CN107735496A - 核酸分析用基板、核酸分析用流动池和核酸分析装置 - Google Patents

核酸分析用基板、核酸分析用流动池和核酸分析装置 Download PDF

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Abstract

本发明的目的在于，提供即使在对同一分析区域反复进行对位的情况下，也能够再现性良好地计算上述分析区域的位置的核酸分析用基板、以及具备该核酸分析用基板的核酸分析用流动池和核酸分析装置。本发明的核酸分析用基板(100)的特征在于，其为具有在基板(10)上划分而成的多个分析区域(12)、对上述各分析区域(12)依次更换而测定的核酸分析用基板(100)，上述分析区域(12)由能够吸附DNA片段或负载有上述DNA片段的负载体的吸附部(13)、以及上述吸附部(13)以外的非吸附部(14)构成，上述非吸附部(14)至少在一部分具备用于计算上述分析区域(12)的位置的预定形状的标记部(15)。

Description

核酸分析用基板、核酸分析用流动池和核酸分析装置
技术领域
本发明涉及核酸分析用基板、核酸分析用流动池和核酸分析装置。
背景技术
近年来，作为分析核酸的碱基序列的方法，已知平行分析多个DNA片段的碱基序列的方法。该方法中，例如，使用光刻技术、蚀刻技术等在基板上形成能够吸附DNA片段等的多个吸附部和难以吸附的非吸附部，使作为分析对象的DNA片段等吸附于上述吸附部而进行分析(例如参照专利文献1)。
在上述那样的分析方法中，对导入有带有对应于碱基的荧光色素的基质的含有多个DNA片段的分析区域照射激发光，检测由各DNA片段发出的荧光而确定碱基(例如参照非专利文献1)。
在这样的分析方法中，通常，上述分析区域在一块基板上设有多个，每次照射更换分析区域，在对全部分析区域进行分析后，使用聚合酶延伸反应导入新的带有荧光色素的基质，从而通过与上述同样的操作对各分析区域进行分析，通过重复上述操作，能够有效地确定碱基序列。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利申请公开第2009/0270273号说明书
非专利文献
非专利文献1：科学(Science)，2005年，第309卷，第1728-1732页
发明内容
发明要解决的问题
然而，在上述那样的以往技术中，在反复对同一分析区域进行分析时，有时分析区域在各循环中发生位置偏移，存在由于该位置偏移而难以在循环间进行DNA片段的图谱化，无法获得正确的碱基序列的担忧。
本发明是基于以上那样的情况而做出的，其目的在于，提供即使在对同一分析区域反复进行对位的情况下，也能够再现性良好地计算上述分析区域的位置的核酸分析用基板、以及具备该核酸分析用基板的核酸分析用流动池和核酸分析装置。
用于解决问题的方法
为了解决上述问题而做出的发明是一种核酸分析用基板，其特征在于，其为具有在基板上划分而成的多个分析区域、对上述各分析区域进行依次更换而测定的核酸分析用基板，
上述分析区域由能够吸附DNA片段或负载有上述DNA片段的负载体的吸附部、以及上述吸附部以外的非吸附部构成，
上述非吸附部至少在一部分具有用于计算上述分析区域的位置的预定形状的标记部。
此外，为了解决上述课题而做出的另一发明是一种核酸分析用流动池，其具备：
上述核酸分析用基板；
以与上述核酸分析用基板相对的方式配设的、使光透射的透光性盖板；
在上述核酸分析用基板与上述透光性盖板之间设置的、以相互大致平行且隔开的方式配设的多个间隔物；
在被上述核酸分析用基板与上述透光性盖板之间的相邻间隔物所夹的部位形成的、流体进行流通的流路；
开口于上述流路的一端的、将上述流体注入的注入口；以及
开口于与上述流路的上述注入口相反侧的另一端的、将上述流体排出的排出口。
进而，为了解决上述课题而做出的另一发明是一种核酸分析装置，其具备：
上述核酸分析用流动池；
使流体在上述核酸分析用流动池的流路中流通的流通单元；
调节DNA片段的反应温度的控温单元；
隔着透光性盖板对作为分析对象的分析区域照射激发光的照射单元；
透过上述透光性盖板检测由于上述激发光的照射而从DNA片段发出的荧光、并且根据检测到的上述荧光来检测上述分析区域中的标记部的位置的检测单元；以及
载置有上述核酸分析用流动池、以上述标记部为标志而使该分析区域移动至预定的位置的移动单元。
其中，本说明书中的“预定形状”是指，在分析区域中的位置的确定中使用的预定的俯视形状(例如十字状等)。此外，本说明书中的“预定的位置”是指，使作为分析对象的分析区域移动的预定的位置。此外，本说明书中的“多个间隔物”是下述概念：不仅包括由多个部件形成的间隔物，也包括由对片材进行冲孔而形成多个间隔物部的中空片材等单一部件形成的间隔物。
发明效果
