-
Querverweis auf verwandte
Anmeldungen
-
Die
Anmeldung beansprucht den Vorteil eines früheren Anmeldetags der US-Patentanmeldungen:
US-Anmeldung 08/867,567 ,
eingereicht am 2. Juni 1997,
US-Anmeldung 08/868,018 ,
eingereicht am 3. Juni 1997,
US-Anmeldung
08/867,584 , eingereicht am 2. Juni 1997, und
US-Anmeldung 08/868,049 , eingereicht am
3. Juni 1997, wobei jede davon durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
-
Technisches Gebiet
-
Die
Erfindung betrifft im Allgemeinen Multi-Well-Platten und Plattformen,
die mittels Cycloolefinen hergestellt wurden, für eine Verwendung in spektroskopischen
Messungen und Verfahren zum Herstellen solcher Vorrichtungen. Multi-Well-Platten
und Plattformen sind insbesondere für Fluoreszenzmessungen von
chemischen oder biologischen Proben verwendbar.
-
Einleitung
-
Eine
Reihe von Multi-Well-Platten ist zum Kultivieren von Zellen oder
Durchführen
von chemischen oder zellulären
Tests käuflich
erhältlich.
Während
viele dieser Multi-Well-Platten die wünschenswerten Eigenschaften
einer Biokompatibilität,
Einfachheit der Herstellung und wesentlicher struktureller Integrität bieten,
haben die Erfinder allgemein festgestellt, dass diese Platten, insbesondere
Platten mit polymerischen Böden,
an einem wesentlich hohen Grad an Fluoreszenz leiden. Die relativ
hohe Menge an Hintergrundfluoreszenz, die in käuflich erhältlichen Platten mit polymerischen
Böden inhärent ist,
macht solche Platten allgemein für
hochgradig empfindliche Fluoreszenzmessungen, die mit vielen Tests,
insbesondere Tests von Mikrolitervolumina oder weniger, assoziiert
sind, nicht geeignet.
-
Die
Erfinder erkannten einen Bedarf auf dem chemischen und biologischen
Gebiet für
Multi-Well-Platten und Plattformen für chemische oder biologische
Ereignisse wie Bindungstests oder Tests auf Zellbasis. Die Erfinder
generierten Auswahlkriterien für
geeignete Materialien zum Herstellen von Multi-Well-Platten und Plattformen
für solche
Anwendungen. Als ein Schlüsselbeispiel
der Auswahlkriterien, das hierin vollständiger beschrieben ist, untersuchten
die Erfinder die spektralen Eigenschaften von verschiedenen Polymeren,
einschließlich
ihrer Fluoreszenz und Transmission, hinsichtlich einer Kompatibilität mit spektroskopischen
Messungen von chemischen und biologischen Ereignissen. Solche Materialien
würden
auch wünschenswerterweise,
aber nicht notwendigerweise, abhängig
von der Anwendung, Biokompatibilität, relative chemische Inertheit und
ausreichende Rigidität
für die
bevorstehende Anwendung und Einfachheit einer Herstellung aufweisen. Die
Erfinder wählten
eine Vielzahl von Polymeren zum Testen aus, basierend teilweise
auf den strukturellen Eigenschaften der Polymere, was vollständiger hierin
beschrieben ist. Die Recherche der Erfinder für Polymere beinhaltete Recherchegebiete,
die nicht mit spektroskopischen Messungen assoziiert sind, einschließlich Gebieten,
die mit Cycloolefin-Polymeren assoziiert sind, wie die Gebiete der
Elektronik und der Tonaufnahme. Die Erfinder verglichen eine Vielzahl
von Materialien gegenüber
Quarzglasplatten (z.B. Glas), die eine relativ niedrige inhärente Fluoreszenz
aufweisen. Aus einer Reihe von getesteten Folien stellten die Erfinder überraschenderweise
fest, dass Cycloolefinfolien die Fluoreszenz- und Transmissionseigenschaften
aufweisen, die an diejenigen von Quarzglas herankommen (oder diese
sogar übertreffen).
-
Wie
hierin beschrieben, haben die Erfinder zum ersten Mal neue Multi-Well-Platten
unter Verwendung von Cycloolefinen entwickelt, die exzellente Leistungseigenschaften
in Tests bieten. Solche Multi-Well-Platten können in Formaten von herkömmlichen
96-Well-Platten oder Formaten höherer
Dichte verwendet werden. Die Erfinder beschreiben hierin auch zum
ersten Mal neue Plattformen, die für Tests oder Reaktionsstellen
verwendet werden können,
die hinsichtlich einer Herstellung mit Cycloolefinen besonders verbesserungsfähig sind.
Solche Platten und Plattformen können
für andere
Anwendungen wie Diagnostik oder Synthese von Chemikalien verwendet
werden.
-
Zusammenfassung
-
Die
Erfindung beinhaltet Vorrichtungen für spektroskopische Messungen
wie Multi-Well-Platten
und Plattformen. Typischerweise umfassen solche Vorrichtungen eine
Schicht niedriger Fluoreszenz und hoher Transmission, umfassend
ein Cycloolefin-Polymer,
und entweder ein Well/Wells einer Multi-Well-Platte oder eine Plattform,
um die Schicht zu halten.
-
Erfindungsgemäße Multi-Well-Platten
umfassen eine Schicht niedriger Fluoreszenz und hoher Transmission,
umfassend ein Cycloolefrn-Polymer, und ein Well/Wells zum Halten
oder Ausbilden der Schicht. Das Cycloolefin umfasst gewöhnlich mindestens
einen Teil einer Bodenoberfläche
eines Wells der Multi-Well-Platte.
-
Erfindungsgemäße Plattformen
umfassen eine Schicht oder ein Fenster niedriger Fluoreszenz und
hoher Transmission, gewöhnlich
umfassend ein Cycloolefin-Polymer oder ein anderes Material niedriger
Fluoreszenz, und ein Gerüst
oder einen Rahmen zum Halten oder Ausbilden der Schicht. Das Fenster
weist eine vorbestimmte Dimension auf und kann als eine Vielzahl
von Fenstern auf dem Rahmen in einer jeglichen geometrischen Anordnung,
einschließlich
zweidimensionaler Anordnungen, angeordnet sein. In einigen Ausführungsformen
erlaubt das Fenster einen Nachweis von spektroskopischen Ereignissen,
wo Strahlung oft durch das Fenster passiert. In anderen Ausführungsformen
ist das Fenster im Wesentlichen eine Reaktions- oder Teststelle,
die einen Nachweis einer chemischen Reaktion oder eines Tests erlaubt.
-
Die
Erfindung beinhaltet auch Verfahren zum Nachweisen und Herstellen,
die erfindungsgemäße Multi-Well-Platten
und Plattformen betreffen.
-
Genaue Beschreibung der Erfindung
-
Definitionen
-
Wenn
nicht anders definiert, weisen alle technischen und wissenschaftlichen
Begriffe, die hierin verwendet werden, die gleiche Bedeutung auf
wie sie herkömmlicherweise
von dem Fachmann auf dem Gebiet, zu dem die Erfindung gehört, aufweist.
