CN105492892A - 图像读取方法 - Google Patents
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Abstract
当从荧光图像读取荧光强度时,实现检测时间的高速化和检测数据容量的减少。本发明是从存在多个发出荧光的区域的试样读取荧光图像的图像读取方法,具有:(a)设定第1拍摄条件的工序,(b)以上述第1拍摄条件拍摄荧光图像的工序,(c)对于拍摄的荧光图像所含的多个区域,算出各区域的荧光强度的工序,(d)基于上述算出的各区域的荧光强度,判定是否结束拍摄的工序,(e)当在上述(d)工序中判断为不结束拍摄时,基于上述(c)工序中算出的各区域的荧光强度,设定接下来的拍摄条件的工序,(f)以上述接下来的拍摄条件拍摄荧光图像的工序,及(g)重复上述(c)工序至(f)工序直至在上述(d)工序中判定为结束拍摄的工序。
Description
技术领域
本发明涉及存在多个发出不同荧光强度的区域的试样的荧光图像的读取方法。
背景技术
在使用荧光激光扫描仪、荧光显微镜等荧光测定装置的荧光观察中,有时根据所观察的试样在观察视野内存在多个发出不同荧光强度的区域。
已知作为如下试样的生物芯片:固定有数十至数万个不同种类的DNA、蛋白质、抗体等生物体相关物质作为探针的试样。从生物芯片检测的荧光强度由弱至强在宽的范围内存在。
通常,在读取荧光时,尽可能以受光量增多的条件拍摄会使信息量变多。
然而,如果在检测时,通过调整激发光的输出强度、露出时间等曝光条件来使发出强荧光的区域的荧光强度不饱和而拍摄,则发出弱荧光的区域的亮度会不充分,从而无法检测正确的荧光量。
另一方面,如果通过调整激发光的输出强度、露出时间等曝光条件来使发出弱荧光的区域的亮度充分而拍摄,则会产生发出强荧光的区域的荧光强度饱和而无法检测正确的荧光量的现象。这是因为拍摄对象所发出的荧光量的动态范围大于检测装置所读取的动态范围而产生的问题。
为了解决这样的问题,已知如下方法:在一边使受光量变化一边获取多个图像后,将这些多个图像彼此比较,选择每个区域合适曝光条件的图像,从而以大的动态范围检测(参照专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特许第3834519号公报
发明内容
发明所要解决的课题
然而,对于上述专利文献1中记载的方法,不论试样的种类,均机械性地获取多个图像,因此即使对于能够在动态范围内捕捉到1张图像的试样,也需要在检测中获取完全不必要的图像。因而,检测时间的高速化、检测数据容量的减少是非常困难的。
本发明是为了解决这样的问题而完成的,其目的在于,提供如下方法:以预定的拍摄条件拍摄荧光图像,基于该拍摄的荧光图像所含的各区域的荧光强度,进行拍摄的结束判定、进一步拍摄的拍摄条件的设定,从而以涉及各区域的合适的条件实现拍摄,实现检测时间的高速化、检测数据容量的减少。
用于解决课题的方法
本发明是从存在多个发出荧光的区域的试样读取荧光图像的图像读取方法,其特征在于,具有:
(a)设定第1拍摄条件的工序,
(b)以第1拍摄条件拍摄荧光图像的工序,
(c)对于拍摄的荧光图像所含的多个区域,算出各区域的荧光强度的工序,
(d)基于算出的各区域的荧光强度,判定是否结束拍摄的工序,
(e)当在(d)工序中判断为不结束拍摄时,基于(c)工序中算出的各区域的荧光强度,设定接下来的拍摄条件的工序,
(f)以接下来的拍摄条件拍摄荧光图像的工序,及
(g)重复(c)工序至(f)工序直至在(d)工序中判定为结束拍摄的工序。
根据如此构成的本发明,基于以规定的拍摄条件拍摄的结果,进行之后的拍摄,因而能够有效地进行拍摄,从而能够实现检测时间的高速化和检测数据容量的减少。
本发明中优选:(d)工序具有:
(d-1)对于(c)工序中算出的各区域的荧光强度,判定荧光强度是否有效的工序,及
(d-2)对于判定为荧光强度有效的区域,将(c)工序中算出的荧光强度作为该区域的荧光强度的读取值而采用的工序;
(e)工序具有:
(e-1)当存在判定为荧光强度无效的区域时,将相比(d)工序中作为判定对象的荧光图像的拍摄条件、受光量更少的拍摄条件设定为该区域的接下来的拍摄条件的工序。
根据如此构成的本发明,算出拍摄的每个区域的荧光强度,随时判断是否需要接下来的拍摄条件的图像,从而能够避免获取检测中不使用的图像,同时实现检测时间的高速化和检测数据容量的减少。
本发明中优选:(d)工序具有:
(d-3)在(d-1)工序中,对于上述荧光图像所含的多个区域,判定为全部荧光强度有效时,判定为结束拍摄的工序。
根据如此构成的本发明,能够避免获取检测中不使用的图像,同时实现检测时间的高速化和检测数据容量的减少。