本发明能够提供即使在对同一分析区域反复进行对位的情况下，也能够再现性良好地计算上述分析区域的位置的核酸分析用基板、以及具备该核酸分析用基板的核酸分析用流动池和核酸分析装置。
附图说明
图1是表示本发明的核酸分析用基板的第一实施方式的示意性俯视图。
图2是表示本发明的核酸分析用基板的第二实施方式的示意性俯视图。
图3是表示本发明的核酸分析用基板的第三实施方式的示意图，(a)表示该实施方式的俯视图，(b)表示荧光图像的一例。
图4是表示本发明的核酸分析用基板的第四实施方式的示意性俯视图，是将一个分析区域放大的图。
图5是表示使用图4的核酸分析用基板获得的荧光图像失真的状态的示意图，(a)表示荧光图像伸缩的状态，(b)表示荧光图像旋转的状态，(c)表示荧光图像旋转的另一状态。
图6是表示图1的核酸分析用基板的制作方法的示意图，(a)表示形成亲水性膜之前的状态，(b)表示形成亲水性膜之后的状态，(c)表示形成抗蚀剂膜之后的状态，(d)表示显影后的状态，(e)表示蚀刻后的状态，(f)表示除去抗蚀剂膜之后的状态。
图7是表示本发明的核酸分析用流动池的一例的示意性立体图，是将透光性盖板的一部分切断的图。
图8是表示本发明的核酸分析装置的一例的示意图。
图9是表示图8的核酸分析装置的控制过程的流程图。
图10是表示使用了本发明的核酸分析装置的分析方法的一例的示意图，(a)表示移动前的荧光图像中标记部的位置关系，(b)表示移动前的目标位置范围与标记部的位置关系，(c)表示移动后的目标位置范围与标记部的位置关系。
图11是表示使用了图1的核酸分析用基板的荧光图像的一例的示意图。
具体实施方式
＜核酸分析用基板＞
本发明的核酸分析用基板的特征在于，其为具有在基板上划分而成的多个分析区域、对上述各分析区域依次更换而测定的核酸分析用基板，上述分析区域由能够吸附DNA片段或负载有上述DNA片段的负载体(以下也将上述DNA片段和负载体统称为“分析样品”)的吸附部、以及上述吸附部以外的非吸附部构成，上述非吸附部在至少一部分具备用于计算上述分析区域的位置的预定形状的标记部。
以下，参照附图对本发明的核酸分析用基板的第一～第四实施方式进行说明，但本发明并非仅限于第一～第四实施方式和该附图中记载的实施方式。
[第一实施方式]
图1是表示本发明的核酸分析用基板的第一实施方式的示意性俯视图。如图1所示，示意性地，本实施方式的核酸分析用基板100具备基板10、反应区域11、分析区域12、吸附部13以及非吸附部14。其中，图1是依次将基板10中的反应区域11、分析区域12和标记部15(后述)放大的图。
基板10是在其一面上形成有反应区域11的板状基材。作为该基板10，可列举例如在石英板、硅板、合成树脂板等的表面上形成有疏水性薄膜的基板等。上述反应区域11是划分为后述多个分析区域12的区域。其中，在该实施方式中，反应区域11划分为140个分析区域12。
分析区域12是吸附分析样品s的区域。分析区域12由能够吸附分析样品s的多个吸附部13、以及吸附部13以外的非吸附部14构成。
吸附部13以能够吸附上述分析样品s的方式由层叠于基板10上的露出于表面的亲水性膜等形成。作为该亲水性膜，可列举例如导入有能够固定分析样品s的官能团(例如氨基等)的无机氧化物等的膜(以下也称为“特定无机氧化物”)等。作为该特定无机氧化物，可列举例如氨基硅烷等。
如图1所示，各分析区域12具有俯视呈圆形的多个吸附部13，各吸附部13呈棋盘格状排列。通过以这种方式，各分析区域12具有多个吸附部13，各吸附部13呈棋盘格状排列，从而能够容易且确实地掌握分析区域12内的吸附部13的位置。
其中，吸附部13的俯视时的直径通常为0.01～10μm。从提高吸附部13的形成容易性和分析样品吸附性的观点出发，作为上述直径的下限，优选为0.05μm，更优选为0.1μm，进一步优选为0.2μm。另一方面，从提高吸附部13的配置密度的观点出发，作为上述直径的上限值，优选为5μm，更优选为1μm，进一步优选为0.5μm。
此外，吸附部13的俯视时的直径也优选对应于使用该核酸分析用基板100的核酸分析装置的检测单元的空间分辨率(像素大小)。在这种情况下，从提高吸附部13的配置密度的观点出发，上述直径优选为1像素大小。
吸附部13的间距通常为0.05～50μm。作为上述间距的下限，从提高分析上相邻吸附部13彼此的防干扰性的观点出发，优选为0.1μm，更优选为0.5μm，进一步优选为1μm。另一方面，作为上述间距的上限，从提高吸附部13的配置密度的观点出发，优选为10μm，更优选为5μm，进一步优选为2μm。
此外，与上述直径同样地，吸附部13的间距也优选对应于核酸分析装置的检测单元的空间分辨率(像素大小)。在这种情况下，从提高荧光分辨率和吸附部13的配置密度的观点出发，上述间距优选为4～5像素大小，更优选为5像素大小。
