JP2004101354A - 生化学的検査用画像処理方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】サンプル画像に含まれる微細パターンの発光輝度を示すシグナルを、簡易な処理で正確かつ迅速に検出できる生化学的検査用画像処理方法を提供できる。
【解決手段】生化学検査用アレイ（１）に励起照明を与えて光画像をサンプル画像として撮り込み、各プローブアレイ要素から発生した蛍光を示す微細パターンの画像を該サンプル画像から除いた背景画像を、レファレンス画像として抽出し、該レファレンス画像で前記サンプル画像を補正する。
【選択図】 図１
【解決手段】生化学検査用アレイ（１）に励起照明を与えて光画像をサンプル画像として撮り込み、各プローブアレイ要素から発生した蛍光を示す微細パターンの画像を該サンプル画像から除いた背景画像を、レファレンス画像として抽出し、該レファレンス画像で前記サンプル画像を補正する。
【選択図】 図１
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生化学的反応の状態を検査する生化学的検査用の画像処理方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
最近、「ハイブリダイゼーションによる配列決定」（ＳＢＨ）のために、アレイドハイブリダイゼーション（ａｒｒａｙｅｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）反応の幾つかの方法が開発されている。これには、例えば膜上に格子状配列された異なるオリゴヌクレオチドプローブとＤＮＡ試料のアレイとの段階的なハイブリダイゼーションの方法を用いたＳＢＨがある。
【０００３】
また、従来「ジェノセンサー（ｇｅｎｏｓｅｎｓｏｒ）」なる語は、その中で二次元アレイの表面に標的核酸配列と相補配列の認識素子としてのオリゴヌクレオチドを結合する方式を称してきた。さらに、ジェノセンサーの概念には、ハイブリダイゼーションを迅速に検出することができ、各試験部位に微細電子部品が存在する微細加工装置が含まれる。
【０００４】
このような二次元アレイに対して、近年以下のような新規なフロースルージェノセンサーが提供されている。そこでは、固形支持材料のウェハーにわたり斑点状に配され密充填された孔またはチャンネル内に、核酸認識素子が固定化されている。支持ウェハーとして有用なマイクロチャンネルまたはナノチャンネルのガラス及び多孔性シリコンの製造には、公知の微細加工技術を利用できる。このフロースルージェノセンサーは、微細加工された光学及び電子工学検出部品、フィルム、荷電結合素子アレイ、カメラシステム及びりん光貯蔵技術を包含する種々の公知の検出方法を利用している。このフロースルー装置については、公知の平面表面設計に比して以下の利点が得られる。
【０００５】
（１）表面積が膨大に増大したことにより、検出感度が改善される。
【０００６】
（２）ハイブリダイゼーション反応に要する時間が短縮し（平均標的分子が表面に結合したプローブに出くわすのに要する時間が、数時間から数ミリ秒に短縮され）、ハイブリダイゼーションがスピード化され、順反応及び逆反応の両方において誤対合識別ができる。
【０００７】
（３）多孔性ウェハーを通して溶液を徐々に流動できるため、希薄な核酸溶液を分析することができる。
【０００８】
（４）大気に曝される平面表面上のプローブ溶液の小液滴が迅速に乾燥するのを避けられることにより、各分離領域内の表面に対するプローブ分子の化学結合が促進する。
【０００９】
以上の利点を有するこのフロースルー装置を、以後三次元アレイと称する。このような三次元アレイに関する従来技術として、特表平９−５０４８６４号公報を引用し、図１２を用いてその構成及び作用を簡単に説明する。
【００１０】
図１２は、三次元アレイをなすテーパ付き試料ウェルアレイを示す図である。図１２において、多孔性のガラスウェハー１０１には、複数のテーパ孔１０２が配設されており、これら各孔１０２にテーパ付きウェル１０３が埋設されている。テーパ付きウェル１０３は、そこに固定した生体分子の結合領域を構成する０．１−１０μｍ直径のチャンネル１０４を底部に含む。各チャンネル１０４は図示のように多くの微小の貫通孔１０５を有している。このウェルアレイを用い、以下のステップで検出を行なう。
【００１１】
（１）３−グリシドキシプロピル−トリメトキシシラン４ｍｌ、キシレン１２ｍｌ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（フーニッヒ（Ｈｕｎｉｇ）塩基）０．５ｍｌの溶液をウェハーの孔に流入させ、次いで、そのウェハーを８０℃の該溶液に５時間浸漬し、次いで、テトラヒドロフランでフラッシュし、８０℃にて乾燥することにより、ウェハーをエポキシシラン−誘導体化ガラスとする。
【００１２】
（２）５′−または３′−アルキルアミン（化学合成の間に導入した）を有する複数のオリゴヌクレオチドプローブを、水に１０μＭ−５０μＭにて溶解し、それぞれ多孔性のガラスウェハー１０１（シリカウェハー）に微量分注する。６５℃にて一晩反応させた後、その表面を６５℃の水、次いで１０ｍＭトリエチルアミンで簡単に流し、表面上の未反応エポキシ基を取り除く。次いで、６５℃の水で再度流し、風乾することにより、アミン−誘導化オリゴヌクレオチドをエポキシシラン−誘導体化ガラスに結合させる。
【００１３】
（３）増幅の間に産物に［３２Ｐ］ヌクレオチドを取り込ませるポリメラーゼ連鎖反応によるか、またはガンマ−３２Ｐ［ＡＴＰ］＋ポリヌクレオチド・キナーゼを用いて増幅産物を５′−標識することによって、標的ＤＮＡ（分析物）を調製する。取り込まれなかった標識は、セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）濾過によって除去する。好ましくは、１のＰＣＲ断片を５′−ビオチン標識すれば、ストレプトアビジン・アフィニティークロマトグラフィーによる一本鎖の調製ができる。少なくとも５ｎＭ（５ｆｍｏｌ／μｌ）の濃度であって、少なくとも５，０００ｃｐｍ／ｆｍｏｌの特異活性のハイブリダイゼーション緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、２ｍＭＥＤＴＡ、３．３Ｍ塩化テトラメチルアンモニウム）中に標的ＤＮＡを溶解する。数百塩基長のＰＣＲ断片が、少なくともオクタマー長の表面につなぎ留めたオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに適している。
【００１４】
（４）標的ＤＮＡ試料をチップの多孔性領域に流し込み、６℃にて５〜１５分間インキュベートし、ハイブリダイゼーションを行なう。次いで、１８℃にて同様の時間、多孔性チップを通してハイブリダイゼーション溶液を流動させることによって洗浄する。別法として、塩化テトラメチルアンモニウムの代わりに、１ＭＫＣＬもしくはＮａＣｌまたは５．２Ｍベタインを含有する緩衝液でハイブリダイゼーションを行なうこともできる。
【００１５】
（５）ＣＣＤジェノセンサー装置を用いてハイブリダイゼーション強度の検出及び定量を行なう。ＣＣＤジェノセンサー装置は、高解像度及び高感度のものを用い、化学ルミネセント、蛍光または放射能標識用として用意される。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
従来では、図１２に示した三次元アレイを用いて生化学検査を行なう場合、まず生化学検査用アレイを製作する。そして、顕微鏡観察下に配置された標準反射板に励起照明を与えて、レファレンス画像をＣＣＤカメラで撮り込む。次に前記反射板を排出し、これと同じ位置に生化学検査用アレイを配置し、蛍光分子で標識された被検サンプルの溶液を供給し、各プローブとサンプル溶液中の物質とで結合反応を生じさせる。続いて生化学検査用アレイに励起照明を与えて、蛍光画像をＣＣＤカメラで撮り込みサンプル画像とする。このサンプル画像をレファレンス画像で補正することにより、多数のプローブアレイ要素３すなわち微細パターンから発生した蛍光を検出している。
【００１７】