Im Allgemeinen sind die hierin verwendete Nomenklatur und die Laborverfahren
in der Spektroskopie, Arzneimittelauffindung, Zellkultur, Molekulargenetik, Plastikherstellung,
Polymerchemie, Diagnostik, Aminosäure- und Nukleinsäurechemie
und Zuckerchemie, die nachstehend beschrieben sind, bekannt und
werden üblicherweise
auf dem Gebiet verwendet. Standardtechniken werden typischerweise
für eine
Herstellung von Plastiken, zum Signalnachweis, für Verfahren von rekombinanten
Nukleinsäuren,
zur Polynukleotidsynthese und mikrobiellen Kultur- und Transformation
(z.B. Elektroporation, Lipofektion) verwendet. Die Techniken und
Verfahren werden allgemein gemäß herkömmlicher
Verfahren auf dem Gebiet und verschiedenen allgemeinen Referenzen
(vgl. im Allgemeinen Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, zweite Ausgabe (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, N. Y., und Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence
Spectroscopy, New York: Plenum Press (1983), für Fluoreszenztechniken, die
hierin durch Bezugnahme eingeschlossen sind), die überall in
diesem Dokument bereitgestellt werden, durchgeführt. Standardtechniken werden
für chemische
Synthesen, chemische Analysen und biologische Tests verwendet. Wie überall in
der Beschreibung verwendet, sollen die nachstehenden Begriffe, wenn nicht
anders angegeben, so verstanden werden, dass sie die nachstehenden
Bedeutungen aufweisen:
"Fluoreszierende
Donorgruppe" betrifft
die Gruppe einer fluorogenen Verbindung, die Energie absorbieren kann
und fähig
ist, die Energie auf ein anderes fluorogenes Molekül oder einen
anderen fluorogenen Teil einer Verbindung zu übertragen. Geeignete fluorogene
Donormoleküle
beinhalten in nicht begrenzender Weise Coumarine und verwandte Farbstoffe,
Xanthen-Farbstoffe wie Fluoresceine, Rhodole und Rhodamine, Resorufine, Cyanin-Farbstoffe,
Bimane, Acridine, Isoindole, Dansyl-Farbstoffe, Aminophthalsäurehydrazide
wie Luminol und Isoluminolderivate, Aminophthalimide, Aminonaphthalimide,
Aminobenzofurane, Aminochinoline, Dicyanhydrochinone und Europium-
und Terbiumkomplexe und verwandte Verbindungen.
-
"Löscher" betrifft ein chromophores Molekül oder einen
Teil einer Verbindung, das/der fähig
ist, die Emission von einem fluoreszierenden Donor, wenn er an den
Donor gebunden ist, zu vermindern. Löschen kann durch einen jeglichen
von mehreren Mechanismen auftreten, einschließlich Fluoreszenzresonanzenergietransfer,
fotoinduziertem Elektronentransfer, paramagnetischer Anreicherung
von Intersystemcrossing, Dexter-Austauschkopplung und Anregungskopplung
wie die Bildung dunkler Komplexe.
-
"Akzeptor" betrifft einen Löscher, der über Fluoreszenzresonanzenergietransfer
funktioniert. Viele Akzeptoren können
die übertragene
Energie als Fluoreszenz wieder emittieren. Beispiele beinhalten
Coumarine und verwandte Fluorophore, Xanthene wie Fluoresceine,
Rhodole und Rhodamine, Resorufine, Cyanine, Difluorboradiazaindazene
und Phthalocyanine. Andere chemische Klassen von Akzeptoren emittieren
nicht im Allgemeinen die übertragene
Energie. Beispiele beinhalten Indigoverbindungen, Benzochinone,
Anthrachinone, Azoverbindungen, Nitroverbindungen, Indoaniline,
Di- und Triphenylmethane.
-
"Bindungspaar" betrifft zwei Gruppen
(z.B. chemisch oder biochemisch), die eine Affinität für einander aufweisen.
Beispiele für
Bindungspaare beinhalten Antigen/Antikörper, Lectin/Avidin, Zielpolynukleotid/Sondenoligonukleotid,
Antikörper/Antiantikörper, Rezeptor/Ligand,
Enzym/Ligand und dergleichen. "Ein
Mitglied eines Bindungspaars" betrifft
eine Gruppe des Paars wie ein Antigen oder einen Liganden.
-
"Farbstoff' betrifft ein Molekül oder einen
Teil einer Verbindung, das/der spezifische Frequenzen von Strahlung
absorbiert, einschließlich
in nicht begrenzender Weise ultravioletter Strahlung. Die Begriffe "Farbstoff" und "Chromophor" sind synonym.
-
"Fluorophor" betrifft ein Chromophor,
das fluoresziert.
-
"Membran permeierendes
Derivat" betrifft
ein chemisches Derivat einer Verbindung, das eine erhöhte Membranpermeabilität im Vergleich
zu einer nicht derivatisierten Verbindung aufweist. Beispiele beinhalten
Ester-, Ether- und Carbamatderivate. Die Fähigkeit dieser Derivate, Zellmembranen
zu durchqueren, wurde verbessert, d.h. diese Derivate durchdringen
eine Membran, da hydrophile Gruppen maskiert werden, um hydrophobere
Derivate bereitzustellen. Auch ist ein Maskieren von Gruppen dahingehend
entwickelt worden, um von einem Vorläufer (z.B. einem fluorogenen
Substratvorläufer)
innerhalb der Zelle gespalten zu werden, um das sich abgeleitete
Substrat intrazellulär
zu erzeugen. Da das Substrat hydrophiler ist als das Membran permeierende
Derivat, ist es nun innerhalb der Zellen eingeschlossen.
-
"Alkylgruppe" betrifft geradkettige,
verzweigte und cyclische aliphatische Gruppen mit allgemein 1 bis 8
Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und am
meisten bevorzugt 1 bis 4 Kohlenstoffatomen. Der Begriff "Niederalkylgrup pe" betrifft geradkettige
und verzweigtkettige Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen.
-
"Aliphatisch" betrifft gesättigte und
ungesättigte
Alkylgruppen mit allgemein 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise
1 bis 6 Kohlenstoffatomen und am meisten bevorzugt 1 bis 4 Kohlenstoffatomen.
-
"Hitzefusionsschweißnaht" betrifft eine durch
Hitze induzierte Schweißnaht.
Die Wärmequelle
kann eine jegliche Quelle sein, die ausreicht, um einen gewissen
Grad an Befestigung zwischen zwei Teilen (separat oder anderweitig)
eines Materials/von Materialien zu fördern, einschließlich einer
chemischen Reaktion, einer externen Wärmequelle (z.B. ein erhitzter
Tiegel, Ultraschall oder Luft) oder inneres Erhitzen (z.B. Hochfrequenzerhitzen).
-
"Isoliertes Polynukleotid" betrifft ein Polynukleotid
mit genomischem, cDNA- oder synthetischem Ursprung oder irgendeiner
Kombination davon, wobei aufgrund seines Ursprungs das "isolierte Polynukleotid" (1) nicht mit der
Zelle assoziiert ist, in der das "isolierte Polynukleotid" in der Natur gefunden
wird, oder (2) mit einem Polynukleotid operabel verbunden ist, mit
dem es in der Natur nicht verbunden ist.
