JP2004531743A - 二次元生化学分析画像のフラット・フィールド補正 - Google Patents

Abstract

電気泳動ゲルにおける二次元溶質ゾーンの光学的画像が、光源又はゲルの下の光分散によって生ずるような非一様性に関して補正される。補正は基準プレートを用いて行われ、基準プレートは光を一様に吸収する又は光を一様に透過することにより又は励起されて光を放出することにより長さと幅の方向で光源に対して一様に応答する。したがって、基準プレートの画像における非一様性又は偏差は光学系の非一様性又は偏差だけから生ずる。類似の補正は、マイクロアレーやマイクロタイター・アレーなど、他の二次元分析画像においても行われる。

Description

【技術分野】
【０００１】
発明の背景
１．発明の属する技術分野
本発明は、二次元電気泳動ゲルの読み取りで用いられるような二次元画像システムに関し、詳しくは、光学系で遭遇する、光学系の一部である光源や光分散に内在する非一様性を生ずる問題に関する。
【背景技術】
【０００２】
２．従来技術
二次元電気得移動ゲルでは、蛍光染料、化学発光ラベル、比色ラベル、ならびに光吸収などを用いて溶質ゾーンの位置を示す。溶質を構成する個々のタンパク質、核酸、その他の分子種の同定と定量は多くの場合に電子画像を生成することによって行われる。そのような画像を形成できるデバイスの一例は電荷結合素子、又はCCD、であり、これは画素の二次元配列を含み、それが入射する光をゾーンの配列に対応する電荷パケットの二次元電子アレーに変換する。光学系が一様でないと、画像が歪み。結果の正確さが損なわれる。このような非一様性を補正する方法は、米国特許Nos. 5.799,773(1998年9月1日交付)、5,891,314(1999年4月6日交付)、5,897,760(1999年4月27日交付)、5,951,838(1999年9月14日交付)（すべてがHeffelfinger, D.M., and C. Van Hornを発明者として列記し、Bio-Rad Laboratories, Inc. に譲渡されている）に開示されている。これらの特許で開示された方法は、走査光源を用いて一様な照明を実現したり、ミラーやビーム・スプリッターを用いて光源をサンプルしたり、ある範囲の開口と倍率の設定に対する補正データを生成したりいろいろな仕方でレンズと検出器装置の校正を含んでいる。
【０００３】
ある種の非一様性は、ゲルの下の光源と光分散から生じており、本発明は特にこのような非一様性に向けられている。
【発明の開示】
【０００４】
発明の簡単な要約
二次元電気得移動ゲルの下の光源と光分散の非一様性による画像の不規則性は、ゲルの画像を入射光に対して長さと幅の方向で一様に応答する基準プレートの画像と比較することによって補正できることが見出された。したがって、ゲルの溶質ゾーンが画像になる仕方に応じて、例えば、基準プレートは光を一様に吸収及び／又は透過する、又はプレートに一様に分布する蛍光物質を含み、入射光によって一様に励起される。基準プレートは、画像形成システムに、ゲルと独立に、すなわち、ゲルの代わりに載置され、基準プレートの画像はゲルの画像と同じ仕方で取り込まれる。次に、２つの画像が比較され、好ましくは画素毎に比較され、ゲル画像は基準プレートの画像の非一様性又は偏差を考慮に入れる適当な公式又はアルゴリズムによって補正される。基準プレートの画像はフラット・フィールド画像と呼ぶことができ、補正されたゲルの画像は同様にフラット・フィールド補正画像と呼ぶことができる。
【０００５】
電気泳動ゲルは、一般の二次元生化学分析の一例であり、本発明は、結果を二次元画像として読みとることができるどんな生化学分析にも拡張される。このような画像は、強度又は大きさを示す値と二次元平面内の前記の値の場所という光学的に検出される両方のデータを含む。電気泳動ゲル以外にこのような画像を検出できる分析媒質の例としては、マイクロアレーやマイクロタイター・プレートなどがある。
【０００６】
本発明のいくつかの実施の形態では、画像は、適当な光源からの励起によって生成されてCCDやその他の電子検出器で検出される蛍光信号の配列であり、基準プレートは光源と検出器の間に置かれた蛍光基準プレートである。蛍光物質は基準プレート全体の一様に分布しており、したがって、光源によって励起されると蛍光が基準プレートの全体から放出される。すなわち、本発明のこれらの実施の形態によれば、一様に蛍光的なプレートが、別の場合にはゲルが占める位置に置かれ、光源が作動してプレートの画像が生成される。画像は記録され、ゲルの画像を表す電子データを補正するのに使用するために記憶される。
【０００７】
発明と好ましい実施の形態の詳細な説明
本発明の実施の形態において、分析媒質が二次元電気泳動厚板ゲルである場合、分析結果は公知のいろいろな電気泳動法のいずれかによって分離された溶質ゾーンの列である。各ゾーンの位置は、そのゾーンを占める溶質が何であるかという指標を、場合によってはその溶質が最初に存在していたサンプルのアイデンティティーを示し、各ゾーンの強度はもとのサンプルにおけるその溶質の量又は濃度を示す。二次元の配列は、個々のゲルのレーンで同時に行われるいろいろなサンプルの一連の平行な直線の分離を表す。あるいはまた、二次元の配列は、二次元電気泳動から生じた列を表す、すなわち、第１段階の直線の分離に続いて第２段階の分離が最初の方向と直角方向に行われて、第１段階で形成されたゾーンがさらにサブゾーンに分離される。さらに別のやり方としては、２つの互いに直交する方向で交替する振動又は交流電界によって溶質混合物を分離するものがある。