しかし従来では、標準反射板を配置してレファレンス画像を得るため、専用の手段が必要となり装置が大型化するとともに、サンプル画像を補正するまでの処理時間が長くなる。また、レファレンス画像を取得する際に、標準反射板上のゴミ等によりノイズが混入することもあり、蛍光輝度を示すシグナルの検出精度に影響を及ぼす。また、標準反射板の保守等も煩雑であるという問題がある。
【００１８】
本発明の目的は、サンプル画像に含まれる微細パターンの発光輝度を示すシグナルを、簡易な処理で正確かつ迅速に検出できる生化学的検査用画像処理方法を提供することにある。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決し目的を達成するために、本発明の生化学的検査用画像処理方法は以下の如く構成されている。
【００２０】
（１）本発明の生化学的検査用画像処理方法は、生化学的物質の溶液を、表面に該生化学的物質に特異的に反応する生化学的物質が各々保持されている生化学検査用アレイに供給し、発光性分子による標識を用いて前記生化学検査用アレイの各プローブアレイ要素ごとに前記発光性分子の発光強度をアレイ型検出器で検出することにより、前記生化学的物質と該生化学的物質に特異的に反応する生化学的物質との反応状態を前記各プローブアレイ要素ごとに検査する生化学的検査用の画像処理方法であり、前記生化学検査用アレイの画像をサンプル画像として撮り込み、前記各プローブアレイ要素から発生した光の強度を示す微細パターンの画像を該サンプル画像から除いた背景画像を、レファレンス画像として抽出し、該レファレンス画像で前記サンプル画像を補正する。
【００２１】
（２）本発明の生化学的検査用画像処理方法は上記（１）に記載の方法であり、かつ前記微細パターンの画像に対して収縮処理を施した後に膨張処理を施すことにより前記レファレンス画像を抽出する。
【００２２】
（３）本発明の生化学的検査用画像処理方法は上記（２）に記載の方法であり、かつ前記収縮処理及び前記膨張処理は、所定形状のカーネルを用い、前記微細パターンを消滅させるのに必要な回数分実行する。
【００２３】
（４）本発明の生化学的検査用画像処理方法は上記（３）に記載の方法であり、かつ前記収縮処理及び前記膨張処理は、３×３画素の十字形カーネルを用い、前記微細パターンの外接円の最大半径以上に相当する画素数を処理回数とする。
【００２４】
（５）本発明の生化学的検査用画像処理方法は上記（３）に記載の方法であり、かつ前記収縮処理及び前記膨張処理は、「前記微細パターンの外接円の最大直径以上に相当する画素数」×「前記外接円の最大直径以上に相当する画素数」画素の円形カーネルを用い、処理回数を１とする。
【００２５】
（６）本発明の生化学的検査用画像処理方法は上記（１）乃至（５）のいずれかに記載の方法であり、かつ前記サンプル画像の各画素の輝度値を、対応する前記レファレンス画像の各画素の輝度値で除算することにより、前記サンプル画像を補正する。
【００２６】
（７）本発明の生化学的検査用画像処理方法は上記（１）乃至（５）のいずれかに記載の方法であり、かつ前記サンプル画像の各画素の輝度値から、対応する前記レファレンス画像の各画素の輝度値を減算することにより、前記サンプル画像を補正する。
【００２７】
（８）本発明の生化学的検査用画像処理方法は上記（１）乃至（５）のいずれかに記載の方法であり、かつ前記レファレンス画像の各画素について、（レファレンス画像の最大輝度値／該画素の輝度値）を算出し、その値を対応する前記サンプル画像の各画素の輝度値に乗じて、前記サンプル画像を補正する。
【００２８】
（９）本発明の生化学的検査用画像処理方法は上記（１）乃至（８）のいずれかに記載の方法であり、かつ前記レファレンス画像に平滑化処理を施し、前記サンプル画像を補正する。
【００２９】
（１０）本発明の生化学的検査用画像処理方法は上記（１）乃至（９）のいずれかに記載の方法であり、かつ前記微細パターンの画像は、蛍光標識された多数の微小スポットを有する前記生化学検査用アレイを励起光で照明して得られる蛍光画像であり、前記サンプル画像を補正することにより前記各微小スポットの蛍光輝度を示す信号を検出する。
【００３０】
上記手段を講じた結果、それぞれ以下のような作用を奏する。
【００３１】
（１）本発明の生化学的検査用画像処理方法によれば、サンプル画像に含まれる微細パターンの発光輝度を示すシグナルを正確に検出することができる。
【００３２】
（２）本発明の生化学的検査用画像処理方法によれば、微細パターンのシグナルが消滅し背景のシグナルのみが表われたレファレンス画像を正確に抽出することができる。
【００３３】
（３）本発明の生化学的検査用画像処理方法によれば、微細パターンのシグナルを確実に消滅させることができる。
【００３４】
（４）本発明の生化学的検査用画像処理方法によれば、短時間の処理で微細パターンのシグナルを確実に消滅させることができる。
【００３５】
（５）本発明の生化学的検査用画像処理方法によれば、短時間の処理で微細パターンのシグナルを確実に消滅させることができる。
【００３６】
（６）本発明の生化学的検査用画像処理方法によれば、レファレンス画像による簡易な処理でサンプル画像に対して照明むらを補正することができる。
【００３７】
（７）本発明の生化学的検査用画像処理方法によれば、レファレンス画像による簡易な処理で背景画像からノイズを除去することができる。
【００３８】
（８）本発明の生化学的検査用画像処理方法によれば、レファレンス画像による簡易な処理でサンプル画像を補正することができる。
【００３９】
（９）本発明の生化学的検査用画像処理方法によれば、微細パターンのシグナルをより正確に検出できる。
【００４０】
（１０）本発明の生化学的検査用画像処理方法によれば、生化学検査用アレイ上の微小スポット内のプローブとサンプル溶液に含まれる生化学的物質との間に生じる特異的な結合反応を、各微小スポットごとに正確に検査することができる。
【００４１】
【発明の実施の形態】
図１は、本発明の実施の形態に係る生化学的検査用画像処理方法を実施する顕微鏡装置の構成を示す図である。図１において、励起光源１１には、水銀光源等が用いられる。この光源１１から出射される励起光の光路上には、シャッター１２、レンズ１３、励起フィルタ１４、およびダイクロイックミラー１５が配置され、このダイクロイックミラー１５の反射光路上には、対物レンズ１６および後述する生化学検査用アレイ１が配置されている。また、ダイクロイックミラー１５の透過光路上には、蛍光フィルタ１７、結像レンズ１８、およびＣＣＤカメラ１９が配置されている。ＣＣＤカメラ１９には画像処理部２０が接続され、画像処理部２０には表示部２１が接続されている。
【００４２】
図２は、本実施の形態で使用する生化学検査用アレイの概略構成を示す図であり、（ａ）は上面のフォーマットを示す図、（ｂ）は一部側面図である。生化学検査用アレイ１は、図１２に示した三次元アレイからなる。図２の（ａ）に示すように、生化学検査用アレイ１にはプローブアレイ要素３（微小スポット）が二次元に配列されている。これらプローブアレイ要素３は、図１２に示したようにテーパ付きウェル１０３からなり、底部に０．１−１０μｍ直径のチャンネル１０４を有し、さらに各チャンネル１０４は図２の（ｂ）に示すように多くの微小な貫通孔１０５を有している。各貫通孔１０５の壁面には、プローブ３１が結合している。
【００４３】
すなわち生化学検査用アレイ１では、プローブの結合反応を確実にするために、望ましくは多孔性ガラスウェハー１０１の表面の異なるテーパ付きウェル１０３にそれぞれプローブの溶液が供給され、該溶液中に含まれるプローブを多孔性ガラスウェハー１０１の内部に設けられた各チャンネル１０４の各貫通孔１０５で保持するのが良いが、多孔性ガラスウェハー１０１を設けずに、直接各貫通孔１０５にプローブの溶液を微量分注して保持しても良い。この貫通孔１０５を含む部材が、多孔質または繊維質の物質あるいは成形物から成る立体構造の反応担体として構成される。
【００４４】
以下、本実施の形態における生化学検査の概略を説明する。
【００４５】
まず検査者は、顕微鏡観察下に生化学検査用アレイ１を配置する。この生化学検査用アレイ１には、あらかじめプローブアレイ要素ごとに異なるプローブをプローブアレイ要素３に固相化してある。
【００４６】