非吸附部14由以能够防止上述分析样品s吸附的方式层叠于基板10上的疏水性膜形成。作为形成该疏水性膜的化合物，可列举例如多价性有机化合物、羧酸化合物、磷酸化合物、硫酸化合物和腈化合物、以及它们的盐等。其中，上述化合物可以单独使用或者组合两种以上而使用。
非吸附部14在其一部分具有用于计算分析区域12的位置的十字状的标记部15。发出荧光的DNA片段难以吸附于该标记部15，因此，能够容易地用分析区域12的荧光图像来区别吸附部13和标记部15。
接下来，对使用了第一实施方式涉及的核酸分析用基板100的分析区域12的对位进行说明。
使用了该核酸分析用基板100的情况下，如果对包括导入了吸附有带有对应于碱基的荧光色素的基质的DNA片段(分析样品)的吸附部13的分析区域12照射特定波长的激发光，则存在被该激发光激发的特定色素的吸附部13(以下也称为“特定吸附部”)发出荧光。其中，例如在进行4色荧光检测(分别对应于4种碱基的4种不同荧光的检测)的情况下，任意吸附部13中因特定波长激发光的照射产生的荧光概率约为25％。
这里，非吸附部14中在至少一部分具备用于计算分析区域12的位置的预定形状的标记部15(没有荧光的部位)，因而，通过所获得的荧光图像的搜索发现标记部15从而确定分析区域12的位置。接下来，基于所确定的分析区域12的位置移动该核酸分析用基板100，使该分析区域12与荧光图像的获得范围一致。由此，能够获得作为分析对象的分析区域12的荧光图像。
以这种方式，该核酸分析用基板100中，分析区域12的非吸附部14在至少一部分具备用于计算分析区域12的位置的预定形状的标记部15，因而即使在反复进行对位的情况下也能够再现性良好地计算分析区域12的位置，其结果是，能够确实且迅速地分析DNA片段的碱基序列。
[第二实施方式]
图2是表示本发明的核酸分析用基板的第二实施方式的示意性俯视图。如图2所示，示意性地，第二实施方式的核酸分析用基板200具备基板10、反应区域11、分析区域12、吸附部13以及非吸附部14。第二实施方式的核酸分析用基板200在下面一点上与第一实施方式是不同的：非吸附部14中的标记部15的俯视时的形状根据分析区域12的不同而不同。其中，基板10、反应区域11、分析区域12和吸附部13与第一实施方式是同样的，因此，对于同一部分赋予同一符号，省略其详细说明。
本实施方式中，标记部15的俯视时的形状是，至少相邻分析区域12彼此间相互不同。具体而言，如图2所示，核酸分析用基板200具有标记部15的俯视时的形状不同的2种分析区域12a、12b，这些种类不同的分析区域12a、12b交替(在奇数编号的分析区域12a与偶数编号的分析区域12b中，标记部15的形状不同)配设。该实施方式中，分析区域12a具有标记部15a，同时，分析区域12b具有标记部15b(参照图2的标记部15的形状)。
接下来，对使用了第二实施方式涉及的核酸分析用基板200的分析区域12的对位进行说明。
使用该核酸分析用基板200的情况下，外部计算机(未图示)中预先存储了奇数编号的分析区域12a和偶数编号的分析区域12b中各自的标记部15a、15b的形状。接下来，通过与第一实施方式的对位同样的方法在最初的分析区域12中进行对位。
接下来，进行通过激发光的照射进行的荧光的检测。该荧光的检测中，在获得作为对象的分析区域12的荧光图像时，识别标记部15的形状，基于所识别的形状，判断该分析区域12是奇数编号的分析区域12a还是偶数编号的分析区域12b。例如，将最初的分析区域12设定为奇数编号的情况下，只要核酸分析用基板200的输送单元(后述)没有失步等错误动作，则在该分析区域12a的分析后移动的相邻的分析区域12应当被识别为偶数编号的标记部15b。假如识别到不是偶数编号而是奇数编号的标记部15a、或者所获得的荧光图像中完全无法检测到荧光的情况下，则意味着该区域不是作为分析对象的分析区域12。
以这种方式，该核酸分析用基板200通过标记部15的俯视时的形状至少在相邻分析区域12彼此间相互不同，能够由标记部15的形状来区别各分析区域12，能够确实地分析作为分析对象的分析区域12。
其中，优选标记部15的俯视时的形状在全部分析区域12中是不同的。具体而言，作为标记部15的形状，可以采用例如模仿数字、能够区别的记号等的形状等(未图示)。
通过以这种方式标记部15的俯视时的形状在全部分析区域12中不同，因此能够由该标记部15的形状来明确区别各分析区域12，能够更确实地分析作为分析对象的分析区域12。
[第三实施方式]
图3是表示本发明的核酸分析用基板的第三实施方式的示意图。如图3(a)所示，示意性地，第三实施方式的核酸分析用基板300具备基板10、反应区域11、分析区域12、吸附部13以及非吸附部14。第三实施方式的核酸分析用基板300中，吸附部13和非吸附部14与第一实施方式不同。其中，基板10、反应区域11和分析区域12与第一实施方式是同样的，因此，对于同一部分赋予同一符号，省略其详细说明。此外，关于使用了第三实施方式涉及的核酸分析用基板300的分析区域12的对位，与第一实施方式是同样的，因此省略其详细说明。
