JP3834519B2 - 生化学的検査方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生化学的反応の状態を検査する生化学的検査方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
最近、「ハイブリダイゼーションによる配列決定」（ＳＢＨ）のために、アレイドハイブリダイゼーション（ａｒｒａｙｅｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）反応の幾つかの方法が開発されている。これには、例えば膜上に格子状配列された異なるオリゴヌクレオチドプローブとＤＮＡ試料のアレイとの段階的なハイブリダイゼーションの方法を用いたＳＢＨがある。
【０００３】
また、従来「ジェノセンサー（ｇｅｎｏｓｅｎｓｏｒ）」なる語は、その中で二次元アレイの表面に標的核酸配列と相補配列の認識素子としてのオリゴヌクレオチドを結合する方式を称してきた。さらに、ジェノセンサーの概念には、ハイブリダイゼーションを迅速に検出することができ、各試験部位に微細電子部品が存在する微細加工装置が含まれる。
【０００４】
このような二次元アレイに対して、近年以下のような新規なフロースルージェノセンサーが提供されている。そこでは、固形支持材料のウェハーにわたり斑点状に配され密充填された孔またはチャンネル内に、核酸認識素子が固定化されている。支持ウェハーとして有用なマイクロチャンネルまたはナノチャンネルのガラス及び多孔性シリコンの製造には、公知の微細加工技術を利用できる。このフロースルージェノセンサーは、微細加工された光学及び電子工学検出部品、フィルム、荷電結合素子アレイ、カメラシステム及びりん光貯蔵技術を包含する種々の公知の検出方法を利用している。このフロースルー装置については、公知の平面表面設計に比して以下の利点が得られる。
【０００５】
（１）表面積が膨大に増大したことにより、検出感度が改善される。
【０００６】
（２）ハイブリダイゼーション反応に要する時間が短縮し（平均標的分子が表面に結合したプローブに出くわすのに要する時間が、数時間から数ミリ秒に短縮され）、ハイブリダイゼーションがスピード化され、順反応及び逆反応の両方において誤対合識別ができる。
【０００７】
（３）多孔性ウェハーを通して溶液を徐々に流動できるため、希薄な核酸溶液を分析することができる。
【０００８】
（４）大気に曝される平面表面上のプローブ溶液の小液滴が迅速に乾燥するのを避けられることにより、各分離領域内の表面に対するプローブ分子の化学結合が促進する。
【０００９】
以上の利点を有するこのフロースルー装置を、以後三次元アレイと称する。このような三次元アレイに関する従来技術として、特表平９−５０４８６４号公報を引用し、図５を用いてその構成及び作用を簡単に説明する。
【００１０】
図５は、三次元アレイをなすテーパ付き試料ウェルアレイを示す図である。図５において、多孔性のガラスウェハー１０１には、複数のテーパ孔１０２が配設されており、これら各孔１０２にテーパ付きウェル１０３が埋設されている。テーパ付きウェル１０３は、そこに固定した生体分子の結合領域を構成する０．１−１０μｍ直径のチャンネル１０４を底部に含む。各チャンネル１０４は図示のように多くの微小の貫通孔１０５を有している。このウェルアレイを用い、以下のステップで検出を行なう。
【００１１】
（１）３−グリシドキシプロピル−トリメトキシシラン４ｍｌ、キシレン１２ｍｌ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（フーニッヒ（Ｈｕｎｉｇ）塩基）０．５ｍｌの溶液をウェハーの孔に流入させ、次いで、そのウェハーを８０℃の該溶液に５時間浸漬し、次いで、テトラヒドロフランでフラッシュし、８０℃にて乾燥することにより、ウェハーをエポキシシラン−誘導体化ガラスとする。
【００１２】
（２）５′−または３′−アルキルアミン（化学合成の間に導入した）を有する複数のオリゴヌクレオチドプローブを、水に１０μＭ−５０μＭにて溶解し、それぞれ多孔性のガラスウェハー１０１（シリカウェハー）に微量分注する。６５℃にて一晩反応させた後、その表面を６５℃の水、次いで１０ｍＭトリエチルアミンで簡単に流し、表面上の未反応エポキシ基を取り除く。次いで、６５℃の水で再度流し、風乾することにより、アミン−誘導化オリゴヌクレオチドをエポキシシラン−誘導体化ガラスに結合させる。
【００１３】
（３）増幅の間に産物に［32Ｐ］ヌクレオチドを取り込ませるポリメラーゼ連鎖反応によるか、またはガンマ−32Ｐ［ＡＴＰ］＋ポリヌクレオチド・キナーゼを用いて増幅産物を５′−標識することによって、標的ＤＮＡ（分析物）を調製する。取り込まれなかった標識は、セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）濾過によって除去する。好ましくは、１のＰＣＲ断片を５′−ビオチン標識すれば、ストレプトアビジン・アフィニティークロマトグラフィーによる一本鎖の調製ができる。少なくとも５ｎＭ（５ｆｍｏｌ／μｌ）の濃度であって、少なくとも５，０００ｃｐｍ／ｆｍｏｌの特異活性のハイブリダイゼーション緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、２ｍＭＥＤＴＡ、３．３Ｍ塩化テトラメチルアンモニウム）中に標的ＤＮＡを溶解する。数百塩基長のＰＣＲ断片が、少なくともオクタマー長の表面につなぎ留めたオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに適している。
【００１４】
（４）標的ＤＮＡ試料をチップの多孔性領域に流し込み、６℃にて５〜１５分間インキュベートし、ハイブリダイゼーションを行なう。次いで、１８℃にて同様の時間、多孔性チップを通してハイブリダイゼーション溶液を流動させることによって洗浄する。別法として、塩化テトラメチルアンモニウムの代わりに、１ＭＫＣＬもしくはＮａＣｌまたは５．２Ｍベタインを含有する緩衝液でハイブリダイゼーションを行なうこともできる。
【００１５】
（５）ＣＣＤジェノセンサー装置を用いてハイブリダイゼーション強度の検出及び定量を行なう。ＣＣＤジェノセンサー装置は、高解像度及び高感度のものを用い、化学ルミネセント、蛍光または放射能標識用として用意される。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
従来では、上述した従来技術に限らず、プローブアレイ要素での生化学的な各反応状態を各々の光強度としてＣＣＤのような同一のエリアセンサーまたはラインセンサーで検出する場合、該エリアセンサーまたはラインセンサーにおいて一般画像と比較して非常に広いダイナミックレンジが要求される。また同様に、検出後に画像処理をする場合には、該画像処理において非常に高い階調分解能（濃度分解能）が要求されるという欠点が有る。
【００１７】
本発明の目的は、通常のダイナミックレンジを有するエリアセンサーまたはラインセンサーを用いる場合でも、実用上大きなダイナミックレンジで各プローブアレイ要素に対応する光強度を同時に検出し得る生化学的検査方法を提供することにある。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決し目的を達成するために、本発明の生化学的検査方法は以下の如く構成されている。
【００１９】
（１）本発明の生化学的検査方法は、第１の生化学的物質の溶液を、表面に該第１の生化学的物質に特異的に反応する第２の生化学的物質が各々保持されている生化学検査用アレイに供給し、発光性分子による標識を用いて前記生化学検査用アレイの各プローブアレイ要素ごとに前記発光性分子の発光強度をアレイ型検出器で検出することにより、前記第１の生化学的物質と該第１の生化学的物質に特異的に反応する第２の生化学的物質との反応状態を前記各プローブアレイ要素ごとに検査する生化学的検査方法であり、前記アレイ型検出器の受光量を変化させながら複数の画像を取得したのち、これらの複数の画像を比較して、各プローブアレイ要素ごとに適正露光条件である画像を選択することにより、前記各プローブアレイ要素の領域内に存在する前記発光性分子が発する発光強度に比例する強度を検出する。