-
"Isoliertes Protein" betrifft ein Protein
mit cDNA-, rekombinanter RNA- oder synthetischem Ursprung oder irgendeiner
Kombination davon, wobei aufgrund seines Ursprungs das "isolierte Protein" (1) nicht mit gefundenen
Proteinen assoziiert ist, mit denen es normalerweise in der Natur
gefunden wird, oder (2) von der Zelle isoliert ist, in der es normalerweise
vorkommt, oder (3) frei von anderen Proteinen aus derselben zellulären Quelle,
z.B. frei von menschlichen Proteinen, isoliert ist, oder (4) von
einer Zelle einer unterschiedlichen Spezies exprimiert wird, oder
(5) nicht in der Natur vorkommt. "Isoliertes natürlich vorkommendes Protein" betrifft ein Protein,
wobei aufgrund seines Ursprungs das "isolierte natürlich vorkommende Protein" (1) nicht mit Proteinen
assoziiert ist, mit denen es normalerweise in der Natur gefunden
wird, oder (2) von der Zelle isoliert ist, in der es normalerweise
vorkommt, oder (3) frei von anderen Proteinen aus der gleichen zellulären Quelle, z.B.
frei von menschlichen Proteinen, isoliert ist.
-
"Polypeptid" wird hierin als
ein generischer Begriff verwendet, um ein natives Protein, Fragmente
oder Analoga einer Polypeptidsequenz zu bezeichnen. Daher sind ein
natives Protein, Fragmente und Analoga Arten des Polypeptid-Überbegriffs.
-
"Natürlich vorkommend", wie hierin verwendet,
wie auf ein Objekt angewendet, betrifft die Tatsache, dass ein Objekt
in der Natur gefunden werden kann. Zum Beispiel ist eine Polypeptid-
oder Polynukleotidsequenz, die in einem Organismus (einschließlich Viren)
vorhanden ist, die aus einer Quelle in der Natur isoliert werden
kann und die nicht absichtlich vom Menschen in dem Labor modifiziert
wurde, natürlich
vorkommend.
-
"Operabel verbunden" betrifft eine Nebeneinanderstellung,
wobei die so beschriebenen Komponenten in einer Beziehung stehen,
die es ihnen ermöglicht,
in ihrer vorgesehenen Weise zu funktionieren. Eine Kontrollsequenz,
die mit einer kodierenden Sequenz "operabel verbunden ist", ist in einer solchen
Weise ligiert, dass eine Expression der kodierenden Sequenz unter
Bedingungen erreicht wird, die kompatibel mit den Kontrollsequenzen
sind.
-
"Kontrollsequenz" betrifft Polynukleotidsequenzen,
die erforderlich sind, um die Expression von kodierenden und nicht
kodierenden Sequenzen, an die sie ligiert sind, zu bewirken. Die
Art solcher Kontrollsequenzen unterscheidet sich abhängig von
dem Wirtsorganismus. In Prokaryoten beinhalten solche Kontrollsequenzen
im Allgemeinen eine Promotor-, ribosomale Bindungsstellen- und Transkriptionsterminationssequenzen. In
Eukaryoten beinhalten solche Kontrollsequenzen im Allgemeinen Promotor-
und Transkriptionsterminationssequenzen. Der Begriff "Kontrollsequenzen" soll mindestens
Komponenten beinhalten, deren Vorhandensein eine Expression beeinflussen
kann. und kann auch zusätzliche
Komponenten beinhalten, deren Vorhandensein vorteilhaft ist, z.B.
Leitsequenzen und Fusionspartnersequenzen.
-
"Polynukleotid" betrifft eine polymerische
Form von Nukleotiden einer Länge
von mindestens 10 Basen, entweder Ribonukleotide oder Desoxynukleotide
oder eine modifizierte Form einer jeden Art von Nukleotid. Der Begriff
beinhaltet einzelsträngige
und doppelsträngige
Formen von DNA.
-
"Entspricht" betrifft den Umstand,
dass eine Polynukleotidsequenz homolog (d.h. identisch, nicht strikt evolutionär verwandt)
zu der gesamten oder einem Teil einer Bezugspolynukleotidsequenz
ist oder dass eine Polypeptidsequenz identisch zu einer Bezugspolypeptidsequenz
ist. Im Gegensatz dazu wird der Begriff "komplementär zu" hierin verwendet, um zu bezeichnen,
dass die komplementäre
Sequenz homolog zu der gesamten oder einem Teil einer Bezugspolynukleotidsequenz
ist. Zur Veranschaulichung entspricht die Nukleotidsequenz "TATAC" einer Bezugssequenz "TATAC" und ist komplementär zu einer
Bezugssequenz "GTATA".
-
"Polypeptidfragment" betrifft ein Polypeptid,
das eine aminoterminale und/oder carboxyterminale Deletion aufweist,
aber wobei die verbleibende Aminosäuresequenz gewöhnlich identisch
zu den entsprechenden Positionen in der natürlich vorkommenden abgeleiteten
Sequenz, z.B. von einer Volllängen-cDNA-Sequenz,
ist. Fragmente weisen typischerweise eine Länge von mindestens 5, 6, 8
oder 10 Aminosäuren,
vorzugsweise mindestens 14 Aminosäuren, mehr bevorzugt mindestens
20 Aminosäuren,
gewöhnlich
mindestens 50 Aminosäuren
und noch mehr bevorzugt mindestens 70 Aminosäuren auf.
-
"Platte" betrifft eine Multi-Well-Platte,
wenn nicht in dem Zusammenhang ihrer Verwendung anderweitig modifiziert.
-
"Modulation" betrifft die Fähigkeit,
eine funktionelle Eigenschaft einer biologischen Aktivität oder eines biologischen
Prozesses (z.B. Enzymaktivität
oder Rezeptorbindung) entweder zu verstärken oder zu hemmen. Eine solche
Verstärkung
oder Hemmung kann von dem Auftreten eines spezifischen Ereignisses,
wie einer Aktivierung eines Signalweiterleitungsweges, abhängig sein
und/oder kann lediglich in spezifischen Zellarten greifbar sein.
-
Der
Begriff "Modulator" betrifft eine chemische
Verbindung (natürlich
vorkommend oder nicht natürlich vorkommend)
wie ein biologisches Makromolekül
(z.B. Nukleinsäure,
Protein, Nichtpeptid oder organisches Molekül) oder einen Extrakt, der
aus biologischen Materialien wie Bakterien, Pflanzen, Pilzen oder
tierischen (insbesondere Säuger-)
Zellen oder Geweben hergestellt wird. Modulatoren werden hinsichtlich
möglicher
Aktivität
als Inhibitoren oder Aktivatoren (direkt oder indirekt) von einem
biologischen Prozess oder biologischen Prozessen (z.B. Agonist,
Teilantagonist, Teilagonist, Antagonist, antineoplastische Mittel,
cytotoxische Mittel, Inhibitoren einer neoplastischen Transformation
oder Zellproliferation, zellproliferationsfördernde Mittel und dergleichen)
durch Einbau in hierin beschriebene Screeningtests evaluiert. Die
Aktivität
eines Modulators kann bekannt, nicht bekannt oder teilweise bekannt
sein.
-
Der
Begriff "Testchemikalie" betrifft eine Chemikalie,
die durch ein oder mehrere erfindungsgemäße Screeningverfahren als ein
möglicher
Modulator getestet werden soll.