本实施方式中，非吸附部14的整个区域是标记部15，分析区域12中的标记部15以外的区域是吸附部13。具体而言，如图3(a)所示，作为标记部15的十字状的非吸附部14形成于分析区域12的大致中心部，该分析区域12中的上述非吸附部14(标记部15)以外的全部区域为吸附部13。其中，图3(b)表示的是使用本实施方式的核酸分析用基板300得到的荧光图像k的一例。该图中，黑色背景中白色的点所表示的部分是对应于发出荧光的分析样品s的部位。
通过以这种方式，该核酸分析用基板300中，非吸附部14的整个区域为标记部15、分析区域12中的标记部15以外的区域为吸附部13，从而能够密集配置分析样品s，能够一次性进行更多的分析。
[第四实施方式]
图4是表示本发明的核酸分析用基板400的第四实施方式的示意性俯视图，是将一个分析区域12放大的图。示意性地，第四实施方式的核酸分析用基板400具备基板10、反应区域11、分析区域12、吸附部13以及非吸附部14。如图4所示，第四实施方式的核酸分析用基板400与第一实施方式不同的一点是，在标记部15设于分析区域12的中心部的基础上，进一步配设于4个角部。其中，基板10、反应区域11和分析区域12与第一实施方式是同样的，因此省略其详细说明。此外，吸附部13与第一实施方式是同样的，在图4中，方便起见，省略了有多个的吸附部13的记载。
本实施方式中，标记部15用于分析区域12内的各吸附部13位置的校正。具体而言，该核酸分析用基板400具备位于分析区域12的中心部的标记部15c、以及形成于该分析区域12的4个角部的L字状的标记部15d。此外，位于4个角部的标记部15d以下述方式配置：位于中心部的标记部15c与连接相邻角部的标记部15d的直线的间隔a相等。此外，虽然未图示，但各吸附部13在标记部15以外的分析区域中以5像素间隔呈棋盘格状排列。
接下来，参照图5，对于在使用了第四实施方式涉及的核酸分析用基板400的分析区域12内的各吸附部13的位置的校正进行说明。
例如，使用该核酸分析用基板400获得的荧光图像有失真的情况下，可以通过以下的方法进行吸附部13的位置的校正。即，如图5(a)所示，设为由于荧光图像k1的失真，对应于该荧光图像k1中心部的标记部15c的部位15c’(以下也称为“标记对应部15c’”)与连接对应于相邻角部的标记部15d的部位(标记对应部15d’)的直线的间隔为b、c、d、e。在这种情况下，作为推测实际的吸附部13的位置的方法，例如可列举如下方法等：对于以标记对应部15c’为中心的左上、右上、左下、右下区域分布进行插值的线性插值方法。
例如，作为上述线性插值方法的一例，分别对b、c、d、e求出与a(参照图4)之商，乘以5像素大小，从而算出实际间距。具体而言，算出：比图5(a)所示的标记对应部15c’更靠近B侧的区域的BD方向的实际间距为b/a×5像素大小，比标记对应部15c’更靠近E侧的区域的CE方向的实际间距为e/a×5像素大小，比标记对应部15c’更靠近D侧的区域的BD方向的实际间距为d/a×5像素大小，比标记对应部15c’更靠近C侧的区域的CE方向的实际间距为c/a×5像素大小，用它们进行各吸附部13的位置的校正。
其中，荧光图像的失真依赖于核酸分析装置的检测器，因此，上述计算仅在第一循环最初的分析区域12进行即可，使用该计算结果进行以后分析的分析区域12的校正。此外，使用2台以上的上述检测器进行分析的情况下，在各检测器中进行上述计算和校正。
另一方面，关于相对于对该核酸分析用基板400照射的激发光的光轴的旋转方向的荧光图像的失真(偏差)，可以通过以下的方法进行吸附部13的位置的校正。即，如图5(b)所示，由利用检测器得到的荧光图像k2中的标记对应部15d’算出倾角θ1。接下来，通过进行与算出的倾角θ1相应的修正来进行旋转方向的校正。其中，荧光图像k的旋转方向的失真依赖于核酸分析装置的检测器，因此，上述计算仅在第一循环最初的分析区域12进行即可，使用该计算结果进行以后分析的分析区域12的校正。此外，使用2台以上的检测器进行分析的情况下，在各检测器中进行上述计算和校正。例如，图5(c)显示了利用与上述检测器不同的另一检测器检测到的荧光图像k3(倾角θ2)。
通过以这种方式，标记部15用于分析区域12内的各吸附部13位置的校正，能够正确掌握分析区域12中各吸附部13的位置。
＜核酸分析用基板的制作方法＞
接下来，对上述核酸分析用基板的制作方法进行说明。图6是表示图1的核酸分析用基板100的制作方法的示意图。该核酸分析用基板100可以使用例如使用日本特开2011-99720号公报的方法来制作。即，使用在一面上预先层叠有疏水性薄膜的基板10(参照图6(a))，在上述疏水性薄膜上，通过例如真空气相沉积法、溅射气相沉积法、CVD法、PVD法等，气相沉积由特定无机氧化物等形成的亲水性的薄膜16(参照图6(b))。
