KR100626244B1 - 생체 관련 물질 마이크로어레이 및 그의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생체 관련 물질이 유지된 복수의 선조체 또는 관통 구멍을 포함하는 블럭에 대하여 선조체 또는 관통 구멍의 길이 방향과 교차하는 방향으로 절단하여 얻어지는 마이크로어레이에 있어서, 상기 선조체 및(또는) 블럭이 그 자가 형광을 감소시키는 물질을 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이에 관한 것이다.
선조체, 관통 구멍, 블럭, 마이크로어레이, 자가 형광, 흡수제, 소광제, 무기 안료, 생체 관련 물질

Description

생체 관련 물질 마이크로어레이 및 그의 제조 방법 {Micro-array of Organism-Associated Substance}
본 발명은 임상 검사, 식품 검사 등의 분야 등에 이용할 수 있는 생체 관련 물질이 프로브로서 고정화된 마이크로어레이 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.
최근, 다수 유전자의 일괄 발현의 해석을 가능하게 하는 DNA 마이크로어레이법 (DNA칩법)이라고 불리우는 새로운 분석법 내지 방법론이 개발되어 주목을 모으고 있다. 이들 방법은 모두 핵산-핵산간 혼성화 반응에 기초하는 핵산 검출ㆍ정량법인 점에서 원리적으로는 종래의 방법과 동일하지만, 마이크로어레이 또는 칩 (이하, "마이크로어레이"라고 함)이라고 불리우는 평면 기반상에 다수의 DNA 단편이 고밀도로 정렬 고정화된 것이 사용되고 있는 점에 큰 특징이 있다. 마이크로어레이법의 구체적인 사용법으로서는, 예를 들면 연구 대상 세포의 발현 유전자 등을 형광 색소 등으로 표지한 샘플을 평면 기반의 한쪽면 위에서 혼성화시켜 서로 상보적인 핵산 (DNA 또는 RNA)들을 결합시키고, 그 부분을 형광 색소 등으로 라벨한 후, 고해상도 해석 장치를 이용하여 고속으로 판독하는 방법을 들 수 있다. 이렇게 하여 샘플 중의 각각의 유전자량을 신속하게 추정할 수 있다. 이 새로운 방법을 도입함으로써 반응 검체의 미량화와, 그 반응 검체를 양호한 재현성으로 다량ㆍ 신속ㆍ계통적으로 분석, 정량할 수 있게 되었다.
이들 DNA 마이크로어레이의 제조법으로서는, DNA를 유리 기판상에 구분하여 고정화하는 방법, 반도체칩 제조에 사용되는 포토리소그래피 기술을 이용하여 실리콘 기판상의 구분된 영역에 핵산을 1개씩 합성하는 방법 등이 개시되어 있다 (미국 특허 5,445,934호, 미국 특허 5,774,305호 공보 참조).
또한, 유리 및 고분자를 포함하는 선조체에 DNA를 고정화하여 이 선조체를 접착제와 함께 다발형으로 하고, 섬유 단면 방향으로 절단하여 DNA 마이크로어레이를 얻는 방법 (일본 특허 공개 (평)11-108928호 공보 참조), DNA 등이 고정된 섬유가 복수가닥 수속된 것을 섬유의 길이 방향에 대하여 교차하도록 절단하여 DNA 마이크로어레이를 얻는 방법 (일본 특허 공개 2000-245461호 공보 참조), 또한 수지 블럭에 복수의 관통 구멍을 뚫고, 이들 구멍에 DNA 등을 유지한 후, 블럭을 슬라이스함으로써 DNA 마이크로어레이를 얻는 방법이 개시되어 있다 (일본 특허 공개 2000-78998호 공보 기재). 이들 제법은 반복 절단을 행함으로써 복수의 마이크로어레이를 제조할 수 있기 때문에, 동일한 배열을 갖는 칩을 대량 생산하는 경우에는 매우 바람직한 제법이다.
