vom Markerbereich 15c in der Mitte jeweils den gleichen Abstand „a“ aufweisen. Ferner sind die einzelnen Absorptionsbereiche 13 (obgleich in der Zeichnung nicht dargestellt) in Gitterform in einem Abstand von 5 Pixeln auf dem Analysenfeld, das sich vom Markerbereich 15 unterscheidet, angeordnet.
  • Nachstehend wird die Positionskorrektur der einzelnen Absorptionsbereiche 13 im Analysenfeld 12 unter Einsatz des Substrats 400 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure gemäß der vierten Ausführungsform unter Bezugnahme auf 5 (a) bis 5 (c) beschrieben.
  • Beispielsweise kann die Positionskorrektur des Absorptionsbereichs 13 nach dem folgenden Verfahren durchgeführt werden, wenn ein vom Substrat 400 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure erhaltenes Fluoreszenzbild verzerrt ist. Speziell ist, wie in 5 (a) dargestellt, aufgrund einer Verzerrung des Fluoreszenzbildes k1 ein Bereich 15c', der dem Markerbereich 15c in der Mitte des Fluoreszenzbilds k1 (nachstehend als „Markerkartierungsbereich 15c'“ bezeichnet) entspricht, von den Geraden, die durch Verbinden von Bereichen, die den Markerbereichen 15d in den benachbarten Ecken (Markerkartierungsbereiche 15d') entsprechen erhalten werden, mit den Abständen b, c, d und e getrennt. In diesem Fall kann als Verfahren zur Bestimmung der Position des Absorptionsbereichs 13 in der Praxis beispielsweise eine Interpolationstechnik angewandt werden, zum Beispiel eine lineare Interpolationstechnik, bei der die Interpolation für jeden der Bereiche oben links, oben rechts, unten links und unten rechts in Bezug zum Markerkartierungsbereich 15c' durchgeführt wird.
  • Beispielsweise wird bei einem derartigen linearen Interpolationsverfahren der tatsächliche Abstand berechnet, indem man das Verhältnis des Abstands „a“ (vergleiche 4) zu den einzelnen Abständen „b, c, d und e“ berechnet und die Verhältniswerte mit fünf Pixeln multipliziert. Speziell ergibt sich der tatsächliche Abstand der BD-Richtung im B-Seiterenbereich vom Markerkartierungsbereich 15c' in 5 (a) als „b/a x fünf Pixel“. Der tatsächliche Abstand der CE-Richtung im E-Seitenbereich vom Markerkartierungsbereich 15c' ergibt sich als „e/a x fünf Pixel“. Der tatsächliche Abstand der BD-Richtung im D-Seitenbereich vom Markerkartierungsbereich 15c' ergibt sich als „d/a x fünf Pixel“. Der tatsächliche Abstand der CE-Richtung im C-Seitenbereich vom Markerkartierungsbereich 15c' ergibt sich als „c/a x fünf Pixel“. Unter Verwendung dieser Werte wird die Positionskorrektur für die einzelnen Absorptionsbereiche 13 vorgenommen.
  • Da eine Verzerrung des Fluoreszenzbilds von einem Detektor der Nucleinsäure-Analysenvorrichtung abhängt, kann die vorerwähnte Berechnung nur für das erste Analysenfeld 12 des ersten Zyklus vorgenommen werden. Die Korrektur wird für die zu analysierenden Analysenfelder 12 unter Verwendung dieses Berechnungsergebnisses durchgeführt. Wenn ferner zwei oder mehr Detektoren bei der Analyse verwendet werden, werden die Berechnung und die Korrektur bei jedem Detektor vorgenommen.
  • Für eine Verzerrung (Abweichung) des Fluoreszenzbilds in Rotationsrichtung in Bezug zur optischen Achse des auf das Substrat 400 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure als Strahl gerichteten Anregungslichts kann die Positionskorrektur des Absorptionsbereichs 13 auf folgende Weise durchgeführt werden. Speziell wird, wie in 5 (b) dargestellt, ein Neigungswinkel θ1 aus dem Markerkartierungsbereich 15d' des vom Detektor erhaltenen Fluoreszenzbilds k2 berechnet. Anschließend wird die Korrektur in Rotationsrichtung auf der Grundlage der berechneten Neigung θ1 durchgeführt. Da die Verzerrung der Rotationsrichtung im Fluoreszenzbild k vom Detektor der Nucleinsäure-Analysenvorrichtung abhängt, kann die vorerwähnte Berechnung nur für das erste Analysenfeld 12 des ersten Zyklus' durchgeführt werden und die Korrektur für die später zu analysierenden Analysenfelder 12 wird unter Verwendung dieses Berechnungsergebnisses vorgenommen. Wenn ferner zwei oder mehr Detektoren bei der Analyse eingesetzt werden, werden die Berechnung und die Korrektur bei jedem Detektor vorgenommen. Beispielsweise zeigt 5(c) ein Fluoreszenzbild k3 (Neigung θ2), das von einem weiteren Detektor, der sich vom vorerwähnten Detektor unterscheidet, erfasst worden ist.
  • Da auf diese Weise die Markerposition 15 bei der Positionskorrektur der einzelnen Absorptionsbereiche 13 im Analysenfeld 12 herangezogen wird, ist es möglich, genau die Position der einzelnen Absorptionsbereiche 13 im Analysenfeld 12 zu erkennen.