接下来，在得到的亲水性的薄膜16上涂布抗蚀剂17后(参照图6(c))，使用光刻技术进行预定的图形化(参照图6(d))，以图形化的抗蚀剂17作为掩模，通过蚀刻将不需要的亲水性薄膜除去(参照图6(e))，将剩下的抗蚀剂17溶解除去(参照图6(f))，从而能够制作形成有由亲水性薄膜16构成的期望的吸附部13的核酸分析用基板100。其中，分析区域12中的吸附部13以外的部位露出上述疏水性薄膜，因此成为非吸附部14。
＜核酸分析用流动池＞
本发明的核酸分析用流动池具备：上述核酸分析用基板；以与上述核酸分析用基板相对的方式配设的、使光透射的透光性盖板；在上述核酸分析用基板与上述透光性盖板之间设置的、以相互大致平行且隔开的方式配设的多个间隔物；在被上述核酸分析用基板与上述透光性盖板之间的相邻间隔物所夹的部位形成的、流体进行流通的流路；开口于上述流路的一端的、将上述流体注入的注入口；以及开口于与上述流路的上述注入口相反侧的另一端的、将上述流体排出的排出口。
以下，参照附图对本发明的核酸分析用流动池进行说明，但本发明并非仅限于该附图中记载的实施方式。
图7是表示本发明的核酸分析用流动池的一例的示意性立体图，是将透光性盖板的一部分切断而得的图。如图7所示，示意性地，该核酸分析用流动池500具备核酸分析用基板100、透光性盖板21、间隔物22以及流路23。予以说明，在本实施方式中，使用上述核酸分析用基板100作为核酸分析用基板，因此，对同一部分赋予同一符号，省略其详细说明。
透光性盖板21是以与核酸分析用基板100相对的方式配设的、透光的平板状盖板。作为透光性盖板的材质，可列举例如苏打玻璃、石英玻璃、蓝宝石玻璃等玻璃、透明聚酰亚胺树脂、聚碳酸酯树脂等透光性树脂等。
间隔物22设于核酸分析用基板100与透光性盖板21之间，以相互大致平行且隔开的方式配设。该核酸分析用流动池500具有多个间隔物22。作为间隔物22的材质，可列举例如日本特开2006-87974号公报中记载的热固性、光固性的环氧树脂、丙烯酸树脂、硅树脂等。其中，从提高与上述玻璃、透光性树脂的粘接强度的观点出发，优选为硅树脂，更优选为聚硅氧烷，进一步优选为聚二甲基硅氧烷(PDMS)。此外，作为间隔物22的厚度没有特别限制，从减少所使用的试剂量和制作容易性的观点出发，优选为0.05～2mm，更优选为0.2～1mm。
流路23是在被核酸分析用基板100与透光性盖板21之间的相邻间隔物22所夹的部位形成的、流体流通的流路。例如与DNA片段反应的试剂等流体在该流路23中流动。具体而言，流路23由下述大致长方体的空间构成：核酸分析用基板100与透光性盖板21、间隔物22之间围成的、顺着流动方向的截面形成为长方形、在流动方向上为长条状。流路23具有开口于其一端的、将流体注入的注入口23a、以及开口于与注入口23a相反侧的另一端的、将流体排出的排出口23b。
以这种方式，该核酸分析用流动池500具备该核酸分析用基板100，因而在进行核酸分析时，即使在反复进行对位的情况下，也能够再现性良好地计算分析区域12的位置，其结果是，能够确实且迅速地分析DNA片段的碱基序列。
＜核酸分析用流动池的制作方法＞
接下来，对核酸分析用流动池500的制作方法进行说明。该核酸分析用流动池500是，例如在上述核酸分析用基板100上，以使2根间隔物22相互平行的方式，使用粘接剂进行粘接。接下来，使用粘接剂在所粘接的间隔物22上粘接透光性盖板21。予以说明，上述粘接剂的种类只要不对核酸分析产生影响就没有特别限定。通过以上的方式，能够制作本发明的核酸分析用流动池500。
＜核酸分析装置＞
本发明的核酸分析装置具备：上述核酸分析用流动池；使流体在上述核酸分析用流动池的流路中流通的流通单元；调节DNA片段的反应温度的控温单元；隔着透光性盖板对作为分析对象的分析区域照射激发光的照射单元；隔着上述透光性盖板检测由于上述激发光的照射而从DNA片段发出的荧光、并且根据检测到的上述荧光来检测上述分析区域中的标记部的位置的检测单元；以及载置有上述核酸分析用流动池、以上述标记部为标志而使该分析区域移动至预定的位置的移动单元。
以下，参照附图对本发明的核酸分析装置进行说明，但本发明并非仅限于该附图中记载的实施方式。
图8是表示本发明的核酸分析装置的一例的示意图。如图8所示，示意性地，该核酸分析装置600具备核酸分析用流动池500、流通单元31、控温单元32、照射单元33、检测单元34以及移动单元35。其中，核酸分析用流动池500与上述＜核酸分析用流动池＞一项中说明的核酸分析用流动池500是同样的，因此，对同一部分赋予同一符号，省略其详细说明。