此外,本发明中优选:在(d-2)工序中,关于采用了上述算出工序中算出的荧光强度的区域,省略(g)工序中的(c)工序的应用。
根据如此构成的本发明,能够实现检测时间的高速化和检测数据容量的减少。
此外,本发明中优选:(d)工序具有:
(d-1)对于(c)工序中算出的各区域的荧光强度,判定荧光强度是否有效的工序;
(e)工序具有:
(e-2)对于判定为荧光强度有效的各个区域,抽取受光量比拍摄条件的受光量多的、1个或2个以上拍摄条件的工序,
(e-3)通过下式,分别算出关于各抽取的拍摄条件的预测荧光强度的工序,
式:预测荧光强度=(区域的荧光强度/基准拍摄条件)×抽取的拍摄条件
(其中,基准拍摄条件是(c)工序中算出了荧光强度的荧光图像的拍摄条件)
(e-4)对各抽取的拍摄条件算出的预测荧光强度之中,将有效的预测荧光强度中与最高预测荧光强度对应的拍摄条件设为该区域的确定拍摄条件的工序,
(e-5)当在上述(e-4)工序中,对抽取的各拍摄条件算出的预测荧光强度之中,不存在有效预测荧光强度时,将相比(c)工序中算出了荧光强度的荧光图像的拍摄条件、受光量更少的拍摄条件设定为该区域的接下来的拍摄条件的工序,及
(e-6)对于判定为荧光强度无效的各个区域,将相比(c)工序中算出了荧光强度的荧光图像的拍摄条件、受光量更少的拍摄条件设定为该区域的接下来的拍摄条件的工序;
(f)工序进一步具有:
(f-1)对于各区域,根据(e-4)工序中得到的确定拍摄条件,拍摄荧光图像的工序;
(d)工序进一步具有:
(d-4)对于各区域,将(f-1)工序中拍摄、(c)工序中算出的荧光强度作为各区域的读取值而采用,并且判定为结束拍摄的工序。
根据如此构成的本发明,从以基准拍摄条件拍摄的荧光图像算出每个区域适当得到各区域的荧光强度的拍摄条件,并从以该拍摄条件拍摄的图像读取荧光强度,从而能够进行有效并且动态范围宽的数值化。进一步,能够避免获取检测中不使用的图像,同时实现检测时间的高速化和检测数据容量的减少。
此外,本发明中优选:具有如下工序来代替(e-5)工序:
(e-5’)当在(e-4)工序中,对抽取的各拍摄条件算出的预测荧光强度之中,不存在有效的预测荧光强度时,将拍摄条件设为该区域的确定拍摄条件的工序。
根据如此构成的本发明,能够实现检测时间的高速化。
此外,本发明中优选:当在(e-5’)工序中,拍摄条件被设为该区域的确定拍摄条件时,对于该区域,将(c)工序中算出的荧光强度作为读取值而采用,并且省略上述(f-1)工序。
根据如此构成的本发明,能够实现检测时间的高速化。
此外,本发明中优选:关于拍摄条件,预先准备3个以上拍摄条件,当将该3个以上拍摄条件以受光量顺序排列时,将位于中央附近的拍摄条件作为第1拍摄条件而采用。
根据如此构成的本发明,能够实现检测时间的高速化。
此外,本发明中优选:当将相比(c)工序中算出了荧光强度的荧光图像的拍摄条件,受光量更少的拍摄条件以受光量顺序排列时,将位于中央附近的拍摄条件作为(e-5)工序和(e-6)工序中的接下来的拍摄条件而采用。
根据如此构成的本发明,能够实现检测时间的高速化。
此外,本发明中优选:在判定(d-1)工序中的荧光强度是否有效中,当荧光强度不饱和,并且荧光强度比背景值大时,判定为荧光强度有效。
根据如此构成的本发明,由于读取有意义的值作为荧光强度,因而能够进行适当的图像读取。
此外,本发明中优选:关于拍摄条件,预先准备多个拍摄条件,以当将该多个拍摄条件以受光量顺序排列时,各个拍摄条件下读取的荧光强度之间不产生间隙的方式,预先准备拍摄条件。
根据如此构成的本发明,能够读取的荧光强度值连续,因此对于各种各样的试样,均能够进行适当的图像读取。
此外,本发明中优选:关于拍摄条件,以即使在进一步减去背景值后,各个拍摄条件下读取的荧光强度之间也不产生间隙的方式,预先准备拍摄条件。
根据如此构成的本发明,即使在减去背景值后,能够读取的荧光强度值也连续,因此对于各种各样的试样,均能够进行适当的图像读取。
此外,本发明中优选:当在(e)工序中,无法设定接下来的拍摄条件时,不在接着(e)工序的(f)工序中进行拍摄,而在接下来的(d)工序中判定为结束拍摄。
根据如此构成的本发明,关于无法设定合适的拍摄条件的试样,能够准确地结束拍摄。
此外,本发明中优选:试样为生物芯片。
根据如此构成的本发明,能够将检测时间高速化、检测数据容量减少的图像读取方法以生物芯片为对象来使用。
发明效果
根据本发明,能够提供如下方法:以规定的拍摄条件拍摄荧光图像,基于该拍摄的荧光图像所含的各区域的荧光强度,进行拍摄的结束判定、进一步拍摄的拍摄条件的设定,从而以涉及各区域的合适的条件实现拍摄,并且实现检测时间的高速化、检测数据容量的减少。
附图说明
图1是表示生物芯片的荧光图像的例子的图。
图2是表示曝光时间和来自试样的荧光强度的关系的图表。
图3是所拍摄的区域的荧光图像的放大图。
