WO2001098781A1 - Microjeu ordonne de substances associees a des organismes - Google Patents

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WO2001098781A1
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Atsushi Takahashi
Takashi Akita
Chiho Itou
Haruko Miyauchi
Kei Murase
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Mitsubishi Rayon Co., Ltd.
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    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Definitions

  • the present invention relates to a microarray in which a biological substance that can be used in fields such as clinical tests and food tests is immobilized as a probe and a method for producing the same.
  • DNA microarray method DNA chip method
  • DNA chip method a new analysis method or methodology that enables the simultaneous expression analysis of a large number of genes.
  • These methods are in principle the same as the conventional methods in that they are nucleic acid detection and quantification methods based on the nucleic acid-nucleic acid hybridization reaction.
  • microarrays or chips hereinafter referred to as microarrays.
  • the main feature is that a large number of DNA fragments are arranged and fixed at high density on a flat substrate called “display”.
  • a sample in which the expressed gene or the like of a research target cell is labeled with a fluorescent dye or the like is hybridized on a flat base plate, and nucleic acids (DNA or RNA) complementary to each other are separated. After binding, labeling the site with a fluorescent dye, etc., read it at high speed with a high-resolution analyzer.
  • a high-resolution analyzer After binding, labeling the site with a fluorescent dye, etc., read it at high speed with a high-resolution analyzer.
  • the amount of each gene in the sample can be quickly estimated.
  • this new method it has become possible to reduce the amount of the reaction sample and to analyze and quantify the reaction sample in a large amount, quickly and systematically with good reproducibility.
  • Methods for producing these DNA microarrays include a method in which DNA is sorted and immobilized on a glass substrate, and the use of photolithography technology used in the manufacture of semiconductor chips to transfer nucleic acids to a partitioned region on a silicon substrate. Methods for individual synthesis are disclosed (see US Pat. No. 5,445,934 and US Pat. No. 5,774,305).
  • DNA is immobilized on a glass-polymer striatum and the striatum is adhered.
  • a method of obtaining a DNA microarray by wrapping with an agent and cutting in the cross-section direction of the fiber see Japanese Patent Application Laid-Open No. H11-108928
  • a method in which a plurality of fibers with DNA and the like immobilized thereon and a converged one in the longitudinal direction of the fiber See Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-245461.
  • a plurality of through-holes are made in a resin block, and after holding DNA and the like in those holes,
  • a method for obtaining a DNA microarray by slicing blocks has been disclosed (described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-78998). These manufacturing methods can be used to mass-produce chips with the same arrangement, since multiple microarrays can be created by repeating the cutting process.
  • the method of producing a plurality of microarrays by repeating the cutting is excellent in that a large number of microarrays having the same arrangement can be manufactured, but has a problem that the microarrays are curved. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a microarray capable of reducing noise light emitted from components other than a probe and a specimen and enabling detection of trace components. It is a further object of the present invention to provide a method for manufacturing a plurality of microarrays by repeating cutting, and for efficiently manufacturing a microarray free from defects such as curvature.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, By adding a substance that reduces auto-fluorescence to the materials that make up the array, we have found that even small amounts of analytes can be detected.
  • the method for producing the microarray it was found that a microarray free from defects such as curvature can be efficiently produced by adding a substance that reduces auto-fluorescence to a material constituting the microarray. That is, the present invention is as follows.
  • a microarray obtained by cutting a block including a plurality of striatum or through-holes holding a biological substance in a direction intersecting the longitudinal direction of the striatum or the through-hole, wherein the striatum and / or Alternatively, the microarray, wherein the block contains a substance that reduces the autofluorescence.
  • a plurality of through-holes are formed in the block containing the substance that reduces the auto-fluorescence of the block, a biological substance is held in the through-hole, and the block is cut in a direction crossing the longitudinal direction of the through-hole.
  • a bundle of the striatum holding the biological substance is fixed with a resin containing a substance that reduces autofluorescence to form a block, and the block is cut in a direction that intersects the longitudinal direction of the striatum.
  • a block is made by fixing a bundle of striatum with a resin containing a substance that reduces autofluorescence, and a bio-related substance is held in each of the striatum.
  • a method for producing a microarray comprising cutting the block in the direction of intersection.
  • the striatum includes, for example, a fiber such as a hollow fiber, and the block includes a resin.
  • the substance that reduces auto-fluorescence include an absorber (for example, an inorganic pigment) and / or a quencher.
  • the inorganic pigment is preferably carbon black, and its content is, for example, 0.5 to 10% by mass.
  • This specification includes the contents described in the specification and / or drawings of Japanese Patent Application No. 2000-184393, which is the basis of the priority of the present application. ) To (3).
  • the block includes a striatum or a through-hole and a block body excluding the striatum or the through-hole. That is, a certain block is composed of a block body and a striatum held therein. Other blocks consist of the block itself and through holes formed therein.
  • a known resin composition such as a polyamide-based, polyester-based, acrylic-based, polyurethane-based, phenol-based, or fluorine-based resin is used.
  • the striatum or the through hole provides a place for holding a biological substance.
  • These striates or through-holes have a substantially straight structure, and the striates or through-holes are arranged substantially parallel to each other.
  • the cross-sectional shape of the striatum or the through hole may be any shape. The most preferred cross-sectional shape is circular.
  • striated A plurality of bodies or through holes are arranged.