【００２０】
（２）本発明の生化学的検査方法は上記（１）に記載の方法であり、かつ前記生化学検査用アレイは、多孔質または繊維質の物質あるいは成形物から成る立体構造の反応担体の表面の異なる位置にプローブの溶液を供給し、該溶液中に含まれるプローブを前記多孔質または繊維質の物質あるいは成形物の内部に保持することにより成る。
【００２１】
（３）本発明の生化学的検査方法は上記（２）に記載の方法であり、かつ前記生化学検査用アレイに、光で励起発光する各々異なる発光性分子で標識された複数のサンプルの混合溶液を供給し、前記複数のサンプルと前記プローブとの間で前記各プローブアレイ要素ごとに特異的反応を生じさせ、前記生化学検査用アレイに励起光を照射し前記異なる発光性分子が発する光の強度を選択的に前記アレイ型検出器で検出する。
【００２２】
（４）本発明の生化学的検査方法は上記（１）乃至（３）のいずれかに記載の方法であり、かつ前記アレイ型検出器の受光量を変化させて得られる複数の光強度画像を比較することにより、適正な受光強度範囲を決定する。
【００２３】
（５）本発明の生化学的検査方法は上記（４）に記載の方法であり、かつ前記適正な受光強度範囲を前記各プローブアレイ要素ごとに決定する。
【００２４】
（６）本発明の生化学的検査方法は上記（５）に記載の方法であり、かつ大なる受光エネルギーから小なる受光エネルギーになるように、受光量を順次変化させながら光エネルギーを検出し、前記各プローブアレイ要素ごとの検出可能な受光エネルギー範囲内の上限付近のエネルギーに対応する既知の受光条件パラメータと前記上限付近のエネルギーとから、前記発光性分子が発する発光強度に比例する強度を決定する。
【００２５】
（７）本発明の生化学的検査方法は上記（１）乃至（６）のいずれかに記載の方法であり、かつＮＤフィルタの切り替えにより受光強度を変化させる。
【００２６】
（８）本発明の生化学的検査方法は上記（１）乃至（６）のいずれかに記載の方法であり、かつ液晶フィルタを電気的制御することにより受光強度を変化させる。
【００２７】
（９）本発明の生化学的検査方法は上記（３）に記載の方法であり、かつ特定の前記プローブアレイ要素の領域内に存在する複数の異なる蛍光分子が発する複数の波長の蛍光強度、または各励起波長に対応する全前記プローブアレイ要素の領域内に存在する複数の異なる蛍光分子ごとの複数の波長の蛍光強度の総和が等しくなるように各励起波長ごとに励起強度を設定する。
【００２８】
（１０）本発明の生化学的検査方法は上記（１）乃至（６）のいずれかに記載の方法であり、かつ前記アレイ型検出器の蓄積時間を変えることにより受光強度を変化させる。
【００２９】
（１１）本発明の生化学的検査方法は上記（４）に記載の方法であり、かつ前記アレイ型検出器が飽和状態になる直前までに得られる蛍光画像から前記生化学検査用アレイのバックグラウンド画像を差し引いた補正画像を処理の対象とする。
【００３０】
上記手段を講じた結果、それぞれ以下のような作用を奏する。
【００３１】
（１）本発明の生化学的検査方法によれば、受光強度を既知の割合で変化させて得られる複数の発光強度画像に演算処理を施すことによって、実用上大きなダイナミックレンジで各プローブアレイ要素に対応する発光強度を同時に検出することが可能であり、各プローブアレイ要素に対して弱い反応から強い反応に至るまで、その反応状態を正確に検査することができる。
【００３２】
（２）本発明の生化学的検査方法によれば、立体構造の反応担体を用いる場合、反応としてのダイナミックレンジが特に広くなるので、上記（１）による作用効果が増大する。
【００３３】
（３）本発明の生化学的検査方法によれば、上記（１）による作用効果に加えて、各プローブアレイ要素に保持されるプローブの状態に差が有る場合でも、参照サンプルと被検サンプルの結合状態の比較から、各プローブアレイ要素ごとの被検サンプルとプローブの結合状態を正確に検査することができる。
【００３４】
（４）本発明の生化学的検査方法によれば、受光強度と出力信号との関係が線型特性領域内の最大値付近に存在することが保証される。
【００３５】
（５）本発明の生化学的検査方法によれば、プローブアレイ要素ごとに受光強度と出力信号との関係が線型特性領域内の最大値付近に存在することが保証される。
【００３６】
（６）本発明の生化学的検査方法によれば、各プローブアレイ要素ごとに大なる光強度から小なる光強度までを順次効率的に決定することができる。
【００３７】
（７）本発明の生化学的検査方法によれば、簡便に受光強度を変化させることができる。
【００３８】
（８）本発明の生化学的検査方法によれば、高速に受光強度を変化させることができる。
【００３９】
（９）本発明の生化学的検査方法によれば、実用上大きなダイナミックレンジで各プローブアレイ要素に対応する各波長ごとの光強度を同時に検出することが可能であり、各プローブアレイ要素に対して弱い反応から強い反応に至るまでその反応状態を正確に検査することができる。
【００４０】
（１０）本発明の生化学的検査方法によれば、簡便に受光強度を変化させることができる。
【００４１】
（１１）本発明の生化学的検査方法によれば、適切な画像を対象画像とすることができる。
【００４２】
【発明の実施の形態】
図１は、本発明の実施の形態に係る生化学的検査方法を実施する顕微鏡装置の構成を示す図である。図１において、励起光源１１には、水銀光源等が用いられる。この光源１１から出射される励起光の光路上には、シャッター１２、レンズ１３、二枚の励起フィルタ１４を選択的に切り替え可能な励起フィルタユニット１４０、およびダイクロイックミラー１５が配置され、このダイクロイックミラー１５の反射光路上には、対物レンズ１６および後述する生化学検査用アレイ１が配置されている。また、ダイクロイックミラー１５の透過光路上には、複数枚のＮＤフィルタ１７を選択的に切り替え可能なＮＤフィルタユニット１７０、結像レンズ１８、およびＣＣＤカメラ１９が配置されている。ＣＣＤカメラ１９には画像処理部２０が接続され、画像処理部２０には表示部２１が接続されている。
【００４３】
図２は、本実施の形態で使用する生化学検査用アレイ１の概略構成を示す図であり、（ａ）は上面のフォーマットを示す図、（ｂ）は一部側面図である。生化学検査用アレイ１は、図５に示した三次元アレイからなる。図２の（ａ）に示すように、生化学検査用アレイ１にはプローブアレイ要素３が二次元に配列されており、４隅にそれぞれ位置検出用アレイ要素２が配置されている。これらプローブアレイ要素３および位置検出用アレイ要素２は、図５に示したようにテーパ付きウェル１０３からなり、底部に０．１−１０μｍ直径のチャンネル１０４を有し、さらに各チャンネル１０４は図２の（ｂ）に示すように多くの微小な貫通孔１０５を有している。各貫通孔１０５の壁面には、プローブ３１が結合している。
【００４４】
すなわち生化学検査用アレイ１では、プローブの結合反応を確実にするために、望ましくは多孔性ガラスウェハー１０１の表面の異なるテーパ付きウェル１０３にそれぞれプローブの溶液が供給され、該溶液中に含まれるプローブを多孔性ガラスウェハー１０１の内部に設けられた各チャンネル１０４の各貫通孔１０５で保持するのが良いが、多孔性ガラスウェハー１０１を設けずに直接各貫通孔１０５にプローブの溶液を微量分注して保持しても良い。この貫通孔１０５を含む部材が多孔質または繊維質の物質あるいは成形物から成る立体構造の反応担体として構成される。
【００４５】
図３は、本実施の形態による検査手順を示すフローチャートである。以下、図３に従って検査方法およびその作用を説明する。
【００４６】