예를 들면, 상기에서 예시한 DNA 마이크로어레이를 사용하여 검체 중의 특정한 DNA를 검출하기 위해서는, 칩에 고정되어 있는 프로브 또는 검체의 DNA를 형광 표지하여 혼성화 등의 조작을 행함으로써 하이브리드를 형성한 프로브 또는 검체에 대하여 외부로부터 형광 여기광을 조사하고, 이 형광 분자로부터 방사되는 형광 여기를 검출함으로써 행해지는 것이 일반적이다.
그러나, 검체 중에 미량만 포함되는 DNA 등의 생체 관련 물질을 검출하는 경우, 프로브 또는 검체 이외로부터 방사되는 형광, 구체적으로는 프로브를 유지하고 있는 기반 등의 자가 형광이 노이즈로서 검출되어 미량의 생체 관련 물질을 검출할 수 없다는 문제가 있었다.
또한, 반복 절단을 행함으로써 복수의 마이크로어레이를 제조하는 방법은, 대량으로 동일한 배열을 갖는 마이크로어레이를 제조할 수 있다는 점에서는 우수하지만, 마이크로어레이의 만곡등이 발생한다는 문제가 있었다.
본 발명은 프로브 및 검체 이외에서 방사되는 노이즈광을 감소시켜 미량 성분의 검출을 가능하게 하는 마이크로어레이를 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 반복 절단을 행함으로써 복수의 마이크로어레이를 제조하는 방법에 있어서, 만곡 등의 문제점없이 효율적으로 마이크로어레이를 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 상기한 문제점을 해결하기 위해 예의 검토한 결과, 마이크로어레이를 구성하는 재료에 자가 형광을 감소시키는 물질을 첨가함으로써, 미량의 검체도 검출 가능해지는 것을 발견하였다. 또한, 그 마이크로어레이의 제조법에 있어서, 자가 형광을 감소시키는 물질을 마이크로어레이를 구성하는 재료에 첨가함으로써, 만곡 등의 문제점없이 효율적으로 마이크로어레이를 제조할 수 있다는 것을 발견하였다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
1. 생체 관련 물질이 유지된 복수의 선조체 또는 관통 구멍을 포함하는 블럭을, 선조체 또는 관통 구멍의 길이 방향과 교차하는 방향으로 절단하여 얻어지는 마이크로어레이에 있어서, 상기 선조체 및(또는) 블럭이 그 자가 형광을 감소시키는 물질을 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.
2. 블럭의 자가 형광을 감소시키는 물질을 포함하는 블럭에 복수의 관통 구멍을 형성하고, 이 관통 구멍 내에 생체 관련 물질을 유지하고, 관통 구멍의 길이 방향과 교차하는 방향으로 상기 블럭을 절단하는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이의 제조 방법.
3. 생체 관련 물질이 유지된 선조체 다발을 자가 형광을 감소시키는 물질을 포함하는 수지로 고정하여 블럭을 제조하고, 선조체의 길이 방향과 교차하는 방향으로 상기 블럭을 절단하는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이의 제조 방법.
4. 자가 형광을 감소시키는 물질을 포함하는 수지로 선조체 다발을 고정하여 블럭을 제조하고, 이 각각의 선조체에 생체 관련 물질을 유지시킨 후, 선조체의 길이 방향과 교차하는 방향으로 상기 블럭을 절단하는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이의 제조 방법.
5. 상기 3 또는 4의 방법에 있어서, 선조체가 자가 형광을 감소시키는 물질을 함유하는 방법.
상기 마이크로어레이 또는 그의 제조 방법에 있어서, 선조체로서는 예를 들면 중공 섬유 등의 섬유를 들 수 있으며, 블럭으로서는 수지를 포함하는 것을 들 수 있다. 또한, 자가 형광을 감소시키는 물질로서는 흡수제 (예를 들면 무기 안 료) 및(또는) 소광제를 예시할 수 있다.