  • the array density of the striatum or the through-hole is not limited, but when a large amount of data is obtained by one analysis, it is preferable to arrange about 100 to 1,000,000 / cni 2 on one microarray. Further, it is preferable that the striata are arranged at equal intervals.
  • the striatum includes, for example, a solid fiber, a porous solid fiber, a metal wire, a hollow fiber, a porous hollow fiber, and a glass tube. Further, after a plurality of thin striated bodies are bundled, the whole striated body may be formed into one linear shape by screwing.
  • Bio-related substances can be of different types for each through-hole or striatum, and the same type of bio-related substance can be held in multiple through-holes or striatum. it can.
  • the striatum and / or the block include a substance that reduces autofluorescence derived from the striatum and the nose or the block.
  • Such substances include substances that absorb autofluorescence (absorbers) and substances that cause deexcitation of autofluorescence (quenchers).
  • the absorbent include organic or inorganic pigments.
  • black pigments include Rikichi pump racks, acetylene black, iron black, and yellow pigments include chrome yellow, zinc yellow, ocher, Hansa Yellow, permanent yellow, benzene yellow, and orange pigments.
  • Orange lakes, molybdenum oranges, benzene oranges, red pigments include Bengala, Cadmium Red, Antimony Vermilion, Permanent Red, Lisole Red, Lake Red, Brilliant Scarlett, Thio Indigo Red, Blue Pigments Cobalt Blue, Phthalocyanine Blue, Indigo, Green pigments include chrome green, viridian naph] yl green, phthalocyanine green and the like.
  • the attenuation of the autofluorescence intensity by the absorbent depends on the number of collisions between the fluorescent wave and the absorbent in the striatum and / or the block body, the collision frequency, and the distance traveled by the fluorescent wave. Therefore, in order to achieve the full effect of the absorbent, use a fine-particle absorbent as much as possible. It is preferred to use a uniform dispersion. Carbon black is very preferred as such an absorbent.
  • those that can reduce the autofluorescence and do not prevent the fluorescence of the fluorescent substance to be detected at the time of detection are selected. For example, if it is desired to detect a substance to which fluorescein isothiocyanate (FITC) is bound, a pigment other than yellow and green is selected.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • Such an absorbent includes a black pigment.
  • the quencher include paramagnetic ions such as Fe (111), Ni (II), Cr (III), Cu (II), and Ti (I). Further, a molecule having no charge such as acrylamide may be used.
  • a part or the whole of the striatum can be dyed.
  • the stained striatum becomes a coordinate reference when detecting a specimen.
  • the thickness of the microarray of the present invention is preferably 5 thighs or less (for example, 50 m to 5 mm), and more preferably 1 mm or less (for example, 100 ⁇ ! To 1 marauder).
  • a method for manufacturing a microarray using the above-described materials will be described.
  • the biological substance is physically or chemically retained on the outer surface of the striatum, the inner wall of the hollow part, or the porous part.
  • the biological substance is physically or chemically held in the hollow or inner wall of the through hole.
  • the method of holding the biological substance is appropriately selected depending on the type of the biological substance to be held, the material and shape of the striatum or the through hole, and the like. For example, after the striatum is immersed in a solution containing a biological substance, the biological substance can be retained on the surface of the striatum by baking or ultraviolet irradiation.
  • the inner wall of the hollow portion is coated with an appropriate coating agent, for example, poly-L- Treatment with lysine, introduction of bio-related substances into the hollow part and retention of the bio-related substance, and filling of the hollow part with a high molecular weight polymer such as acryl-based polymer or agarose containing the bio-related substance
  • an appropriate coating agent for example, poly-L- Treatment with lysine
  • introduction of bio-related substances into the hollow part and retention of the bio-related substance and filling of the hollow part with a high molecular weight polymer such as acryl-based polymer or agarose containing the bio-related substance
  • a high molecular weight polymer such as acryl-based polymer or agarose containing the bio-related substance
  • Examples of the method include winding and pouring a resin or the like into a gap portion of the wound material to fix the bundle.
  • two perforated plates with multiple holes are stacked, and each striatum is passed through each hole in those perforated plates, the interval between the two perforated plates is opened, and resin or the like is poured between them.
  • a method for fixing the bundle can be exemplified.
  • Examples of a method for forming a plurality of through holes in the block body include a method in which a block body made of resin or the like is prepared, and a through hole is formed in the block body using a drill, a laser, or the like. Also, a method in which a block including a plurality of metal wires is created and a through hole is formed by extracting a metal wire from the block can be exemplified.
  • a method of including a substance that reduces autofluorescence in the striatum for example, when fibers are used as the striatum, spinning is performed in a state in which an absorbent and Z or a quencher are mixed in the fiber raw material in advance. An absorbent and a quencher can be dispersed and contained in the fiber.
  • a microarray is manufactured by cutting a block containing a plurality of striatum or through-holes holding the bio-related substance obtained in this manner in a direction intersecting the longitudinal direction of the striatum or the through-holes. be able to.
  • the cutting angle is not particularly limited.However, in order to sufficiently utilize the biomaterial held in the thick portion when detecting a specimen, the cutting is performed in a direction perpendicular to the longitudinal direction of the striatum or the through hole. It is preferable to do so.
  • a substance that reduces autofluorescence preferably an inorganic pigment, and more preferably a force pump rack is added to the striatum and the Z or the block, whereby advantageous effects can be obtained at the time of cutting.