图4是存在亮点的区域的荧光图像的放大图。
图5是表示本发明的图像读取方法中第1实施方式处理的流程图。
图6是表示本发明的图像读取方法中第2实施方式处理的流程图。
具体实施方式
首先,进行本说明书中记载的用语的说明。
就存在多个发出荧光的区域的试样而言,作为“存在多个发出不同荧光强度的区域的试样”的一个例子,相当于图1所示的生物芯片的荧光图像。在生物芯片11中,以二维状配置有多个发出荧光强度的区域12,各个区域所发出的荧光由弱至强存在多个。所配置的区域的大小、形状、个数、间距没有特别限制。
“生物芯片”是指,在载体上高密度且各自独立地固定有大量探针的芯片。关于生物芯片,只要在支撑体上固定有探针(例如寡核苷酸探针),就没有限制。
对于生物芯片,其支撑体的形态没有特别限制,可使用平板、棒状、珠等任意的形态。作为支撑体,在使用平板的情况下,在该平板上,能够以预定的间隔固定每种规定的探针(点样法等;参照Science270,467-470(1995)等)。此外,也能够在平板上的特定位置,逐次合成每种规定的探针(光刻法等;参照Science251,767-773(1991)等)。
作为其他优选的支撑体的形态,可举出使用中空纤维的支撑体。在使用中空纤维作为支撑体的情况下,可优选例示将每种寡核苷酸探针固定于各中空纤维,并将全部中空纤维集束而固定后,沿纤维的长度方向反复切断而得到的生物芯片。该生物芯片能够以将寡核苷酸探针固定于贯通孔基板的类型进行说明(参照日本特许第3510882号公报等,图1)。
向支撑体固定探针的方法没有特别限制,任何结合样式均可。此外,不限于直接固定于支撑体,例如,也可预先将支撑体用聚赖氨酸等聚合物进行涂覆处理,并将探针固定于处理后的支撑体。进一步,在使用中空纤维等管状体作为支撑体的情况下,也可使凝胶状物保持于管状体,并使探针固定于该凝胶状物。
“荧光图像”是指,对试样照射来自激发光源的激发光并用拍摄装置获取试样所发出的荧光而得的图像。能够用作发出激发光的激发光源的有激光、汞灯、LED等,只要能够照射激发想要观察的荧光的波长的光,则任何光源均可。能够用作拍摄装置的有CCD照相机、CMOS传感器、PMT等,没有特别限制。
就“拍摄条件”而言,尤其对于受光量,是决定利用拍摄装置接收何种程度的试样的荧光强度的条件。作为改变受光量的方法,能够如下实现:改变向样品照射的激发光的照射强度;改变拍摄装置的设定。在改变照射强度的情况下,可如下进行:直接改变激发光源的输出;通过将ND滤光片等插入激发光的光路中来改变激发光对样品的照射强度。此外,在改变拍摄装置的设定的情况下,例如,当使用CCD照相机作为拍摄装置时,可如下进行:改变拍摄的曝光时间;通过改变增益(gain)来改变受光量。由于为了改变条件而使用的每个激发光源、拍摄装置具有特性,因此事前从使用同一试样并改变各个条件而获取的荧光强度算出条件与受光量的关系为佳。
例如,在使用16bit的CCD照相机作为拍摄装置的情况下,试样的荧光强度能够以图2所示的曝光时间与受光量的关系摄入拍摄装置。如果以1秒当量换算CCD照相机所读取的来自试样的荧光强度,则曝光时间1秒能够读取1~65535的亮度、0.1秒能够读取10~655350的亮度、10秒能够读取0.1~6553.5的亮度、100秒能够读取0.01~655.35的亮度。这样的多个拍摄条件被预先准备,关于设定的多个拍摄条件的基准,将这些多个拍摄条件以受光量顺序(升序或降序)排列时,设为以1秒当量换算的荧光强度产生重叠的条件为佳,即各个拍摄条件下读取的换算后的荧光强度之间不产生间隙为佳。此外,优选如下预先准备拍摄条件:即使在减去拍摄的荧光图像的背景值后,各个拍摄条件下读取的荧光强度之间也不产生间隙。
图3中作为例子示出了某一试样的规定区域的荧光图像的放大图。区域31由二维状的像素32构成。
“算出区域的荧光强度”是指,基于处在区域的边界33的内侧的各像素32的荧光强度的值,得到区域31的荧光强度的值的信息,对于处在区域的边界33的内侧的像素32的全部荧光强度,例如,算出平均值、中间值、最小值、最大值、标准偏差、CV(变异系数)等代表性的统计量。该情况下使用的图像不仅可以使用刚拍摄后的荧光图像,也可以使用例如进行了背景校正(减去背景值)、阴影(shading)校正等图像校正的荧光图像,使用者适当选择即可。
在以下各实施方式中,所谓“荧光强度有效”表示在某一拍摄条件下所拍摄的试样的荧光强度不饱和。对于“饱和”的意义将后述。相反,在荧光强度饱和或荧光强度为背景值以下的情况下,对于所得的荧光强度的值,被判断为没有作为测定值的意义。在这样的情况下,判定为荧光强度无效。予以说明的是,可将荧光强度不饱和并且荧光强度比背景值大作为荧光强度有效的条件。