  • Verfahren zur Herstellung eines Substrats zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure
  • Nachstehend wird ein Verfahren zur Herstellung des vorerwähnten Substrats zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure beschrieben. 6(a) bis 6(f) zeigen in schematischer Weise ein Verfahren zur Herstellung des Substrats 100 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure gemäß 1. Dieses Substrat 100 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure kann beispielsweise unter Anwendung des in JP 2011-99720 A beschriebenen Verfahrens hergestellt werden. Dabei wird ein Substrat 10 mit einer Oberfläche, auf die eine hydrophobe Membran laminiert ist, vorher hergestellt (vergleiche 6(a)). Auf diese hydrophobe Membran wird eine hydrophile Membran 16 aus einem speziellen anorganischen Oxid oder dergleichen beispielsweise durch Vakuumabscheidung, Sputtering, chemische Abscheidung aus der Dampfphase (CVD), physikalische Abscheidung aus der Dampfphase (PVD) oder dergleichen (vergleiche 6(b) abgeschieden.
  • Anschließend wird ein Resist 17 schichtförmig auf die erhaltene hydrophile Membran 16 aufgebracht (vergleiche 6(c)). Sodann wird eine vorbestimmte Bemusterung unter Anwendung einer photolithographischen Technik durchgeführt (vergleiche 6(d)). Der nicht benötigte Teil der hydrophilen Membran wird durch Ätzen unter Verwendung des bemusterten Resists 17 als Maske entfernt (vergleiche 6(e)), und der verbleibende Resist 17 wird durch Lösen entfernt (vergleiche 6(f)). Als Ergebnis ist es möglich, ein Substrat 100 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure mit einem erwünschten Absorptionsbereich 13, der mit der hydrophilen Membran 16 versehen ist, herzustellen. Da die hydrophobe Membran als Teil des Analysenfelds 12, der sich vom Absorptionsbereich 13 unterscheidet, exponiert ist, dient dieser Teil als Nichtabsorptionsbereich 14.
  • Durchflusszelle zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure
  • Die erfindungsgemäße Durchflusszelle zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure umfasst Folgendes: das Substrat zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure, eine lichtdurchlässige Abdeckung, die dem Substrat zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure zugewandt ist und Licht durchlässt, eine Mehrzahl von Abstandshaltern, die zwischen dem Substrat zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure und der lichtdurchlässigen Abdeckung vorgesehen sind und parallel im Abstand voneinander angeordnet sind, eine Durchflusspassage, die in einem Bereich im Zwischenraum von benachbarten Abstandshaltern zwischen dem Substrat zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure und der lichtdurchlässigen Abdeckung angeordnet ist und in der eine Flüssigkeit zirkuliert, eine Einlassöffnung an einem Ende der Durchflusspassage, in die die Flüssigkeit eingespritzt wird, und eine Auslassöffnung an dem der Einlassöffnung gegenüberliegenden Ende der Durchflusspassage, aus der die Flüssigkeit ausgetragen wird.
  • Nachstehend wird die erfindungsgemäße Durchflusszelle zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die in den Zeichnungen dargestellten Ausführungsformen beschränkt.
  • 7 zeigt in schematischer Weise eine perspektivische Darstellung einer beispielhaften Durchflusszelle gemäß der vorliegenden Erfindung zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure, wobei die lichtdurchlässige Abdeckung teilweise weggelassen ist. Wie in 7 dargestellt, umfasst die Durchflusszelle 500 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure im Wesentlichen Folgendes: ein Substrat 100 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure, eine lichtdurchlässige Abdeckung 21, Abstandshalter 22 und eine Durchflusspassage 23. Da das vorstehend beschriebene Substrat 100 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure in dieser Ausführungsform verwendet wird und gleiche Bezugszeichen gleiche Elemente bedeuten, erfolgt nachstehend keine Wiederholung der Beschreibung.
  • Die lichtdurchlässige Abdeckung 21 stellt eine flache Abdeckung dar, die so platziert wird, dass sie dem Substrat 100 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure zugewandt ist und Licht durchlässt. Die lichtdurchlässige Abdeckung kann beispielsweise aus Glas gebildet werden, zum Beispiel aus Natronglas, Quarzglas oder Saphirglas, sowie aus einem lichtdurchlässigen Harz, zum Beispiel einem durchsichtigen Polyimidharz oder einem Polycarbonatharz und dergleichen.
  • Die Abstandshalter 22 werden zwischen dem Substrat 100 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure und der lichtdurchlässigen Abdeckung 21 platziert und sind im Wesentlichen parallel im Abstand voneinander angeordnet. Die Durchflusszelle 500 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure weist eine Mehrzahl von Abstandshaltern 22 auf. Die Abstandshalter 22 sind beispielsweise aus einem hitzehärtenden oder photohärtenden Epoxyharz, Acrylharz, Silikonharz und dergleichen gebildet, wie es in JP 2006-87974 A ausgeführt wird. Unter diesen Materialien wird im Hinblick auf eine Verbesserung der Haftfestigkeit mit dem Glas oder dem lichtdurchlässigen Harz ein Siliconharz bevorzugt, wobei Polysiloxan besonders bevorzugt ist und Polydimethylsiloxan (PDMS) am meisten bevorzugt ist. Ferner weisen die Abstandshalter 22 vorzugsweise eine Dicke von 0,05 bis 2 mm und insbesondere von 0,2 bis 1 mm auf, wobei aber keine Beschränkung hierauf besteht.