무기 안료는 카본 블랙인 것이 바람직하며, 그 함유량은 예를 들면 0.5 내지 10 질량％이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. 본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본 특허 출원 2000-184393호의 명세서 및(또는) 도면에 기재되는 내용을 포함한다.
본 발명에 있어서, 생체 관련 물질이란 이하의 (1) 내지 (3)의 물질로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 들 수 있다.
(1) 핵산, 아미노산, 당 또는 지질
(2) 상기 (1)의 물질 중 1종 이상의 성분을 포함하는 중합물
(3) 상기 (1) 또는 (2)의 물질과 상호 작용을 갖는 물질
예를 들면, 생체 관련 물질로서 핵산을 사용하는 경우에는, 생세포로부터의 DNA 또는 RNA의 제조는 공지된 방법, 예를 들면 DNA의 추출에 대해서는 블린(Blin) 등의 방법 (Nucleic Acids Res. 3. 2303(1976)) 등에 의해, 또한 RNA의 추출에 대해서는 파발로로(Favaloro) 등의 방법 (Methods, Enzymol. 65. 718(1980)) 등에 의해 행할 수 있다. 또한, 쇄상 또는 환상의 플라스미드 DNA 또는 염색체 DNA가 사용된다. 이들 DNA로서는 제한 효소에 의해 또는 화학적으로 절단된 DNA 단편, 시험관 내에서 효소 등에 의해 합성된 DNA 또는 화학 합성된 올리고뉴클레오티드 등을 사용할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 블럭은 선조체 또는 관통 구멍, 및 이들 선조체 또는 관 통 구멍을 제외한 블럭 본체로 이루어진다. 즉, 한 블럭은 블럭 본체 및 그 내부에 유지되어 있는 선조체로 이루어진다. 또한 다른 블럭은 블럭 본체 및 그 내부에 형성되어 있는 관통 구멍으로 이루어진다.
블럭 본체의 재질로서는 폴리아미드계, 폴리에스테르계, 아크릴계, 폴리우레탄계, 페놀계, 불소계 등의 공지된 수지 조성물이 사용된다.
본 발명에 있어서, 선조체 또는 관통 구멍은 생체 관련 물질을 유지하는 장을 제공한다. 이들 선조체 또는 관통 구멍은 실질적으로 직선형 구조로서, 각 선조체 또는 관통 구멍은 서로 실질적으로 평행하게 배치된다. 선조체 또는 관통 구멍의 단면 형상은 어떠한 형태이든 좋다. 가장 바람직한 단면 형상은 원형이다. 통상, 선조체 또는 관통 구멍은 복수개 배치된다.
선조체 또는 관통 구멍의 배열 밀도는 한정되지 않지만, 1회의 분석으로 다량의 데이타를 취득하는 경우에는, 1장의 마이크로어레이에 100 내지 1,000,000 /cm2 정도 배치되는 것이 바람직하다. 또한, 선조체는 선조체들이 등간격으로 배치되어 있는 것이 바람직하다.
선조체는, 예를 들면 중실 섬유, 다공질 중실 섬유, 금속선, 중공 섬유, 다공질 중공 섬유, 유리관 등으로 구성된다. 또한, 복수의 가는 선조체를 다발로 묶은 후, 비틀어 전체를 1개의 직선형 선조체로 할 수도 있다.
생체 관련 물질은, 개개의 관통 구멍 또는 선조체마다 종류가 다른 것을 유지시킬 수 있으며, 또한, 동일한 종류의 생체 관련 물질을 복수의 관통 구멍 또는 선조체에 유지시킬 수도 있다.
본 발명에 있어서, 선조체 및(또는) 블럭에는 그 선조체 및(또는) 블럭에 유래하는 자가 형광을 감소시키는 물질을 포함시킨다. 그러한 물질로서는, 자가 형광을 흡수하는 물질(흡수제)과 자가 형광의 탈여기를 일으키는 물질(소광제)을 들 수 있다.