-
Die
Begriffe "Markierung" oder "markiert" betreffen den Einbau
eines nachweisbaren Mackers, z.B. durch Einbau einer radiomarkierten
Aminosäure
oder Anbringung an ein Polypeptid von Biotinylgruppen, die durch
markiertes Avidin (z.B. Streptavidin mit einem Fluoreszenzmarker
oder einer enzymatischen Aktivität, die
durch optische oder kolorimetrische Verfahren nachgewiesen werden
kann) nachgewiesen werden können.
Verschiedene Verfahren zum Markieren von Polypeptiden und Glykoproteinen
sind bekannt und können verwendet
werden. Beispiele für
Markierungen für
Polypeptide beinhalten in nicht begrenzender Weise die nachstehenden:
Radioisotope (z.B. 3H, 14C, 35S, 125I 131I), fluoreszierende Markierungen (z.B.
FITC, Rhodamin, Lanthanidleuchtstoffe), enzymatische Markierungen
(oder Reportergene) (z.B. Meerrettichperoxidase, β-Galactosidase, β-Latamase,
Luciferase, alkalische Phosphatase), chemilumineszierendes Mittel,
Biotinylgruppen, vorbestimmte Polypeptidepitope, die von einem sekundären Reporter
erkannt werden (z.B. Leucinzipperpaarsequenzen, Bindungsstellen
für sekundäre Antikörper, Metallbindungsdomänen, Epitoptags).
In einigen Ausführungsformen
sind Markierungen durch Spacerarme verschiedener Längen angebunden,
um eine mögliche
sterische Hinderung zu vermindern.
-
"Fluoreszierende Markierung" betrifft einen Einbau
eines nachweisbaren Markers, z.B. durch Einbau einer fluoreszierenden
Gruppe an eine chemische Einheit, die ein Ziel bindet, oder eine
Anbringung an ein Polypeptid von Biotinylgruppen, die durch Avidin
nachgewiesen werden können
(z.B. Streptavidin mit einer fluoreszierenden Markierung oder enzymatischen
Aktivität,
die durch Fluoreszenznachweisverfahren nachgewiesen werden kann).
Verschiedene Verfahren zum Markieren von Polypeptiden und Glykoproteinen
sind bekannt und können
verwendet werden. Beispiele für
Markierungen für
Polypeptide beinhalten in nicht begrenzender Weise Farbstoffe (z.B.
FITC und Rhodamin), intrinsisch fluoreszierende Proteine und Lanthanidleuchtstoffe.
In einigen Ausführungsformen
sind Markierungen durch Spacerarme verschiedener Längen angebunden,
um eine mögliche
sterische Hinderung zu vermindern.
-
"Reportergen" betrifft eine Nukleotidsequenz,
die für
ein Protein kodiert, das leicht entweder durch sein Vorhandensein
oder seine Aktivität
nachweisbar ist, ein schließlich
in nicht begrenzender Weise Luciferase, grün fluoreszierendes Protein,
Chloramphenicolacetyltransferase, β-Galactosidase, sekretierte
alkalische Phosphatase aus Plazenta, β-Lactamase, menschliches Wachstumshormon
und andere sekretierte Enzymreporter. Im Allgemeinen kodieren Reportergene
für ein
Polypeptid, das nicht anderweitig durch die Wirtszelle erzeugt wird,
was durch Analyse der Zelle/der Zellen nachweisbar ist, z.B. durch
die direkte fluorometrische, radioisotopische oder spektrophotometrische
Analyse der Zelle(n) und vorzugsweise ohne den Bedarf einer Entfernung
der Zellen für
eine Signalanalyse eines Wells. Vorzugsweise kodiert das Gen für ein Enzym,
das eine Änderung
der fluorometrischen Eigenschaften der Wirtszelle erzeugt, die durch
eine qualitative, quantitative oder semiquantitative Funktion einer
transkriptionellen Aktivierung nachweisbar ist. Beispielhafte Enzyme beinhalten
Esterasen, Phosphatasen, Proteasen (Gewebeplasminogenaktivator oder
Urokinase) und andere Enzyme, deren Funktion durch geeignete chromogene
oder fluorogene Substrate, die dem Fachmann bekannt sind, nachgewiesen
werden kann. Proteine, insbesondere Enzyme, von Reportergenen können auch
als Sonden in biochemischen Tests, z.B. nach geeigneter Konjugation
an entweder das Ziel oder eine chemische Einheit, die an das Ziel
bindet, verwendet werden.
-
"Transmission" betrifft die Fraktion
an einfallender Strahlung, die durch ein Medium bei einer gegebenen
Wellenlänge
tritt. Sie kann auch als das Verhältnis von Strahlungsleistung,
die durch ein Medium durchgeleitet wurde, zu der Strahlungsleistung,
die auf das Medium eintraf, bei einer bestimmten Wellenlange angesehen
werden.
-
Andere
hierin verwendete Chemiebegriffe werden gemäß einer herkömmlichen
Verwendung auf dem Gebiet verwendet, wie durch The McGraw-Hill Dictionary
of Chemical Terms (Hrsg. Parker, S., (1985), McGraw-Rill, San Francisco,
hierin durch Bezugnahme eingeschlossen) veranschaulicht.
-
Erfindungsgemäße Ausführungsformen
-
Als
eine nicht begrenzende Einführung
zu der Breite der Erfindung beinhaltet die Erfindung mehrere allgemeine
und verwendbare Aspekte, einschließlich:
- 1)
Multi-Well-Platten mit Cycloolefinwellböden, die in Fluoreszenzmessungen
verwendbar sind,
- 2) Plattformen mit Cycloolefinschichten oder -fenstern, die
in Fluoreszenzmessungen verwendbar sind,
- 3) Verfahren zum Herstellen von (1) und (2) und
- 4) Verfahren und Systeme eines Nachweises, basierend teilweise
auf (1) und (2).
-
Diese
erfindungsgemäßen Aspekte
als auch andere hierin beschriebene können unter Verwendung der hierin
beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen erreicht werden. Um
eine vollständige
Würdigung
des erfindungsgemäßen Umfangs
zu erlangen, wird ferner verstanden werden, dass verschiedene erfindungsgemäße Aspekte
kombiniert werden können,
um wünschenswerte
erfindungsgemäße Ausführungsformen
zu erzeugen.
-
Multi-Well-Platten und Plattformen
-
Erfindungsgemäß sind Vorrichtungen
für spektroskopische
Messungen wie Multi-Well-Platten
und Plattformen eingeschlossen. Typischerweise umfassen solche Vorrichtungen
eine Schicht niedriger Fluoreszenz und hoher Transmission, umfassend
ein Cycloolefin-Polymer, und entweder ein Well/Wells einer Multi-Well-Platte
oder eine Plattform, um die Schicht zu halten. Sowohl Multi-Well-Platten
als auch Plattformen sind nachstehend beschrieben.