  • Bei der Durchflusspassage 23 handelt es sich um eine Durchflusspassage, die in einem Bereich zwischen benachbarten Abstandshaltern 22 zwischen dem Substrat 100 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure und der lichtdurchlässigen Abdeckung 21 ausgebildet ist und in der eine Flüssigkeit fließen kann. Beispielsweise fließt durch diese Durchflusspassage 23 eine Flüssigkeit, zum Beispiel ein Reagenz, das mit dem DNA-Fragment reagieren kann. Speziell ist die Durchflusspassage 23 vom Substrat 100 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure, der lichtdurchlässigen Abdeckung 21 und den Abstandshaltern 22 umgeben, wobei sich ein rechteckiger Querschnitt bei Betrachtung in Fließrichtung und ein im Wesentlichen rechtwinkliger Parallelepipedraum, der sich in der Fließrichtung erstreckt, ergibt. Die Durchflusspassage 23 weist an einem Ende eine Einlassöffnung 23a auf, in die eine Flüssigkeit eingespritzt wird. Am anderen Ende, das der Einlassöffnung 23a gegenüberliegt, weist sie eine Auslassöffnung 23b auf, durch die die Flüssigkeit ausgetragen wird.
  • Da die Durchflusszelle 500 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure das Substrat 100 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure aufweist, ist es möglich, in reproduzierbarer Weise die Position des Analysenfelds 12 zu ermitteln, selbst wenn die Positionierung während der Nucleinsäureanalyse wiederholt durchgeführt wird. Im Ergebnis ist es möglich, in zuverlässiger und rascher Weise Basensequenzen von DNA-Fragmenten zu analysieren.
  • Verfahren zur Herstellung einer Durchflusszelle zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure
  • Nachstehend wird ein Verfahren zur Herstellung der Durchflusszelle 500 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure beschrieben. Für die Durchflusszelle 500 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure wird beispielsweise ein Paar von Abstandshaltern 22 auf das vorstehend beschriebene Substrat 100 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure parallel zueinander unter Verwendung eines Klebstoffs aufgeklebt. Anschließend wird die lichtdurchlässige Abdeckung 21 unter Verwendung eines Klebstoffs auf die verklebten Abstandshalter 22 aufgeklebt. Es können beliebige Typen von Klebstoffen ohne besondere Beschränkung verwendet werden, solange der Klebstoff nicht die Nucleinsäureanalyse beeinflusst. Mit dem vorerwähnten Verfahren ist es möglich, die erfindungsgemäße Durchflusszelle 500 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure herzustellen.
  • Nucleinsäure-Analysenvorrichtung
  • Die erfindungsgemäße Nucleinsäure-Analysenvorrichtung umfasst Folgendes: die Durchflusszelle zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure, eine Zirkulationseinrichtung, in der eine Flüssigkeit in einer Durchflusspassage der Durchflusszelle zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure zirkuliert, eine Temperatursteuereinrichtung, die die Reaktionstemperatur des DNA-Fragments steuert, eine Bestrahlungseinrichtung, die einen Strahl von Anregungslicht auf ein Analysenfeld als Analysenziel durch die lichtdurchlässige Abdeckung richtet, eine Erfassungseinrichtung, die die Fluoreszenz erfasst, die vom DNA-Fragment bei Bestrahlung mit Anregungslicht durch die lichtdurchlässige Abdeckung emittiert wird und eine Position des Markerbereichs aufgrund der detektierten Fluoreszenz erfasst, und eine Transporteinrichtung, die die Durchflusszelle zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure transportiert und das Analysenfeld auf eine vorbestimmte Position in Bezug zum Markerbereich verschiebt.
  • Nachstehend wird eine erfindungsgemäße Nucleinsäure-Analysenvorrichtung unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die in den Zeichnungen dargestellten Ausführungsformen beschränkt.
  • 8 zeigt in schematischer Weise eine beispielhafte erfindungsgemäße Nucleinsäure-Analysenvorrichtung. Wie in 8 dargestellt, umfasst die Nucleinsäure-Analysenvorrichtung 600 im Wesentlichen Folgendes: eine Durchflusszelle 500 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure, eine Zirkulationseinrichtung 31, eine Temperatursteuereinrichtung 32, eine Bestrahlungseinrichtung 33, eine Erfassungseinrichtung 34 und eine Transporteinrichtung 35. Die Durchflusszelle 500 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure ist ähnlich wie die im vorstehenden Abschnitt mit der Bezeichnung „Durchflusszelle zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure“ beschriebene Durchflusszelle 500 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure. Gleiche Bezugszeichen bezeichnen gleiche Elemente und werden daher nicht erneut beschrieben.
  • Die Zirkulationseinrichtung 31 bewirkt die Zirkulation der Flüssigkeit in der Durchflusspassage 23 der Durchflusszelle 500 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure. Die Zirkulationseinrichtung 31 weist eine Reagenz-Speicher- und Kühlkammer 312 auf, die eine Mehrzahl von Reagenzbehältern 311, die Reagenz enthalten, aufnimmt, sowie eine Düse 313, die Zugang zum Reagenzbehälter 311 hat, eine Rohrleitung 314, die Reagenz in die Durchflusszelle 500 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure einleitet, und einen Behälter 315 für Abfallflüssigkeit, in der das mit den DNA-Fragmenten reagierende Reagenz entsorgt wird.