次に検査者は、該生化学検査用アレイ１に蛍光分子で標識された被検サンプルの溶液を供給し、各プローブとサンプル溶液中の物質とで結合反応を生じさせた後、未結合の前記物質をプローブアレイ要素３から除去する。
【００４７】
次に、該生化学検査用アレイ１（基板）に励起照明を与えて、サンプル画像をＣＣＤカメラ１９で撮り込む。このサンプル画像は、標識に使用する蛍光物質の種類数だけ撮り込まれる。このサンプル画像は、励起強度に比例するバックグラウンド（背景）を示す画像上に、同じく励起強度に比例する多数のプローブアレイ要素３から発生した蛍光の微細パターンが散在し、さらに励起強度と無関係なノイズが加わった画像となる。なお、蛍光物質の劣化を防止するために、撮り込まれた後直ちにシャッター１２などで励起照明を遮断するのが好ましい。
【００４８】
次に、画像処理部２０は、サンプル画像から微細パターンを除いたバックグラウンド画像を抽出し、それぞれレファレンス画像とする。そして画像処理部２０は、各レファレンス画像で対応する各サンプル画像を補正する。これにより、サンプル画像に含まれる微細パターンのシグナルが正確に検出される。
【００４９】
図３は、本実施の形態による検査手順を示すフローチャートである。以下、図３に従って検査方法およびその作用を説明する。
【００５０】
（１）ステップＳ１：まず検査者は、ＦＩＴＣなどの蛍光分子で標識された生化学的物質の溶液を作成する。
【００５１】
（２）ステップＳ２：検査者は、生化学検査用アレイ１に生化学的物質の溶液を供給し、各プローブと特異的に反応させる。この場合検査者は、図１に示した蛍光顕微鏡の観察下で、試料面に図２の（ａ）に示す生化学検査用アレイ１を配置し、その表面に一様に生化学的物質の溶液を供給する。これにより、生化学検査用アレイ１上のプローブアレイ要素３内のプローブと溶液に含まれる生化学的物質との間に特異的な結合反応が生じる。この結果、各プローブアレイ要素３内で反応の強さに応じた数量の蛍光分子が間接的にプローブに結合することになる。
【００５２】
（３）ステップＳ３：検査者は、生化学検査用アレイ１から未反応の生化学的物質を除去する。この場合検査者は、前述した結合反応後に、生化学検査用アレイ１の各プローブアレイ要素３から未結合の生化学的物質を除去する。一般的には洗浄液を用いて洗浄する方法が採用されるが、反応担体が立体構造である場合には洗浄液を用いずにポンプなどで溶液ごと除去しても良い。但し、洗浄液を用いる方が確実に除去されることは言うまでもない。
【００５３】
（４）ステップＳ４：検査者は、生化学検査用アレイ１の画像をサンプル画像としてＣＣＤカメラ１９で撮り込む。この場合、生化学検査用アレイ１を励起光源１１で励起照明して、蛍光画像を撮り込む。
【００５４】
励起光源１１からの励起光は、レンズ１３、励起フィルタ１４を介してダイクロイックミラー１５で反射され、対物レンズ１６を介して生化学検査用アレイ１の上面全体に照射される。生化学検査用アレイ１のプローブアレイ要素３内のサンプル物質に結合している蛍光分子から発生した蛍光と共に、バックグラウンドを形成する生化学検査用アレイ１における反射光、生化学検査用アレイ１の自家蛍光、外部から混入する迷光などが、対物レンズ１６、ダイクロイックミラー１５、バンドパスフィルタ１７および結像レンズ１８を介して、ＣＣＤカメラ１９に入射し、サンプル画像が撮り込まれる。ＣＣＤカメラ１９で撮り込んだサンプル画像は、画像処理部２０へ送られる。
【００５５】
なお、本実施の形態では受光素子としてＣＣＤを用いているが、ＣＣＤに特定するものではなく、他のエリアセンサを用いても良い。従って、以下に記述される「ＣＣＤ」は「エリアセンサ」でも通用するものである。
【００５６】
図４は、サンプル画像の例を等輝度線を用いて示した図である。図４において４１は二次元的に配列された微細パターンの等輝度線、４２はバックグラウンドの等輝度線であり、該バックグラウンドの等輝度線４２付近の数字は該バックグラウンドの等輝度線の輝度を示す。
【００５７】
図５は、サンプル画像の輝度分布を示す図であり、横軸は画素（ピクセル）番地、縦軸は輝度（階調）を示し、図４に示すサンプル画像上の所定の画素行Ｌの輝度分布を表わしている。今、バックグラウンドが一様な輝度値５００を有し、微細パターンを示すシグナルの輝度が全て５００である時に、形成されるサンプル画像は、一様なバックグラウンドの輝度値５００からのシグナルの突出量は全て５００となる。しかし、中央画素付近で最大輝度値５００であるような、むらのある励起照明でバックグラウンドが形成される場合のサンプル画像は、図５に示すように、励起照明むらを含むバックグラウンドを示すシグナル（信号）５２上に該バックグラウンドの輝度分布に比例するシグナル５１が突出した分布となる。
【００５８】
（５）ステップＳ５：画像処理部２０は、各サンプル画像に対して収縮処理を行なう。このとき、例えば図６の（ａ）に示す３×３画素からなる十字形カーネルを適用する。画像処理部２０は、サンプル画像の各画素に、図６の（ａ）に示す十字形カーネルの中心画素６１を当てはめ、この中心画素６１の輝度を斜線部で示す５画素（中心画素６１自身とその上下左右の４画素）の最小輝度に置き換える処理、すなわち収縮処理を行なう。
【００５９】
この収縮処理をサンプル画像の全画素に対して１回行なうと、周囲の１画素分だけ収縮する。この収縮処理を、微細パターン４１の外接円の最大半径に相当する画素数（例えば１３画素）以上の回数分実行すると、サンプル画像は、全微細パターンが消滅しバックグラウンドのみに変調された画像となる。
【００６０】
なお、この収縮処理は、３×３画素からなる十字形カーネル以外に円形カーネルも適用できる。例えば、図６の（ｂ）に示す５×５画素からなる円形カーネルを用いることもできる。
【００６１】
（６）ステップＳ６：画像処理部２０は、ステップＳ５で収縮処理された各サンプル画像に対して膨張処理を行なう。このときも、例えば図６の（ａ）に示す３×３画素からなる十字形カーネルを適用する。画像処理部２０は、収縮処理されたサンプル画像の各画素に、図６の（ａ）に示す十字形カーネルの中心画素６１を当てはめ、この中心画素６１の輝度を斜線部で示す５画素の最大輝度に置き換える処理、すなわち膨張処理を行なう。
【００６２】
この膨張処理を収縮処理されたサンプル画像の全画素に対して１回行なうと、周囲の１画素分だけ膨張する。この膨張処理を、微細パターン４１の外接円の最大半径に相当する画素数（例えば１３画素）以上の回数分実行すると、サンプル画像は、変調されたバックグラウンド画像が、シグナルの全微細パターンが消滅した状態で、復調した画像となる。この画像をレファレンス画像とする。また、この膨張処理は、３×３画素からなる十字形カーネル以外に円形カーネルも適用できる。例えば、図６の（ｂ）に示す５×５画素からなる円形カーネルを用いることもできる。
【００６３】
図７は、ステップＳ５およびステップＳ６により得られたレファレンス画像の等輝度線図であり、等輝度線付近の数字は各等輝度線の輝度を示す。図７では、図４に示したサンプル画像から微細パターン４１が消滅し、バックグラウンド４２１のみが表わされている。
【００６４】
図８は、レファレンス画像の輝度分布を示す図であり、横軸は画素（ピクセル）番地、縦軸は輝度（階調）を示している。図８は、サンプル画像に対して収縮処理と膨張処理を実行した後の輝度分布を表わしている。図８では、図５にてバックグラウンドを示すシグナル５２上に突出していた微細パターンを示す七つのシグナル５１が消滅し、バックグラウンドを示すシグナル５２１のみが表われている。
【００６５】
（７）ステップＳ７：画像処理部２０は、図８に示したレファレンス画像の輝度分布から最大輝度を検出する。そして画像処理部２０は、レファレンス画像の各画素に対して（レファレンス画像の最大輝度／画素の輝度）を算出し、サンプル画像に乗じて補正サンプル画像を得る。
【００６６】
言い換えれば、画像処理部２０により、サンプル画像をレファレンス画像で除算し、これに一定値であるレファレンス画像の最大輝度を乗じて補正サンプル画像を得る。ここで、一定値であるレファレンス画像の最大輝度は輝度レベルを補正前のサンプル画像に合わせるためのものであり、レファレンス画像の最大輝度に限定しなくても、後述の効果を損なうものではない。すなわち、レファレンス画像の最大輝度の代わりに１を採用しても良く、この場合、画像処理部２０は、サンプル画像の各画素の輝度値を、対応する前記レファレンス画像の各画素の輝度値で除算することにより、補正サンプル画像を得る。