流通单元31使流体在核酸分析用流动池500的流路23中流通。流通单元31具备：收纳含有试剂的多个试剂容器311的试剂冷却保存库312；进入试剂容器311的喷嘴313；将上述试剂导入核酸分析用流动池500的管线314；以及将已与DNA片段反应的试剂等废弃的废液罐315。
控温单元32调节DNA片段的反应温度。控温单元32设于后述XY平台351上，具备促进所分析的DNA片段(分析样品s)与上述试剂的反应的控温基板321。控温基板321内置有例如帕尔帖元件。
照射单元33具备：作为激发光的LED(发光二极管)等光源331；能够对于从光源331射出的激发光选择任意波长的滤镜切换机构332；反射上述激发光且使后述荧光透射的分色镜333；对所分析的分析样品s照射激发光的物镜334；以及在与上述X轴和Y轴两轴正交的Z轴方向上驱动物镜334来调节上述激发光的焦点的Z平台335。
检测单元34隔着透光性盖板21检测由于激发光的照射而从DNA片段发出的荧光，并且根据检测到的荧光来检测分析区域12中的标记部15的位置。检测单元34具备：回收分析样品s发出的荧光的物镜334；将来自物镜334的平行光按荧光波长进行分割的荧光分离用分色镜341；使平行光成像的管状透镜342；以及具有检测成像而得的像的CMOS传感器等传感器的检测器343。其中，检测单元34的物镜334兼用作上述照射单元33，因此，被赋予了同一符号。
移动单元35载置有核酸分析用流动池500，以标记部15为标志而使分析区域12移动至预定的位置。移动单元35具备能够向在同一平面内正交的X轴和Y轴的各方向输送的XY平台351、以及驱动XY平台351的驱动用马达(未图示)。其中，XY平台351以开环方式控制。
＜分析方法＞
接下来，参照图8～图11对使用了本发明的核酸分析装置600的DNA片段的碱基序列的分析方法进行说明。予以说明，在这里，分析样品s是负载有DNA片段的负载体，以使用了具备上述第一实施方式的核酸分析用基板100的核酸分析用流动池500的情况为例进行说明。
使用了该核酸分析装置600的分析可以通过例如组合以下例示的“流动池的准备”、“流动池的设置”、“试剂的导入”、“温度调节”、“平台的移动”和“平台的对位”等步骤来进行。以下对上述各步骤详细说明，但使用了该核酸分析装置600的分析并非仅限于以下记载的方式。
[流动池的准备]
该步骤中，准备预先负载了分析样品s的核酸分析用流动池500(参照图7)。如图1所示，核酸分析用流动池500内的核酸分析用基板100在基板10上的各分析区域12中具有吸附部13和非吸附部14，非吸附部14的中央部形成有十字状的标记部15。其中，仅在吸附部13负载有分析样品s。
[流动池的设置]
该步骤中，将在上述[流动池的准备]中准备的核酸分析用流动池500固定于设置在核酸分析装置600的XY平台351上的控温基板321上。
[试剂的导入]
该步骤中，流通单元31的喷嘴313进入试剂冷却保存库312内的试剂容器311，吸取试剂。接下来，通过管线314和注入口23a将吸取的试剂注入核酸分析用流动池500内的流路，使注入的试剂与负载于吸附部的分析样品s接触并反应。其中，上述反应后的试剂通过管线丢弃在废液罐315中。
[温度调节]
该步骤中，利用控温基板321对核酸分析用流动池500进行温度调节，以分析样品s达到预定的温度的方式调节。通过该温度调节，核酸分析用流动池500内的分析样品s与试剂反应。此时，适当重复上述试剂的导入和温度调节，进行DNA的延伸反应。该延伸反应通过使聚合酶与分别用不同荧光色素标记的4种核苷酸反应而进行。上述核苷酸是FAM-dCTP、Cy3-dATP、Texas Red-dGTP、Cy5-dTsTP。试剂中含有聚合酶，仅加入1碱基的、与DNA片段互补的荧光核苷酸。
[平台的移动]
该步骤中，为了观察已反应的分析样品s，利用驱动用马达(未图示)驱动XY平台351，使核酸分析用流动池500向预先设定的位置移动。这里，上述“预先设定的位置”的意思是，作为目标的最初的分析区域12的位置，检测单元34的荧光检测范围内，标记部15存在的位置。其中，对于平台的正确对位，在后述[平台的对位]步骤中进行详述。
[平台的对位]
该步骤中，首先，驱动检测单元34的Z平台335，调节物镜334中分析样品s的焦点位置。接下来，使物镜334移动至焦点位置后，使用滤镜切换机构332对分析样品s照射特定波长的激发光。此时，通过激发光的照射，只有负载于吸附部13的分析样品s中对应于激发波长的分析样品s发出荧光。另一方面，标记部15不发出荧光。