  • a resin in which carbon black is uniformly dispersed is harder than a resin cured under the same curing conditions because carbon black behaves as a pseudo-crosslinking point.
  • the viscosity of the striatum and / or the block can be reduced, and further, static electricity can be suppressed. Therefore, when cutting the blocks continuously, it is possible to prevent close contact between the microarrays. Furthermore, when the pump rack is dispersed in the striatum that can also prevent the adsorption of dust and microorganisms and spores floating in the air during production or detection, the striatum turns black. Therefore, the visibility in the form of a bundle is improved, and the arrangement work is facilitated.
  • the inorganic pigment is sufficiently dispersed in the striatum and the squares or blocks.
  • the addition amount is preferably large in order to sufficiently suppress autofluorescence derived from the striatum and ⁇ or block, and is preferably small in order to improve dispersibility in the striatum and / or block. preferable.
  • the addition amount is preferably 0.5 to 10% by mass based on the striatum and the nose or block.
  • FIG. 1 is a photograph showing a microarray (cross-sectional view) when a resin block is sliced to a thickness of 500 2 111.
  • Example 1 The present invention is described in more detail by the following examples. However, the technical scope of the present invention is not limited by these examples.
  • Example 1 The present invention is described in more detail by the following examples. However, the technical scope of the present invention is not limited by these examples.
  • Two piano wires (length 10 cm) with a diameter of 2fflm were arranged in parallel, and a resin block was created to include those piano wires.
  • a polyurethane resin adhesive (Nippon Polyurethane Industry Co., Ltd. Nipporan 4276, Coronate 4403) was used.
  • Coronate 4403 was added and cured at room temperature for about one week.
  • a carbon black dispersion of 2 cm ⁇ 2 cm ⁇ 7 cm including a piano wire was prepared.
  • the piano wire was then pulled out, creating two 7 cm long holes in the block.
  • the obtained block was sliced with a microtome in a direction perpendicular to the longitudinal direction of the through-hole to obtain ten thin pieces having a thickness of about 500 m. None of the slices was curved.
  • the power pump rack was well dispersed in the block.
  • Oligonucleotides were synthesized using an automated DNA / RM synthesizer (model 394) from PE Biosystems.In the final step of ⁇ A synthesis, oligos of the GCAT sequence with Cy 3 introduced at the 5 'end were used. Nucleotides were synthesized (Cy3-GCAT). These were used after deprotection and purification by a general method.
  • Cy3_GCAT 500 nmol / ml
  • glycidyl methacrylate and dimethylformamide (DMF) 51 were mixed and reacted at 70 ° C for 2 hours to prepare a fluorescent dye having a methacrylate group.
  • 1901 was added to obtain a fluorescent dye having a methacrylate group of lOOnmol / ml (GMA-modified Cy3-GCAT).
  • the obtained polymerization solution is filled in the hollow portion of the hollow fiber in the resin block obtained in (1), and the block is transferred to a sealed glass container whose inside is saturated with steam, and left at 80 ° C for 4 hours. Thus, a polymerization reaction was performed.
  • Table 2
  • the block was repeatedly cut using a microtome in a direction perpendicular to the longitudinal direction of the hollow fiber, to obtain 30 thin pieces having a thickness of about 750 mm2. Each of the obtained slices had no curvature.
  • Riki Bon Black was well dispersed in the block.
  • Example 2 the fluorescence intensity of the polymerization solution 5 was set, and in Comparative Example 2, the fluorescence intensity of the polymerization solution 3 was set to 1, and the fluorescence intensity ratio was calculated.
  • Example 3 the fluorescence intensity of the polymerization solution 5 was set, and in Comparative Example 2, the fluorescence intensity of the polymerization solution 3 was set to 1, and the fluorescence intensity ratio was calculated.
  • Example 2 The same procedure as in Example 2 was carried out except that hollow fibers made of polymethyl methacrylate (PMMA) (outer diameter 0.3 mm, inner diameter 0.2 mm) containing 1.6 parts by mass of carbon black were used instead of the polyethylene hollow fibers.
  • PMMA polymethyl methacrylate
  • Example 3 a resin block was prepared without adding a force pump rack to the hollow fiber and the resin. Ten days later, when the hardness of this resin block was measured in accordance with J ISK 7215, it was 72. When this resin block was thinned to a thickness of 500 m, all of the resulting flakes were curved flakes (see Fig. 1). All publications, patents and patent applications cited in the present invention are hereby incorporated by reference in their entirety. Industrial applicability
  • a microarray and a method for manufacturing the same are provided.