【００６７】
図９は、サンプル画像に「レファレンス画像の最大輝度／画素の輝度」を乗じることにより得られた補正サンプル画像を示す図である。図９では、微細パターン４１１が表わされているとともに、バックグラウンド４２２が一定強度５００の輝度分布で表わされている。
【００６８】
図１０は、補正サンプル画像の輝度分布を示す図であり、横軸は画素（ピクセル）番地、縦軸は輝度（階調）を示している。図１０は、サンプル画像に対して補正を実施した後の輝度分布を表わしている。図１０では、バックグラウンドを示すシグナル５２２は、輝度値がほぼ一定値（約５００）となっている。バックグラウンドを示すシグナル５２２上に突出している微細パターンを示す七つのシグナル５１１は、最大輝度値がほぼ一定値１０００すなわち突出量が５００となっている。このように微細パターンを示す各シグナル５１１の突出量は７個共ほぼ一定値５００となり、これはバックグラウンドに影響されず、正確な輝度値を示している。従って、前記突出量を求め、これを補正後のシグナル輝度値とすれば、正確な輝度値が得られることになる。
【００６９】
なお、上記ステップＳ６で得たレファレンス画像に対して、画像処理部２０で平滑化処理（ローパスフィルタ処理）を行なうこともできる。このとき、例えば図６の（ｃ）に示す１１×１１画素からなる円形カーネルを適用する。画像処理部２０はレファレンス画像の各画素に、１１×１１画素からなる円形カーネルの中心画素を当てはめ、この中心画素の輝度を円形カーネル中の９７画素の平均輝度で置き換える処理、すなわち平滑化処理を行なう。微細パターン４１の外接円の最大半径が例えば１３画素である場合、この平滑化処理をレファレンス画像の全画素に対して例えば１０回実行する。
【００７０】
図１１は、平滑化処理されたレファレンス画像の輝度分布を示す図であり、横軸は画素（ピクセル）番地、縦軸は輝度（階調）を示している。図１１では、図８におけるバックグラウンドを示すシグナル５２１に表われていた輝度値の段差が消滅し、滑らかなシグナル５２３となっている。
【００７１】
以上のように平滑化処理されたレファレンス画像を基にして上記ステップＳ７で補正サンプル画像を得る。その補正サンプル画像の輝度分布では、図１０における微細パターンを示す七つのシグナル５１１の頂部が平坦になる。このようにレファレンス画像に平滑化処理を施すことにより、補正サンプル画像上の微細パターンを示す各シグナルは、より正確な輝度値を示すことになる。
【００７２】
また上記ステップＳ５，Ｓ６で、画像処理部２０は、３×３画素または５×５画素以外に限らず任意の形状のカーネルを用いて、収縮処理と膨張処理を実行することができる。例として、「微細パターン４１の外接円の最大直径（例えば２６画素）以上に相当する画素数」×「前記外接円の最大直径以上に相当する画素数」画素の円形カーネル、例えば２７×２７画素からなる円形カーネルを用い、収縮処理と膨張処理を１回実行してもよい。このように、所定形状のカーネルを用い、微細パターンを消滅させるのに必要な回数分、収縮処理と膨張処理を実行することにより、レファレンス画像を得ることができる。
【００７３】
以上のように、むらのある励起照明でバックグラウンドが形成される場合は、除算処理が有効である。一方、これに反して、暗電流ノイズや迷光ノイズなどの励起照明以外のノイズで形成される場合には減算処理が有効である。すなわち画像処理部２０は、サンプル画像の各画素の輝度値から、対応する前記レファレンス画像の各画素の輝度値を減算することにより、補正サンプル画像を得る。これにより、バックグラウンド画像に含まれる不要な暗電流ノイズや迷光ノイズなどの直流ノイズを除去することができる。
【００７４】
本実施の形態によれば、バックグラウンド中に微細パターンが散在するサンプル画像からバックグラウンド画像のみをレファレンス画像として抽出し、該レファレンス画像でサンプル画像を補正することにより、サンプル画像に含まれる微細パターンの蛍光輝度を示すシグナルを正確に検出することができる。すなわち本実施の形態の画像処理を実行することにより、生化学検査用アレイ１上のプローブアレイ要素３内のプローブと溶液に含まれる生化学的物質との間に生じる特異的な結合反応を、各プローブアレイ要素３ごとに正確に検査することができる。
【００７５】
本発明は上記実施の形態のみに限定されず、要旨を変更しない範囲で適宜変形して実施できる。例えば、説明上、微細パターンの数を３５、このシグナルの輝度値をすべて同一値５００、バックグラウンドの最大輝度値を５００としたが、これらの数値は如何なる値でも良い。また、シグナルごとに輝度値が異なっても良い。
【００７６】
【発明の効果】
本発明の生化学的検査用画像処理方法によれば、サンプル画像に含まれる微細パターンの発光輝度を示すシグナルを、簡易な処理で正確かつ迅速に検出できる。
【００７７】
本発明によれば、レファレンス画像を、従来のように標準反射板を用いて専用の手段で取得する必要がなく、撮り込んだサンプル画像を処理することで取得できる。よって本発明では、サンプル画像を補正するまでの時間が短縮され、専用の手段を用いたときのようにレファレンス画像を取得する際にノイズが混入することもないため、シグナル検出の精度が向上する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態に係る生化学的検査用画像処理方法を実施する顕微鏡装置の構成を示す図。
【図２】本発明の実施の形態に係る生化学検査用アレイの概略構成を示す図。
【図３】本発明の実施の形態に係る検査手順を示すフローチャート。
【図４】本発明の実施の形態に係るサンプル画像の例を等輝度線を用いて示した図。
【図５】本発明の実施の形態に係るサンプル画像の輝度分布を示す図。
【図６】本発明の実施の形態に係る十字形カーネルと円形カーネルを示す図。
【図７】本発明の実施の形態に係るレファレンス画像の等輝度線図。
【図８】本発明の実施の形態に係るレファレンス画像の輝度分布を示す図。
【図９】本発明の実施の形態に係る補正サンプル画像を示す図。
【図１０】本発明の実施の形態に係る補正サンプル画像の輝度分布を示す図。
【図１１】本発明の実施の形態に係る平滑化処理されたレファレンス画像の輝度分布を示す図。
【図１２】従来例に係る三次元アレイをなすテーパ付き試料ウェルアレイを示す図。
【符号の説明】
１…生化学検査用アレイ
３…プローブアレイ要素
３１…プローブ
１１…励起光源
１２…シャッター
１３…レンズ
１４…励起フィルタ
１５…ダイクロイックミラー
１６…対物レンズ
１７…ＮＤフィルタ
１８…結像レンズ
１９…ＣＣＤカメラ
２０…画像処理部
２１…表示部
１０１…多孔性ガラスウェハー
１０２…孔
１０３…テーパ付きウェル
１０４…チャンネル
１０５…貫通孔
４１，４１１…微細パターン
４２，４２１，４２２…バックグラウンド
５１，５１１…微細パターンの輝度を示すシグナル
５２，５２１，５２２，５２３…バックグラウンドの輝度を示すシグナル
【発明の属する技術分野】
本発明は、生化学的反応の状態を検査する生化学的検査用の画像処理方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
最近、「ハイブリダイゼーションによる配列決定」（ＳＢＨ）のために、アレイドハイブリダイゼーション（ａｒｒａｙｅｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）反応の幾つかの方法が開発されている。これには、例えば膜上に格子状配列された異なるオリゴヌクレオチドプローブとＤＮＡ試料のアレイとの段階的なハイブリダイゼーションの方法を用いたＳＢＨがある。
【０００３】
また、従来「ジェノセンサー（ｇｅｎｏｓｅｎｓｏｒ）」なる語は、その中で二次元アレイの表面に標的核酸配列と相補配列の認識素子としてのオリゴヌクレオチドを結合する方式を称してきた。さらに、ジェノセンサーの概念には、ハイブリダイゼーションを迅速に検出することができ、各試験部位に微細電子部品が存在する微細加工装置が含まれる。
【０００４】