흡수제로서는 유기질 또는 무기질의 안료를 예시할 수 있다. 구체적으로는 흑색 안료로서는 카본 블랙, 아세틸렌 블랙, 철흑, 황색 안료로서는 크롬황, 아연황, 황토, 한자(Hansa) 옐로우, 퍼머넌트 옐로우, 벤진 옐로우, 오렌지색 안료로서는 오렌지 레이크, 몰리브덴 오렌지, 벤진 오렌지, 적색 안료로서는 철단, 카드뮴 레드, 안티몬 주홍색, 퍼머넌트 레드, 리솔 레드, 레이크 레드, 브릴리안트 진홍색, 티오인디고 레드, 청색 안료로서는 군청, 코발트 블루, 프탈로시아닌 블루, 인디고, 녹색 안료로서는 크롬 그린, 비리디안 나프톨 그린, 프탈로시아닌 그린 등을 들 수 있다.
특히 흡수제에 의한 자가 형광 강도의 감쇠는, 형광파와 선조체 및(또는) 블럭 본체 중의 흡수제와의 충돌 횟수, 충돌 빈도, 형광파가 진행하는 거리에 의존한다. 따라서, 흡수제의 효과를 충분히 발휘시키기 위해서는, 될 수 있는 한 미립자의 흡수제를 사용하여 균일하게 분산시키는 것이 바람직하다. 그러한 흡수제로서는 카본 블랙이 매우 바람직하다.
이들 흡수제는 자가 형광을 감소시킬 수 있으며, 또한 검출시에 검출해야 할 형광 물질의 형광을 방해하지 않는 것을 선택한다. 예를 들면, 플루오레세인 이소 티오시아네이트(FITC)가 결합된 물질을 검출하고자 하는 경우에는, 황색 및 녹색 이외의 안료가 선택된다.
2색 형광 검출법에서 예시되는 복수의 형광 표지를 사용하는 경우에는, 가시광 영역의 광을 폭넓게 흡수하는 것을 선택하는 것이 바람직하다. 그러한 흡수제로서는 흑색 안료를 들 수 있다.
소광제로서는 상자성 이온인 Fe(III), Ni(II), Cr(III), Cu(II), Ti(I) 등을 예시할 수 있다. 또한, 아크릴아미드 등의 전하를 갖지 않는 분자를 들 수 있다.
상기한 흡수제 및(또는) 소광제는 통상은 한쪽만 사용되지만, 두가지를 조합하여 사용할 수도 있다.
또한, 본 발명에 있어서는, 필요에 따라 선조체의 일부 또는 전부를 염색할 수도 있다. 선조체의 일부 또는 전부를 염색함으로써, 염색된 선조체는 검체를 검출할 때 좌표 기준이 된다.
본 발명의 마이크로어레이의 두께는 5 mm 이하 (예를 들면 50 ㎛ 내지 5 mm)가 바람직하며, 1 mm 이하 (예를 들면 100 ㎛ 내지 1 mm)가 보다 바람직하다.
이하, 상기한 재료를 사용한 마이크로어레이의 제조 방법을 예시한다.
생체 관련 물질은 선조체의 외표면, 중공부의 내벽 부분, 또는 다공질부 등에 물리적 또는 화학적으로 유지된다. 또한, 생체 관련 물질은 관통 구멍의 중공부 또는 내벽부에 물리적 또는 화학적으로 유지된다. 생체 관련 물질의 유지 방법은 유지하는 생체 관련 물질의 종류, 선조체 또는 관통 구멍의 재질 및 형상 등에 따라 적절하게 선택된다. 예를 들면, 생체 관련 물질을 포함하는 용액에 선조체를 침지한 후, 베이킹 및 자외선 조사에 의해 선조체 표면에 생체 관련 물질을 유지시킬 수 있다. 또한, 선조체가 중공 섬유라면 중공부의 내벽을 적당한 코팅제, 예를 들면 폴리-L-리신으로 처리하고, 중공부로 생체 관련 물질을 도입하여 생체 관련 물질을 유지하는 방법이나, 중공부에 생체 관련 물질을 함유한 아크릴드계 중합체, 아가로스 등의 고분자 중합체를 충전함으로써 유지하는 방법을 예시할 수 있다.