所谓“饱和”,例如,在拍摄装置使用16bit的CCD照相机的情况下,作为读取上限值的65535相当于饱和状态,但由于设备的干扰等外因会导致荧光强度的数值偏向,因此使用者只要以例如对60000以上的情况判断为饱和的方式设定任意的值即可。区域内的像素中即使1像素也存在饱和值,例如对于平均值也无法算出正的荧光强度,但如果使用中间值,则只要构成区域内的像素中饱和像素、亮点像素和因它们而受到影响的像素的合计不超过全部像素的5成,就能够算出有意义的值,因此相比平均值,优选使用中间值作为区域的代表值。关于判断该区域的荧光强度是否饱和的像素数,根据需要,使用者只要设定任意的值即可。
图4中示出了与图3不同的其他区域的荧光图像的放大图。由于在区域41上载有异物,因此该异物被激发而发出荧光,并作为亮点42而被拍摄。该情况下,由于无法算出区域内正确的荧光强度,因此必须进一步从以受光量更弱的拍摄条件拍摄的荧光图像算出区域的荧光强度。此处,对于相应区域内的全部像素的荧光强度,应用公知的亮点去除处理(日本特许第4979516号),从而能够算出排除了亮点影响的荧光强度。
为了该处理,首先,将区域41的全部像素以升序排列后,分别求出中间值、四分之一、四分之三。之后,基于下式算出用于判断为亮点的阈值。
阈值=中间值+(四分之三-四分之一)×α···式1
(α:亮点去除的灵敏度)
1个1个比较构成区域41的像素的荧光强度是否为阈值以上,阈值以上的像素作为亮点从构成区域41的像素中排除。之后,对剩余的像素判断是否饱和,如果不饱和,则能够算出该区域的荧光强度。
此外,即使是从进行了装置背景校正、阴影校正等图像校正的荧光图像算出区域的荧光强度的情况,也能够组合亮点去除处理。对于对刚拍摄后、即未校正的荧光图像实施了预先决定的图像校正的校正图像进行亮点去除,将此时判断为亮点的像素记录在存储器上,对于未校正的荧光图像,将记录在存储器上的位置的像素作为亮点去除后,对剩余的该区域的像素判断是否饱和。此时,如果不饱和,则算出校正图像的亮点去除后的荧光强度。
“采用、非采用”是指,判定区域内是否存在饱和像素,在存在饱和像素的情况下,判定为不采用该拍摄条件的数值结果(非采用),在不存在饱和像素的情况下,将算出的荧光强度作为该区域的数值结果而采用(采用)。此处,由于能够比较从多个拍摄条件算出的荧光强度,因此通过使用事前算出的、拍摄条件与受光量的关系式而换算成同一条件,能够比较多个拍摄条件的结果。可在全部区域均判定为采用时输出换算成同一条件的结果,也可在每次判定采用或非采用时输出结果。
接着,参照图5的流程图对本发明的图像读取方法的第1实施方式进行说明。在实行本实施方式的图像读取方法的情况下,作为图像读取对象的荧光图像的拍摄,能够使用利用公知的拍摄装置获取的荧光图像。例如,能够利用日本特许第3834519号公报中记载的装置的构成。原本,实际上直至实行荧光强度的测定,从试样的各区域发出的荧光强度是不清楚的,但此处,从便于说明来看,预先假定使用以下状态的试样。
试样的状态
发出荧光强度的区域的个数:4个
利用拍摄装置(16bit的CCD照相机)时曝光1.0秒的荧光强度:
区域A:100、区域B:2000、区域C:20000、区域D:100000
在本实施方式中,当开始一连串的处理时,进行将预先设定的、受光量不同的多个拍摄条件以受光量为降序的顺序进行排列的开始处理(步骤S101)。在本实施方式中,对于多个拍摄条件,分别改变受光量而设定。在本实施方式中,将拍摄装置(16bit的CCD照相机)的曝光时间设为0.1秒、1.0秒、4.0秒、40.0秒4种。如果将本拍摄条件以受光量为降序的顺序进行排列,则能够排列成a:40.0秒、b:4.0秒、c:1.0秒、d:0.1秒的顺序。予以说明的是,作为拍摄装置的设定与受光量的关系,通常已知在CCD照相机中曝光时间与受光量成比例。
通过将以各设定的曝光时间拍摄的荧光强度除以其曝光时间,能够换算成每1秒的荧光强度,基于由此得到的荧光强度,能够比较荧光强度。
接着,上述拍摄条件之中,以第1个拍摄条件进行拍摄荧光图像的拍摄工序(步骤S102)。在本实施方式中,在对试样照射激发光的状态下,拍摄以第1个拍摄条件即40.0秒曝光的荧光图像。关于荧光物质,已知如果持续照射激发光会发生退色,从而在荧光图像的拍摄时间以外,优选利用遮板等遮盖以使试样不被激发光照射。予以说明的是,在本实施方式中,对于多个拍摄条件,预先以受光量为降序的顺序排列设定,并且首先以第1个拍摄条件进行拍摄工序,但除了将这样的多个拍摄条件预先排列设定以外,作为后述重复工序的开始点的拍摄的初期设定,应用规定的拍摄条件也无妨。
接着,对于上述拍摄工序中拍摄的荧光图像所含的多个区域,进行算出各区域的荧光强度的算出工序(步骤S103)。在本实施方式中,各区域的荧光强度的算出能够使用公知的技术,通过利用一般的图像解析软件能够容易地算出。此处,关于实际的荧光强度,区域A为4000、区域B为80000、区域C为800000、区域D为4000000,但由于CCD照相机为16bit,因此对于区域B~D,所算出的荧光强度分别为65535。