このような二次元アレイに対して、近年以下のような新規なフロースルージェノセンサーが提供されている。そこでは、固形支持材料のウェハーにわたり斑点状に配され密充填された孔またはチャンネル内に、核酸認識素子が固定化されている。支持ウェハーとして有用なマイクロチャンネルまたはナノチャンネルのガラス及び多孔性シリコンの製造には、公知の微細加工技術を利用できる。このフロースルージェノセンサーは、微細加工された光学及び電子工学検出部品、フィルム、荷電結合素子アレイ、カメラシステム及びりん光貯蔵技術を包含する種々の公知の検出方法を利用している。このフロースルー装置については、公知の平面表面設計に比して以下の利点が得られる。
【０００５】
（１）表面積が膨大に増大したことにより、検出感度が改善される。
【０００６】
（２）ハイブリダイゼーション反応に要する時間が短縮し（平均標的分子が表面に結合したプローブに出くわすのに要する時間が、数時間から数ミリ秒に短縮され）、ハイブリダイゼーションがスピード化され、順反応及び逆反応の両方において誤対合識別ができる。
【０００７】
（３）多孔性ウェハーを通して溶液を徐々に流動できるため、希薄な核酸溶液を分析することができる。
【０００８】
（４）大気に曝される平面表面上のプローブ溶液の小液滴が迅速に乾燥するのを避けられることにより、各分離領域内の表面に対するプローブ分子の化学結合が促進する。
【０００９】
以上の利点を有するこのフロースルー装置を、以後三次元アレイと称する。このような三次元アレイに関する従来技術として、特表平９−５０４８６４号公報を引用し、図１２を用いてその構成及び作用を簡単に説明する。
【００１０】
図１２は、三次元アレイをなすテーパ付き試料ウェルアレイを示す図である。図１２において、多孔性のガラスウェハー１０１には、複数のテーパ孔１０２が配設されており、これら各孔１０２にテーパ付きウェル１０３が埋設されている。テーパ付きウェル１０３は、そこに固定した生体分子の結合領域を構成する０．１−１０μｍ直径のチャンネル１０４を底部に含む。各チャンネル１０４は図示のように多くの微小の貫通孔１０５を有している。このウェルアレイを用い、以下のステップで検出を行なう。
【００１１】
（１）３−グリシドキシプロピル−トリメトキシシラン４ｍｌ、キシレン１２ｍｌ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（フーニッヒ（Ｈｕｎｉｇ）塩基）０．５ｍｌの溶液をウェハーの孔に流入させ、次いで、そのウェハーを８０℃の該溶液に５時間浸漬し、次いで、テトラヒドロフランでフラッシュし、８０℃にて乾燥することにより、ウェハーをエポキシシラン−誘導体化ガラスとする。
【００１２】
（２）５′−または３′−アルキルアミン（化学合成の間に導入した）を有する複数のオリゴヌクレオチドプローブを、水に１０μＭ−５０μＭにて溶解し、それぞれ多孔性のガラスウェハー１０１（シリカウェハー）に微量分注する。６５℃にて一晩反応させた後、その表面を６５℃の水、次いで１０ｍＭトリエチルアミンで簡単に流し、表面上の未反応エポキシ基を取り除く。次いで、６５℃の水で再度流し、風乾することにより、アミン−誘導化オリゴヌクレオチドをエポキシシラン−誘導体化ガラスに結合させる。
【００１３】
（３）増幅の間に産物に［３２Ｐ］ヌクレオチドを取り込ませるポリメラーゼ連鎖反応によるか、またはガンマ−３２Ｐ［ＡＴＰ］＋ポリヌクレオチド・キナーゼを用いて増幅産物を５′−標識することによって、標的ＤＮＡ（分析物）を調製する。取り込まれなかった標識は、セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）濾過によって除去する。好ましくは、１のＰＣＲ断片を５′−ビオチン標識すれば、ストレプトアビジン・アフィニティークロマトグラフィーによる一本鎖の調製ができる。少なくとも５ｎＭ（５ｆｍｏｌ／μｌ）の濃度であって、少なくとも５，０００ｃｐｍ／ｆｍｏｌの特異活性のハイブリダイゼーション緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、２ｍＭＥＤＴＡ、３．３Ｍ塩化テトラメチルアンモニウム）中に標的ＤＮＡを溶解する。数百塩基長のＰＣＲ断片が、少なくともオクタマー長の表面につなぎ留めたオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに適している。
【００１４】
（４）標的ＤＮＡ試料をチップの多孔性領域に流し込み、６℃にて５〜１５分間インキュベートし、ハイブリダイゼーションを行なう。次いで、１８℃にて同様の時間、多孔性チップを通してハイブリダイゼーション溶液を流動させることによって洗浄する。別法として、塩化テトラメチルアンモニウムの代わりに、１ＭＫＣＬもしくはＮａＣｌまたは５．２Ｍベタインを含有する緩衝液でハイブリダイゼーションを行なうこともできる。
【００１５】
（５）ＣＣＤジェノセンサー装置を用いてハイブリダイゼーション強度の検出及び定量を行なう。ＣＣＤジェノセンサー装置は、高解像度及び高感度のものを用い、化学ルミネセント、蛍光または放射能標識用として用意される。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
従来では、図１２に示した三次元アレイを用いて生化学検査を行なう場合、まず生化学検査用アレイを製作する。そして、顕微鏡観察下に配置された標準反射板に励起照明を与えて、レファレンス画像をＣＣＤカメラで撮り込む。次に前記反射板を排出し、これと同じ位置に生化学検査用アレイを配置し、蛍光分子で標識された被検サンプルの溶液を供給し、各プローブとサンプル溶液中の物質とで結合反応を生じさせる。続いて生化学検査用アレイに励起照明を与えて、蛍光画像をＣＣＤカメラで撮り込みサンプル画像とする。このサンプル画像をレファレンス画像で補正することにより、多数のプローブアレイ要素３すなわち微細パターンから発生した蛍光を検出している。
【００１７】
しかし従来では、標準反射板を配置してレファレンス画像を得るため、専用の手段が必要となり装置が大型化するとともに、サンプル画像を補正するまでの処理時間が長くなる。また、レファレンス画像を取得する際に、標準反射板上のゴミ等によりノイズが混入することもあり、蛍光輝度を示すシグナルの検出精度に影響を及ぼす。また、標準反射板の保守等も煩雑であるという問題がある。
【００１８】
本発明の目的は、サンプル画像に含まれる微細パターンの発光輝度を示すシグナルを、簡易な処理で正確かつ迅速に検出できる生化学的検査用画像処理方法を提供することにある。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決し目的を達成するために、本発明の生化学的検査用画像処理方法は以下の如く構成されている。
【００２０】
（１）本発明の生化学的検査用画像処理方法は、生化学的物質の溶液を、表面に該生化学的物質に特異的に反応する生化学的物質が各々保持されている生化学検査用アレイに供給し、発光性分子による標識を用いて前記生化学検査用アレイの各プローブアレイ要素ごとに前記発光性分子の発光強度をアレイ型検出器で検出することにより、前記生化学的物質と該生化学的物質に特異的に反応する生化学的物質との反応状態を前記各プローブアレイ要素ごとに検査する生化学的検査用の画像処理方法であり、前記生化学検査用アレイの画像をサンプル画像として撮り込み、前記各プローブアレイ要素から発生した光の強度を示す微細パターンの画像を該サンプル画像から除いた背景画像を、レファレンス画像として抽出し、該レファレンス画像で前記サンプル画像を補正する。
【００２１】
（２）本発明の生化学的検査用画像処理方法は上記（１）に記載の方法であり、かつ前記微細パターンの画像に対して収縮処理を施した後に膨張処理を施すことにより前記レファレンス画像を抽出する。
【００２２】
（３）本発明の生化学的検査用画像処理方法は上記（２）に記載の方法であり、かつ前記収縮処理及び前記膨張処理は、所定形状のカーネルを用い、前記微細パターンを消滅させるのに必要な回数分実行する。
【００２３】
（４）本発明の生化学的検査用画像処理方法は上記（３）に記載の方法であり、かつ前記収縮処理及び前記膨張処理は、３×３画素の十字形カーネルを用い、前記微細パターンの外接円の最大半径以上に相当する画素数を処理回数とする。