【０００８】
本発明の実施の形態で、分析媒質が核酸マイクロアレー・テクノロジーで用いられているようなマイクロアレーである場合、媒質は普通、二次元の格子パタンでポリリシンでコーティングされた顕微鏡スライドに配置されたPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)生成物のファミリーである。典型的な分析の手順は、ある細胞から抽出され蛍光ラベルで標識された標的の核酸によるスライド上の核酸とのハイブリダイゼーションを含む。スライドの蛍光を画像にして分析することによって、どのPCR生成物が標的の核酸とハイブリダイズするかが決定され、PCR生成物はスライド上の場所によって同定される。その他のバリエーションは当業者には周知である。
【０００９】
本発明の実施の形態で、分析媒質がマイクロタイター・プレートである場合、個々の分析はプレートのいろいろなウエルのそれぞれで行われ、媒質を画像化して分析することによって、各分析の結果が決定され、分析が行われたウエルの位置によってその結果が特定の分析と同定される。
【００１０】
いずれの場合でも、基準プレートは分析媒質と同じ寸法の、又は少なくとも媒質の画像化される部分と同じ寸法のフラット・プレートであることが好ましい。プレートの厚さは決定的に重要ではなく、16分の1インチ（0.16cm）から2分の1インチ（1.27cm）までの範囲にあるが、好ましい厚さは約8分の1インチ（0.32cm）である。基準プレートは入射光に対してその長さと幅の方向で一様に応答する、すなわち、基準プレート自身は、どの点においても他の点と異なる仕方で光を吸収又は透過させるような非一様性を何も含まない。本発明のいくつかの実施の形態では、一様な厚さの蛍光基準プレートであり、それは光源の像を透過させずに光を透過させ、蛍光染料で着色されているか又は白色である。プレートは光源から入射する光を分散させ、光源に由来する以外の空間的変動を含まないような仕方で光を検出器の方へ放出する。分析結果が蛍光ラベルで示され、分析媒質からの蛍光信号によって画像が生成されるシステムでは、基準プレートは蛍光染料、例えば、赤やオレンジ色の染料を有する。分析結果が、光放出ではなく光源からの光の吸収によって生成されるシステムでは、適当な基準プレートの一例は、光源からの紫外光を白色に変換する光透過性の蛍光白色染料である。
【００１１】
本発明の実施で用いられる画像生成システムと基準プレートは、二次元電気泳動ゲルの画像化で使用される、又は使用できることが知られている、どんなタイプの光源で照らしても良い。多くの用途で、画像化は紫外光で行われており、したがって、紫外光が好ましい光源である。
【００１２】
ゲルの画像化と基準プレートの画像化はどんな順序で行っても良い。しかし、好ましい手順は、分析媒質を最初に画像化し、分析媒質を画像化した後で基準プレートを画像化するものである。この手順を、例えば、電気泳動ゲルに適用すると、ユーザーはまず、溶質ゾーンが分離された後でゲルを画像化システムのプラテンにゲルを載せて、透光（transillumination）又は落射（epi-illumination）によってゲルの像を生成する。こうして光透過のパタンが検出されてディジタル・データとして記憶されるが、まだ表示されない。次に、ユーザーはゲルを除去し、プラテンを清浄にしてゲルの代わりに適当な基準プレートをプラテンに載せる。次に、基準プレートの基準画像が取り込まれ、ディジタル・データとして記憶される。この画像からのデータを用いて、ゲル画像からのデータを補正する。次に、補正されたデータが表示される。
【００１３】
データの補正は、２つの画像を比較して、基準画像における非一様性又は偏差に基づいてゲル画像を補正する何らかの式又はアルゴリズムによって行われる。この比較と補正は、ソフトウエアによって容易に実行されて、それによって補正された画像を表示することができる。例えば、好ましい画像化のプロセス１つは、画像が画素の二次元の配列から成り、配列の中の画素の位置は直交座標XとYで定められるようなものである。その場合、各画素に関して補正は、知られている比の式：
Piff(XY) = Pi(XY)×(Aν_Flat/P(XY)_Flat)
を用いて、ソフトウエアによって実行できる、ここで：
Piff(XY)は、位置XYにおける画素の補正された値
Pi(XY)は、位置XYにおける画素の補正される前の値
Aν_Flat は、基準プレートで得られた値の平均から得られた係数
P(XY)_Flat は、基準プレートの位置XYにおける画素の値、である。
【００１４】
次に、補正された画素を寄せ集めて補正された画像を構成する。補正のその他のアルゴリズム及び方法は当業者には明らかであろう。
【００１５】
本発明が適用できるゲル画像化システムの例としては、Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, California, USA, のVersaDoc^TMシステムがあげられる。照明は、紫外光又は白色光である。
【００１６】
以上の記述は、主として説明のためである。当業者ならば本明細書を読んで、本発明の精神と範囲を逸脱することなくさらにいろいろなバリエーション、変更及び置き換えが可能であることを認められるであろう。