(1)ステップＳ１：まず検査者は、２色の蛍光分子（または化学発光分子）で標識された２種の生化学的物質の溶液を作成する。この場合検査者は、比較したい２種の生化学的物質の溶液を同一濃度で作成し、一方をＦＩＦＣ、他方をローダミンで標識する。これらの標識物質は、蛍光波長の異なる物質の組み合わせであれば他の物質でも構わない。その後、作成した２種の生化学的物質の溶液を１：１の割合で混合して撹拌し、生化学的物質の混合溶液とする。混合比率については、２種の生化学的物質の溶液および標識物質の特性に応じて変更しても良い。
【００４７】
(2)ステップＳ２：検査者は、生化学検査用アレイ１に生化学的物質の混合溶液を供給し、各プローブと特異的に反応させる。この場合検査者は、図１に示した蛍光顕微鏡の観察下で、試料面に図２の（ａ）に示す生化学検査用アレイ１を配置し、その表面に一様に生化学的物質の混合溶液を供給する。これにより、生化学検査用アレイ１上のプローブアレイ要素３内のプローブと混合溶液に含まれる生化学的物質との間に特異的な結合反応が生じる。この結果、各プローブアレイ要素３内で反応の強さに応じた数量の蛍光分子（または化学発光分子）が間接的にプローブ結合することになる。
【００４８】
(3)ステップＳ３：検査者は、生化学検査用アレイ１から未反応の生化学的物質を除去する。この場合検査者は、前述した結合反応後に、生化学検査用アレイ１の各プローブアレイ要素３から未結合の生化学的物質を除去する。一般的には洗浄液を用いて洗浄する方法が採用されるが、反応担体が立体構造である場合には洗浄液を用いずにポンプなどで溶液ごと除去しても良い。但し、洗浄液を用いる方が確実に除去されることは言うまでもない。
【００４９】
(4)ステップＳ４：検査者は観察光路ａ上のＮＤフィルタ１７を切り替えながら、生化学検査用アレイ１の蛍光画像を色別にＣＣＤカメラ１９で撮り込む。この場合、生化学検査用アレイ１を励起光源１１で励起照明して、各プローブアレイ要素３内の蛍光分子が発生する蛍光の画像をＣＣＤカメラ１９で撮り込む。この際、検査者は励起フィルタユニット１４０を切り替え操作して所望の蛍光分子の色に対応する励起フィルタ１４を照明光路ｂ上に配置し、さらにＮＤフィルタユニット１７０を切り替え操作して所望のＮＤフィルタ１７を観察光路ａ上に配置する。
【００５０】
励起光源１１からの励起光は、レンズ１３、励起フィルタ１４を介してダイクロイックミラー１５で反射され、対物レンズ１６を介して生化学検査用アレイ１の上面全体に照射される。なお、発光性分子が化学発光分子である場合は、以上の励起照明は不要となる。生化学検査用アレイ１から発生した蛍光は、対物レンズ１６、ダイクロイックミラー１５、ＮＤフィルタ１７、および結像レンズ１８を介して、ＣＣＤカメラ１９に入射し、蛍光分子（または化学発光分子）の色別に蛍光画像が撮り込まれる。従ってこの段階で、２色×ＮＤフィルタの枚数分の蛍光画像が得られる。ＣＣＤカメラ１９で撮り込んだ蛍光画像は、画像処理部２０へ送られる。
【００５１】
なお上記では、ＮＤフィルタ１７を切り替えることで、ＣＣＤカメラ１９における蛍光の受光量（受光強度）を変化させた。これ以外に、ＣＣＤカメラ１９におけるＣＣＤの蓄積時間を変えることで、蛍光の受光量を変化させることもできる。
【００５２】
この場合、図示しない制御部により、ＣＣＤの蓄積時間を例えば（ｔ0、２ｔ0、４ｔ0、…、２ｎ−１ｔ0（ｎ＝１，２，…））と一定の比率で順次増加させ、生化学検査用アレイ１の蛍光画像を撮り込む。そして、ＣＣＤが飽和状態になる直前までの各蛍光画像を対象画像とし、画像処理部２０へ送るようにする。または、同様にＣＣＤの蓄積時間を順次増加させ、生化学検査用アレイ１の蛍光画像とバックグラウンド画像を撮り込む。そして、バックグラウンド画像によりＣＣＤが飽和状態になる直前までの各蛍光画像を対象画像とし、画像処理部２０へ送るようにする。
【００５３】
なお、ＣＣＤの最大蓄積時間を、生化学検査用アレイ１における各アレイ要素の領域の最小発光強度に対応する受光量が後述するアレイ型検出器の出力特性の線形領域内に存在するという条件による定まる、蓄積時間の最大値としてもよい。この場合、ＣＣＤの蓄積時間を、最小蓄積時間から最大蓄積時間まで、前述したように一定の比率で順次増加させて得られる複数の画像を、対象画像とする。
【００５４】
(5)ステップＳ５：検査者は観察光路ａ上のＮＤフィルタ１７を切り替えながら、生化学検査用アレイ１のバックグラウンド画像を蛍光分子（または化学発光分子）の色別にＣＣＤカメラ１９で撮り込む。ここで、発光性分子が蛍光分子である場合には、前述した生化学検査用アレイ１の蛍光画像を撮り込んだ直後にシャッター１２により励起照明を遮断し、ＣＣＤカメラ１９でバックグラウンド画像を撮り込む。また、発光性分子が化学発光分子である場合には、生化学検査用アレイ１の直前に置かれたシャッターにより化学発光分子からの光を遮断し、ＣＣＤカメラ１９でバックグラウンド画像を取り込む。この生化学検査用アレイ１のバックグラウンド画像の数は、蛍光画像の数と同一となる。このバックグラウンド画像は、検出強度に不要な暗電流ノイズおよび迷光ノイズにより構成される。ＣＣＤカメラ１９で撮り込んだバックグラウンド画像は、画像処理部２０へ送られる。
【００５５】
(6)ステップＳ６：画像処理部２０は、蛍光画像からバックグラウンド画像を差し引き補正画像とする。一般的に、受光素子の出力には暗電流ノイズや迷光ノイズなどの直流ノイズが含まれる。この直流ノイズを除去するために蛍光画像からバックグラウンド画像を差し引き、これを補正画像と称し以後の処理の対象とする。従って、この段階で２色×ＮＤフィルタの枚数分の補正画像が得られる。なお、蛍光画像およびバックグラウンド画像は、以後不要となる。
【００５６】
(7)ステップＳ７：画像処理部２０は、補正画像を回転移動して回転画像とする。図２の（ａ）に示すように、生化学検査用アレイ１に形成されるアレイ要素は二次元に配列されており、４隅に位置する４個のアレイ要素が位置検出用アレイ要素２として用いられる。それ以外のアレイ要素はプローブアレイ要素３として用いられる。位置検出用アレイ要素２には、望ましくは使用される２色の蛍光波長とは異なる蛍光波長の蛍光物質を用いる方が良い。その目的は、位置検出用アレイ要素２から発生する蛍光がノイズとして作用する可能性を無くすことである。この場合には、位置検出用の励起波長で照明し、位置検出をすることになる。
【００５７】
位置検出の方法として、画像処理部２０にて補正画像を最大強度の１／２のレベルで二値化し、得られた４個の位置検出用アレイ要素２の二値化スポット像における各図心座標の位置で形成される四辺形が最小偏差で矩形となるように各図心座標を修正してから、この矩形の各辺が座標軸と平行になるように画像中心を回転中心として補正画像を回転移動する。あるいは、４個の位置検出用アレイ要素２の各画像の重心座標を位置座標とし、各位置座標の位置で形成される四辺形が最小偏差で矩形となるように各位置座標を修正してから、この矩形の各辺が座標軸と平行になるように画像中心を回転中心として補正画像を回転移動する。移動後の画像を回転画像と呼ぶ。なお、補正画像は以後不要となる。
【００５８】
(8)ステップＳ８：画像処理部２０は、回転画像をプローブアレイ要素３ごとの画像に分割し、それぞれ分割画像とする。この場合、画像処理部２０は、回転画像における４個の位置検出用アレイ要素２の二値化スポット像の図心座標とプローブアレイ要素３の配列条件とから分割条件を決定して、この分割条件ですべての回転画像をプローブアレイ要素３ごとの画像に分割し、分割画像とする。従ってこの段階で、２色×ＮＤフィルタの枚数×プローブアレイ要素数分の分割画像が得られる。なお、回転画像は以後不要となる。
【００５９】
(9)ステップＳ９：画像処理部２０は、最適なＮＤフィルタ１７に対応する各分割画像を色別および要素別の測定用画像として抽出する。この場合、画像処理部２０は、同一色で同一位置のプローブアレイ要素３のＮＤフィルタ枚数分の分割画像の中から、最大信号強度がダイナミックレンジの範囲内にあり、その中で信号強度が最大である分割画像を１個抽出する。これを測定用画像と呼ぶ。
【００６０】
測定用画像は、後述する受光強度比率βi を大から小の順に並ベ、大きい方から順次後述するＲk を求め、Ｒk の変化率が負の条件を満たしたときに、その前のβi に対応する画像として抽出される。この段階で、２色×プローブアレイ要素数の測定用画像が得られる。以後、抽出されない分割画像は不要となる。