【００２４】
（５）本発明の生化学的検査用画像処理方法は上記（３）に記載の方法であり、かつ前記収縮処理及び前記膨張処理は、「前記微細パターンの外接円の最大直径以上に相当する画素数」×「前記外接円の最大直径以上に相当する画素数」画素の円形カーネルを用い、処理回数を１とする。
【００２５】
（６）本発明の生化学的検査用画像処理方法は上記（１）乃至（５）のいずれかに記載の方法であり、かつ前記サンプル画像の各画素の輝度値を、対応する前記レファレンス画像の各画素の輝度値で除算することにより、前記サンプル画像を補正する。
【００２６】
（７）本発明の生化学的検査用画像処理方法は上記（１）乃至（５）のいずれかに記載の方法であり、かつ前記サンプル画像の各画素の輝度値から、対応する前記レファレンス画像の各画素の輝度値を減算することにより、前記サンプル画像を補正する。
【００２７】
（８）本発明の生化学的検査用画像処理方法は上記（１）乃至（５）のいずれかに記載の方法であり、かつ前記レファレンス画像の各画素について、（レファレンス画像の最大輝度値／該画素の輝度値）を算出し、その値を対応する前記サンプル画像の各画素の輝度値に乗じて、前記サンプル画像を補正する。
【００２８】
（９）本発明の生化学的検査用画像処理方法は上記（１）乃至（８）のいずれかに記載の方法であり、かつ前記レファレンス画像に平滑化処理を施し、前記サンプル画像を補正する。
【００２９】
（１０）本発明の生化学的検査用画像処理方法は上記（１）乃至（９）のいずれかに記載の方法であり、かつ前記微細パターンの画像は、蛍光標識された多数の微小スポットを有する前記生化学検査用アレイを励起光で照明して得られる蛍光画像であり、前記サンプル画像を補正することにより前記各微小スポットの蛍光輝度を示す信号を検出する。
【００３０】
上記手段を講じた結果、それぞれ以下のような作用を奏する。
【００３１】
（１）本発明の生化学的検査用画像処理方法によれば、サンプル画像に含まれる微細パターンの発光輝度を示すシグナルを正確に検出することができる。
【００３２】
（２）本発明の生化学的検査用画像処理方法によれば、微細パターンのシグナルが消滅し背景のシグナルのみが表われたレファレンス画像を正確に抽出することができる。
【００３３】
（３）本発明の生化学的検査用画像処理方法によれば、微細パターンのシグナルを確実に消滅させることができる。
【００３４】
（４）本発明の生化学的検査用画像処理方法によれば、短時間の処理で微細パターンのシグナルを確実に消滅させることができる。
【００３５】
（５）本発明の生化学的検査用画像処理方法によれば、短時間の処理で微細パターンのシグナルを確実に消滅させることができる。
【００３６】
（６）本発明の生化学的検査用画像処理方法によれば、レファレンス画像による簡易な処理でサンプル画像に対して照明むらを補正することができる。
【００３７】
（７）本発明の生化学的検査用画像処理方法によれば、レファレンス画像による簡易な処理で背景画像からノイズを除去することができる。
【００３８】
（８）本発明の生化学的検査用画像処理方法によれば、レファレンス画像による簡易な処理でサンプル画像を補正することができる。
【００３９】
（９）本発明の生化学的検査用画像処理方法によれば、微細パターンのシグナルをより正確に検出できる。
【００４０】
（１０）本発明の生化学的検査用画像処理方法によれば、生化学検査用アレイ上の微小スポット内のプローブとサンプル溶液に含まれる生化学的物質との間に生じる特異的な結合反応を、各微小スポットごとに正確に検査することができる。
【００４１】
【発明の実施の形態】
図１は、本発明の実施の形態に係る生化学的検査用画像処理方法を実施する顕微鏡装置の構成を示す図である。図１において、励起光源１１には、水銀光源等が用いられる。この光源１１から出射される励起光の光路上には、シャッター１２、レンズ１３、励起フィルタ１４、およびダイクロイックミラー１５が配置され、このダイクロイックミラー１５の反射光路上には、対物レンズ１６および後述する生化学検査用アレイ１が配置されている。また、ダイクロイックミラー１５の透過光路上には、蛍光フィルタ１７、結像レンズ１８、およびＣＣＤカメラ１９が配置されている。ＣＣＤカメラ１９には画像処理部２０が接続され、画像処理部２０には表示部２１が接続されている。
【００４２】
図２は、本実施の形態で使用する生化学検査用アレイの概略構成を示す図であり、（ａ）は上面のフォーマットを示す図、（ｂ）は一部側面図である。生化学検査用アレイ１は、図１２に示した三次元アレイからなる。図２の（ａ）に示すように、生化学検査用アレイ１にはプローブアレイ要素３（微小スポット）が二次元に配列されている。これらプローブアレイ要素３は、図１２に示したようにテーパ付きウェル１０３からなり、底部に０．１−１０μｍ直径のチャンネル１０４を有し、さらに各チャンネル１０４は図２の（ｂ）に示すように多くの微小な貫通孔１０５を有している。各貫通孔１０５の壁面には、プローブ３１が結合している。
【００４３】
すなわち生化学検査用アレイ１では、プローブの結合反応を確実にするために、望ましくは多孔性ガラスウェハー１０１の表面の異なるテーパ付きウェル１０３にそれぞれプローブの溶液が供給され、該溶液中に含まれるプローブを多孔性ガラスウェハー１０１の内部に設けられた各チャンネル１０４の各貫通孔１０５で保持するのが良いが、多孔性ガラスウェハー１０１を設けずに、直接各貫通孔１０５にプローブの溶液を微量分注して保持しても良い。この貫通孔１０５を含む部材が、多孔質または繊維質の物質あるいは成形物から成る立体構造の反応担体として構成される。
【００４４】
以下、本実施の形態における生化学検査の概略を説明する。
【００４５】
まず検査者は、顕微鏡観察下に生化学検査用アレイ１を配置する。この生化学検査用アレイ１には、あらかじめプローブアレイ要素ごとに異なるプローブをプローブアレイ要素３に固相化してある。
【００４６】
次に検査者は、該生化学検査用アレイ１に蛍光分子で標識された被検サンプルの溶液を供給し、各プローブとサンプル溶液中の物質とで結合反応を生じさせた後、未結合の前記物質をプローブアレイ要素３から除去する。
【００４７】
次に、該生化学検査用アレイ１（基板）に励起照明を与えて、サンプル画像をＣＣＤカメラ１９で撮り込む。このサンプル画像は、標識に使用する蛍光物質の種類数だけ撮り込まれる。このサンプル画像は、励起強度に比例するバックグラウンド（背景）を示す画像上に、同じく励起強度に比例する多数のプローブアレイ要素３から発生した蛍光の微細パターンが散在し、さらに励起強度と無関係なノイズが加わった画像となる。なお、蛍光物質の劣化を防止するために、撮り込まれた後直ちにシャッター１２などで励起照明を遮断するのが好ましい。
【００４８】
次に、画像処理部２０は、サンプル画像から微細パターンを除いたバックグラウンド画像を抽出し、それぞれレファレンス画像とする。そして画像処理部２０は、各レファレンス画像で対応する各サンプル画像を補正する。これにより、サンプル画像に含まれる微細パターンのシグナルが正確に検出される。
【００４９】
図３は、本実施の形態による検査手順を示すフローチャートである。以下、図３に従って検査方法およびその作用を説明する。
【００５０】
（１）ステップＳ１：まず検査者は、ＦＩＴＣなどの蛍光分子で標識された生化学的物質の溶液を作成する。
【００５１】
（２）ステップＳ２：検査者は、生化学検査用アレイ１に生化学的物質の溶液を供給し、各プローブと特異的に反応させる。この場合検査者は、図１に示した蛍光顕微鏡の観察下で、試料面に図２の（ａ）に示す生化学検査用アレイ１を配置し、その表面に一様に生化学的物質の溶液を供給する。これにより、生化学検査用アレイ１上のプローブアレイ要素３内のプローブと溶液に含まれる生化学的物質との間に特異的な結合反応が生じる。この結果、各プローブアレイ要素３内で反応の強さに応じた数量の蛍光分子が間接的にプローブに結合することになる。
【００５２】
（３）ステップＳ３：検査者は、生化学検査用アレイ１から未反応の生化学的物質を除去する。この場合検査者は、前述した結合反応後に、生化学検査用アレイ１の各プローブアレイ要素３から未結合の生化学的物質を除去する。一般的には洗浄液を用いて洗浄する方法が採用されるが、反応担体が立体構造である場合には洗浄液を用いずにポンプなどで溶液ごと除去しても良い。但し、洗浄液を用いる方が確実に除去されることは言うまでもない。