  • Die Temperatursteuereinrichtung 32 steuert die Reaktionstemperatur des DNA-Fragments. Die Temperatursteuereinrichtung 32 weist ein Temperatursteuersubstrat 321 auf, das auf einem nachstehend beschriebenen XY-Tisch 351 angeordnet ist und die Reaktion zwischen dem zu analysieren DNA-Fragment (Analysenprobe s) und dem Reagenz fördert. Das Temperatursteuersubstrat 321 ist beispielsweise mit einem Peltier-Element versehen.
  • Die Bestrahlungseinrichtung 33 weist Folgendes auf: eine Lichtquelle 331, zum Beispiel eine lichtemittierende Diode (LED), die als Anregungslicht dient, einen Filterschaltmechanismus 332, der dazu befähigt ist, eine beliebige Wellenlänge aus dem von der Lichtquelle 331 emittierten Anregungslicht auszuwählen, einen dichroitischen Spiegel 333, der das Anregungslicht reflektiert und die nachstehend beschriebene Fluoreszenz durchlässt, eine Objektivlinse 334, die das Anregungslicht strahlenförmig auf die zu analysierende Probe s richtet, und einen Z-Tisch 335, der die Objektivlinse 334 in Richtung der Z-Achse, die senkrecht zur X-Achse und der Y-Achse steht, bewegt, um den Brennpunkt des Anregungslichts einzustellen.
  • Die Erfassungseinrichtung 34 erfasst die Fluoreszenz, die vom DNA-Fragment bei Bestrahlung mit dem Anregungslicht durch die lichtdurchlässige Abdeckung 21 emittiert wird, und die Position des Markerbereichs 15 im Analysenfeld 12 aufgrund der detektierten Fluoreszenz. Die Erfassungseinrichtung 34 weist Folgendes auf: eine Objektivlinse 334, die die von der Analysenprobe s emittierte Fluoreszenz aufnimmt, einen dichroitischen FluoreszenzTrennfilter 341, der paralleles Licht von der Objektivlinse 334 auf Grundlage der Wellenlänge auftrennt, eine Tubuslinse 342, die das parallele Licht fokussiert, und einen Detektor 343, der mit einem Sensor versehen ist, zum Beispiel mit einem komplementären Metalloxid-Halbleiter (CMOS)-Sensor zur Erfassung des fokussierten Bilds. Da die Objektivlinse 334 der Erfassungseinrichtung 34 Bestandteil der Bestrahlungseinrichtung 33 ist, werden die gleichen Bezugszeichen verwendet.
  • Die Transporteinrichtung 35 transportiert die Durchflusszelle 500 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure und verschiebt das Analysenfeld 12 auf eine vorbestimmte Position in Bezug zum Markerbereich 15. Die Transporteinrichtung 35 weist einen XY-Tisch 351 auf, der dazu befähigt ist, die Durchflusszelle zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure jeweils in Richtung der X-Achse und der Y-Achse koplanar und senkrecht zueinander zu bewegen, und einen Antriebsmotor (nicht dargestellt), der den XY-Tisch 351 antreibt. Der XY-Tisch 351 wird in einem offenen Regelkreis gesteuert.
  • Analysenverfahren
  • Nachstehend wird ein Verfahren zur Analyse von Basensequenzen der DNA-Fragmente unter Verwendung der erfindungsgemäßen Nucleinsäure-Analysenvorrichtung 600 unter Bezugnahme auf die 8 bis 11 beschrieben. Dabei wird als Beispiel ein Fall beschrieben, bei dem es sich bei der Analysenprobe s um einen Vektor handelt, der das DNA-Fragment enthält, und bei dem die Durchflusszelle 500 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure mit dem Substrat 100 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure gemäß der vorstehend beschriebenen ersten Ausführungsform versehen ist.
  • Die Analyse unter Verwendung der Nucleinsäure-Analysenvorrichtung 600 kann beispielsweise durchgeführt werden, indem man die nachstehend beschriebenen Verfahren mit den Bezeichnungen „Herstellung der Durchflusszelle“, „Installation der Durchflusszelle“, „Zufuhr von Reagenz“, „Temperatursteuerung“, „Verschiebung des Tisches“ und „Positionierung des Tisches“ kombiniert. Nachstehend werden die einzelnen Verfahren ausführlich beschrieben, wobei aber die Analyse unter Verwendung der Nucleinsäure-Analysenvorrichtung 600 nicht auf die folgenden Aspekte beschränkt ist.
  • Herstellung der Durchflusszelle
  • Gemäß diesem Vorgang wird zunächst eine Durchflusszelle 500 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure hergestellt (vergleiche 7), die die Analysenprobe s aufnimmt. Das Substrat 100 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure der Durchflusszelle 500 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure weist einen Absorptionsbereich 13 und einen Nichtabsorptionsbereich 14 in jedem Analysenfeld 12 des Substrats 10 auf. Ein Markerbereich 15 in Gestalt eines Kreuzes ist in der Mitte des Nichtabsorptionsbereichs 14 ausgebildet, wie in 1 dargestellt ist. Die Analysenprobe s wird nur im Absorptionsbereich 13 aufgenommen.
  • Installation der Durchflusszelle
  • Bei diesem Vorgang wird die Durchflusszelle 500 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure, die gemäß dem Abschnitt „Herstellung der Durchflusszelle“ hergestellt worden ist, am Temperatursteuersubstrat 321, das am XY-Tisch 351 der Nucleinsäure-Analysenvorrichtung 600 bereitgestellt ist, fixiert.