-
Multi-Well-Platten
-
Erfindungsgemäße Multi-Well-Platten
umfassen eine Schicht niedriger Fluoreszenz und hoher Transmission,
umfassend ein Cycloolefin-Polymer, und ein Well/Wells, um die Schicht
zu halten oder auszubilden. Das Cycloolefin umfasst gewöhnlich mindestens
einen Teil einer Bodenoberfläche
eines Wells der Multi-Well-Platte. In vielen Ausführungsformen
wird zum Vereinfachen der Herstellung ein Cycloolefin im Wesentlichen
den gesamten Boden umfassen. Das Cycloolefin kann verwendet werden,
um die Wände
der Platte auszubilden, was ein zweiter Weg zum Vermindern der inhärenten Fluoreszenz
einer Platte ist. In einigen geformten erfindungsgemäßen Ausführungsformen
wird das Cycloolefin gegebenenfalls einen jeglichen Teil einer Platte
umfassen, einschließlich
des Plattenbodens, der Wellwände,
der Zwischenwell-strukturellen Mitglieder, die die Wells miteinander
verbinden, Plattenseiten, obere oder untere Plattenoberflächen als
auch Plattendeckel.
-
Multi-Well-Platten
können
eine jegliche Anzahl von Wells in einer jeglichen Wellanordnung
auf einem jeglichen Multi-Well-Plattenformat oder auf einer jeglichen
Multi-Well-Plattengrundfläche
bieten. Typischerweise werden Wells in zweidimensionalen linearen
Anordnungen angeordnet sein und gewöhnlich etwa 96 bis 9600 Wells
aufweisen, vorzugsweise ist die Anzahl von Wells ein Vielfaches
von 96. Größere Anzahlen
von Wells oder eine erhöhte
Welldichte kann auch leicht erreicht werden, da die Cycloolefin-Polymere
leicht in eine Vielzahl von Wellformen und Formen mit kleinen Dimensionen
und Volumina hergestellt werden können. Andere üblicherweise
verwendete Anzahlen von Wells beinhalten 1536, 3456 und 9600. Wellvolumina
variieren typischerweise von 500 nl bis über 200 μl, abhängig von der Welltiefe und
der Querschnittsfläche.
Wellvolumina von 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 und 500 μl werden üblicherweise
verwendet. Wells können
in einer jeglichen Querschnittsform (in der Draufsicht) hergestellt
werden, einschließlich
quadratisch, rund und hexagonal und Kombinationen davon. Wells können in
einer jeglichen Querschnittsform (in der vertikalen Ansicht) hergestellt werden,
einschließlich
vertikaler Scherwände
mit flachen oder runden Böden,
konischen Wänden
mit flachen oder runden Böden
und gekrümmten
vertikalen Wänden
mit flachen oder runden Böden
und Kombinationen davon. In erfindungsgemäßen Anwendungen, die fokussierte
Strahlung verwenden, kann das Cycloolefin verwendet werden, um eine
Linse auszubilden, die Teil des Wellbodens ist. Linsen werden in
ihrer Dicke und Krümmung
abhängig
von der Anwendung variieren.
-
Die
Materialien zum Herstellen der Platte werden typischerweise polymerisch
sein, da diese Materialien sich für Massenherstellungstechniken
eignen. Polymerische Materialien können insbesondere eine Plattenherstellung
durch Formverfahren erleichtern, die bekannt sind und zukünftig entwickelt
werden. Polymere, die mit Cycloolefin kompatibel sind, sollten in
Bereichen der Platte in physischem Kontakt mit Cycloolefin verwendet
werden. In einigen Ausführungsformen
können
Plattenwells mit einem Material hergestellt werden, das von einem
Cycloolefin-Polymer verschieden ist, und das Cycloolefin kann an
das zweite Material gebunden, verschweißt oder anderweitig daran fusioniert
werden. Polymere mit Glasübergangstemperaturen,
die für
eine hitzeinduzierte Fusion mit Cycloolefin geeignet sind, können zum
Herstellen der Wells und anderer Teile der Platte ausgewählt werden.
Vorzugsweise werden Polymere ausgewählt, die eine niedrige Fluoreszenz
oder andere hierin beschriebene Eigenschaften aufweisen. Die gesamte
Platte mit der Ausnahme des Bodens kann aus einem zweiten Polymer
hergestellt sein und sodann an eine Cycloolefinfolie der geeigneten
Dimensionen unter Verwendung von Verfahren ver schweißt werden,
die auf dem Gebiet bekannt sind oder zukünftig entwickelt werden. Es
ist auch bevorzugt, einen wesentlichen Teil oder die gesamte Platte
aus Cycloolefin herzustellen. Solche Verwendungen von zweiten Polymeren
können
auch als eine Richtschnur zum Ausbilden anderer erfindungsgemäßer Ausführungsformen
verwendet werden.
-
Da
die meisten Messungen nicht typischerweise erfordern, dass Strahlung
durch die Wand des Wells tritt, können Polymere Pigmente beinhalten,
um Wellwände
abzudunkeln oder Strahlung zu absorbieren. Eine solche Verwendung
von Pigmenten wird dabei helfen, Hintergrundfluoreszenz zu vermindern.
Pigmente können
durch ein jegliches bekanntes Mittel wie Beschichten oder Mischen
während
des Polymerisationsverfahrens eingebracht werden. Eine Pigmentauswahl
kann auf einem Gemisch von Pigmenten zum Dämpfen des gesamten Hintergrunds,
der dem Polymer inhärent
ist, oder auf einem einzigen Pigment oder einem Ensemble von Pigmenten
basieren, die ausgewählt
sind, um Strahlung bei gewünschten
Wellenlängen
zu filtern oder zu absorbieren. Pigmente können Ruß beinhalten. Eine solche Pigmentierung
ist im Allgemeinen bei Ausführungsformen
nicht erwünscht,
bei denen Strahlung durch die Wellwände als ein Verfahren zum Bestrahlen
des Inhalts der Wells gerichtet wird. Solche Techniken können auch
auf erfindungsgemäße Plattformausführungen angewendet
werden.
-
Die
Dicke des Cycloolefins, das den Plattenboden umfasst, kann abhängig von
den Gesamteigenschaften abhängen,
die für
den Plattenboden benötigt
werden, was durch eine spezifische Anbindung diktiert werden kann.
Solche Eigenschaften beinhalten die Menge an intrinsischer Fluoreszenz,
Rigidität,
Bruchfestigkeit und Herstellungserfordernisse, die das in der Platte
verwendete Cycloolefin betreffen. Wellboden-Cycloolefinschichten
weisen typischerweise eine Dicke von etwa 30 bis 500 Mikrons und
vorzugsweise etwa 50 bis 300 Mikrons auf. Solche Dickewerte können auch
als eine Richtschnur zum Ausbilden anderer erfindungsgemäßer Ausführungen
verwendet werden.