【００６１】
(10)ステップＳ１０：画像処理部２０は、各測定用画像からプローブアレイ要素３ごとのスポット強度を算出する。この場合、画像処理部２０は、後述するように測定用画像とＮＤフィルタ１７の透過率とからプローブアレイ要素３ごとの信号強度を算出し、全範囲でこの信号強度を積分してスポット強度とする。
【００６２】
図４は、本実施の形態の生化学的検査方法で使われるＣＣＤカメラ１９の如きアレイ型検出器（ＣＣＤ）の出力特性を示す図である。図中で横軸は受光強度Ｐ、縦軸は出力信号Ｓである。この特性は図に示す通り、０≦Ｐ≦ＰE の線型領域（線型特性を有する領域）とＰ≧ＰE の非線型領域（非線型特性を有する領域）とで形成され、次の関数で表すことができる。
【００６３】
【数１】
ここで、Ｐ≧ＰE の非線型領域では図に示すように、
【数２】
である。
【００６４】
今、反応状態に対応して蛍光分子（または化学発光分子）により標識されたｍ個のプローブアレイ要素を有する生化学検査用アレイ１に存在する蛍光分子（または化学発光分子）から発生する蛍光を上記アレイ型検出器に導き、受光強度（受光量）をｎ段階変化させて、ｋ（ｋ＝１，２，…，ｍ）番目のプローブアレイ要素に存在する蛍光分子（または化学発光分子）の数量に対応する受光強度（受光エネルギー）Ｐk,i による出力信号Ｓk,i を検出するものとする。ここで、ｉは受光強度（受光エネルギー）の変化に対応した番号（ｉ＝１，２，…，ｎ）である。このとき出力信号Ｓ＝Ｓk,i と受光強度Ｐ＝Ｐk,i とは（１）式を満足しているので、
【数３】
となる。ここで受光強度Ｐk,i は、変化させる前の受光強度Ｐk を既知の割合である受光強度比率βi で変化させて得られるものとして、
【数４】
とする。
【００６５】
（３）式および（４）式により、
【数５】
となる。
【００６６】
βi を変化させる方法としては、ＮＤフィルタの切り替え、ＣＣＤカメラ１９におけるＣＣＤの蓄積時間の制御、液晶フィルタの電気的制御、励起強度の制御などが有る。励起強度の制御では、特定のプローブアレイ要素３の領域内に存在する蛍光分子（または化学発光分子）が発する複数の蛍光強度、または各励起波長に対応する全プローブアレイ要素３の領域内に存在する蛍光強度の複数の総和が等しくなるように、各励起波長ごとに励起強度を設定する。
【００６７】
本実施の形態の第１の生化学的検査方法は、（５）式により、プローブアレイ要素ごとにｉに対応したｎ個の方程式が形成されるので、画像処理部２０でこれらの方程式を解くことにより、変化させる前の受光強度Ｐk を求める。この方法によれば、非線型領域を積極的に利用するために、実質的なダイナミックレンジの増加が一段と促進するという特有の効果がある。また、ｎを増すことによる平均化作用により高精度の検査も可能となる。この場合、望ましくは顕著な低分解能領域（飽和出力にごく近い領域）での検出データは誤差の要因となるので、処理対象から除外するのが良い。なお、プローブアレイ要素ごとの方程式ではなく、画素ごとに方程式を形成し、画素出力から画素入力強度を求め、その後プローブアレイ要素ごとに積分して受光強度Ｐk を求めることもできる。
【００６８】
次に、本実施の形態の第２の生化学検査方法を説明する。
【００６９】
線型領域すなわち０≦Ｐ≦ＰE の場合は、（５）式により、
【数６】
であり、Ｓk,i とβi との比をＲk とすれば、（６）式により
【数７】
となり、Ｒk は一定値となる。
【００７０】
一方、非線型領域すなわちＰE ≦Ｐの場合は、（５）式により、
【数８】
となる。従って、このときのＳk,i とβi との比Ｒk は、
【数９】
となる。また、（２）式により、
【数１０】
（９）式および（１０）式により、
【数１１】
となり、Ｒk は一定値とならず、しかも線型領域の一定値Ｒk より小さい。本実施の形態における第２の方法ではこの点に注目して、Ｒk が一定とみなせる範囲に存在する場合に限り線型領域内に在るものと認定し、さらにこの中からβi の最大の検出値を用いて、次式
【数１２】
により、変化させる前の受光強度Ｐk を求める。
【００７１】
なお、Ｐk には測定誤差が含まれるため、Ｒk にも誤差が生じる。この中で「Ｒk が一定とみなせる範囲に存在する」ことを判断しなければならないが、βi を大きくしたときのＲk の変化率が一定値以上（またはβi を小さくしたときのＲk の変化率が一定値以下）のときにＲk が一定とみなせば良い。この一定値は、たとえば１％、０％などが採用される。
【００７２】
また、画素ごとに画素出力から画素入力強度を求め、この後プローブアレイ要素ごとに積分して受光強度Ｐk を求めることもできる。この方法によれば、検出値が安定している線型領域を使うため、高精度の検査ができるという特有の効果がある。
【００７３】
なお、本発明は上記実施の形態のみに限定されず、要旨を変更しない範囲で適宜変形して実施できる。例えば、適用できる検査用アレイは、上述した例に限らず、三次元的に混合溶液を収容して反応を行なうような多数の液体保持部を密に配置しているアレイ全般に適用でき、特に柱状の空間に液体を収容するタイプに適している。
【００７４】
【発明の効果】
本発明によれば、通常のダイナミックレンジを有するエリアセンサーまたはラインセンサーを用いる場合でも、実用上大きなダイナミックレンジで各プローブアレイ要素に対応する光強度を同時に検出し得る生化学的検査方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態に係る生化学的検査方法を実施する顕微鏡装置の構成を示す図。
【図２】本発明の実施の形態に係る生化学検査用アレイの概略構成を示す図。
【図３】本発明の実施の形態に係る検査手順を示すフローチャート。
【図４】本発明の実施の形態に係る生化学的検査方法で使われるＣＣＤカメラの如きアレイ型検出器の出力特性を示す図。
【図５】従来例に係る三次元アレイをなすテーパ付き試料ウェルアレイを示す図。
【符号の説明】
１…生化学検査用アレイ
２…位置検出用アレイ要素
３…プローブアレイ要素
１１…励起光源
１２…シャッター
１３…レンズ
１４０…励起フィルタユニット
１４…励起フィルタ
１５…ダイクロイックミラー
１６…対物レンズ
１７０…ＮＤフィルタユニット
１７…ＮＤフィルタ
１８…結像レンズ
１９…ＣＣＤカメラ
２０…画像処理部
２１…表示部
１０１…多孔性ガラスウェハー
１０２…孔
１０３…テーパ付きウェル
１０４…チャンネル
１０５…貫通孔
【発明の属する技術分野】
本発明は、生化学的反応の状態を検査する生化学的検査方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
最近、「ハイブリダイゼーションによる配列決定」（ＳＢＨ）のために、アレイドハイブリダイゼーション（ａｒｒａｙｅｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）反応の幾つかの方法が開発されている。これには、例えば膜上に格子状配列された異なるオリゴヌクレオチドプローブとＤＮＡ試料のアレイとの段階的なハイブリダイゼーションの方法を用いたＳＢＨがある。
【０００３】
また、従来「ジェノセンサー（ｇｅｎｏｓｅｎｓｏｒ）」なる語は、その中で二次元アレイの表面に標的核酸配列と相補配列の認識素子としてのオリゴヌクレオチドを結合する方式を称してきた。さらに、ジェノセンサーの概念には、ハイブリダイゼーションを迅速に検出することができ、各試験部位に微細電子部品が存在する微細加工装置が含まれる。
【０００４】