【００５３】
（４）ステップＳ４：検査者は、生化学検査用アレイ１の画像をサンプル画像としてＣＣＤカメラ１９で撮り込む。この場合、生化学検査用アレイ１を励起光源１１で励起照明して、蛍光画像を撮り込む。
【００５４】
励起光源１１からの励起光は、レンズ１３、励起フィルタ１４を介してダイクロイックミラー１５で反射され、対物レンズ１６を介して生化学検査用アレイ１の上面全体に照射される。生化学検査用アレイ１のプローブアレイ要素３内のサンプル物質に結合している蛍光分子から発生した蛍光と共に、バックグラウンドを形成する生化学検査用アレイ１における反射光、生化学検査用アレイ１の自家蛍光、外部から混入する迷光などが、対物レンズ１６、ダイクロイックミラー１５、バンドパスフィルタ１７および結像レンズ１８を介して、ＣＣＤカメラ１９に入射し、サンプル画像が撮り込まれる。ＣＣＤカメラ１９で撮り込んだサンプル画像は、画像処理部２０へ送られる。
【００５５】
なお、本実施の形態では受光素子としてＣＣＤを用いているが、ＣＣＤに特定するものではなく、他のエリアセンサを用いても良い。従って、以下に記述される「ＣＣＤ」は「エリアセンサ」でも通用するものである。
【００５６】
図４は、サンプル画像の例を等輝度線を用いて示した図である。図４において４１は二次元的に配列された微細パターンの等輝度線、４２はバックグラウンドの等輝度線であり、該バックグラウンドの等輝度線４２付近の数字は該バックグラウンドの等輝度線の輝度を示す。
【００５７】
図５は、サンプル画像の輝度分布を示す図であり、横軸は画素（ピクセル）番地、縦軸は輝度（階調）を示し、図４に示すサンプル画像上の所定の画素行Ｌの輝度分布を表わしている。今、バックグラウンドが一様な輝度値５００を有し、微細パターンを示すシグナルの輝度が全て５００である時に、形成されるサンプル画像は、一様なバックグラウンドの輝度値５００からのシグナルの突出量は全て５００となる。しかし、中央画素付近で最大輝度値５００であるような、むらのある励起照明でバックグラウンドが形成される場合のサンプル画像は、図５に示すように、励起照明むらを含むバックグラウンドを示すシグナル（信号）５２上に該バックグラウンドの輝度分布に比例するシグナル５１が突出した分布となる。
【００５８】
（５）ステップＳ５：画像処理部２０は、各サンプル画像に対して収縮処理を行なう。このとき、例えば図６の（ａ）に示す３×３画素からなる十字形カーネルを適用する。画像処理部２０は、サンプル画像の各画素に、図６の（ａ）に示す十字形カーネルの中心画素６１を当てはめ、この中心画素６１の輝度を斜線部で示す５画素（中心画素６１自身とその上下左右の４画素）の最小輝度に置き換える処理、すなわち収縮処理を行なう。
【００５９】
この収縮処理をサンプル画像の全画素に対して１回行なうと、周囲の１画素分だけ収縮する。この収縮処理を、微細パターン４１の外接円の最大半径に相当する画素数（例えば１３画素）以上の回数分実行すると、サンプル画像は、全微細パターンが消滅しバックグラウンドのみに変調された画像となる。
【００６０】
なお、この収縮処理は、３×３画素からなる十字形カーネル以外に円形カーネルも適用できる。例えば、図６の（ｂ）に示す５×５画素からなる円形カーネルを用いることもできる。
【００６１】
（６）ステップＳ６：画像処理部２０は、ステップＳ５で収縮処理された各サンプル画像に対して膨張処理を行なう。このときも、例えば図６の（ａ）に示す３×３画素からなる十字形カーネルを適用する。画像処理部２０は、収縮処理されたサンプル画像の各画素に、図６の（ａ）に示す十字形カーネルの中心画素６１を当てはめ、この中心画素６１の輝度を斜線部で示す５画素の最大輝度に置き換える処理、すなわち膨張処理を行なう。
【００６２】
この膨張処理を収縮処理されたサンプル画像の全画素に対して１回行なうと、周囲の１画素分だけ膨張する。この膨張処理を、微細パターン４１の外接円の最大半径に相当する画素数（例えば１３画素）以上の回数分実行すると、サンプル画像は、変調されたバックグラウンド画像が、シグナルの全微細パターンが消滅した状態で、復調した画像となる。この画像をレファレンス画像とする。また、この膨張処理は、３×３画素からなる十字形カーネル以外に円形カーネルも適用できる。例えば、図６の（ｂ）に示す５×５画素からなる円形カーネルを用いることもできる。
【００６３】
図７は、ステップＳ５およびステップＳ６により得られたレファレンス画像の等輝度線図であり、等輝度線付近の数字は各等輝度線の輝度を示す。図７では、図４に示したサンプル画像から微細パターン４１が消滅し、バックグラウンド４２１のみが表わされている。
【００６４】
図８は、レファレンス画像の輝度分布を示す図であり、横軸は画素（ピクセル）番地、縦軸は輝度（階調）を示している。図８は、サンプル画像に対して収縮処理と膨張処理を実行した後の輝度分布を表わしている。図８では、図５にてバックグラウンドを示すシグナル５２上に突出していた微細パターンを示す七つのシグナル５１が消滅し、バックグラウンドを示すシグナル５２１のみが表われている。
【００６５】
（７）ステップＳ７：画像処理部２０は、図８に示したレファレンス画像の輝度分布から最大輝度を検出する。そして画像処理部２０は、レファレンス画像の各画素に対して（レファレンス画像の最大輝度／画素の輝度）を算出し、サンプル画像に乗じて補正サンプル画像を得る。
【００６６】
言い換えれば、画像処理部２０により、サンプル画像をレファレンス画像で除算し、これに一定値であるレファレンス画像の最大輝度を乗じて補正サンプル画像を得る。ここで、一定値であるレファレンス画像の最大輝度は輝度レベルを補正前のサンプル画像に合わせるためのものであり、レファレンス画像の最大輝度に限定しなくても、後述の効果を損なうものではない。すなわち、レファレンス画像の最大輝度の代わりに１を採用しても良く、この場合、画像処理部２０は、サンプル画像の各画素の輝度値を、対応する前記レファレンス画像の各画素の輝度値で除算することにより、補正サンプル画像を得る。
【００６７】
図９は、サンプル画像に「レファレンス画像の最大輝度／画素の輝度」を乗じることにより得られた補正サンプル画像を示す図である。図９では、微細パターン４１１が表わされているとともに、バックグラウンド４２２が一定強度５００の輝度分布で表わされている。
【００６８】
図１０は、補正サンプル画像の輝度分布を示す図であり、横軸は画素（ピクセル）番地、縦軸は輝度（階調）を示している。図１０は、サンプル画像に対して補正を実施した後の輝度分布を表わしている。図１０では、バックグラウンドを示すシグナル５２２は、輝度値がほぼ一定値（約５００）となっている。バックグラウンドを示すシグナル５２２上に突出している微細パターンを示す七つのシグナル５１１は、最大輝度値がほぼ一定値１０００すなわち突出量が５００となっている。このように微細パターンを示す各シグナル５１１の突出量は７個共ほぼ一定値５００となり、これはバックグラウンドに影響されず、正確な輝度値を示している。従って、前記突出量を求め、これを補正後のシグナル輝度値とすれば、正確な輝度値が得られることになる。
【００６９】
なお、上記ステップＳ６で得たレファレンス画像に対して、画像処理部２０で平滑化処理（ローパスフィルタ処理）を行なうこともできる。このとき、例えば図６の（ｃ）に示す１１×１１画素からなる円形カーネルを適用する。画像処理部２０はレファレンス画像の各画素に、１１×１１画素からなる円形カーネルの中心画素を当てはめ、この中心画素の輝度を円形カーネル中の９７画素の平均輝度で置き換える処理、すなわち平滑化処理を行なう。微細パターン４１の外接円の最大半径が例えば１３画素である場合、この平滑化処理をレファレンス画像の全画素に対して例えば１０回実行する。
【００７０】
図１１は、平滑化処理されたレファレンス画像の輝度分布を示す図であり、横軸は画素（ピクセル）番地、縦軸は輝度（階調）を示している。図１１では、図８におけるバックグラウンドを示すシグナル５２１に表われていた輝度値の段差が消滅し、滑らかなシグナル５２３となっている。
【００７１】