-
Eines
der hervorstechenden Merkmale der erfindungsgemäßen Multi-Well-Platten ist
deren niedrige intrinsische Fluoreszenz. Die Bodenschicht, die aus
Cycloolefin aufgebaut ist, erzeugt typischerweise etwa 400 % bis
200 % oder weniger der Fluoreszenz im Vergleich zu Quarzglas einer
Dicke von 150 Mikrons. Quarzglas wird typischerweise als "Goldstandard" zum Vergleich von
relativer Fluoreszenz verwendet. Fluoreszenz und relative Fluoreszenz
können
unter Verwendung jeglicher verlässli cher
Techniken gemessen werden, die bekannt sind oder auf dem Gebiet
entwickelt werden, vorzugsweise werden die hierin beschriebenen
Techniken verwendet. Vorzugsweise wird der Quarzglasstandard, der
hierin dazu verwendet wird, um die überraschend niedrige Fluoreszenz
von Cycloolefin zu zeigen, als ein Standard verwendet. Vorzugsweise
wird die aus Cycloolefin aufgebaute Bodenschicht typischerweise
etwa 100 bis 50 % oder weniger der Fluoreszenz erzeugen im Vergleich
zu Quarzglas von einer Dicke von etwa 150 Mikrons. Die Menge an
intrinsischer Fluoreszenz kann teilweise durch die Schichtdicke
diktiert sein. In einigen Anwendungen, die besonders dünne Schichten
tolerieren können,
wie Anwendungen, bei denen die Schicht keine signifikante strukturelle
Stärke benötigt, kann
die Schichtdicke sehr dünn
sein (z.B. 20 bis 80 Mikrons), um die aus der Schicht entstehende Fluoreszenz
zu vermindern. Die Dünnheit
einer Schicht wird gewöhnlich
auch gegenüber
der Schwierigkeit eines gleichmäßigen Verschweißens oder
Erzeugens von dünneren
Schichten in Herstellungsprozessen abgewägt. Die niedrige relative Fluoreszenz
von Cycloolefin-Vorrichtungen ist gewöhnlich bei Anregungswellenlängen von
etwa 300 bis 400 nm und bei Emissionswellenlängen von etwa 300 bis 800 nm
vorhanden. Solche relativen Fluoreszenzwerte können auch als eine Richtschnur
zum Ausbilden anderer erfindungsgemäßer Ausführungsformen verwendet werden.
-
Die
erfindungsgemäßen Multi-Well-Platten
können
Beschichtungen oder Oberflächenmodifikationen beinhalten,
um verschiedene Anwendungen der Platte zu vereinfachen, wie hierin
beschrieben und auf dem relevanten Gebiet bekannt oder entwickelt.
Beschichtungen können
unter Verwendung eines jeglichen bekannten Verfahrens eingebracht
werden, einschließlich
Drucken, Sprühen,
Strahlungsenergie, Ionisationstechniken oder Eintauchen. Oberflächenmodifikationen
können
auch durch geeignetes Derivatisieren eines Polymers vor oder nach
dem Herstellungsprozess und durch Einschließen eines geeigneten derivatisierten
Polymers in die Cycloolefinschicht eingebracht werden. Das derivatisierte
Polymer kann sodann mit einer chemischen Gruppe umgesetzt werden,
die in einer Anwendung der Platte verwendet wird. Vor der Reaktion mit
einer chemischen Gruppe kann ein solches Polymer sodann entweder
kovalente oder nicht kovalente Anbindungsstellen an das Cycloolefin
bereitstellen. Solche Stellen in oder auf der Cycloolefinoberfläche können verwendet
werden, um Gruppen wie Testkomponenten (z.B. ein Mitglied eines
Bindungspaars), chemische Reaktionskomponenten (z.B. Festsynthesenkomponenten
für eine
Aminosäure-
oder Nukleinsäuresynthese) und
Zellkulturkomponenten (z.B. Proteine, die Wachstum oder Adhäsion vereinfachen)
anzubinden. Beispiele für
derivatisierte Polymere beinhalten diejenigen, die von der
US-PS 5,583,211 (Coassin et
al.) beschrieben sind. Besonders bevorzugte Ausführungsformen basieren auf Polyethylen-
und Polypropylen-Derivaten, die als Cycloolefin-Copolymere eingeschlossen
werden können.
-
Die
Cycloolefinschicht kann auch eine Vielzahl von lebenden Zellen beinhalten.
Solche Ausführungsformen
sind für
auf Zellen basierte Tests, die hierin beschrieben sind, und für wachsende
Zellen unter Verwendung von Kultivierungsverfahren verwendbar. Erfindungsgemäße Platten
können
eine Beschichtung (z.B. Polylysin) beinhalten, um eine Anheftung
von Zellen zu fördern.
-
Verwendungen
für Multi-Well-Platten
sind auf den bekannten Gebieten bekannt und beinhalten diagnostische
Tests, chemische oder biochemische Bindungstests, Filtrationstests,
chemische Synthesestellen, Lagerungsstellen und dergleichen. Solche
Verwendungen können
auch auf die Erfindung angewendet werden. Es wird anerkannt werden,
dass einige Arten von Multi-Well-Platten für spektroskopische Messungen
oft für andere
Multi-Well-Platten-Anwendungen verwendet werden können. Typischerweise
wird eine Multi-Well-Platte zum Nachweisen eines Signals von einer
Probe verwendet. Unterschiedliche Arten von Signalmessungen sind
hierin beschrieben.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
wird erfindungsgemäß eine Multi-Well-Platte
für spektroskopische Messungen
bereitgestellt, umfassend eine Vielzahl von Wells, wobei jedes Well
eine Wand und einen Boden umfasst, mit einem niedrigen Fluoreszenz-
und hohen Transmissionsanteil, umfassend ein Cycloolefin-Copolymer
und einen Rahmen, wobei die Wells in einem Rahmen verteilt sind.
Die Multi-Well-Platte kann zum Nachweisen eines Signals von einer
Probe verwendet werden. In einigen Ausführungsformen fehlt der Multi-Well-Platte
die Grundfläche
einer Standard-96-Well-Mikrotiterplatte
(d.h. "Nichtstandardgrundflächen"). Die Grundfläche einer
Standard-96-Well-Mikrotiterplatte weist eine Länge von 12,7 cm und eine Breite
von 8,5 cm auf. Die allgemein anerkannte Standardgrundfläche für eine Standard-96-Well-Mikrotiterplatte
für Roboteranwendungen
ist eine Länge
von 12,77 ± 0,25
cm und eine Breite von 8,55 ± 0,25
cm (vgl. T. Astle, Standards in Robotics and Instrumentation, J.
of Biomolecular Screening, Band 1, Seiten 163–168 (1996)). In keinem Fall wird
die Standardgrundfläche
größer oder
kleiner als der Bereich von Längen
und Breiten, die in Tabelle 1 aufgelistet sind, sein, der ein Maximum
von 12,83 cm und ein Minimum von 12,63 cm für die Länge und ein Maximum von 8,63
cm und ein Minimum von 8,37 cm für
die Breite angibt. In Nichtstandard grundflächen kann die Multi-Well-Platte
864 Wells oder mehr (z.B. 1536, 3456 und 9600) aufweisen. Tabelle 1
| Mfrs Cal.