블럭 본체 중에 선조체 다발을 고정하는 방법으로서는, 예를 들면 점착 시트 등의 시트형물에 선조체를 복수개 평행하게 배치 및 고정한 후, 이 시트를 나선형으로 권취하여 권취된 것의 간극 부분에 수지 등을 유입시켜 다발을 고정하는 방법을 예시할 수 있다. 또한, 복수의 구멍이 뚫린 다공판 2장을 중첩하고, 이들 다공판에 존재하는 각 구멍에 각 선조체를 통과시켜 2장의 다공판 간격을 열고, 그 사이에 수지 등을 유입시켜 다발을 고정하는 방법을 예시할 수 있다.
블럭 본체 중에 복수의 관통 구멍을 형성하는 방법으로서는, 수지 등을 포함하는 블럭 본체를 준비하고, 드릴, 레이저 등으로 블럭 본체에 관통 구멍을 형성하는 방법을 예시할 수 있다. 또한, 복수의 금속선을 포함하는 블럭을 제조하고, 블럭으로부터 금속선을 뽑아냄으로써 관통 구멍을 형성하는 방법을 예시할 수 있다.
자가 형광을 감소시키는 물질을 선조체에 함유시키는 방법으로서는, 예를 들면 선조체로서 섬유를 사용하는 경우에는 섬유 원료 중에 흡수제 및(또는) 소광제를 미리 혼합한 상태에서 방사함으로써, 흡수제 및(또는) 소광제를 섬유 중에 분산 함유시킬 수 있다.
또한, 자가 형광을 감소시키는 물질을 블럭 본체 중에 함유시키는 방법으로 서는, 블럭 본체의 성형 가공시에 흡수제 및(또는) 소광제를 함유시키는 방법이 예시된다.
이와 같이 하여 얻어진 생체 관련 물질이 유지된 복수의 선조체 또는 관통 구멍을 포함하는 블럭을 선조체 또는 관통 구멍의 길이 방향과 교차하는 방향으로 절단함으로써 마이크로어레이를 제조할 수 있다. 절단 각도는 특별히 한정되지 않지만, 검체 검출시에 두께 부분에 유지된 생체 관련 물질을 충분히 이용하기 위해서는 선조체 또는 관통 구멍의 길이 방향과 수직으로 교차하는 방향으로 절단하는 것이 바람직하다.
본 발명의 제조 방법에 있어서, 선조체 및(또는) 블럭에 자가 형광을 감소시키는 물질, 바람직하게는 무기 안료, 더욱 바람직하게는 카본 블랙을 첨가함으로써 절단시 유리한 효과를 발휘한다.
예를 들면, 카본 블랙을 균일하게 분산시킨 수지는, 카본 블랙이 의사 가교점으로서 작용하기 때문에 동일한 경화 조건에서 경화한 수지보다 단단해진다. 이에 따라, 절단시의 수지 변형, 수지에 포함되어 있는 선조체 변형, 마이크로어레이의 만곡 등을 억제할 수 있게 된다. 상기한 효과는 마이크로어레이의 두께가 얇아지면 얇아질 수록 현저하게 나타나기 때문에, 본 발명의 방법은 1 mm 이하의 두께, 바람직하게는 500 ㎛ 이하 (100 내지 500 ㎛)의 두께의 마이크로어레이를 제조할 때 바람직한 방법이다.
또한, 카본 블랙을 사용했을 경우에는 선조체 및(또는) 블럭의 점성을 저하시킬 수 있고, 또한 정전기를 억제할 수 있다. 따라서, 블럭을 연속적으로 절단할 때, 마이크로어레이끼리 밀착되는 것 등도 방지할 수 있다. 또한, 제조시 또는 검출시에 먼지나 공기 중에 부유하는 미생물, 포자 등의 흡착도 방지할 수 있다.