このような二次元アレイに対して、近年以下のような新規なフロースルージェノセンサーが提供されている。そこでは、固形支持材料のウェハーにわたり斑点状に配され密充填された孔またはチャンネル内に、核酸認識素子が固定化されている。支持ウェハーとして有用なマイクロチャンネルまたはナノチャンネルのガラス及び多孔性シリコンの製造には、公知の微細加工技術を利用できる。このフロースルージェノセンサーは、微細加工された光学及び電子工学検出部品、フィルム、荷電結合素子アレイ、カメラシステム及びりん光貯蔵技術を包含する種々の公知の検出方法を利用している。このフロースルー装置については、公知の平面表面設計に比して以下の利点が得られる。
【０００５】
（１）表面積が膨大に増大したことにより、検出感度が改善される。
【０００６】
（２）ハイブリダイゼーション反応に要する時間が短縮し（平均標的分子が表面に結合したプローブに出くわすのに要する時間が、数時間から数ミリ秒に短縮され）、ハイブリダイゼーションがスピード化され、順反応及び逆反応の両方において誤対合識別ができる。
【０００７】
（３）多孔性ウェハーを通して溶液を徐々に流動できるため、希薄な核酸溶液を分析することができる。
【０００８】
（４）大気に曝される平面表面上のプローブ溶液の小液滴が迅速に乾燥するのを避けられることにより、各分離領域内の表面に対するプローブ分子の化学結合が促進する。
【０００９】
以上の利点を有するこのフロースルー装置を、以後三次元アレイと称する。このような三次元アレイに関する従来技術として、特表平９−５０４８６４号公報を引用し、図５を用いてその構成及び作用を簡単に説明する。
【００１０】
図５は、三次元アレイをなすテーパ付き試料ウェルアレイを示す図である。図５において、多孔性のガラスウェハー１０１には、複数のテーパ孔１０２が配設されており、これら各孔１０２にテーパ付きウェル１０３が埋設されている。テーパ付きウェル１０３は、そこに固定した生体分子の結合領域を構成する０．１−１０μｍ直径のチャンネル１０４を底部に含む。各チャンネル１０４は図示のように多くの微小の貫通孔１０５を有している。このウェルアレイを用い、以下のステップで検出を行なう。
【００１１】
（１）３−グリシドキシプロピル−トリメトキシシラン４ｍｌ、キシレン１２ｍｌ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（フーニッヒ（Ｈｕｎｉｇ）塩基）０．５ｍｌの溶液をウェハーの孔に流入させ、次いで、そのウェハーを８０℃の該溶液に５時間浸漬し、次いで、テトラヒドロフランでフラッシュし、８０℃にて乾燥することにより、ウェハーをエポキシシラン−誘導体化ガラスとする。
【００１２】
（２）５′−または３′−アルキルアミン（化学合成の間に導入した）を有する複数のオリゴヌクレオチドプローブを、水に１０μＭ−５０μＭにて溶解し、それぞれ多孔性のガラスウェハー１０１（シリカウェハー）に微量分注する。６５℃にて一晩反応させた後、その表面を６５℃の水、次いで１０ｍＭトリエチルアミンで簡単に流し、表面上の未反応エポキシ基を取り除く。次いで、６５℃の水で再度流し、風乾することにより、アミン−誘導化オリゴヌクレオチドをエポキシシラン−誘導体化ガラスに結合させる。
【００１３】
（３）増幅の間に産物に［32Ｐ］ヌクレオチドを取り込ませるポリメラーゼ連鎖反応によるか、またはガンマ−32Ｐ［ＡＴＰ］＋ポリヌクレオチド・キナーゼを用いて増幅産物を５′−標識することによって、標的ＤＮＡ（分析物）を調製する。取り込まれなかった標識は、セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）濾過によって除去する。好ましくは、１のＰＣＲ断片を５′−ビオチン標識すれば、ストレプトアビジン・アフィニティークロマトグラフィーによる一本鎖の調製ができる。少なくとも５ｎＭ（５ｆｍｏｌ／μｌ）の濃度であって、少なくとも５，０００ｃｐｍ／ｆｍｏｌの特異活性のハイブリダイゼーション緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、２ｍＭＥＤＴＡ、３．３Ｍ塩化テトラメチルアンモニウム）中に標的ＤＮＡを溶解する。数百塩基長のＰＣＲ断片が、少なくともオクタマー長の表面につなぎ留めたオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに適している。
【００１４】
（４）標的ＤＮＡ試料をチップの多孔性領域に流し込み、６℃にて５〜１５分間インキュベートし、ハイブリダイゼーションを行なう。次いで、１８℃にて同様の時間、多孔性チップを通してハイブリダイゼーション溶液を流動させることによって洗浄する。別法として、塩化テトラメチルアンモニウムの代わりに、１ＭＫＣＬもしくはＮａＣｌまたは５．２Ｍベタインを含有する緩衝液でハイブリダイゼーションを行なうこともできる。
【００１５】
（５）ＣＣＤジェノセンサー装置を用いてハイブリダイゼーション強度の検出及び定量を行なう。ＣＣＤジェノセンサー装置は、高解像度及び高感度のものを用い、化学ルミネセント、蛍光または放射能標識用として用意される。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
従来では、上述した従来技術に限らず、プローブアレイ要素での生化学的な各反応状態を各々の光強度としてＣＣＤのような同一のエリアセンサーまたはラインセンサーで検出する場合、該エリアセンサーまたはラインセンサーにおいて一般画像と比較して非常に広いダイナミックレンジが要求される。また同様に、検出後に画像処理をする場合には、該画像処理において非常に高い階調分解能（濃度分解能）が要求されるという欠点が有る。
【００１７】
本発明の目的は、通常のダイナミックレンジを有するエリアセンサーまたはラインセンサーを用いる場合でも、実用上大きなダイナミックレンジで各プローブアレイ要素に対応する光強度を同時に検出し得る生化学的検査方法を提供することにある。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決し目的を達成するために、本発明の生化学的検査方法は以下の如く構成されている。
【００１９】
（１）本発明の生化学的検査方法は、第１の生化学的物質の溶液を、表面に該第１の生化学的物質に特異的に反応する第２の生化学的物質が各々保持されている生化学検査用アレイに供給し、発光性分子による標識を用いて前記生化学検査用アレイの各プローブアレイ要素ごとに前記発光性分子の発光強度をアレイ型検出器で検出することにより、前記第１の生化学的物質と該第１の生化学的物質に特異的に反応する第２の生化学的物質との反応状態を前記各プローブアレイ要素ごとに検査する生化学的検査方法であり、前記アレイ型検出器の受光量を変化させながら複数の画像を取得したのち、これらの複数の画像を比較して、各プローブアレイ要素ごとに適正露光条件である画像を選択することにより、前記各プローブアレイ要素の領域内に存在する前記発光性分子が発する発光強度に比例する強度を検出する。
【００２０】
（２）本発明の生化学的検査方法は上記（１）に記載の方法であり、かつ前記生化学検査用アレイは、多孔質または繊維質の物質あるいは成形物から成る立体構造の反応担体の表面の異なる位置にプローブの溶液を供給し、該溶液中に含まれるプローブを前記多孔質または繊維質の物質あるいは成形物の内部に保持することにより成る。
【００２１】
（３）本発明の生化学的検査方法は上記（２）に記載の方法であり、かつ前記生化学検査用アレイに、光で励起発光する各々異なる発光性分子で標識された複数のサンプルの混合溶液を供給し、前記複数のサンプルと前記プローブとの間で前記各プローブアレイ要素ごとに特異的反応を生じさせ、前記生化学検査用アレイに励起光を照射し前記異なる発光性分子が発する光の強度を選択的に前記アレイ型検出器で検出する。
【００２２】
（４）本発明の生化学的検査方法は上記（１）乃至（３）のいずれかに記載の方法であり、かつ前記アレイ型検出器の受光量を変化させて得られる複数の光強度画像を比較することにより、適正な受光強度範囲を決定する。
【００２３】
（５）本発明の生化学的検査方法は上記（４）に記載の方法であり、かつ前記適正な受光強度範囲を前記各プローブアレイ要素ごとに決定する。
【００２４】