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Description

明 細 書 生体関連物質マイクロアレイ及びその製造方法 技術分野
本発明は、 臨床検査、 食品検査等の分野などに利用できる生体関連物質がプ ローブとして固定化されたマイクロアレイ及びその製造方法に関する。 背景技術
近年、 多数遺伝子の一括発現解析を可能とする D N Aマイクロアレイ法 （D N Aチップ法） と呼ばれる新しい分析法、 ないし方法論が開発され、 注目を集 めている。 これらの方法は、 いずれも核酸一核酸間ハイブリダィゼーシヨン反 応に基づく核酸検出 ·定量法である点で原理的には従来の方法と同じであるが 、 マイクロアレイ又はチップ （以下、 マイクロアレイと表示） と呼ばれる平面 基盤上に、 多数の D N A断片が高密度に整列固定化されたものが用いられてい る点に大きな特徴がある。 マイクロアレイ法の具体的使用法としては、 例えば 、 研究対象細胞の発現遺伝子等を蛍光色素等で標識したサンプルを平面基盤片 上でハイブリダィゼ一シヨンさせ、 互いに相補的な核酸 （D N A又は R N A) 同士を結合させ、 その箇所を蛍光色素等でラベル後、 高解像度解析装置で高速 に読みとる方法が挙げられる。 こうして、 サンプル中のそれぞれの遺伝子量を 迅速に推定できる。 この新しい方法の導入により、 反応検体の微量化と、 その 反応検体を再現性よく多量 ·迅速 ·系統的に分析、 定量することが可能となつ てきた。
これらの D N Aマイクロアレイの製造法としては、 D N Aをガラス基板上に 区分けして固定化する方法、 半導体チップの製造に用いられるホトリゾグラフ ィー技術を用いて、 シリコン基板上の区分けした領域に核酸を 1個づっ合成す る方法等が開示されている （米国特許 5, 445， 934号、 米国特許 5, 774, 305号公 報参照） 。
また、 ガラスゃ高分子からなる線条体に D N Aを固定化して該線条体を接着 剤と共に簀巻き状にして繊維断面方向に切断して D N Aマイクロアレイを得る 方法 （特開平 11- 108928号公報参照） 、 DNA等が固定された繊維を複数本、 収束 されたものを繊維の長手方向に対して交叉するように切断し DNAマイクロアレ ィを得る方法 （特開 2000- 245461号公報参照） 、 さらには、 樹脂プロックに複数 の貫通穴を開け、 それらの穴に DNA等を保持した後、 ブロックをスライスするこ とにより DNAマイクロアレイを得る方法が開示されている （特開 2000- 78998号公 報記載） 。 これらの製法は切断を繰り返すことにより複数枚のマイクロアレイ が作成できるため、 同じ配列を持つチップを大量生産する場合には非常に好ま しい製法である。
例えば、 上記で例示した D N Aマイクロアレイを使用し、 検体中の特定の D N Aを検出するには、 チップに固定されているプローブ又は検体の DNAを蛍光標 識し、 ハイプリダイゼーシヨン等の操作を行うことにより、 ハイブリットを形 成したプローブ又は検体を外部から蛍光励起光を照射して、 該蛍光分子から放 射される蛍光励起を検出することにより行われるのが一般的である。
しかし、 検体中に微量しか含まれない D N A等の生体関連物質を検出する場 合、 プローブ又は検体以外から放射される蛍光、 具体的にはプローブを保持し ている基盤等の自家蛍光がノイズとして検出され、 微量の生体関連物質を検出 できないという問題があった。
また、 切断を繰り返すことにより複数枚のマイクロアレイを作成する方法は 、 大量に同じ配列を持つマイクロアレイが製造できる点で優れているが、 マイ クロアレイの湾曲等が生じるという問題があつた。 発明の開示
本発明は、 プローブや検体以外から放射されるノイズ光を減少させ、 微量成 分の検出を可能とするマイクロアレイを提供することを目的とする。 さらに本 発明は、 切断を繰り返すことにより複数枚のマイクロアレイを製造する方法に おいて、 湾曲等の不具合がないマイクロアレイを効率よく製造する方法を提供 することを目的とする。
本発明者らは、 上記の問題点を解決するために鋭意検討した結果、 マイクロ アレイを構成する材料に自家蛍光を減少させる物質を添加することにより、 微 量の検体も検出可能となることを見出した。 また、 そのマイクロアレイの製造 法において、 自家蛍光を減少させる物質を、 マイクロアレイを構成する材料に 添加することにより、 湾曲等の不具合がないマイクロアレイが効率よく製造で きることを見出した。 すなわち、 本発明は、 以下の通りである。
1 . 生体関連物質が保持された複数の線条体又は貫通穴を含むプロックを、 線 条体又は貫通穴の長手方向と交差する方向で切断して得られるマイクロアレイ において、 前記線条体及び/又はブロックが、 その自家蛍光を減少させる物質 を含有していることを特徴とするマイクロアレイ。
2 . ブロックの自家蛍光を低減させる物質を含むブロックに、 複数の貫通穴を 形成し、 該貫通穴内に生体関連物質を保持し、 貫通穴の長手方向と交差する方 向で前記プロックを切断することを特徴とするマイクロアレイの製造方法。