선조체에 카본 블랙을 분산시키면 선조체는 흑색이 된다. 따라서, 다발형으로 했을 때 가시성을 향상시키기 때문에 배열화 작업이 용이해진다.
또한, 생체 관련 물질이 겔을 통해 선조체의 중공부 또는 관통 구멍에 유지되어 있는 경우, 무기 안료가 첨가된 선조체의 내벽 표면 또는 관통 구멍과 면한 블럭 본체의 표면은 조면화되기 때문에 겔과의 밀착성이 향상된다. 그에 따라, 절단시 겔이 마이크로어레이로부터 탈락되는 것을 억제할 수 있다.
상기와 같은 효과를 얻기 위해서는, 무기 안료가 선조체 및(또는) 블럭에 충분히 분산되어 있는 것이 바람직하다. 또한, 그 첨가량은 선조체 및(또는) 블럭에 유래하는 자가 형광을 충분히 억제하기 위해서는 많은 것이 바람직하며, 선조체 및(또는) 블럭에 대한 분산성을 양호하게 하기 위해서는 적은 것이 바람직하다. 카본 블랙이라면, 그 첨가량은 선조체 및(또는) 블럭에 대하여 0.5 내지 10 질량％인 것이 바람직하다.
도 1은 수지 블럭을 두께 500 ㎛로 박편화시켰을 때의 마이크로어레이(단면도)를 나타내는 사진이다.
본 발명을 이하의 실시예에 의해, 더욱 상세하게 설명한다. 단, 본 발명은 이들 실시예에 의해 그 기술 범위가 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
직경 2 mm의 피아노선 (길이 10 cm)을 2개 평행하게 배치하고, 이들 피아노선을 포함하도록 수지 블럭을 제조하였다. 수지는 폴리우레탄 수지 접착제 (닛본 폴리우레탄 고교(주)제조의 닛폴란 4276, 코로네이트 4403)를 사용하였다. 우선, 닛폴란 4276/코로네이트 4403=62/38의 배합비에서 총 중량에 대하여 0.5 질량％, 1.0 질량％ 또는 2.5 질량％의 카본 블랙 (미쯔비시 가가꾸사 제조 MA-100)을 각각 닛폴란 4276에 첨가하고, 균질기를 이용하여 3시간 분산시켰다. 이어서, 코로네이트 4403을 첨가하고, 실온에서 약 1주일간 경화시켰다. 피아노선을 포함하는 2 cm×2 cm×7 cm의 카본 블랙 분산 우레탄 블럭을 제조하였다. 이어서, 피아노선을 뽑아냄으로써 블럭 중에 길이 7 cm의 2개의 관통 구멍이 형성되었다.
얻어진 블럭을 마이크로톰으로 관통 구멍의 길이 방향에 대하여 직각 방향으로 슬라이스하여 두께 약 500 ㎛의 박편을 10장 얻었다. 어떠한 박편에도 만곡은 발생하지 않았다. 또한, 카본 블랙은 블럭 중에서 충분히 분산되어 있었다.
이들 박편 중에서 임의로 3장을 선택하여 니콘제 형광 현미경 E600/하마마쯔 포토닉스제 냉각 CCD 카메라 C488-37로 관찰하고, 슬라이스편의 검출광 강도는 Cy3필터 (입사광측 535±25 nm, 검출광측 610±75 nm)를 사용하여 3O초의 노광 시간으로 형광 측정을 행하였다. 측정 후, 3장의 형광 강도의 평균치를 구하였다. 결과를 표 1에 나타내었다.