Claims (12)

1. 二次元生化学分析媒質における光学的に検出可能な生化学分析結果を検出する方法であって、以下のステップ、すなわち：
   (a) 二次元光学画像化システムにおいて光源からの光で前記分析媒質を照射して前記分析媒質の二次元画像を生成するステップ；
   (b) 基準プレートを、前記分析媒質と独立に、前記二次元光学画像化システムにおいて前記光源からの光で照射して前記基準プレートの二次元画像を生成するステップ、ここで前記基準プレートは、入射光に対して前記基準プレートの長さ及び幅の方向で一様に応答する；及び
   (c) 前記分析媒質の前記画像を前記基準プレートの前記画像と比較して、前記基準プレートの前記画像に示された前記光学画像化システムの非一様性に関して前記分析媒質の前記画像を補正するステップ；
   を含み、ステップ(a)と(b)は任意の順序で行われ、(c)は(a)と(b)の両方が完了した後で行われることを特徴とする方法。
2. 前記分析媒質が電気泳動ゲルであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記分析媒質が顕微鏡スライド上のマイクロアレーであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
4. 前記分析媒質がマイクロタイター・プレートであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
5. 前記基準プレートが光を一様に吸収するものであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
6. 前記基準プレートが入射光によって一様に励起されて蛍光を放出することを特徴とする請求項１に記載の方法。
7. 前記入射光が紫外光源からのものであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
8. 前記入射光が白色光源からのものであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
9. 前記生化学分析は蛍光ラベルをもつ分析試薬によって結果が示される分析であり、前記基準プレートは蛍光染料を含む明澄透明なプレートであり、前記入射光が前記蛍光ラベル及び前記蛍光染料を励起させて蛍光を放出させる光源からのものであり、ステップ(a)と(b)が蛍光信号の画像を生成するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
10. 前記生化学分析は選ばれた波長で光を吸収する比色ラベルをもつ分析試薬によって結果が示される分析であり、前記基準プレートは前記選ばれた波長で光を一様に吸収し、ステップ(a)と(b)が吸収の画像を生成するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
11. ステップ(a)がステップ(b)の前に行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
12. ステップ(a)と(b)の前記二次元画像が画素の二次元アレーから成り、各前記アレーにおける画素の位置が直交座標XとYによって定められ、各前記画素は前記光学画像化システムによって検出可能な値を有し、ステップ(c)が前記ゲルの前記ゲル画像の各画素を次の関係：
    Piff(XY) = Pi(XY)×(Aν_Flat/P(XY)_Flat)
    ここで：
    Piff(XY)は、前記ゲルの前記画像の座標XとYにおける画素の補正された値
    Pi(XY)は、前記ゲルの前記画像の座標XとYにおける画素の補正される前の値
    Aν_Flat は、基準プレートの前記画像の全ての画素の値の平均に等しい係数
    P(XY)_Flat は、基準プレートの前記画像の座標XとYにおける画素の値、
    に従って補正するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。