= | Mfrs Name | Äußere Dimensionen | Wells |
| | | Länge | Breite | Höhe | Wells | Form | Farbe | Material | Boden |
| | | | | | | | | | |
| | AGTC | 128.118 | 85.319 | 41.14 | | | | Styrol | 1
ml |
| | AIM | 127.762 | 85.598 | 41.504 | | | | Styrol | 1
ml |
| | AIM | 127.635 | 85.141 | 40.945 | | | | Propylen | 1
ml |
| | Beckman | 127.93 | 85.55 | 41.84 | 96 | rund | klar | Styrol | rund |
| | Beckman | 127.93 | 85.55 | 41.84 | 96 | rund | lichtdurchlässig | Propylen | rund |
| 373660 | Beckman | 127.787 | 85.573 | 14.224 | | | klar | Styrol | flach |
| 2587 | Corning/ Costar | 127.68 | 85.12 | 14.2 | 96 | rund | klar | Styrol | flach (Blende) |
| 35207 | Corning/ Costar | 127.61 | 85.166 | 14.224 | | | klar | Styrol | flach |
| 35205 | Corning /Costar | 127.33 | 85.014 | 14.224 | | | klar | Styrol | U-Boden |
| | Corning/ Costar | 127.6 | 85.2 | 14.3 | 96 | rund | klar | Styrol | Kegel |
| 7000003 | Corning/ Costar | 127.1 | 5.3 | 14.3 | 96 | rund | schwarz | Styrol | flach |
| 7000004 | Corning/Costar | 127.6 | 85.47 | 14.2 | 96 | rund | schwarz | Styrol | flach |
| 7000008 | Corning/ Costar | 126.7 | 84.62 | 14.45 | 96 | rund | lichtdurchlässig | Propylen | rund |
| 7000010 | Corning/Costar | 127.83 | 85.4 | 14.53 | 96 | rund | klar | Styrol | flach |
| 35203 | Corning/Costar | 127.508 | 85.319 | 14.224 | | | klar | Styrol | flach |
| 35202 | Corning/ Costar | | 85.42 | 14.326 | | | klar | Styrol | flach A/2 |
| 35190 | Dvnatech | 127.889 | 85.649 | 14,173 | | | klar | Styrol | flach |
| 35139 | Dvnatech | 127.838 | 85.522 | 14.097 | | | klar | Styrol | V-Boden |
| 35194 | Evergreen | 127.483 | 85.344 | 14.376 | | | klar | Styrol | flach |
| 35192 | Evergreen | 127.483 | 85.217 | 14.275 | | | klar | Styrol | U-Boden |
| 3519 | Evergreen | 127.43 | 83.268 | 14.3 | | | klar | Styrol | V-Boden |
| 35197 | Falcon | 127.381 | 85.471 | 14.351 | | | klar | Styrol | flach |
| 7000017 | Genetix | 128.28 | 86.31 | 10.17 | 384 | rund | klar | Styrol | flach |
| 35188 | Immulon | 127.406 | 85.344 | 14.402 | | | klar | Styrol | flach |
| 35176 | Interlab | 127.914 | 85.852 | 13.665 | | | klar | Styrol | V-Boden |
| | Iwaki | 127.279 | 85.065 | 14.021 | | | | Styrol | flach |
| 35181 | LabSystems | 127.838 | 85.598 | 15.291 | | | schwarz | Propylen | flach |
| 35187 | MicroFluor | 127.406 | 85.217 | 12.221 | | | weiß | Propylen | flach |
| 35184 | MicroFluor | 127.508 | 5.4 | 14.275 | | | schwarz | Propylen | flach |
| 35183 | MicroFluor | 127.533 | 85.42 | 14.224 | | | weiß | Propylen | flach A/2 |
| 35185 | MicroLite | 127.584 | 85.369 | 14.148 | | | weiß | Propylen | flach |
| 35186 | MicroLite
2 | 127.635 | 85.471 | 14.199 | | | weiß | Propylen | flach |
| | Millipore | 128.016 | 85.75 | 14.859 | | | weiß | Propylen | flach |
| | Millipore | 127.813 | 85.598 | 14.605 | | | klar | Styrol | flach |
| 35177 | NBT | 127.838 | 85.59 | 14.3 | | | klar | Styrol | U-Boden |
| 7000001 | Nunc | 127.6 | 83.7 | 14.4 | 96 | rund | klar | Styrol | flach |
| 7000006 | Nunc | 127.7 | 85.6 | 14.5 | 384 | quadratisch | klar | Styrol | flach |
| 63765 | Nunc | 127.559 | 85.573 | 14.351 | | | klar | Styrol | flach |
| 35201 | Nunc | 127.432 | 85.34 | 14.097 | | | klar | Styrol | U-Boden |
| 35200 | Nunc | 126.314 | 84.379 | 14.351 | | | | Propylen | U-Boden |
| 35199 | Nunc | 127.305 | 85395 | 14.402 | | | klar | Styrol | V-Boden |
| 35210 | Packard | 127.762 | 85.471 | 14.275 | | | weiß | Propylen | GF/B |
| 35209 | Packard | 127.965 | 85.776 | 14.351 | | | weiß | Propylen | GF/C |
| 35203 | Pall | 127.635 | 85.598 | 14.325 | | | weiß | Propylen | flach |
| 7000005 | Polyfiltronics | 127.5 | 85.8 | 44.03 | 96 | quadratisch | lichtdurchlässig | Propylen | rund |
| 7000009 | Polyfiltronics | 127.09 | 85.12 | 30.43 | 96 | rund | lichtdurchlässig | Propylen | Filter |
| 7000011 | Polyfiltronics | 127.3 | 85.25 | 16 | 96 | rund | lichtdurchlässig | Propylen | Kegel |
| 7000012 | Polyfiltronics | 127.8 | 85.69 | 9.56 | 384 | rund | lichtdurchlässig | Propylen | Kegel |
| 35175 | Polyfiltronics | 127.787 | 85.552 | 15.24 | | | weiß | Propylen | flach |
| 35174 | Polyfiltronics | 127.483 | 85.547 | 15.189 | | | schwarz | Propylen | flach |
| 35173 | Polyfiltronics | 127.991 | 85.7 | 15.24 | | | weiß | Propylen | klar-flach |
| 35179 | Polyfiltronics | 127.559 | 85.344 | 14.351 | | | weiß | Propylen | F/B |
| 35180 | Polymetrics | 127.533 | 85.369 | 14.097 | | | lichtdurchlässig | Propylen | Tiefes
V |
| | Sumilon | 127.33 | 85.395 | 14.503 | | | | Styrol | flach |
| 35178 | Tilertek | 127.381 | 85.319 | 14.224 | | | klar | Styrol | flach |
-
Typischerweise
weist die Multi-Well-Platte Wells mit einem Abstand von Wellcenter
zu Wellcenter von weniger als etwa 9 bis 6 mm, vorzugsweise weniger
als 3 mm und manchmal weniger als etwa 1 mm auf. Geringere Abstände von
Wellcenter zu Wellcenter sind für
kleinere Volumina bevorzugt. Solche Platten weisen typischerweise
eine Dicke des Cycloolefin-Polymers von etwa 20 bis 200 Mikrons,
vorzugsweise etwa 30 bis 80 Mikrons, auf. Vorzugsweise weist das
Cycloolefin-Polymer eine niedrige Fluoreszenz von einer Anregungsstrahlung
von etwa 300 bis 500 nm auf und der niedrige Fluoreszenz- und hohe
Transmissionsanteil ist im Wesentlichen der gesamte Boden. Oft werden
die Wells und gegebenenfalls der Rahmen aus einem Cycloolefin-Copolymer
hergestellt sein, was beim Vermindern der Fluoreszenz hilft.