카본 블랙 농도 (질량％) 형광 강도
0.5 5462
1 5157
2.5 4919
<실시예 2>
(1) 중공 섬유 배열체의 제조
직경 0.32 mm의 구멍을 가지며, 구멍의 중심간 거리가 0.42 mm인 다공판으로서, 종횡 각 7열로 총 49개 배열된 두께 0.1 mm의 다공판 2장을 중첩하고, 이들 다공판 2장의 각 구멍에 폴리에틸렌제 중공 섬유 (외경 0.3 mm, 내경 0.2 mm) 49가닥을 통과시켜 2장의 다공판 간격을 50 mm로 하고, 실을 당긴 상태에서 양단을 고정하였다. 실시예 1과 동일하게 하여 폴리우레탄 수지 접착제의 총 중량에 대하여 2.5 질량％의 카본 블랙을 첨가하여 교반하였다. 이 수지 원료를 중공 섬유 배열체 주위에 유입시켜 경화시키고, 이어서 다공판을 제거함으로써 중공 섬유를 포함하는 수지 블럭을 얻었다.
(2) 메타크릴레이트기를 갖는 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 제조
올리고뉴클레오티드의 합성은 PE 바이오 시스템즈사의 자동 합성기 DNA/RNA synthesizer (model394)를 이용하여 행하고, DNA 합성의 최종 단계에서 5'말단에 Cy3을 도입한 GCAT 배열의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다 (Cy3-GCAT). 이들은 일반적인 방법에 의해 탈보호 및 정제하여 사용하였다.
얻어진 Cy3-GCAT (500 nmol/㎖) 50 ㎕, 글리시딜메타크릴레이트 5 ㎕ 및 디메틸포름아미드(DMF) 5 ㎕를 혼합하고, 70 ℃에서 2시간 반응시켜 메타크릴레이트기를 갖는 형광 색소를 제조하고, 물 190 ㎕를 첨가하여 100 nmol/㎖의 메타크릴레 이트기를 갖는 형광 색소(GMA 변성 Cy3-GCAT)를 얻었다.
(3) 핵산 고정화겔이 유지된 섬유 배열체 및 이 박편의 제조
하기의 질량비로 혼합하여 단량체액 및 개시제액을 제조하였다.
a) 단량체액
아크릴아미드 0.76 질량부
메틸렌비스아크릴아미드 0.04 질량부
물 4.2 질량부
b) 개시제액
2,2'-아조비스(2-아미디노프로판)이염산염 0.01 질량부
물 4.99 질량부
상술한 단량체액 a) 및 개시제액 b)에 대하여, 표 2에 나타낸 농도가 되도록 (2)에서 제조한 GMA 변성 Cy3-GCAT를 혼합하였다 (중합액 1 내지 5).
얻어진 중합액을 (1)에서 얻어진 수지 블럭 중의 중공 섬유의 중공부에 충전하고, 블럭을 내부가 수증기로 포화된 밀폐 유리 용기로 옮겨 80 ℃에서 4시간 방치함으로써 중합 반응을 행하였다.
중합액 1 중합액 2 중합액 3 중합액 4 중합액 5
Cy3 농도 (nmol/L) 0.5 0.05 0.005 0.0005 0.00005
Cy3량 (pmol)/1스폿 10 1 0.1 0.01 0.001
중합 반응 종료 후, 블럭을 마이크로톰을 사용하여 중공 섬유의 길이 방향에 대하여 직각 방향으로 반복 절단하여 두께 약 750 ㎛의 박편을 30장 얻었다. 얻어 진 박편은 모두 만곡이 없는 것이었다. 또한, 카본 블랙은 블럭 중에서 충분히 분산되어 있었다.
얻어진 박편으로부터 임의로 3장을 선택하여 니콘제 형광 현미경 E600/하마마쯔 포토닉스제 냉각 CCD 카메라 C488-37로 관찰하고, 실시예 1과 동일한 필터를 사용하여 마이크로어레이의 검출광 강도를 측정하였다. 측정 후, 3장의 형광 강도의 평균치를 구하였다. 그 결과, 0.005 nmol/L의 Cy3까지 검출할 수 있었다.