（６）本発明の生化学的検査方法は上記（５）に記載の方法であり、かつ大なる受光エネルギーから小なる受光エネルギーになるように、受光量を順次変化させながら光エネルギーを検出し、前記各プローブアレイ要素ごとの検出可能な受光エネルギー範囲内の上限付近のエネルギーに対応する既知の受光条件パラメータと前記上限付近のエネルギーとから、前記発光性分子が発する発光強度に比例する強度を決定する。
【００２５】
（７）本発明の生化学的検査方法は上記（１）乃至（６）のいずれかに記載の方法であり、かつＮＤフィルタの切り替えにより受光強度を変化させる。
【００２６】
（８）本発明の生化学的検査方法は上記（１）乃至（６）のいずれかに記載の方法であり、かつ液晶フィルタを電気的制御することにより受光強度を変化させる。
【００２７】
（９）本発明の生化学的検査方法は上記（３）に記載の方法であり、かつ特定の前記プローブアレイ要素の領域内に存在する複数の異なる蛍光分子が発する複数の波長の蛍光強度、または各励起波長に対応する全前記プローブアレイ要素の領域内に存在する複数の異なる蛍光分子ごとの複数の波長の蛍光強度の総和が等しくなるように各励起波長ごとに励起強度を設定する。
【００２８】
（１０）本発明の生化学的検査方法は上記（１）乃至（６）のいずれかに記載の方法であり、かつ前記アレイ型検出器の蓄積時間を変えることにより受光強度を変化させる。
【００２９】
（１１）本発明の生化学的検査方法は上記（４）に記載の方法であり、かつ前記アレイ型検出器が飽和状態になる直前までに得られる蛍光画像から前記生化学検査用アレイのバックグラウンド画像を差し引いた補正画像を処理の対象とする。
【００３０】
上記手段を講じた結果、それぞれ以下のような作用を奏する。
【００３１】
（１）本発明の生化学的検査方法によれば、受光強度を既知の割合で変化させて得られる複数の発光強度画像に演算処理を施すことによって、実用上大きなダイナミックレンジで各プローブアレイ要素に対応する発光強度を同時に検出することが可能であり、各プローブアレイ要素に対して弱い反応から強い反応に至るまで、その反応状態を正確に検査することができる。
【００３２】
（２）本発明の生化学的検査方法によれば、立体構造の反応担体を用いる場合、反応としてのダイナミックレンジが特に広くなるので、上記（１）による作用効果が増大する。
【００３３】
（３）本発明の生化学的検査方法によれば、上記（１）による作用効果に加えて、各プローブアレイ要素に保持されるプローブの状態に差が有る場合でも、参照サンプルと被検サンプルの結合状態の比較から、各プローブアレイ要素ごとの被検サンプルとプローブの結合状態を正確に検査することができる。
【００３４】
（４）本発明の生化学的検査方法によれば、受光強度と出力信号との関係が線型特性領域内の最大値付近に存在することが保証される。
【００３５】
（５）本発明の生化学的検査方法によれば、プローブアレイ要素ごとに受光強度と出力信号との関係が線型特性領域内の最大値付近に存在することが保証される。
【００３６】
（６）本発明の生化学的検査方法によれば、各プローブアレイ要素ごとに大なる光強度から小なる光強度までを順次効率的に決定することができる。
【００３７】
（７）本発明の生化学的検査方法によれば、簡便に受光強度を変化させることができる。
【００３８】
（８）本発明の生化学的検査方法によれば、高速に受光強度を変化させることができる。
【００３９】
（９）本発明の生化学的検査方法によれば、実用上大きなダイナミックレンジで各プローブアレイ要素に対応する各波長ごとの光強度を同時に検出することが可能であり、各プローブアレイ要素に対して弱い反応から強い反応に至るまでその反応状態を正確に検査することができる。
【００４０】
（１０）本発明の生化学的検査方法によれば、簡便に受光強度を変化させることができる。
【００４１】
（１１）本発明の生化学的検査方法によれば、適切な画像を対象画像とすることができる。
【００４２】
【発明の実施の形態】
図１は、本発明の実施の形態に係る生化学的検査方法を実施する顕微鏡装置の構成を示す図である。図１において、励起光源１１には、水銀光源等が用いられる。この光源１１から出射される励起光の光路上には、シャッター１２、レンズ１３、二枚の励起フィルタ１４を選択的に切り替え可能な励起フィルタユニット１４０、およびダイクロイックミラー１５が配置され、このダイクロイックミラー１５の反射光路上には、対物レンズ１６および後述する生化学検査用アレイ１が配置されている。また、ダイクロイックミラー１５の透過光路上には、複数枚のＮＤフィルタ１７を選択的に切り替え可能なＮＤフィルタユニット１７０、結像レンズ１８、およびＣＣＤカメラ１９が配置されている。ＣＣＤカメラ１９には画像処理部２０が接続され、画像処理部２０には表示部２１が接続されている。
【００４３】
図２は、本実施の形態で使用する生化学検査用アレイ１の概略構成を示す図であり、（ａ）は上面のフォーマットを示す図、（ｂ）は一部側面図である。生化学検査用アレイ１は、図５に示した三次元アレイからなる。図２の（ａ）に示すように、生化学検査用アレイ１にはプローブアレイ要素３が二次元に配列されており、４隅にそれぞれ位置検出用アレイ要素２が配置されている。これらプローブアレイ要素３および位置検出用アレイ要素２は、図５に示したようにテーパ付きウェル１０３からなり、底部に０．１−１０μｍ直径のチャンネル１０４を有し、さらに各チャンネル１０４は図２の（ｂ）に示すように多くの微小な貫通孔１０５を有している。各貫通孔１０５の壁面には、プローブ３１が結合している。
【００４４】
すなわち生化学検査用アレイ１では、プローブの結合反応を確実にするために、望ましくは多孔性ガラスウェハー１０１の表面の異なるテーパ付きウェル１０３にそれぞれプローブの溶液が供給され、該溶液中に含まれるプローブを多孔性ガラスウェハー１０１の内部に設けられた各チャンネル１０４の各貫通孔１０５で保持するのが良いが、多孔性ガラスウェハー１０１を設けずに直接各貫通孔１０５にプローブの溶液を微量分注して保持しても良い。この貫通孔１０５を含む部材が多孔質または繊維質の物質あるいは成形物から成る立体構造の反応担体として構成される。
【００４５】
図３は、本実施の形態による検査手順を示すフローチャートである。以下、図３に従って検査方法およびその作用を説明する。
【００４６】
(1)ステップＳ１：まず検査者は、２色の蛍光分子（または化学発光分子）で標識された２種の生化学的物質の溶液を作成する。この場合検査者は、比較したい２種の生化学的物質の溶液を同一濃度で作成し、一方をＦＩＦＣ、他方をローダミンで標識する。これらの標識物質は、蛍光波長の異なる物質の組み合わせであれば他の物質でも構わない。その後、作成した２種の生化学的物質の溶液を１：１の割合で混合して撹拌し、生化学的物質の混合溶液とする。混合比率については、２種の生化学的物質の溶液および標識物質の特性に応じて変更しても良い。
【００４７】
(2)ステップＳ２：検査者は、生化学検査用アレイ１に生化学的物質の混合溶液を供給し、各プローブと特異的に反応させる。この場合検査者は、図１に示した蛍光顕微鏡の観察下で、試料面に図２の（ａ）に示す生化学検査用アレイ１を配置し、その表面に一様に生化学的物質の混合溶液を供給する。これにより、生化学検査用アレイ１上のプローブアレイ要素３内のプローブと混合溶液に含まれる生化学的物質との間に特異的な結合反応が生じる。この結果、各プローブアレイ要素３内で反応の強さに応じた数量の蛍光分子（または化学発光分子）が間接的にプローブ結合することになる。
【００４８】
(3)ステップＳ３：検査者は、生化学検査用アレイ１から未反応の生化学的物質を除去する。この場合検査者は、前述した結合反応後に、生化学検査用アレイ１の各プローブアレイ要素３から未結合の生化学的物質を除去する。一般的には洗浄液を用いて洗浄する方法が採用されるが、反応担体が立体構造である場合には洗浄液を用いずにポンプなどで溶液ごと除去しても良い。但し、洗浄液を用いる方が確実に除去されることは言うまでもない。
【００４９】