  • Zufuhr des Reagenz
  • Bei diesem Vorgang ermöglicht die Düse 313 der Zirkulationseinrichtung 31 den Zugang des Reagenzbehälters 311 der Reagenz-Kühl- und Speicherkammer 312, um das Reagenz anzusaugen. Anschließend wird das angesaugte Reagenz in die Durchflusspassage der Durchflusszelle 500 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure durch die Rohrleitung 314 und die Einlassöffnung 23a eingespritzt. Das eingespritzte Reagenz kommt in Kontakt mit der im Absorptionsbereich befindlichen Analysenprobe s, um eine Reaktion auszulösen. Das der vorerwähnten Reaktion unterworfene Reagenz wird durch eine Rohrleitung in den Behälter 315 zur Aufnahme von Abfallflüssigkeit entsorgt.
  • Temperatursteuerung
  • Bei diesem Vorgang wird eine Temperatursteuerung der Durchflusszelle 500 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure unter Verwendung des Temperatursteuersubstrats 321 durchgeführt, um eine Einstellung der Analysenprobe s auf eine vorgegebene Temperatur zu ermöglichen. Aufgrund der Temperatursteuerung reagiert das Reagenz mit der Analysenprobe s der Durchflusszelle 500 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure. Dabei wird eine DNA-Elongation durch eine geeignete Wiederholung der vorerwähnten Vorgänge „Zufuhr von Reagenz“ und „Temperatursteuerung“ durchgeführt. Diese Elongation wird durch Umsetzung von Polymerase mit vier Typen von Nucleotiden, die mit unterschiedlichen Fluorochromen markiert sind, vorgenommen. Das Nucleotid umfasst FAM-dCTP, Cy3-dATP, Texas Red-dGTP oder Cy5-dTsTP. Das Reagenz enthält Polymerase und nur eine Base des komplementären Fluoreszenz-Nucleotids wird in das DNA-Fragment eingebaut.
  • Verschiebung des Tisches
  • Bei diesem Vorgang wird zur Betrachtung der umgesetzten Analysenprobe s der XY-Tisch 351 durch einen Antriebsmotor (nicht dargestellt) so bewegt, dass sich die Durchflusszelle 500 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure auf eine festgelegte Position verschiebt. Die „festgelegte Position“ bezieht sich auf eine anfängliche Zielposition des Analysenfelds 12, auf das der Markerbereich 15 innerhalb eines Fluoreszenzerfassungsbereichs der Erfassungseinrichtung 34 zu platzieren ist. Die genaue Positionierung des Tisches wird nachstehend ausführlich im Abschnitt „Positionierung des Tisches“ beschrieben.
  • Positionierung des Tisches
  • Bei diesem Vorgang wird zunächst eine Brennpunktposition der Analysenprobe s in der Objektivlinse 334 eingestellt, indem man den Z-Tisch 335 der Erfassungseinrichtung 34 bewegt. Anschließend wird nach Verschieben der Objektivlinse 334 in die Brennpunktposition Anregungslicht mit einer bestimmten Wellenlänge auf die Analysenprobe s unter Verwendung des Filterschaltmechanismus 332 eingestrahlt. Dabei emittiert aufgrund der Bestrahlung mit Anregungslicht nur eine Analysenprobe s, die einer Anregungswellenlänge entspricht, unter den im Absorptionsbereich 13 enthaltenen Analysenproben s Fluoreszenz. Der Marker 315 emittiert keine Fluoreszenz.
  • Anschließend wird ein Fluoreszenzbild k unter Verwendung der Erfassungseinrichtung 34 erhalten. Wenn dabei die vier vorstehend beschriebenen Fluoreszenzfarben erfasst werden, emittiert die Analysenprobe s Fluoreszenz mit einer Wahrscheinlichkeit von „1/4“. Daher ist es möglich, eine Gestalt des Markerbereichs 15 im erhaltenen Fluoreszenzbild k wahrzunehmen, der keine Fluoreszenz emittiert. Anschließend wird gemäß Darstellung in den 10 (a) bis 10 (c) für den Erfassungsbereich des Fluoreszenzbilds kein Markerbereich 15 mit der in einem Computer (nicht dargestellt) vorher gespeicherten Gestalt abgesucht. Wenn dabei der Markerbereich 15 abgesucht wird, werden Pixelwerte der X-Achse und der Y-Achse in der Mitte des Markerbereichs 15 (Koordinaten, umgewandelt in Pixel des Markerbereichs 15 im Fluoreszenzbild k) berechnet (vergleiche 10 (a)). Wenn der Markerbereich 15 nicht abgesucht wird, bewegt sich der Suchbereich zum nächsten Analysenfeld, indem der XY-Tisch 351 bewegt wird. Wenn dabei der berechnete Pixelwert innerhalb eines Zielpositionsbereichs 344 liegt, wird die Positionierung des XY-Tisches 351 nicht vorgenommen. Wenn aber der berechnete Pixelwert außerhalb des Zielpositionsbereichs 344 liegt, werden relative Pixelnummern Xa und Ya für diese Pixelwerte für die Mittelposition innerhalb des Zielpositionsbereichs 344 berechnet (vergleiche 10 (b)). Anschließend werden die Pixelnummern Xa und Ya in die Anzahl von Pulsen, die für die Positionierung erforderlich sind, umgewandelt. Die Anzahl von Pulsen wird auf die Transporteinrichtung 35 übertragen. Nach dieser Übertragung wird der XY-Tisch 351 durch Betätigung des Antriebsmotors der Transporteinrichtung 35 bewegt (vergleiche 10 (c)).