<비교예 1>
카본 블랙을 혼입하지 않은 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 박편을 제조하고, 얻어진 박편의 형광 강도를 측정하였다. 그 결과, 0.005 nmol/L의 Cy3는 검출할 수 없었으며, 0.05 nmol/L의 Cy3만 검출할 수 있었다.
형광 강도비
실시예 2 비교예 2
중합액 5 1.00 N.T.
중합액 4 1.01 1.07
중합액 3 1.86 1.00
중합액 2 9.12 5.48
중합액 1 N.T. 74.5
N.T.= 시험되지 않음

실시예 2는 중합액 5의 형광 강도를, 비교예 2는 중합액 3의 형광 강도를 1로 하여 형광 강도비를 산출하였다.
<실시예 3>
폴리에틸렌제 중공 섬유 대신에 카본 블랙을 1.6 질량부 포함하는 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA)제 중공 섬유 (외경 0.3 mm, 내경 0.2 mm)를 사용한 것 이외 에는, 실시예 2와 동일하게 하여 수지 블럭을 제조하였다. 10일 후, JIS K 7215에 의해 가압면이 수지 블럭에 밀착되고 나서 5초 후에 수지 블럭의 경도를 측정하였다. 그 결과, 경도는 95였다. 이 수지 블럭을 박편화하여 30장의 박편을 얻었다. 어떠한 박편에도 만곡은 발생하지 않았다.
<비교예 2>
실시예 3에서, 중공 섬유 및 수지에 카본 블랙을 첨가하지 않고 수지 블럭을 제조하였다. 10일 후, JIS K 7215에 따라 상기 수지 블럭의 경도를 측정했더니 72였다. 이 수지 블럭을 두께 500 ㎛로 박편화했더니 생성된 박편은 모두 만곡이 있는 박편이었다 (도 1 참조).
본 발명에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 참조로서 그 전체를 본 발명에 삽입하기로 한다.
본 발명에 의해 마이크로어레이 및 그의 제조 방법이 제공된다.
선조체 및(또는) 블럭에 자가 형광을 감소시키는 물질을 첨가함으로써, 검출시의 백 그라운드, 크로스 토크를 현저하게 저하시킬 수 있고, 검출 감도를 향상시킬 수 있다. 또한, 선조체 및(또는) 블럭에 자가 형광을 감소시키는 물질을 첨가함으로써, 제법시 및 절단시에 만곡 등이 없는 마이크로어레이를 안정하게 제조할 수 있다.

Claims (28)

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  9. 카본 블랙을 의사 가교제로서 포함하는 블럭에 복수의 관통 구멍을 형성하고, 이 관통 구멍 내에 생체 관련 물질을 유지하고, 관통 구멍의 길이 방향과 교차하는 방향으로 상기 블럭을 절단하는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이의 제조 방법.
  10. 생체 관련 물질이 유지된 선조체 다발을 카본 블랙을 의사 가교제로서 포함하는 수지로 고정하여 블럭을 제조하고, 선조체의 길이 방향과 교차하는 방향으로 상기 블럭을 절단하는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이의 제조 방법.
  11. 카본 블랙을 의사 가교제로서 포함하는 수지로 선조체 다발을 고정하여 블럭을 제조하고, 이 각각의 선조체에 생체 관련 물질을 유지시킨 후, 선조체의 길이 방향과 교차하는 방향으로 상기 블럭을 절단하는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이의 제조 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 선조체가 카본 블랙을 함유하는 것인 방법.
  13. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 선조체가 섬유인 제조 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 섬유가 중공 섬유인 제조 방법.
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  18. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 카본 블랙의 함유량이 0.5 내지 10 질량％인 제조 방법.
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  23. 제12항에 있어서, 상기 선조체가 섬유인 제조 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 섬유가 중공 섬유인 제조 방법.
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  28. 제12항에 있어서, 상기 카본 블랙의 함유량이 0.5 내지 10 질량%인 제조 방법.
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