接着,对于算出工序中算出的各区域的荧光强度,判定荧光强度是否饱和,如果荧光强度不饱和,则对于所判定的区域,进行采用算出工序中算出的荧光强度的饱和判定工序(步骤S104)。在本实施方式中,荧光强度是否有效基于荧光强度是否饱和来判断。如果荧光强度不饱和,则荧光强度有效,如果荧光强度饱和,则荧光强度无效。在本实施方式中,对于各区域的荧光强度,作为判断饱和(即荧光强度无效)的指标,当区域内存在1像素以上超过65000的荧光强度时定为饱和,由于区域B~D饱和,因此第1个拍摄条件的荧光强度被判定为非采用,另一方面,由于区域A不饱和,因此荧光强度有效,本曝光时间的荧光强度被判定为采用。
接着,对于经由上述饱和判定工序的荧光图像,进行判定是否满足读取结束条件的结束判定工序(步骤S105)。作为该读取结束条件,例如,对于荧光图像所含的多个区域,能够将不存在判定为荧光强度饱和的区域(即在全部区域中荧光强度有效)设为条件。在本实施方式中,对于区域A~D各区域,当不存在判定为荧光强度饱和的区域时,即当判定为区域A~D全部不饱和,全部荧光强度均被采用时,结束读取(步骤S105的Yes至步骤S106)。
在结束判定工序中,在存在判定为荧光强度饱和的区域(即判定为荧光强度无效的区域)的情况下,本实施方式继续处理(步骤S105的No)。对于判定为荧光强度饱和的区域,认为拍摄工序S102中应用的拍摄条件不恰当。此时,相比拍摄工序S102中应用的拍摄条件,应用受光量少的拍摄条件(步骤S107)。对于本实施方式的例子,在饱和判定工序S104中,由于判定区域B~D的3个区域饱和,因此设定为以受光量更少的接下来的拍摄条件、即第2个拍摄条件b:4.0秒进行曝光。
然后,以对试样照射激发光的状态,应用新的拍摄条件,拍摄荧光图像(步骤S107至步骤S102)。对于本实施方式的例子,拍摄以新应用的接下来的拍摄条件、b:4.0秒曝光的荧光图像。之后,重复应用上述算出工序(步骤S103)、饱和判定工序(步骤S104)、结束判定工序(步骤S105)。
在本实施方式的例子中,对于以第2个拍摄条件即b:4.0秒进行曝光的设定拍摄的荧光图像,算出工序(步骤S103)中算出荧光强度的区域对应B~D的3个区域,对于采用已算出的荧光强度的区域A,为了处理的高速化、效率化,省略该算出工序以下、各工序的实施。关于进行算出工序的区域B~D的实际荧光强度,区域B为8000、区域C为80000、区域D为400000,但由于CCD照相机为16bit,因此对于区域C~D,所算出的荧光强度分别为65535。
在本实施方式的例子中,对于从以第2个拍摄条件拍摄的荧光图像算出的荧光强度,进一步进行饱和判定工序。如上所述,在第2个拍摄条件中,由于区域C~D饱和,因此第2个拍摄条件下的荧光强度被判定为非采用,另一方面,由于区域B不饱和,因此第2个拍摄条件下的荧光强度被判定为采用。以下,同样地继续处理,持续改变拍摄条件,如果变得不存在判定为荧光强度饱和的区域,则结束读取处理。
在本实施方式的例子中,关于采用的拍摄条件(曝光时间)、该曝光时间下的荧光强度、和基于此以曝光时间1秒换算的荧光强度,最终能够得到表1所示的结果。
[表1]
这样,根据本发明的实施方式,通过算出拍摄的每个区域的荧光强度,能够避免获取检测中不使用的图像,同时实现检测时间的高速化和检测数据容量的减少。
另外,对于本实施方式的图像读取方法,当判定为全部区域的荧光强度不饱和(即全部区域的荧光强度均有效)时,结束本荧光图像的读取,但在受光量最少的拍摄条件中仍存在荧光强度饱和的区域的情况下,作为适宜结果,只要向使用者输出该区域饱和而无法算出正确的荧光强度即可。在该情况下,作为读取结束条件,除了“不存在判定为荧光强度饱和的区域”以外,还要附加“不能再改变拍摄条件”作为条件。
在上述第1实施方式中,将不存在判定为荧光强度饱和的区域作为读取结束条件,但除此之外,也能够将相对于全部区域的面积,判定为荧光强度饱和的区域的面积为规定比率以下作为读取结束条件。
接着,参照图6的流程图,对本发明的图像读取方法的第2实施方式进行说明。与上述第1实施方式同样,在实行本实施方式的图像读取方法的情况下,作为图像读取对象的荧光图像的拍摄也能够使用利用公知的拍摄装置获取的荧光图像。例如,能够使用日本特许第3834519号公报中记载的装置的构成。原本,实际上直至实行荧光强度的测定,从试样的各区域发出的荧光强度是不清楚的,但此处,从便于说明来看,预先假定使用以下状态的试样。
试样的状态
发出荧光强度的区域的个数:5个
使用拍摄装置(16bit的CCD照相机)时曝光1.0秒的荧光强度:
区域A:500、区域B:2000、区域C:20000、区域D:100000、区域E:1000000
关于本实施方式,在以下说明中,“基准拍摄条件”是指,为了求出每个区域的最适的拍摄条件即确定拍摄条件,用作基准的拍摄条件,是下述步骤S204中算出了荧光强度的荧光图像的拍摄条件。后述步骤S202中设定第1拍摄条件,其对应最初的基准拍摄条件。之后,在存在无法决定确定拍摄条件的区域的情况下,设定新的接下来的拍摄条件,其对应接下来的基准拍摄条件。
此外,关于本实施方式,在以下说明中,“预测荧光强度”是指,基于从以成为基准拍摄条件的拍摄条件拍摄的荧光图像算出的区域的荧光强度,对以另一拍摄条件拍摄的情况预测的荧光强度。如上所述,在CCD照相机的情况下,曝光时间与受光量具有成比例的关系。作为基准拍摄条件为10秒的曝光时间,当某一区域的荧光强度为1000时,如果另一拍摄条件为20秒的曝光时间,则能够预测其荧光强度为2000左右。
在本实施方式中,预先准备受光量不同的3个以上拍摄条件,具体而言,准备以下说明的7个拍摄条件。在本实施方式中,当开始一连串处理时,进行以受光量为升序的顺序排列这些受光量不同的多个拍摄条件的开始处理(步骤S201)。在本实施方式中,对于多个拍摄条件,分别改变受光量而设定。在本实施方式中,将拍摄装置(16bit的CCD照相机)的曝光时间设为0.01秒、0.1秒、1.0秒、4.0秒、40.0秒、100.0秒、400.0秒7种。如果以受光量为升序的顺序排列本拍摄条件,则能够以a:0.01秒、b:0.1秒、c:1.0秒、d:4.0秒、e:40.0秒、f:100.0秒、g:400.0秒的顺序排列。予以说明的是,作为拍摄装置的设定与受光量的关系,对于CCD照相机,通常已知曝光时间与受光量成比例。通过将以各设定的曝光时间拍摄的荧光强度除以其曝光时间,能够换算成每1秒的荧光强度,基于这样得到的荧光强度,能够比较荧光强度。予以说明的是,在本实施方式中,以受光量为升序的顺序排列了拍摄条件,但以降序的顺序排列也无妨。总之,无论升序还是降序,只要以受光量顺序排列拍摄条件即可。
接着,进行拍摄条件(作为基准拍摄条件的第1拍摄条件)的设定(步骤S202)。在本实施方式中,接着步骤S201,将上述拍摄条件的中间值、即第4个拍摄条件d设定为作为基准拍摄条件的第1拍摄条件。予以说明的是,在本实施方式中,由于预先准备的拍摄条件为奇数个,因此将位于正中央的第4个拍摄条件设定为第1拍摄条件。在预先准备的拍摄条件为偶数个的情况下,将中央附近的2个拍摄条件中的任一个设定为第1拍摄条件均可。总之,在以受光量顺序排列多个拍摄条件的情况下,只要将位于中央附近的拍摄条件用作第1拍摄条件即可。
接着,以设定的拍摄条件(在步骤S201、步骤S202的流程中,作为基准拍摄条件的第1拍摄条件)拍摄荧光图像(步骤S203)。以对试样照射激发光的状态,拍摄以4.0秒曝光的荧光图像。关于荧光物质,已知如果持续照射激发光会发生退色,从而在不拍摄荧光图像时,优选利用遮板等遮盖,以便不对试样照射激发光。
对于上述拍摄工序(步骤S203)中拍摄的荧光图像所含的多个区域,进行算出各区域的荧光强度的算出工序(步骤S204)。在本实施方式中,各区域的荧光强度的算出能够利用公知的技术,通过利用一般的图像解析软件能够容易地算出。关于此处实际的荧光强度,区域A为2000、区域B为8000、区域C为80000、区域D为400000、区域E为4000000,但由于CCD照相机为16bit,因此对于区域C~E算出的荧光强度分别为65535。该算出工序(步骤S204)中算出荧光强度的荧光图像是在拍摄工序(步骤S203)中拍摄的,该拍摄工序(步骤S203)的拍摄条件是在步骤S202中设定的,该拍摄条件为基准拍摄条件。
接着,进行确定拍摄条件的算出(步骤S205)。首先,对于从上述判断拍摄条件算出的各区域的荧光强度,进行饱和的判定(即荧光强度是否有效的判定)。在本实施方式中,对于各区域的荧光强度,作为判断饱和的指标,当区域内存在1像素以上超过65000的荧光强度时定为饱和,从而区域A~B被判定为不饱和(即荧光强度有效),区域C~E被判定为饱和(即荧光强度无效)。
接着,抽取受光量为基准拍摄条件(步骤S203中拍摄的荧光图像的拍摄条件)时的受光量以上的拍摄条件。在本实施方式中,抽取拍摄条件d~g四种。
接着,进行预测荧光强度的算出。关于预测荧光强度的算出,相对于上述不饱和的区域A~B,针对如上抽取的拍摄条件d~g算出。
预测荧光强度=(区域的荧光强度/基准拍摄条件)×抽取的拍摄条件···式2
基于上述式2算出的预测荧光强度为表2所示的结果。
[表2]
接着,进行各区域的确定拍摄条件的确定。如果在表2中选择预测荧光强度不饱和并且预测荧光强度最高,则对于区域A,拍摄条件f:100.0秒被定为确定拍摄条件,对于区域B,拍摄条件d:4.0秒被定为确定拍摄条件。