  • Anschließend werden die Bestrahlung mit Anregungslicht und die Positionserfassung des Markerbereichs 15 unter Verwendung der Erfassungseinrichtung 34 erneut durchgeführt, um zu prüfen, ob der Markerbereich 15 zum nächsten Zielpositionsbereich 344 verschoben worden ist oder nicht. Wenn sich dabei der Markerbereich 15 innerhalb des Zielpositionsbereichs 344 befindet, ist die Positionierung des XY-Tisches 351 beendet. Wenn aber der Markerbereich 15 sich außerhalb des Zielpositionsbereichs 344 befindet, wird die Positionierung erneut vorgenommen. Danach wird nach Beendigung der Positionierung diese Position (die vorerwähnte Anzahl von Pulsen) gespeichert. Wenn dabei die Position des Markerbereichs 15 sich nach der Positionierung des XY-Tisches 351 nicht ändert, wird dies als eine fehlerhafte Ausrichtung des Antriebsmotors angesehen und die Analyse wird unter Ausgeben eines Alarms unterbrochen.
  • Erfassung der Fluoreszenz
  • Bei diesem Vorgang wird, eine Brennpunktposition erneut durch Bewegen der Objektivlinse 334 der Erfassungseinrichtung 34 eingestellt. Dabei wird diese erneute Einstellung der Brennpunktposition durchgeführt, um eine Abweichung in vertikaler Richtung, die durch die Bewegung des XY-Tisches verursacht wird, zu korrigieren. Wenn jedoch die Erfassungseinrichtung 34 und die Analysenprobe s eine ausreichende Tiefenschärfe aufweisen, ist diese Einstellung nicht erforderlich.
  • Anschließend wird unter Verwendung des Filterschaltmechanismus 332 das Anregungslicht auf das Analysenfeld 12 gerichtet, indem man das Anregungslicht zwischen zwei Wellenlängenbanden von 490 nm und 595 nm als Median umschaltet. Die Fluoreszenz wird in jedem Fall erfasst. Dabei wird Anregungslicht mit einer Wellenlänge von 490 nm als Median zur Erfassung von Fluoreszenz von FAM-dCTP und Cy3-dATP verwendet und Anregungslicht mit einer Wellenlänge von 595 nm als Median wird zur Erfassung von Fluoreszenz von Texas Red-dGTP und Cy5-dTsTP verwendet.
  • Die von der Analysenprobe 12 emittierte Fluoreszenz wird durch den dichroitischen Fluoreszenztrennfilter 341 in ein Paar von Detektoren 343 geleitet. Da dabei der dichroitische Fluoreszenztrennfilter 341 eine glatte Reflexionscharakteristik für die vier Fluoreszenzwellenlängen-Farbbereiche aufweist, ist es möglich, ein Verhältnis der Fluoreszenzintensität an einem von der Analysenprobe s emittierten hellen Fleck unter Verwendung eines Paars von Detektoren 343 zu berechnen. Aus diesem Grund ist es durch Berechnung des Intensitätsverhältnisses auf den Bildebenen eines Paars von Detektoren 343 möglich, festzustellen, welche der vier Fluoreszenzfarben zur Fluoreszenz der Analysenprobe gehört. Es befinden sich mehrere zehntausend bis mehrere einhunderttausend Analysenproben s im Analysenfeld 12. Welche Position der Analysenproben s welche Fluoreszenz emittiert, wird in einem Ansatz durch die Fluoreszenzerfassung erfasst.
  • In 11 ist ein beispielhaftes Fluoreszenzbild k, das durch die Fluoreszenzerfassung erfasst wird, dargestellt. In 11 bezeichnet das Bezugszeichen „345“ Pixel des Fluoreszenzbilds k, das Bezugszeichen „13'“ bezeichnet einen Bereich auf dem Fluoreszenzbild k, der dem Absorptionsbereich 13 entspricht, und das Bezugszeichen „15'“ bezeichnet einen Bereich auf dem Fluoreszenzbild k, der dem Markerbereich 15 entspricht. 11 zeigt ein beispielhaftes Fluoreszenzbild, das dann erhalten wird, wenn die einzelnen Absorptionsbereiche 13 in einem Abstand von 1,4 µm angeordnet sind, die räumliche Auflösung der Erfassungseinrichtung 34 auf 0,28 µm/Pixel eingestellt wird und der Absorptionsbereich 13 im gleichen Abstand von fünf Pixeln des Fluoreszenzbilds k angeordnet ist. In diesem Beispiel weist die Analysenprobe s eine Größe von 0,28 µm oder mehr auf. Wenn die Fluoreszenz der Analysenprobe s erfasst wird, wird daher eine Probenposition in einem Abstand von fünf Pixeln vom Rand des Markerbereichs 15 angegeben und die Fluoreszenz von neun Pixeln (drei Pixel in jeder Richtung) wird für jede Position der einzelnen Analysenproben s erfasst.
  • Nach Beendigung der Erfassung der Fluoreszenz für ein einzelnes Analysenfeld 12 wird der Erfassungsbereich zum nächsten Analysenfeld 12 verschoben. Anschließend wird die Positionierung des XY-Tisches 351 erneut vorgenommen und die Fluoreszenz von diesem Analysenfeld 12 wird erfasst. Die Bewegung des XY-Tisches 351, die Positionierung der Analysenprobe s, die Speicherung der Position der Analysenprobe s und die Fluoreszenzerfassung werden wiederholt, bis die Erfassung für sämtliche Analysenfelder 12 beendet ist. Um dabei die Analysenzeit zu verringern, wird die Positionierung der Analysenprobe s nur für ein willkürliches Analysenfeld 12 durchgeführt, und die Positionsinformationen, die auf die vorstehend beschriebene Weise gespeichert werden, können für die übrigen Analysenfelder 12 verwendet werden. Vorstehend wurde somit kurz der Vorgang für einen einzelnen Zyklus bei dieser Analyse beschrieben.