以上のように平滑化処理されたレファレンス画像を基にして上記ステップＳ７で補正サンプル画像を得る。その補正サンプル画像の輝度分布では、図１０における微細パターンを示す七つのシグナル５１１の頂部が平坦になる。このようにレファレンス画像に平滑化処理を施すことにより、補正サンプル画像上の微細パターンを示す各シグナルは、より正確な輝度値を示すことになる。
【００７２】
また上記ステップＳ５，Ｓ６で、画像処理部２０は、３×３画素または５×５画素以外に限らず任意の形状のカーネルを用いて、収縮処理と膨張処理を実行することができる。例として、「微細パターン４１の外接円の最大直径（例えば２６画素）以上に相当する画素数」×「前記外接円の最大直径以上に相当する画素数」画素の円形カーネル、例えば２７×２７画素からなる円形カーネルを用い、収縮処理と膨張処理を１回実行してもよい。このように、所定形状のカーネルを用い、微細パターンを消滅させるのに必要な回数分、収縮処理と膨張処理を実行することにより、レファレンス画像を得ることができる。
【００７３】
以上のように、むらのある励起照明でバックグラウンドが形成される場合は、除算処理が有効である。一方、これに反して、暗電流ノイズや迷光ノイズなどの励起照明以外のノイズで形成される場合には減算処理が有効である。すなわち画像処理部２０は、サンプル画像の各画素の輝度値から、対応する前記レファレンス画像の各画素の輝度値を減算することにより、補正サンプル画像を得る。これにより、バックグラウンド画像に含まれる不要な暗電流ノイズや迷光ノイズなどの直流ノイズを除去することができる。
【００７４】
本実施の形態によれば、バックグラウンド中に微細パターンが散在するサンプル画像からバックグラウンド画像のみをレファレンス画像として抽出し、該レファレンス画像でサンプル画像を補正することにより、サンプル画像に含まれる微細パターンの蛍光輝度を示すシグナルを正確に検出することができる。すなわち本実施の形態の画像処理を実行することにより、生化学検査用アレイ１上のプローブアレイ要素３内のプローブと溶液に含まれる生化学的物質との間に生じる特異的な結合反応を、各プローブアレイ要素３ごとに正確に検査することができる。
【００７５】
本発明は上記実施の形態のみに限定されず、要旨を変更しない範囲で適宜変形して実施できる。例えば、説明上、微細パターンの数を３５、このシグナルの輝度値をすべて同一値５００、バックグラウンドの最大輝度値を５００としたが、これらの数値は如何なる値でも良い。また、シグナルごとに輝度値が異なっても良い。
【００７６】
【発明の効果】
本発明の生化学的検査用画像処理方法によれば、サンプル画像に含まれる微細パターンの発光輝度を示すシグナルを、簡易な処理で正確かつ迅速に検出できる。
【００７７】
本発明によれば、レファレンス画像を、従来のように標準反射板を用いて専用の手段で取得する必要がなく、撮り込んだサンプル画像を処理することで取得できる。よって本発明では、サンプル画像を補正するまでの時間が短縮され、専用の手段を用いたときのようにレファレンス画像を取得する際にノイズが混入することもないため、シグナル検出の精度が向上する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態に係る生化学的検査用画像処理方法を実施する顕微鏡装置の構成を示す図。
【図２】本発明の実施の形態に係る生化学検査用アレイの概略構成を示す図。
【図３】本発明の実施の形態に係る検査手順を示すフローチャート。
【図４】本発明の実施の形態に係るサンプル画像の例を等輝度線を用いて示した図。
【図５】本発明の実施の形態に係るサンプル画像の輝度分布を示す図。
【図６】本発明の実施の形態に係る十字形カーネルと円形カーネルを示す図。
【図７】本発明の実施の形態に係るレファレンス画像の等輝度線図。
【図８】本発明の実施の形態に係るレファレンス画像の輝度分布を示す図。
【図９】本発明の実施の形態に係る補正サンプル画像を示す図。
【図１０】本発明の実施の形態に係る補正サンプル画像の輝度分布を示す図。
【図１１】本発明の実施の形態に係る平滑化処理されたレファレンス画像の輝度分布を示す図。
【図１２】従来例に係る三次元アレイをなすテーパ付き試料ウェルアレイを示す図。
【符号の説明】
１…生化学検査用アレイ
３…プローブアレイ要素
３１…プローブ
１１…励起光源
１２…シャッター
１３…レンズ
１４…励起フィルタ
１５…ダイクロイックミラー
１６…対物レンズ
１７…ＮＤフィルタ
１８…結像レンズ
１９…ＣＣＤカメラ
２０…画像処理部
２１…表示部
１０１…多孔性ガラスウェハー
１０２…孔
１０３…テーパ付きウェル
１０４…チャンネル
１０５…貫通孔
４１，４１１…微細パターン
４２，４２１，４２２…バックグラウンド
５１，５１１…微細パターンの輝度を示すシグナル
５２，５２１，５２２，５２３…バックグラウンドの輝度を示すシグナル
Claims (10)
- 生化学的物質の溶液を、表面に該生化学的物質に特異的に反応する生化学的物質が各々保持されている生化学検査用アレイに供給し、発光性分子による標識を用いて前記生化学検査用アレイの各プローブアレイ要素ごとに前記発光性分子の発光強度をアレイ型検出器で検出することにより、前記生化学的物質と該生化学的物質に特異的に反応する生化学的物質との反応状態を前記各プローブアレイ要素ごとに検査する生化学的検査用の画像処理方法であり、
前記生化学検査用アレイの画像をサンプル画像として撮り込み、前記各プローブアレイ要素から発生した光の強度を示す微細パターンの画像を該サンプル画像から除いた背景画像を、レファレンス画像として抽出し、該レファレンス画像で前記サンプル画像を補正することを特徴とする生化学的検査用画像処理方法。 - 前記微細パターンの画像に対して収縮処理を施した後に膨張処理を施すことにより前記レファレンス画像を抽出することを特徴とする請求項１に記載の生化学的検査用画像処理方法。
- 前記収縮処理及び前記膨張処理は、所定形状のカーネルを用い、前記微細パターンを消滅させるのに必要な回数分実行することを特徴とする請求項２に記載の生化学的検査用画像処理方法。
- 前記収縮処理及び前記膨張処理は、３×３画素の十字形カーネルを用い、前記微細パターンの外接円の最大半径以上に相当する画素数を処理回数とすることを特徴とする請求項３に記載の生化学的検査用画像処理方法。
- 前記収縮処理及び前記膨張処理は、「前記微細パターンの外接円の最大直径以上に相当する画素数」×「前記外接円の最大直径以上に相当する画素数」画素の円形カーネルを用い、処理回数を１とすることを特徴とする請求項３に記載の生化学的検査用画像処理方法。
- 前記サンプル画像の各画素の輝度値を、対応する前記レファレンス画像の各画素の輝度値で除算することにより、前記サンプル画像を補正することを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の生化学的検査用画像処理方法。
- 前記サンプル画像の各画素の輝度値から、対応する前記レファレンス画像の各画素の輝度値を減算することにより、前記サンプル画像を補正することを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の生化学的検査用画像処理方法。
- 前記レファレンス画像の各画素について、（レファレンス画像の最大輝度値／該画素の輝度値）を算出し、その値を対応する前記サンプル画像の各画素の輝度値に乗じて、前記サンプル画像を補正することを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の生化学的検査用画像処理方法。
- 前記レファレンス画像に平滑化処理を施し、前記サンプル画像を補正することを特徴とする請求項請求項１乃至８のいずれかに記載の生化学的検査用画像処理方法。
- 前記微細パターンの画像は、蛍光標識された多数の微小スポットを有する前記生化学検査用アレイを励起光で照明して得られる蛍光画像であり、前記サンプル画像を補正することにより前記各微小スポットの蛍光輝度を示す信号を検出することを特徴とする請求項１乃至９のいずれかに記載の生化学的検査用画像処理方法。
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