接着,对全部区域进行决定确定拍摄条件的判定(步骤S206)。至此,由于区域C~E未决定确定拍摄条件(步骤S206的No),因此对于区域C~E,进行与接下来的拍摄条件的设定(步骤S202)相同的计算处理。
关于接下来的拍摄条件,设定与上述第1拍摄条件不同的新的拍摄条件。由于在至此的步骤中,将拍摄条件d~g用于确定拍摄条件的设定,因此从剩余的拍摄条件a~c中选择。对于步骤S202,与上述方法同样,在将相比基准拍摄条件受光量少的剩余拍摄条件以受光量顺序排列的情况下,将位于中央附近的拍摄条件设为接下来的拍摄条件。如果选择这3种条件的中间值,则作为用于求得与区域C~E相关的确定拍摄条件的基准的接下来的拍摄条件为b:0.1秒。
以下,基于接下来的拍摄条件b:0.1秒,同样地进行步骤S203~步骤S205的操作,从而区域C的确定拍摄条件为拍摄条件c,区域D的确定拍摄条件为拍摄条件b。对于区域E,由于未决定确定拍摄条件,因此继续返回步骤S202,作为接下来的拍摄条件,选择拍摄条件a,同样地进行步骤S203~步骤S205的操作。作为结果,对于各区域的确定拍摄条件,区域A为拍摄条件e、区域B为拍摄条件d、区域C为拍摄条件c、区域D为拍摄条件b、区域E为拍摄条件a。
在决定确定拍摄条件中,当全部区域最终达到不饱和状态时,决定与全部区域有关的确定拍摄条件,结束一连串的确定拍摄条件的决定(步骤S206的Yes)。此外,在受光量最少的拍摄条件中仍存在饱和的情况下,作为适当结果,只要向使用者输出该区域饱和而无法算出正确的荧光强度即可。
[表3]
[表4]
接着,以确定拍摄条件进行拍摄(步骤S207)。进行拍摄之后,对于各个区域,只算出对应拍摄条件的荧光强度,读取(步骤S208),结束一连串的处理(步骤S209)。
在本实施方式的例子中,最终,关于采用的确定拍摄条件(曝光时间)、该曝光时间下的荧光强度、和基于此以曝光时间1秒换算的荧光强度,能够得到表5所示的结果。
[表5]
这样,根据本发明的实施方式,从以基准拍摄条件拍摄的荧光图像算出每个区域的最适合得到各区域的荧光强度的拍摄条件,从以该拍摄条件拍摄的图像读取荧光强度,从而能够进行有效并且动态范围宽的数值化。进一步,能够避免获取检测中不使用的图像,同时实现检测时间的高速化和检测数据容量的减少。
另外,在本实施方式中,当算出确定拍摄条件时,对于荧光强度不饱和的区域,抽取受光量为基准拍摄条件时的受光量以上的拍摄条件,从它们中算出确定拍摄条件。如上所述,当对抽取的拍摄条件算出的预测荧光强度之中,不存在有效的荧光强度时,对于该区域,再设定基准拍摄条件而进行同样的处理。如果基于再设定的基准拍摄条件,进行同样的处理,则最终,再设定前的基准拍摄条件作为确定拍摄条件而算出。因此,除了本实施方式的处理,关于荧光强度不饱和的区域,当对抽取的各拍摄条件算出的预测荧光强度之中,不存在有效的荧光强度时,对于该区域,也能够将目前算出中使用的基准拍摄条件设为该区域的确定拍摄条件来代替再设定基准拍摄条件。如果这样,则能够提高计算处理的效率。
此外,在本实施方式中,对各区域得到确定拍摄条件后,以确定拍摄条件进行拍摄(步骤S207),进行拍摄后,对于各个区域,只算出对应拍摄条件的荧光强度(步骤S208)。另一方面,如上所述,在将目前算出中使用的基准拍摄条件设为该区域的确定拍摄条件来代替再设定基准拍摄条件的实施方式中,从而能够认为已经进行了确定拍摄条件下的拍摄。因而,为了节约拍摄时间,也能够省略确定拍摄条件下的拍摄等,以设为基准拍摄条件的拍摄条件拍摄,将算出工序(步骤S204)中算出了荧光强度的荧光强度作为读取值而采用。
另外,在上述实施方式中,对于全部区域均求出了确定拍摄条件,但除此之外,也能够在相对于全部区域的面积、未得到确定拍摄条件的区域的面积为预定比率以下的阶段,对于该比率以上,不求出确定拍摄条件,基于已经得到的确定拍摄条件进行拍摄,并进行读取。
Claims (14)
1.一种图像读取方法,其是从存在多个发出荧光的区域的试样读取荧光图像的图像读取方法,具有:
(a)设定第1拍摄条件的工序,
(b)以所述第1拍摄条件拍摄荧光图像的工序,
(c)对于拍摄的荧光图像所含的多个区域,算出各区域的荧光强度的工序,
(d)基于所述算出的各区域的荧光强度,判定是否结束拍摄的工序,
(e)当在所述(d)工序中判断为不结束拍摄时,基于所述(c)工序中算出的各区域的荧光强度,设定接下来的拍摄条件的工序,
(f)以所述接下来的拍摄条件拍摄荧光图像的工序,及
(g)重复所述(c)工序至(f)工序,直至在所述(d)工序中判定为结束拍摄的工序。
2.根据权利要求1所述的图像读取方法,
所述(d)工序具有:
(d-1)对于所述(c)工序中算出的、所述各区域的荧光强度,判定荧光强度是否有效的工序,及
(d-2)对于判定为荧光强度有效的区域,将在所述(c)工序中算出的荧光强度作为该区域的荧光强度的读取值而采用的工序;
所述(e)工序具有:
(e-1)当存在判定为荧光强度无效的区域时,将相比所述(d)工序中作为判定对象的荧光图像的拍摄条件、受光量更少的拍摄条件设定为该区域的接下来的拍摄条件的工序。
3.根据权利要求2所述的图像读取方法,所述(d)工序具有:
(d-3)在所述(d-1)工序中,对于所述荧光图像所含的多个区域,判定为全部荧光强度有效时,判定为结束拍摄的工序。
4.根据权利要求2或3所述的图像读取方法,在所述(d-2)工序中,关于采用了所述算出工序中算出的荧光强度的区域,省略所述(g)工序中的所述(c)工序的应用。
5.根据权利要求1所述的图像读取方法,
所述(d)工序具有:
(d-1)对于所述(c)工序中算出的、所述各区域的荧光强度,判定荧光强度是否有效的工序;
所述(e)工序具有:
(e-2)对于判定为荧光强度有效的各个区域,抽取受光量比所述拍摄条件的受光量多的、1个或2个以上拍摄条件的工序,
(e-3)根据下式,分别算出关于各抽取的拍摄条件的预测荧光强度的工序,
式:预测荧光强度=(区域的荧光强度/基准拍摄条件)×抽取的拍摄条件
其中,基准拍摄条件是(c)工序中算出了荧光强度的荧光图像的拍摄条件,
(e-4)在对各抽取的拍摄条件算出的所述预测荧光强度之中,将有效的预测荧光强度中、与最高预测荧光强度对应的拍摄条件设为该区域的确定拍摄条件的工序,
(e-5)当在所述(e-4)工序中,对所述抽取的各拍摄条件算出的所述预测荧光强度之中,不存在有效的预测荧光强度时,将相比所述(c)工序中算出了荧光强度的荧光图像的拍摄条件、受光量更少的拍摄条件设定为该区域的所述接下来的拍摄条件的工序,及
(e-6)对于判定为荧光强度无效的各个区域,将相比所述(c)工序中算出了荧光强度的荧光图像的拍摄条件、受光量更少的拍摄条件设定为该区域的所述接下来的拍摄条件的工序;
所述(f)工序进一步具有:
(f-1)对于各区域,根据所述(e-4)工序中得到的确定拍摄条件,拍摄荧光图像的工序;
所述(d)工序进一步具有:
(d-4)对于各区域,将所述(f-1)工序中拍摄、所述(c)工序中算出的荧光强度作为所述各区域的读取值而采用,并且判定为结束拍摄的工序。
6.根据权利要求5所述的图像读取方法,具有如下工序来代替所述(e-5)工序:
(e-5’)当在所述(e-4)工序中,对所述抽取的各拍摄条件算出的所述预测荧光强度之中,不存在有效的预测荧光强度时,将所述拍摄条件设为该区域的确定拍摄条件的工序。
7.根据权利要求6所述的图像读取方法,当在所述(e-5’)工序中,所述拍摄条件被设为该区域的确定拍摄条件时,对于该区域,将所述(c)工序中算出的荧光强度作为读取值而采用,并且省略所述(f-1)工序。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的图像读取方法,关于所述拍摄条件,预先准备3个以上拍摄条件,当将该3个以上拍摄条件以受光量顺序排列时,将位于中央附近的拍摄条件作为所述第1拍摄条件而采用。
9.根据权利要求8所述的图像读取方法,当将相比所述(c)工序中算出了荧光强度的荧光图像的拍摄条件,受光量更少的拍摄条件以受光量顺序排列时,将位于中央附近的拍摄条件作为所述(e-5)工序和(e-6)工序中的所述接下来的拍摄条件而采用。
10.根据权利要求2至9中任一项所述的图像读取方法,在判定所述(d-1)工序中的荧光强度是否有效中,当荧光强度不饱和,并且荧光强度比背景值大时,判定为荧光强度有效。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的图像读取方法,关于所述拍摄条件,预先准备多个拍摄条件,以当将该多个拍摄条件以受光量顺序排列时,各个拍摄条件下读取的荧光强度之间不产生间隙的方式,预先准备所述拍摄条件。
12.根据权利要求11所述的图像读取方法,关于所述拍摄条件,以即使在进一步减去背景值后,各个拍摄条件下读取的荧光强度之间也不产生间隙的方式,预先准备所述拍摄条件。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的图像读取方法,当在所述(e)工序中,无法设定所述接下来的拍摄条件时,不在接着所述(e)工序的(f)工序中进行拍摄,而在接下来的(d)工序中判定为结束拍摄。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的图像读取方法,所述试样是生物芯片。
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