  • Anschließend wird die Analyse für den zweiten und die anschließenden Zyklen durchgeführt. Bei der Tischbewegung des zweiten Zyklus und der anschließenden Zyklen wird die Positionierung durch Verschieben auf eine Position des ursprünglichen Analysenfelds 12, die bei der Positionierung des ersten Zyklus erhalten worden ist, durchgeführt. Diese Positionierung wird vorgenommen, um eine Wärmeausdehnung aufgrund einer internen Temperaturveränderung der Nucleinsäure-Analysenvorrichtung 600 zu korrigieren. Nach Beendigung der Positionierung wird die korrigierte Position gespeichert.
  • Für das folgende Analysenfeld 12 wird die Analyse durchgeführt, indem man eine Verschiebung zu einer relativen Position in Bezug zum anfänglichen Analysenfeld 12, das beim ersten Zyklus erhalten worden ist, vornimmt. Es wird beispielsweise angenommen, dass die anfänglichen Analysenfelder 12 des ersten Zyklus und die anschließenden beiden Analysenfelder 12 sich in den Positionen 1000 µm, 2000 µm bzw. 3000 µm befinden. Wenn das anfängliche Analysenfeld 12 des zweiten Zyklus sich bei 950 µm befindet, werden die folgenden beiden Analysenfelder 12 auf 1950 µm bzw. 2950 µm positioniert.
  • Bei diesem Vorgang können ein Fehler oder eine Positionsabweichung bei der Genauigkeit der wiederholten Positionierung des XY-Tisches 351 auftreten. Wenn die Genauigkeit der wiederholten Positionierung des XY-Tisches 351 ausreichend gering ist, kommt es nicht leicht zu einem Erfassungsverlust. Wenn jedoch die Genauigkeit der wiederholten Positionierung des XY-Tisches 351 hoch ist, ist dies nicht vernachlässigbar. Wenn die Genauigkeit der wiederholten Positionierung hoch ist, ist es erforderlich, die Analysenfelder 12 für die Positionierung unter Berücksichtigung des Erfassungsverlustes und der Erfassungszeit zu vergrößern.
  • Durch Wiederholung der vorerwähnten Zyklen werden die DNA-Basensequenzen der Analysenprobe s analysiert. Nimmt man beispielsweise an, dass eine bestimmte Analysenprobe s Fluoreszenz für jeden Zyklus in der Reihenfolge Cy3→Texas Red→FAM→Cy5→... emittiert, kann die Basensequenz der Probe zu „A→G→C→T→...“ aus dem dNTP entsprechend dem Fluorochrom bestimmt werden. Auf diese Weise wird die Fluoreszenz von mehreren zehntausend bis mehreren einhunderttausend Analysenproben s in einem Ansatz erfasst. Sämtliche Basensequenzen der Analysenproben s werden parallel bestimmt.
  • Obgleich die Analyse der DNA-Basensequenzen der Analysenproben s in diesem Beispiel mit dem ersten Zyklus beginnt, kann es sich beim ersten Zyklus um einen Kartierungsvorgang des Analysenfelds 12 handeln. Wenn bei diesem Kartierungsvorgang beispielsweise Texas Red-dGTP den DNA-Fragmenten sämtlicher Analysenproben einverleibt wird, emittieren sämtliche Analysenproben Fluoreszenz bei Verwendung von Anregungslicht mit einer Wellenlänge von 595 nm. Im Ergebnis ist es möglich, in zuverlässigerer Weise den Markerbereich zu erfassen. Es ist daher möglich, das Analysenfeld 12 zu verkleinern, wenn die Positionierung nicht durchgeführt wird.
  • Die Nucleinsäure-Analysenvorrichtung 600 weist die Durchflusszelle 500 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure auf, die mit dem Substrat 100 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure versehen ist. Selbst wenn die wiederholte Positionierung durchgeführt wird, ist es möglich, in reproduzierbarer Weise die Position des Absorptionsbereichs 13 zu erhalten. Infolgedessen ist es möglich, die Basensequenzen der DNA-Fragmente in zuverlässiger und rascher Weise zu analysieren.
  • Das Substrat zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure, die Durchflusszelle zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure und die Nucleinsäure-Analysenvorrichtung der vorliegenden Erfindung sind nicht auf die vorstehend beschriebenen Ausführungsformen beschränkt, vielmehr umfasst der Schutzumfang der Erfindung den in den Patentansprüchen beschriebenen Gegenstand, deren Äquivalente und sämtliche möglichen Abänderungen.
  • Beispielsweise weist zwar in den vorstehenden Ausführungsformen der Markerbereich 15 die Gestalt eines Kreuzes oder eines Hakens auf, es können aber beliebige Gestalten des Markerbereichs, zum Beispiel die Gestalt eines Sterns oder eines Kreises, verwendet werden, sofern die Position des Markerbereichs 15 im Analysenfeld 12 angegeben werden kann.
  • Das Substrat 400 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure mit den Markerbereichen 15, die in der Mitte und an den vier Ecken des Analysenfelds 12 ausgebildet sind, wurde anhand der 4 und 5 (a) bis 5 (c) beschrieben; jedoch kann der Schutzumfang der Erfindung auch ein Substrat ohne einen Markerbereich 15 in der Mitte oder mit Markerbereichen 15 nur in gegenüberliegenden Ecken umfassen.