3 . 生体関連物質が保持された線条体の束を、 自家蛍光を低減する物質を含む 樹脂で固定してブロックを作製し、 線条体の長手方向と交差する方向で前記ブ ロックを切断することを特徴とするマイクロアレイの製造方法。
4 . 自家蛍光を低減する物質を含む樹脂で線条体の束を固定してブロックを作 製し、 該線条体の各々に生体関連物質を保持させた後、 線条体の長手方向と交 差する方向で前記プロックを切断することを特徴とするマイクロアレイの製造 方法。
5 . 前記 3又は 4の方法において、 線条体が自家蛍光を低減する物質を含有す る方法。
上記マイクロアレイ又はその製造方法において、 線条体としては、 例えば中 空繊維などの繊維が挙げられ、 プロックとしては樹脂からなるものが挙げられ る。 また、 自家蛍光を減少させる物質としては、 吸収剤 （例えば無機顔料） 及 び/又は消光剤を例示することができる。
無機顔料はカーボンブラックであることが好ましく、 その含有量は、 例えば 0 . 5〜10質量％である。 以下本発明を詳細に説明する。 本明細書は、 本願の優先権の基礎である日本 国特許出願 2000-184393号の明細書及び/又は図面に記載される内容を包含する 本発明において、 生体関連物質とは、 以下の（1)〜（3)の物質からなる群から 選択されるものが挙げられる。
(1)核酸、 アミノ酸、 糖又は脂質
(2)上記（1)の物質のうち少なくとも 1種類の成分からなる重合物
(3)上記（1)又は（2)の物質と相互作用を有する物質 例えば、 生体関連物質として核酸を用いる場合には、 生細胞からの DNA又 は RNAの調製は、 公知の方法、 例えば DNAの抽出については、 Blinらの方 法（Nucleic Acids Res.3· 2303 (1976) )等により、 また、 RNAの抽出について は、 Favaloroらの方法（Methods. Enzymol.65.718 (1980) )等により行うことがで きる。 更には、 鎖状若しくは環状のプラスミド DNA又は染色体 DNAが用い られる。 これらの DNAは、 制限酵素により若しくは化学的に切断した DNA 断片、 試験管内で酵素等により合成された DNA又は化学合成したオリゴヌク レオチド等を用いることもできる。
本発明において、 ブロックは、 線条体又は貫通穴と、 これら線条体又は貫通 穴を除いたブロック本体からなる。 即ち、 あるブロックは、 ブロック本体及び その内部に保持されている線条体からなる。 また他のブロックは、 ブロック本 体及びその内部に形成されている貫通穴からなる。
ブロック本体の材質としては、 ポリアミド系、 ポリエステル系、 アクリル系 、 ポリウレタン系、 フエノール系、 フッ素系等の公知の樹脂組成物が使用され る。
本発明において、 線条体又は貫通穴は、 生体関連物質を保持する場を提供す る。 これらの線条体又は貫通穴は、 実質的に直線状の構造であって、 各線条体 又は各貫通穴はお互いに実質的に平行に配置される。 線条体又は貫通穴の断面 形状はいずれの形でもよい。 最も好ましい断面形状は円形である。 通常、 線条 体又は貫通穴は複数、 配置される。 線条体又は貫通穴の配列密度は限定されないが、 一度の分析で多量のデータ を取得する場合には、 1枚のマイクロアレイに、 100〜： 1,000,000/cni2程度、 配 置することが好ましい。 また、 線条体は、 線条体同士が等間隔で配置されてい ることが好ましい。
線条体は、 例えば、 中実繊維、 多孔質中実繊維、 金属線、 中空繊維、 多孔質 中空繊維、 ガラス管等から構成される。 また、 複数本の細い線条体を束ねた後 、 ねじつて全体が 1本の直線状となる線条体としてもよい。
生体関連物質は、 個々の貫通穴又は線条体ごとに、 種類が異なるものを保持 させることができ、 また、 同一種類の生体関連物質を複数本の貫通穴又は線条 体に保持させることができる。
本発明において、 線条体及び 又はブロックには、 その線条体及びノ又はブ ロックに由来する自家蛍光を低減させる物質を包含させる。 そのような物質と しては、 自家蛍光を吸収する物質 （吸収剤） と自家蛍光の脱励起を引き起こす 物質 （消光剤） とがある。 吸収剤としては、 有機質又は無機質の顔料が例示できる。 具体的には、 黒色 顔料としては、 力一ポンプラック、 アセチレンブラック、 鉄黒、 黄色顔料とし ては、 クロム黄、 亜鉛黄、 黄土、 ハンザイェロー、 パーマネントイエロ一、 ベ ンジンイェロー、 橙色顔料としては、 オレンジレーキ、 モリブデンオレンジ、 ベンジンオレンジ、 赤色顔料としては、 べんがら、 カドミウムレッド、 アンチ モン朱、 パ一マネントレッド、 リソールレッド、 レーキレッド、 ブリリアント スカ一レット、 チォインジゴレッド、 青色顔料としては、 群生、 コバルトブル 一、 フタロシアニンブルー、 インジゴ、 緑色顔料としては、 クロムグリーン、 ビリジアンナフ ] ^一ルグリーン、 フタロシアニングリーン等があげられる。 特に吸収剤による自家蛍光強度の減衰は、 蛍光波と線条体及び/又はブロッ ク本体中の吸収剤との衝突回数、 衝突頻度、 蛍光波の進む距離に依存する。 よ つて、 吸収剤の効果を十分に発揮させるには、 できるだけ微粒子の吸収剤を使 用し、 均一に分散させることが好ましい。 そのような吸収剤としてはカーボン ブラックが非常に好ましい。