接下来，使用检测单元34获得荧光图像k。此时，例如上述4色荧光检测的情况下，分析样品s有1/4的概率是发出荧光的，因而，能够识别获得的荧光图像k中不发出荧光的标记部15的形状。接下来，如图10所示，对于荧光图像k获得范围，搜寻形状预先存储于计算机(未图示)的标记部15。此时，如果能够搜寻到标记部15，则算出标记部15中心的X轴、Y轴的像素值(荧光图像k中的标记部15的像素换算的坐标)(参照图10(a))。假如无法搜寻到标记部15，则驱动XY平台351向下一分析区域移动。另外，如果上述算出的像素值在目标位置范围344内，则不进行XY平台351的对位。另一方面，如果上述算出的像素值在目标位置范围344外，则算出该像素值相对于目标位置范围344内的中心位置的相对像素数Xa、Ya(参照图10(b))。接下来，变换为对位算出的Xa、Ya所需的脉冲数，向移动单元35发送信号。该信号发送后，驱动移动单元35的驱动用马达，使XY平台351移动(参照图10(c))。
接下来，再次进行激发光的照射以及利用检测单元34进行的标记部15的位置检测，确认标记部15是否移动至目标位置范围344内。此时，如果标记部15在目标位置范围344内，则XY平台351的对位结束。另一方面，如果标记部15在目标位置范围344外，则再次进行上述对位。接下来，该对位结束后，存储该位置(上述脉冲数)。另外，在XY平台351的对位后标记部15的位置没有变化的情况下，视为驱动用马达的失步，发出警报，中止分析。
[荧光检测]
该步骤中，再次驱动检测单元34的物镜334，调节焦点位置。予以说明，焦点位置的再次调节是为了校正XY平台的移动导致的垂直方向的偏差，如果检测单元34和分析样品s具有充分的景深，则不需要本调节。
接下来，使用滤镜切换机构332切换中央值为波长490nm和595nm的2段波长带的激发光，同时对分析区域12照射该激发光，每次检测荧光。这里，中央值为波长490nm的激发光是为了对FAM-dCTP和Cy3-dATP进行荧光检测而使用的，中央值为波长595nm的激发光是为了对Texas Red-dGTP和Cy5-dTsTP进行荧光检测而使用的。
从分析样品12发出的荧光通过荧光分离用分色镜341进入2个检测器343。这里，荧光分离用分色镜341具有对4色荧光波长区域柔和的反射特性，因而能够使用2个检测器343分别算出从分析样品s发出的亮点的荧光强度比。因此，通过算出2个检测器343中的成像面上的强度比，能够判断该分析样品s的荧光属于上述4色荧光中的哪一种。其中，分析区域12中负载有数万～数十万的分析样品s，通过荧光检测，一次性检测哪一位置的分析样品s发出何种荧光。
接下来，将通过荧光检测检测到的荧光图像k的一例示于图11。图11中，符号345表示荧光图像k的像素，符号13’表示荧光图像k上对应于吸附部13的部位，符号15’表示荧光图像k上对应于标记部15的部位。图11是各吸附部13以1.4μm间隔配置、检测单元34的空间分辨率为0.28μm/像素、吸附部13以与荧光图像k的5像素间隔同样的间隔配置时的荧光图像的例子。此外，该例子中，分析样品s的大小为0.28μm以上。因此，检测分析样品s的荧光时，从十字状的标记部15一端开始，以5像素间隔确定样品位置，按各分析样品s的位置进行9像素(3像素见方)的荧光检测。
一个分析区域12中的荧光检测结束后，移动至下一分析区域12。接下来，再次进行XY平台351的对位，进行该分析区域12中的荧光检测。重复这样的XY平台351的移动、分析样品s的对位、分析样品s的位置的存储和荧光检测，直至全部分析区域12结束。其中，为了缩短分析时间，可以上述分析样品s的对位仅在任一分析区域12中进行，在其他分析区域12中使用上述存储的位置信息来进行。以上是该分析中1个循环的动作的大体情况。
接下来，进行第二循环以后的操作。第二循环以后的平台移动中，向通过上述第一循环的对位得到的最初的分析区域12的位置移动，进行对位。该对位是为了校正核酸分析装置600内部的温度变化所导致的热膨胀而进行的。该对位结束后，存储经校正的位置。
下一分析区域12以后，移动至相对于通过第一循环中得到的最初的分析区域12的位置。例如，设为第一循环中的最初的分析区域12和之后的2个分析区域12的位置分别为1,000μm、2,000μm、3,000μm。而在第二循环的最初的分析区域12为950μm的情况下，以后的2个分析区域12的位置分别为1,950μm和2,950μm。
另外，该动作中，存在根据XY平台351的返回位置决定精度的误差发生位置偏移的可能性。XY平台351的返回位置决定精度充分小的情况下，检测损失几乎不发生，但在XY平台351的返回位置决定精度大的情况下，不能忽视。假如上述返回位置决定精度大的情况下，需要考虑检测损失和检测时间，增加进行对位的分析区域12。
重复以上的循环，对分析样品s的DNA碱基序列进行分析。例如，如果设为某一分析样品s按循环发出Cy3→Texas Red→FAM→Cy5→···的荧光，则可以根据对应于荧光色素的dNTP确定样品的碱基序列为A→G→C→T→…。以这种方式，一次性对数万～数十万的分析样品s进行荧光检测，平行确定这些分析样品s全部的碱基序列。