  • Die Durchflusszelle 500 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure, die mit dem Substrat 100 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure versehen ist, wurde in den vorstehenden Ausführungsformen beschrieben; es können aber beliebige Substrate zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure verwendet werden, sofern sie die Anforderungen für die Konfiguration des Substrats zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung erfüllen.
  • Die Durchflusszelle 500 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure, die mit einem Paar von Abstandshaltern 22 versehen ist, die im Wesentlichen parallel im Abstand voneinander verlaufen, wurde unter Bezugnahme auf 7 beschrieben; jedoch kann die Durchflusszelle zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure auch drei oder mehr Abstandshalter aufweisen, wodurch sich eine Mehrzahl von Linien der Durchflusspassagen 23 ergibt. Beispielsweise kann eine Durchflusszelle zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure, die aus Polydimethylsiloxan (PDMS) oder dergleichen gebildet ist und mit einer ausgestanzten Platte, die durch Ausstanzen der Durchflusspassagenbereiche erhalten worden ist, verwendet werden.
  • Die Nucleinsäure-Analysenvorrichtung 600, die mit der Durchflusszelle 500 zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure versehen ist, wurde in den vorerwähnten Ausführungsformen beschrieben; es können jedoch auch beliebige Durchflusszellen zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure verwendet werden, sofern sie die Anforderungen bezüglich der Konfiguration der Durchflusszelle zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung erfüllen.
  • Die Nucleinsäure-Analysenvorrichtung 600 mit der Erfassungseinrichtung 34, die mit einem Paar von Detektoren 343 versehen ist, wurde anhand von 8 beschrieben; jedoch kann die Nucleinsäure-Analysenvorrichtung zusätzlich einen dichroitischen Fluoreszenztrennspiegel aufweisen und die Nucleinsäure-Analysenvorrichtung kann eine Erfassungseinrichtung 34 mit drei oder vier Detektoren aufweisen.
  • Bezugszeichenliste
    • 10
    Substrat
    11
    Reaktionsfeld
    12
    Analysenfeld
    13
    Absorptionsbereich
    14
    Nichtabsorptionsbereich
    15
    Markerbereich
    21
    Lichtdurchlässige Abdeckung
    22
    Abstandshalter
    23
    Durchflusspassage
    23a
    Einlassöffnung
    23b
    Auslassöffnung
    31
    Zirkulationseinrichtung
    32
    Temperatursteuereinrichtung
    33
    Bestrahlungseinrichtung
    34
    Erfassungseinrichtung
    35
    Transporteinrichtung
    100, 200, 300, 400
    Substrat zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure
    500
    Durchflusszelle zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure
    600
    Nucleinsäure-Analysenvorrichtung
    s
    Analysenprobe
    k
    Fluoreszenzbild

Claims (3)

  1. Nucleinsäure-Analysenvorrichtung, umfassend: eine Durchflusszelle zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure, die ein Substrat zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure aufweist; wobei das Substrat zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure eine Mehrzahl von auf einem Substrat verteilten Analysenfeldern zur Durchführung einer Messung durch sequenzielles Wechseln der einzelnen Analysenfelder aufweist, wobei das Analysenfeld einen Absorptionsbereich, der zur Absorption eines DNA-Fragments oder eines Vektors, der das DNA-Fragment trägt, befähigt ist und einen Nichtabsorptionsbereich, der sich vom Absorptionsbereich unterscheidet, aufweist, und wobei mindestens ein Teil des Nichtabsorptionsbereichs mit einem Markerbereich mit einer vorbestimmten Gestalt zur Berechnung einer Position des Analysenfelds versehen ist; eine Zirkulationseinrichtung, in der eine Flüssigkeit in einer Durchflusspassage der Durchflusszelle zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure zirkuliert; eine Temperatursteuereinrichtung, die die Reaktionstemperatur des DNA-Fragments steuert; eine Bestrahlungseinrichtung, die einen Strahl von Anregungslicht auf ein Analysenfeld, das als Analysenziel dient, durch die lichtdurchlässige Abdeckung richtet; eine Erfassungseinrichtung, die die vom DNA-Fragment aufgrund der Bestrahlung mit dem Anregungslicht unter Verwendung der lichtdurchlässigen Abdeckung emittierte Fluoreszenz erfasst und eine Position des Markerbereichs im Analysenfeld aufgrund der festgestellten Fluoreszenz erfasst; und eine Transporteinrichtung, die die Durchflusszelle zur Analyse einer Nucleinsäure trägt und das Analysenfeld durch Transport der Durchflusszelle auf eine bestimmte Position in Bezug zum Markerbereich verschiebt.
  2. Nucleinsäure-Analysenvorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Bewegung in eine vorbestimmte Position unter Verwendung der Transproteinrichtung im zweiten Zyklus und in den nachfolgenden Zyklen in einem anfänglichen Analysenfeld, das mindestens im ersten Zyklus analysiert worden ist, durchgeführt wird.
  3. Nucleinsäure-Analysenvorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Transporteinrichtung einen XY-Tisch, der dazu befähigt ist, die Durchflusszelle zur Verwendung bei der Analyse einer Nucleinsäure sowohl in Richtung der X-Achse als auch in Richtung der Y-Achse koplanar senkrecht zueinander zu transportieren, und einen Antriebsmotor, der den XY-Tisch antreibt, aufweist.
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