これらの吸収剤は、 自家蛍光を低減でき、 且つ検出時に検出すべき蛍光物質 の蛍光を妨げないものを選択する。 例えば、 フルォレセインイソチオシァネ一 ト（FITC)が結合した物質を検出したい場合は、 黄色及び緑色以外の顔料が選択 される。
二色蛍光検出法で例示されるような複数の蛍光標識を用いる場合は、 可視光 領域の光を幅広く吸収するものを選択することが好ましい。 そのような吸収剤 としては、 黒色顔料が挙げられる。 消光剤としては、 常磁性イオンである Fe (111)、 Ni (I I)、 Cr (III)、 Cu (II)、 T i (I)等が例示できる。 また、 アクリルアミド等の電荷を持たない分子があげら れる。
上記の吸収剤及び/又は消光剤は、 通常は一方のみが使用されるが、 両者を 組み合わせて使用することも可能である。
また、 本発明においては、 必要に応じて、 線条体の一部又は全部を染色する ことも可能である。 線条体の一部又は全部を染色することにより、 染色された 線条体は、 検体を検出する際に座標基準となる。
本発明のマイクロアレイの厚みは、 5腿以下 （例えば 50 m〜 5mm) が好ましく 、 1mm以下 （例えば 100 π！〜 1匪） がより好ましい。 以下に上記の材料を使用したマイクロアレイの製造方法を例示する。
生体関連物質は、 線条体の外表面、 中空部の内壁部分、 又は多孔質部等に物 理的又は化学的に保持される。 また、 生体関連物質は、 貫通穴の中空部又は内 壁部に物理的又は化学的に保持される。 生体関連物質の保持方法は、 保持する 生体関連物質の種類、 線条体又は貫通穴の材質や形状等により適宜選択される 。 例えば、 生体関連物質を含む溶液に線条体を浸漬した後、 ベーキングや紫外 線照射により線条体表面に生体関連物質を保持することができる。 また、 線条 体が中空繊維であれば、 中空部の内壁を適当なコーティング剤、 例えば poly- L- lys ineで処理し、 中空部へ生体関連物質を導入し、 生体関連物質を保持する方 法や、 中空部に生体関連物質を含有したアクリルド系のポリマー、 ァガロース 等の高分子ポリマ一を充填することにより保持する方法が例示できる。 ブロック本体中に線条体の束を固定する方法としては、 例えば、 粘着シート 等のシート状物に線条体を複数本、 平行に配置及び固定した後、 該シ一トをら せん状に巻き取り、 巻き取ったものの隙間部分に樹脂等を流し込み、 束を固定 する方法が例示できる。 また、 複数の穴のあいた多孔板 2枚を重ね、 それらの 多孔板に存在する各穴に、 各線条体を通過させ、 2枚の多孔板の間隔を開き、 そ の間に樹脂等を流し込み、 束を固定する方法が例示できる。
ブロック本体中に複数の貫通穴を形成する方法としては、 樹脂等からなるブ ロック本体を用意し、 ドリル、 レーザー等でブロック本体に貫通穴を形成する 方法が例示できる。 また、 複数本の金属線を含むブロックを作成し、 ブロック から金属線を引き抜くことにより貫通穴を形成する方法が例示できる。 自家蛍光を低減させる物質を線条体に含有させる方法としては、 例えば、 線 条体として繊維を用いる場合は、 繊維原料中に吸収剤及び Z又は消光剤を予め 混合した状態で紡糸することによって、 吸収剤及びノ又は消光剤を繊維中に分 散含有させることができる。
また自家蛍光を低減させる物質をブロック本体中に含有させる方法としては 、 ブロック本体の成形加工時に吸収剤及び/又は消光剤を含有させる方法が例 示される。 このようにして得られた生体関連物質が保持された複数の線条体又は貫通穴 を含むプロックを、 線条体又は貫通穴の長手方向と交差する方向で切断するこ とによりマイクロアレイを製造することができる。 切断角度は、 特に限定され ないが、 検体の検出の際に厚み部分に保持された生体関連物質を十分利用する ためには、 線条体又は貫通穴の長手方向と垂直に交差する方向で切断すること が好ましい。 本発明の製造方法において、 線条体及び Z又はブロックに、 自家蛍光を低減 する物質、 好ましくは無機顔料、 さらに好ましくは力一ポンプラックを添加す ることにより、 切断時に有利な効果を奏する。
例えば、 カーボンブラックを均一に分散した樹脂は、 カーボンブラックが擬 似架橋点として振舞うため、 同一の硬化条件で硬化した樹脂よりも硬くなる。 これにより、 切断時の樹脂の変形、 樹脂に含まれている線条体の変形、 マイク ロアレイの湾曲等を抑制することが可能となる。 上記の効果はマイクロアレイ の厚みが薄くなればなるほど顕著に表れるため、 本発明の方法は、 1廳以下の厚 さ、 好ましくは 500 i m以下 （100〜500 ΠΙ) の厚さのマイクロアレイを製造する 際に好適な方法である。
また、 カーボンブラックを使用した場合は線条体及び/又はプロックの粘性を 低下でき、 さらには静電気を抑制することができる。 よって、 ブロックを連続 的に切断する際、 マイクロアレイ同士の密着等も防止できる。 さらには、 製造 時又は検出時にほこりや空気中に浮遊する微生物、 胞子等の吸着も防止できる 線条体に力一ポンプラックを分散すると線条体は黒色となる。 よって、 束状 とするときの視認性が向上するため、 配列化作業が容易となる。