(4)ステップＳ４：検査者は観察光路ａ上のＮＤフィルタ１７を切り替えながら、生化学検査用アレイ１の蛍光画像を色別にＣＣＤカメラ１９で撮り込む。この場合、生化学検査用アレイ１を励起光源１１で励起照明して、各プローブアレイ要素３内の蛍光分子が発生する蛍光の画像をＣＣＤカメラ１９で撮り込む。この際、検査者は励起フィルタユニット１４０を切り替え操作して所望の蛍光分子の色に対応する励起フィルタ１４を照明光路ｂ上に配置し、さらにＮＤフィルタユニット１７０を切り替え操作して所望のＮＤフィルタ１７を観察光路ａ上に配置する。
【００５０】
励起光源１１からの励起光は、レンズ１３、励起フィルタ１４を介してダイクロイックミラー１５で反射され、対物レンズ１６を介して生化学検査用アレイ１の上面全体に照射される。なお、発光性分子が化学発光分子である場合は、以上の励起照明は不要となる。生化学検査用アレイ１から発生した蛍光は、対物レンズ１６、ダイクロイックミラー１５、ＮＤフィルタ１７、および結像レンズ１８を介して、ＣＣＤカメラ１９に入射し、蛍光分子（または化学発光分子）の色別に蛍光画像が撮り込まれる。従ってこの段階で、２色×ＮＤフィルタの枚数分の蛍光画像が得られる。ＣＣＤカメラ１９で撮り込んだ蛍光画像は、画像処理部２０へ送られる。
【００５１】
なお上記では、ＮＤフィルタ１７を切り替えることで、ＣＣＤカメラ１９における蛍光の受光量（受光強度）を変化させた。これ以外に、ＣＣＤカメラ１９におけるＣＣＤの蓄積時間を変えることで、蛍光の受光量を変化させることもできる。
【００５２】
この場合、図示しない制御部により、ＣＣＤの蓄積時間を例えば（ｔ0、２ｔ0、４ｔ0、…、２ｎ−１ｔ0（ｎ＝１，２，…））と一定の比率で順次増加させ、生化学検査用アレイ１の蛍光画像を撮り込む。そして、ＣＣＤが飽和状態になる直前までの各蛍光画像を対象画像とし、画像処理部２０へ送るようにする。または、同様にＣＣＤの蓄積時間を順次増加させ、生化学検査用アレイ１の蛍光画像とバックグラウンド画像を撮り込む。そして、バックグラウンド画像によりＣＣＤが飽和状態になる直前までの各蛍光画像を対象画像とし、画像処理部２０へ送るようにする。
【００５３】
なお、ＣＣＤの最大蓄積時間を、生化学検査用アレイ１における各アレイ要素の領域の最小発光強度に対応する受光量が後述するアレイ型検出器の出力特性の線形領域内に存在するという条件による定まる、蓄積時間の最大値としてもよい。この場合、ＣＣＤの蓄積時間を、最小蓄積時間から最大蓄積時間まで、前述したように一定の比率で順次増加させて得られる複数の画像を、対象画像とする。
【００５４】
(5)ステップＳ５：検査者は観察光路ａ上のＮＤフィルタ１７を切り替えながら、生化学検査用アレイ１のバックグラウンド画像を蛍光分子（または化学発光分子）の色別にＣＣＤカメラ１９で撮り込む。ここで、発光性分子が蛍光分子である場合には、前述した生化学検査用アレイ１の蛍光画像を撮り込んだ直後にシャッター１２により励起照明を遮断し、ＣＣＤカメラ１９でバックグラウンド画像を撮り込む。また、発光性分子が化学発光分子である場合には、生化学検査用アレイ１の直前に置かれたシャッターにより化学発光分子からの光を遮断し、ＣＣＤカメラ１９でバックグラウンド画像を取り込む。この生化学検査用アレイ１のバックグラウンド画像の数は、蛍光画像の数と同一となる。このバックグラウンド画像は、検出強度に不要な暗電流ノイズおよび迷光ノイズにより構成される。ＣＣＤカメラ１９で撮り込んだバックグラウンド画像は、画像処理部２０へ送られる。
【００５５】
(6)ステップＳ６：画像処理部２０は、蛍光画像からバックグラウンド画像を差し引き補正画像とする。一般的に、受光素子の出力には暗電流ノイズや迷光ノイズなどの直流ノイズが含まれる。この直流ノイズを除去するために蛍光画像からバックグラウンド画像を差し引き、これを補正画像と称し以後の処理の対象とする。従って、この段階で２色×ＮＤフィルタの枚数分の補正画像が得られる。なお、蛍光画像およびバックグラウンド画像は、以後不要となる。
【００５６】
(7)ステップＳ７：画像処理部２０は、補正画像を回転移動して回転画像とする。図２の（ａ）に示すように、生化学検査用アレイ１に形成されるアレイ要素は二次元に配列されており、４隅に位置する４個のアレイ要素が位置検出用アレイ要素２として用いられる。それ以外のアレイ要素はプローブアレイ要素３として用いられる。位置検出用アレイ要素２には、望ましくは使用される２色の蛍光波長とは異なる蛍光波長の蛍光物質を用いる方が良い。その目的は、位置検出用アレイ要素２から発生する蛍光がノイズとして作用する可能性を無くすことである。この場合には、位置検出用の励起波長で照明し、位置検出をすることになる。
【００５７】
位置検出の方法として、画像処理部２０にて補正画像を最大強度の１／２のレベルで二値化し、得られた４個の位置検出用アレイ要素２の二値化スポット像における各図心座標の位置で形成される四辺形が最小偏差で矩形となるように各図心座標を修正してから、この矩形の各辺が座標軸と平行になるように画像中心を回転中心として補正画像を回転移動する。あるいは、４個の位置検出用アレイ要素２の各画像の重心座標を位置座標とし、各位置座標の位置で形成される四辺形が最小偏差で矩形となるように各位置座標を修正してから、この矩形の各辺が座標軸と平行になるように画像中心を回転中心として補正画像を回転移動する。移動後の画像を回転画像と呼ぶ。なお、補正画像は以後不要となる。
【００５８】
(8)ステップＳ８：画像処理部２０は、回転画像をプローブアレイ要素３ごとの画像に分割し、それぞれ分割画像とする。この場合、画像処理部２０は、回転画像における４個の位置検出用アレイ要素２の二値化スポット像の図心座標とプローブアレイ要素３の配列条件とから分割条件を決定して、この分割条件ですべての回転画像をプローブアレイ要素３ごとの画像に分割し、分割画像とする。従ってこの段階で、２色×ＮＤフィルタの枚数×プローブアレイ要素数分の分割画像が得られる。なお、回転画像は以後不要となる。
【００５９】
(9)ステップＳ９：画像処理部２０は、最適なＮＤフィルタ１７に対応する各分割画像を色別および要素別の測定用画像として抽出する。この場合、画像処理部２０は、同一色で同一位置のプローブアレイ要素３のＮＤフィルタ枚数分の分割画像の中から、最大信号強度がダイナミックレンジの範囲内にあり、その中で信号強度が最大である分割画像を１個抽出する。これを測定用画像と呼ぶ。
【００６０】
測定用画像は、後述する受光強度比率βi を大から小の順に並ベ、大きい方から順次後述するＲk を求め、Ｒk の変化率が負の条件を満たしたときに、その前のβi に対応する画像として抽出される。この段階で、２色×プローブアレイ要素数の測定用画像が得られる。以後、抽出されない分割画像は不要となる。
【００６１】
(10)ステップＳ１０：画像処理部２０は、各測定用画像からプローブアレイ要素３ごとのスポット強度を算出する。この場合、画像処理部２０は、後述するように測定用画像とＮＤフィルタ１７の透過率とからプローブアレイ要素３ごとの信号強度を算出し、全範囲でこの信号強度を積分してスポット強度とする。
【００６２】
図４は、本実施の形態の生化学的検査方法で使われるＣＣＤカメラ１９の如きアレイ型検出器（ＣＣＤ）の出力特性を示す図である。図中で横軸は受光強度Ｐ、縦軸は出力信号Ｓである。この特性は図に示す通り、０≦Ｐ≦ＰE の線型領域（線型特性を有する領域）とＰ≧ＰE の非線型領域（非線型特性を有する領域）とで形成され、次の関数で表すことができる。
【００６３】
【数１】
【数２】
【００６４】
今、反応状態に対応して蛍光分子（または化学発光分子）により標識されたｍ個のプローブアレイ要素を有する生化学検査用アレイ１に存在する蛍光分子（または化学発光分子）から発生する蛍光を上記アレイ型検出器に導き、受光強度（受光量）をｎ段階変化させて、ｋ（ｋ＝１，２，…，ｍ）番目のプローブアレイ要素に存在する蛍光分子（または化学発光分子）の数量に対応する受光強度（受光エネルギー）Ｐk,i による出力信号Ｓk,i を検出するものとする。ここで、ｉは受光強度（受光エネルギー）の変化に対応した番号（ｉ＝１，２，…，ｎ）である。このとき出力信号Ｓ＝Ｓk,i と受光強度Ｐ＝Ｐk,i とは（１）式を満足しているので、