予以说明，该例子中从第一循环开始分析样品s的DNA碱基序列分析，但第一循环也可以设为分析区域12的制图动作。该制图动作中，例如如果将Texas Red-dGTP加入全部分析样品的DNA片段中，则利用595nm的激发光，全部分析样品发出荧光。由此，能够更确实地检测标记部，因而能够减少无法对位的分析区域12。
以这种方式，该核酸分析装置600具备具有该核酸分析用基板100的核酸分析用流动池500，因而即使在反复进行对位的情况下也能够再现性良好地计算吸附部13的位置，其结果是，能够确实且迅速地分析DNA片段的碱基序列。
予以说明，本发明的核酸分析用基板、核酸分析用流动池和核酸分析装置并非限定于上述实施方式的构成，旨在包括权利要求所示的、与权利要求等同的意思和范围内的全部变更。
例如，上述实施方式中，作为标记部15的形状，例示了十字状、钩状的标记部，但只要能够确定分析区域12中的标记部15的位置，就可以采用任何形状的标记部，例如星形、圆形等。
此外，图4和图5中，对标记部15在分析区域12的中心部和4个角部形成的核酸分析用基板400进行了说明，但上述中心部未形成标记部15的基板、仅在一对对角设有标记部15的基板等也属于本发明的范畴。
此外，上述核酸分析用流动池500的说明中，对具备核酸分析用基板100的流动池进行了说明，但只要满足本发明的核酸分析用基板的构成，就可以采用任何核酸分析用基板。
此外，图7中，对具备以相互大致平行且隔开开的方式配设的2块间隔物22的核酸分析用流动池500进行了说明，但也可以是具备3块以上的间隔物22、具备多条流路23的核酸分析用流动池，可以采用例如具备使使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)等材料形成的流路部中空而得的中空片材的核酸分析用流动池等。
此外，上述核酸分析装置600的说明中，对具备核酸分析用流动池500的装置进行了说明，但只要满足本发明的核酸分析用流动池的构成，就可以采用任何核酸分析用流动池。
此外，图8中，对检测单元34具备2个检测器343的核酸分析装置600进行了说明，但也可以是增设荧光分离用分色镜、检测单元34具有3个或4个检测器的核酸分析装置。
符号的说明
10 基板
11 反应区域
12 分析区域
13 吸附部
14 非吸附部
15 标记部
21 透光性盖板
22 间隔物
23 流路
23a 注入口
23b 排出口
31 流通单元
32 控温单元
33 照射单元
34 检测单元
35 移动单元
100、200、300、400 核酸分析用基板
500 核酸分析用流动池
600 核酸分析装置
s 分析样品
k 荧光图像

Claims (8)

1.一种核酸分析用基板，其特征在于，其为具有在基板上划分而成的多个分析区域、依次更换所述各分析区域而测定的核酸分析用基板，
所述分析区域由能够吸附DNA片段或负载有所述DNA片段的负载体的吸附部、以及所述吸附部以外的非吸附部构成，
所述非吸附部在至少一部分具备用于计算所述分析区域的位置的预定形状的标记部。
2.根据权利要求1所述的核酸分析用基板，标记部的俯视时的形状至少在相邻分析区域彼此间互不相同。
3.根据权利要求2所述的核酸分析用基板，标记部的俯视时的形状在全部分析区域中是不同的。
4.根据权利要求1至权利要求3中任一项所述的核酸分析用基板，各分析区域具有多个吸附部，所述各吸附部呈棋盘格状排列。
5.根据权利要求1至权利要求3中任一项所述的核酸分析用基板，非吸附部的整个区域为标记部，分析区域中的所述标记部以外的区域为吸附部。
6.根据权利要求1至权利要求5中任一项所述的核酸分析用基板，标记部用于分析区域内的各吸附部位置的校正。
7.一种核酸分析用流动池，其具备：
权利要求1至权利要求6中任一项所述的核酸分析用基板；
以与所述核酸分析用基板相对的方式配设的、使光透射的透光性盖板；
在所述核酸分析用基板与所述透光性盖板之间设置的、以相互大致平行且隔开的方式配设的多个间隔物；
在被所述核酸分析用基板与所述透光性盖板之间的相邻间隔物所夹的部位形成的、流体进行流通的流路；
开口于所述流路的一端的、将所述流体注入的注入口；以及
开口于与所述流路的所述注入口相反侧的另一端的、将所述流体排出的排出口。
8.一种核酸分析装置，其具备：
权利要求7所述的核酸分析用流动池；
使流体在所述核酸分析用流动池的流路中流通的流通单元；
调节DNA片段的反应温度的控温单元；
隔着透光性盖板对作为分析对象的分析区域照射激发光的照射单元；
隔着所述透光性盖板检测由于所述激发光的照射而从DNA片段发出的荧光、并且根据检测到的所述荧光来检测所述分析区域中的标记部的位置的检测单元；以及
载置有所述核酸分析用流动池、以所述标记部为标志而使该分析区域移动至预定的位置的移动单元。
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