また、 生体関連物質がゲルを介して、 線条体の中空部又は貫通穴に保持され ている場合、 無機顔料が添加された線条体の内壁表面又は貫通穴に面したプロ ック本体の表面は粗面化されるため、 ゲルとの密着性が向上する。 それにより 切断時にゲルがマイクロアレイから脱落することを抑制することができる。 上記のような効果を得るためには、 無機顔料は線条体及び Ζ又はブロックに 十分に分散していることが好ましい。 またその添加量は、 線条体及び Ζ又はブ ロックに由来する自家蛍光を十分抑制するには、 多い方が好ましく、 線条体及 び 又はプロックに対する分散性を良くするには、 少ない方が好ましい。 カー ボンブラックであれば、 その添加量は線条体及びノ又はプロックに対して 0. 5〜 10質量％が好ましい。 図面の簡単な説明
図 1は、 樹脂ブロックを厚さ 500 2 111で薄片化させたときのマイクロアレイ （ 断面図） を示す写真である。 発明を実施するための最良の形態
本発明を以下の実施例により、 さらに詳細に説明する。 ただし、 本発明はこ れら実施例によりその技術範囲が限定されるものではない。 実施例 1
直径 2fflmのピアノ線 （長さ 10cm) を 2本平行に配置し、 それらのピアノ線を含 むように樹脂ブロックを作成した。 樹脂は、 ポリウレタン樹脂接着剤 （日本ポ リウレタン工業 （株） ニッポラン 4276、 コロネート 4403) を使用した。 まず、 ニッポラン 4276/コロネート 4403 = 62/38の配合比における総重量に対し、 0. 5 質量％、 1. 0質量％又は 2. 5質量％のカーボンブラック （三菱化学社製 MA- 100) をそれぞれ二ッポラン 4276に加え、 ホモジナイザ一を用いて 3時間分散させた。 次にコロネート 4403を加え、 室温にて約一週間硬化させた。 ピアノ線を含む 2 c mX 2 cmX 7 cmのカーボンブラック分散ゥレ夕ンプロックを作製した。次にピアノ 線を引き抜くことにより、 プロック中に長さ 7cmの 2つの貫通穴が形成された。 得られたブロックをミクロトームで貫通穴の長手方向に対して直角方向にス ライスして厚さ約 500 mの薄片を 10枚得た。 いずれの薄片も湾曲がなかった。 また、 力一ポンプラックはブロック中で十分、 分散されていた。
これらの薄片から任意に 3枚選択し、 Nikon製蛍光顕微鏡 E600ノ浜松ホトニク ス製冷却 CCDカメラ C488- 37で観察し、 スライス片の検出光強度は Cy3フィル夕一 (入射光側 535 ± 25nm検出光側 610±75 ）を用い露光時間 3 0秒で蛍光測定を行 つた。 測定後、 3枚の蛍光強度の平均値をもとめた。 結果を表 1に示した。 表 1
Figure imgf000012_0001
実施例 2
( 1 ) 中空繊維配列体の作製
直径 0. 32iMiの孔を有し、 孔の中心間距離が 0. 42丽の多孔板であって、 縦横各 7列に合計 49個配列された厚さ 0. 1腿の多孔板 2枚を重ね、 これらの多孔板 2枚 の各孔に、 ポリエチレン製中空繊維 （外径 0. 3醒、 内径 0. 2iMi) 49本を通過させ 、 2枚の多孔板の間隔を 50讓とし、 糸を張った状態で両端を固定した。 実施例 1 と同様にしてポリウレタン樹脂接着剤の総重量に対し、 2. 5質量％のカーポンプ ラックを添加、 攪拌した。 この樹脂原料を中空繊維配列体の周囲に流し込み硬 化させ、 次いで多孔板を取り除くことによって中空繊維を含む樹脂ブロックを 得た。
( 2 ) メタクリレート基を有する蛍光標識オリゴヌクレオチドの調製
オリゴヌクレオチドの合成は、 PEバイオシステムズ社の自動合成機 DNA/RM s ynthes izer (model394)を用いて行い、 丽 A合成の最終ステップで、 5 ' 末端に Cy 3を導入した GCATの配列のオリゴヌクレオチドを合成した （Cy3 - GCAT) 。 これら は、 一般的手法によって脱保護及び精製して使用した。
得られた Cy3_GCAT (500nmol/ml) 50 1、 グリシジルメ夕クリレート 及 びジメチルホルムアミド （DMF) 5 1を混合し、 70°Cで 2時間反応させて、 メタ クリレート基を有する蛍光色素を調製し、 水 190 1を加えて、 lOOnmol/mlのメタ クリレート基を有する蛍光色素（GMA変性 Cy3- GCAT)を得た。
( 3 ) 核酸固定化ゲルが保持された繊維配列体及び該薄片の調製 下記の質量比で混合して、 モノマー液及び開始剤液を調製した。 a ) モノマ一液
アクリルアミド 0. 76 質量部
0. 04 質量部 水 4. 2 % 部 b ) 開始剤液
2， 2' -ァゾビス (2 -アミジノプロパン) 二塩酸塩 0. 01 質量部 水 4. 99 質量部 上述のモノマー液 a ) 及び開始剤液 b ) に対して、 表 2に示した濃度となる ように （2 ) で調製した GMA変性 Cy3- GCATを混合した （重合液 1〜 5 ) 。
得られた重合液を （1 ) で得られた樹脂ブロック中の中空繊維の中空部に充 填し、 ブロックを内部が水蒸気で飽和された密閉ガラス容器に移し、 80°Cで 4 時間放置することにより重合反応を行った。 表 2