【数３】
【数４】
【００６５】
（３）式および（４）式により、
【数５】
【００６６】
βi を変化させる方法としては、ＮＤフィルタの切り替え、ＣＣＤカメラ１９におけるＣＣＤの蓄積時間の制御、液晶フィルタの電気的制御、励起強度の制御などが有る。励起強度の制御では、特定のプローブアレイ要素３の領域内に存在する蛍光分子（または化学発光分子）が発する複数の蛍光強度、または各励起波長に対応する全プローブアレイ要素３の領域内に存在する蛍光強度の複数の総和が等しくなるように、各励起波長ごとに励起強度を設定する。
【００６７】
本実施の形態の第１の生化学的検査方法は、（５）式により、プローブアレイ要素ごとにｉに対応したｎ個の方程式が形成されるので、画像処理部２０でこれらの方程式を解くことにより、変化させる前の受光強度Ｐk を求める。この方法によれば、非線型領域を積極的に利用するために、実質的なダイナミックレンジの増加が一段と促進するという特有の効果がある。また、ｎを増すことによる平均化作用により高精度の検査も可能となる。この場合、望ましくは顕著な低分解能領域（飽和出力にごく近い領域）での検出データは誤差の要因となるので、処理対象から除外するのが良い。なお、プローブアレイ要素ごとの方程式ではなく、画素ごとに方程式を形成し、画素出力から画素入力強度を求め、その後プローブアレイ要素ごとに積分して受光強度Ｐk を求めることもできる。
【００６８】
次に、本実施の形態の第２の生化学検査方法を説明する。
【００６９】
線型領域すなわち０≦Ｐ≦ＰE の場合は、（５）式により、
【数６】
【数７】
【００７０】
一方、非線型領域すなわちＰE ≦Ｐの場合は、（５）式により、
【数８】
【数９】
【数１０】
【数１１】
【数１２】
【００７１】
なお、Ｐk には測定誤差が含まれるため、Ｒk にも誤差が生じる。この中で「Ｒk が一定とみなせる範囲に存在する」ことを判断しなければならないが、βi を大きくしたときのＲk の変化率が一定値以上（またはβi を小さくしたときのＲk の変化率が一定値以下）のときにＲk が一定とみなせば良い。この一定値は、たとえば１％、０％などが採用される。
【００７２】
また、画素ごとに画素出力から画素入力強度を求め、この後プローブアレイ要素ごとに積分して受光強度Ｐk を求めることもできる。この方法によれば、検出値が安定している線型領域を使うため、高精度の検査ができるという特有の効果がある。
【００７３】
なお、本発明は上記実施の形態のみに限定されず、要旨を変更しない範囲で適宜変形して実施できる。例えば、適用できる検査用アレイは、上述した例に限らず、三次元的に混合溶液を収容して反応を行なうような多数の液体保持部を密に配置しているアレイ全般に適用でき、特に柱状の空間に液体を収容するタイプに適している。
【００７４】
【発明の効果】
本発明によれば、通常のダイナミックレンジを有するエリアセンサーまたはラインセンサーを用いる場合でも、実用上大きなダイナミックレンジで各プローブアレイ要素に対応する光強度を同時に検出し得る生化学的検査方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態に係る生化学的検査方法を実施する顕微鏡装置の構成を示す図。
【図２】本発明の実施の形態に係る生化学検査用アレイの概略構成を示す図。
【図３】本発明の実施の形態に係る検査手順を示すフローチャート。
【図４】本発明の実施の形態に係る生化学的検査方法で使われるＣＣＤカメラの如きアレイ型検出器の出力特性を示す図。
【図５】従来例に係る三次元アレイをなすテーパ付き試料ウェルアレイを示す図。
【符号の説明】
１…生化学検査用アレイ
２…位置検出用アレイ要素
３…プローブアレイ要素
１１…励起光源
１２…シャッター
１３…レンズ
１４０…励起フィルタユニット
１４…励起フィルタ
１５…ダイクロイックミラー
１６…対物レンズ
１７０…ＮＤフィルタユニット
１７…ＮＤフィルタ
１８…結像レンズ
１９…ＣＣＤカメラ
２０…画像処理部
２１…表示部
１０１…多孔性ガラスウェハー
１０２…孔
１０３…テーパ付きウェル
１０４…チャンネル
１０５…貫通孔
Claims (11)
- 第１の生化学的物質の溶液を、表面に該第１の生化学的物質に特異的に反応する第２の生化学的物質が各々保持されている生化学検査用アレイに供給し、発光性分子による標識を用いて前記生化学検査用アレイの各プローブアレイ要素ごとに前記発光性分子の発光強度をアレイ型検出器で検出することにより、前記第１の生化学的物質と該第１の生化学的物質に特異的に反応する第２の生化学的物質との反応状態を前記各プローブアレイ要素ごとに検査する生化学的検査方法であり、
前記アレイ型検出器の受光量を変化させながら複数の画像を取得したのち、これらの複数の画像を比較して、各プローブアレイ要素ごとに適正露光条件である画像を選択することにより、前記各プローブアレイ要素の領域内に存在する前記発光性分子が発する発光強度に比例する強度を検出することを特徴とする生化学的検査方法。 - 前記生化学検査用アレイは、多孔質または繊維質の物質あるいは成形物から成る立体構造の反応担体の表面の異なる位置にプローブの溶液を供給し、該溶液中に含まれるプローブを前記多孔質または繊維質の物質あるいは成形物の内部に保持することにより成ることを特徴とする請求項１に記載の生化学的検査方法。
- 前記生化学検査用アレイに、光で励起発光する各々異なる発光性分子で標識された複数のサンプルの混合溶液を供給し、前記複数のサンプルと前記プローブとの間で前記各プローブアレイ要素ごとに特異的反応を生じさせ、前記生化学検査用アレイに励起光を照射し前記異なる発光性分子が発する光の強度を選択的に前記アレイ型検出器で検出することを特徴とする請求項２に記載の生化学的検査方法。
- 前記アレイ型検出器の受光量を変化させて得られる複数の光強度画像を比較することにより、適正な受光強度範囲を決定することを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の生化学的検査方法。
- 前記適正な受光強度範囲を前記各プローブアレイ要素ごとに決定することを特徴とする請求項４に記載の生化学的検査方法。
- 大なる受光エネルギーから小なる受光エネルギーになるように、受光量を順次変化させながら光エネルギーを検出し、前記各プローブアレイ要素ごとの検出可能な受光エネルギー範囲内の上限付近のエネルギーに対応する既知の受光条件パラメータと前記上限付近のエネルギーとから、前記発光性分子が発する発光強度に比例する強度を決定することを特徴とする請求項５に記載の生化学的検査方法。
- ＮＤフィルタの切り替えにより受光強度を変化させることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の生化学的検査方法。
- 液晶フィルタを電気的制御することにより受光強度を変化させることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の生化学的検査方法。
- 特定の前記プローブアレイ要素の領域内に存在する複数の異なる蛍光分子が発する複数の波長の蛍光強度、または各励起波長に対応する全前記プローブアレイ要素の領域内に存在する複数の異なる蛍光分子ごとの複数の波長の蛍光強度の総和が等しくなるように各励起波長ごとに励起強度を設定することを特徴とする請求項３に記載の生化学的検査方法。
- 前記アレイ型検出器の蓄積時間を変えることにより受光強度を変化させることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の生化学的検査方法。
- 前記アレイ型検出器が飽和状態になる直前までに得られる蛍光画像から前記生化学検査用アレイのバックグラウンド画像を差し引いた補正画像を処理の対象とする請求項４に記載の生化学的検査方法。
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