Figure imgf000013_0001
重合反応終了後、 ブロックを、 ミクロトームを使用し中空繊維の長手方向に 対して直角方向に切断を繰り返し、 厚さ約 750 Α ΠΙの薄片を 30枚得た。 得られた 薄片はいずれも湾曲のないものであった。 また、 力一ボンブラックはブロック 中で十分、 分散されていた。
得られた薄片から任意に 3枚選択し、 Nikon製蛍光顕微鏡 E600Z浜松ホトニク ス製冷却 CCDカメラ C488- 37で観察し、 実施例 1と同様のフィルターを用い、 マ イクロアレイの検出光強度を測定した。 測定後、 3枚の蛍光強度の平均値をも とめた。 その結果、 0. 005 nmol/L の Cy3まで検出できた。 比較例 1
カーボンブラックを混入しないことを除いて、 実施例 2と同様の方法で薄片 を調製し、 得られた薄片の蛍光強度を測定した。 その結果、 0. 005 nmo l/L の Cy 3は検出できず、 0. 05 mno】/Lの Cy3までしか検出できなかった。 表 3
Figure imgf000014_0001
N. T. = not tes t ed
実施例 2は重合液 5の蛍光強度を、 比較例 2は重合液 3の蛍光強度を 1とし 、 蛍光強度比を算出した。 実施例 3
ポリエチレン製中空繊維の代わりにカーボンブラックを 1. 6質量部含むポリ メチルメタクリレート（PMMA)製中空繊維 （外径 0. 3匪、 内径 0. 2mm) を使用した 以外は、 実施例 2と同様にして樹脂ブロックを調製した。 1 0日後、 樹脂プロ ックを; HS K 7215 により、 加圧面が樹脂ブロックに密着してから 5秒後に硬度 を測定した。 結果、 硬度は 95であった。 この樹脂ブロックを薄片化し、 3 0枚 の薄片を得た。 いずれの薄片も湾曲のないものであった。 比較例 2
実施例 3において、 中空繊維及び樹脂に力一ポンプラックを添加せずに樹脂 ブロックを作成した。 1 0日後、 この樹脂ブロックを J IS K 7215に従って硬度 を測定したところ 72であった。 この樹脂ブロックを厚さ 500 mで薄片化したと ころ、 できた薄片はいずれも湾曲のある薄片であった （図 1参照） 。 本発明で引用したすべての刊行物、 特許及び特許出願は、 参照によりその全 体を本発明に組み入れるものとする。 産業上の利用の可能性
本発明により、 マイクロアレイ及びその製造方法が提供される。
線条体及び Z又はプロックに、 自家蛍光を低減させる物質を添加することに より、 検出時におけるバックグラウンド、 クロストークを著しく低下すること ができ、 検出感度が向上できる。 さらに、 線条体及び Z又はブロックに、 自家 蛍光を低減させる物質を添加することにより、 製法時には切断時に湾曲等のな いマイクロアレイを安定して製造することができる。

Claims

請 求 の 範 囲 生体関連物質が保持された複数の線条体又は貫通穴を含むブロックを、 線 条体又は貫通穴の長手方向と交差する方向で切断して得られるマイクロア レイにおいて、 前記線条体及びノ又はブロックが、 その自家蛍光を減少さ せる物質を含有していることを特徴とするマイクロアレイ。
線条体が繊維である請求項 1記載のマイクロアレイ。
繊維が中空繊維である請求項 2記載のマイクロアレイ。
ブロックが樹脂からなるものである請求項 1〜3のいずれか 1項に記載の 自家蛍光を減少させる物質が、 吸収剤及び Z又は消光剤である請求項 1〜 4のいずれか 1項に記載のマイクロアレイ。
吸収剤が無機顔料である請求項 5記載のマイクロアレイ。
無機顔料がカーボンブラックである請求項 6記載のマイクロアレイ。
カーボンブラックの含有量が、 0. 5~ 10質量％である請求項 7記載のマイク ロアレイ。
ブロックの自家蛍光を低減させる物質を含むブロックに、 複数の貫通穴を 形成し、 該貫通穴内に生体関連物質を保持し、 貫通穴の長手方向と交差す る方向で前記プロックを切断することを特徴とするマイクロアレイの製造 方法。
. 生体関連物質が保持された線条体の束を、 自家蛍光を低減する物質を含 む樹脂で固定してブロックを作製し、 線条体の長手方向と交差する方向で 前記ブロックを切断することを特徴とするマイクロアレイの製造方法。. 自家蛍光を低減する物質を含む樹脂で線条体の束を固定してブロックを 作製し、 該線条体の各々に生体関連物質を保持させた後、 線条体の長手方 向と交差する方向で前記ブロックを切断することを特徴とするマイクロア レイの製造方法。
. 線条体が自家蛍光を低減する物質を含有している請求項 1 0又は 1 1記 載の方法。
13. 線条体が繊維である請求項 9〜1 2のいずれか 1項に記載の製造方法。
14. 繊維が中空繊維である請求項 1 3記載の製造方法。
1 5. 自家蛍光を減少する物質が、 吸収剤及び/又は消光剤である請求項 9〜 14のいずれか 1項に記載の製造方法。
16. 吸収剤が無機顔料である請求項 1 5記載の製造方法。
17. 無機顔料が力一ポンプラックである請求項 1 6記載の製造方法。
1 8. カーボンブラックの含有量が、 0.5〜10質量％である請求項 1 7記載の製 造方法。
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