-
Erfindungsgemäß ist gegebenenfalls
der Disclaimer eingeschlossen, dass in dem Fall, bei dem die Multi-Well-Platte
eine Mikrotiterplatte mit einer Grundfläche einer Standard-96-Well-Mikrotiterplatte
ist und Mikrotiterwells aufweist, die Anzahl der Mikrotiterwells
nicht 864 Mikrotiterwells übersteigen
wird.
-
Plattformen
-
Erfindungsgemäße Plattformen
umfassen eine Schicht oder ein Fenster niedriger Fluoreszenz und
hoher Transmission, gewöhnlich
umfassend ein Cycloolefin-Polymer oder ein anderes Material niedriger
Fluoreszenz, und ein Gerüst
oder einen Rahmen, das die Schicht hält oder ausbildet. Das Fenster
weist eine vorbestimmte Dimension auf und kann als eine Vielzahl
von Fenstern auf dem Rahmen in einer jeglichen geometrischen Anordnung
angeordnet sein, einschließlich
zweidimensionaler Anordnungen. In einigen Ausführungsformen erlaubt das Fenster
einen Nachweis von spektroskopischen Ereignissen, bei denen Strahlung
oft durch das Fenster tritt. In anderen Ausführungsformen ist das Fenster
im Wesentlichen eine Reaktions- oder Teststelle, die einen Nachweis
einer chemischen Reaktion oder eines Tests, z.B. durch die Messung
von Strahlungsbrechung oder Reflektierung erlaubt. Wenn das Fenster
eine Reaktions- oder Teststelle ist, muss Strahlung nicht notwendigerweise
durch das Fenster treten.
-
Das
Cycloolefin umfasst gewöhnlich
mindestens einen Teil des Fensters. In vielen Ausführungsformen wird
zum Vereinfachen der Herstellung das Cycloolefin im Wesentlichen
das gesamte Fenster und die Plattform umfassen. Das Cycloolefin
kann auch verwendet werden, um das Gerüst oder den Rahmen auszubilden, das/der
die Plattform ausbildet, was ein zweiter Weg zum Vermindern der
inhärenten
Fluores zenz einer Platte ist. In einigen erfindungsgemäßen geformten
Ausführungsformen
wird das Cycloolefin gegebenenfalls einen jeglichen Teil einer Plattform
umfassen, einschließlich
des Plattformbodens, der Wände,
strukturellen Mitglieder zwischen den Fenstern, die die Wells verbinden,
Plattformseiten, obere oder untere Plattformoberflächen als
auch Plattformdeckel. Andere Polymere können durch Cycloolefin substituiert
werden, abhängig
von den spektroskopischen oder anderen Erfordernissen des Tests
oder der Reaktion.
-
In
einer Ausführungsform
umfasst die Plattform ein Gerüst
für eine
Matrix von räumlich
vorbestimmten Anordnungsstellen auf der Schicht und das Gerüst interferiert
nicht wesentlich mit einem Nachweis eines Signals von den Teststellen.
Die Schicht weist typischerweise eine Dicke von 40 bis 300 Mikrons
auf. Die Teststellen weisen typischerweise eine Fläche von
etwa 10 Quadratmikrons bis 200 Quadratmikrons auf, obwohl größere Stellen
von mehr als 200 Mikrons (z.B. 500 bis 2000 Mikrons oder mehr) vorgesehen
sind und kleinere Stellen als 10 Mikrons (z.B. 5 bis 0,5 Mikrons
oder kleiner) vorgesehen sind. Die Schicht kann für die Anbindung
von chemischen Einheiten, wie hierin beschrieben, derivatisiert
werden. Die Teststellen können
auch auf die Schicht gedruckt sein. Solche Plattformen können in
vielen Fällen
wie die hierin beschriebenen Multi-Well-Platten verwendet und hergestellt
werden. Vorzugsweise umfasst die Plattform ein Cycloolefin-Copolymer.
-
Erfindungsgemäße Ausführungsformen
beinhalten keine optischen, informationsaufzeichnenden Medien, die
typischerweise zum Speichern und Abrufen von Information verwendet
werden (z.B. CDs (Compact Discs) für Audioaufzeichnungen oder
Computerdaten). Solche optischen Aufzeichnungsmedien weisen eine Aufzeichnungsschicht
auf. Die Aufzeichnungsschicht umfasst gewöhnlich entweder 1) vorbestimmte
physikalische Deformationen (z.B. Vertiefungen oder Wölbungen)
auf der Oberfläche
der Aufzeichnungsschicht, die durch Bestrahlung der Aufzeichnungsschicht
bei genauen vorbestimmten Stellen ausgebildet werden, oder 2) vorbestimmte
Stellen mit geändertem
Brechungsindex oder geändertem
Reflexionsgrad auf der Oberfläche der
Aufzeichnungsschicht, die durch Bestrahlung der Aufzeichnungsschicht
bei genauen vorbestimmten Stellen ausgebildet werden. Aufzeichnungsschichten
werden typischerweise aus einem Metall mit niedrigem Schmelzpunkt
(z.B. Te) hergestellt und können
andere Elemente für
gewünschte
Eigenschaften (z.B. Cr, C und H) enthalten. Die Aufzeichnungsschicht
wird gewöhnlich
auf ein Substrat abgeschieden, umfassend ein Polymer wie ein Cycloolefin.
Im Gegensatz dazu betrifft die Erfindung nicht optische informationsaufzeich nende Medien,
um die Verwendung von Cycloolefinen niedriger Fluoreszenz und hoher
Transmission für
die Verwendung auf den chemischen und biologischen Gebieten, im
Gegensatz zu den Computer- oder Audiogebieten. Bei vielen dieser
Ausführungsformen
wird Strahlung oft durch die Cycloolefinschicht treten im Gegensatz
zu den optischen informationsaufzeichnenden Medien, bei denen Strahlung
von der Aufzeichnungsschicht "abprallt". Herkömmliche
optische informationsaufzeichnende Medien unterscheiden sich auch
von der Erfindung, da die Aufzeichnungsschichten solcher Medien
eine weiche Metallschicht enthalten. Die weiche Metallschicht ist
normalerweise ein nachteiliges Merkmal zum Messen von chemischen
oder biologischen Ereignissen. In vielen Fällen wird eine solche Aufzeichnungsschicht
nicht mit vielen chemischen Reaktionen oder biologischen Gruppen
kompatibel sein. Es wird jedoch verstanden, dass einige erfindungsgemäße Ausführungsformen
Informationen enthalten oder speichern können als auch Stellen bereitstellen
können,
damit chemische oder biologische Ereignisse in einem CD-Format oder
einem modifizierten CD-Format gemäß den erfindungsgemäßen Dimensionen
und anderen Charakteristika stattfinden. In einigen Fällen können solche
chemischen oder biologischen Ereignisse ein Signal bereitstellen,
das als eine Veränderung
der Strahlungsbrechung oder -reflexion gemessen werden kann. Es
soll auch verstanden werden, dass einige erfindungsgemäße Ausführungsformen
Stellen für
chemische oder biologische Ereignisse beinhalten können, die
die Speicherung und Abfrage von Informationen in einem Format ermöglichen,
das dem herkömmlichen
CD-Format ähnelt.
Auch sind erfindungsgemäß keine
Cycloolefine, die als Blisterpackungen oder Packungsmaterial hergestellt
sind, eingeschlossen.
-
Materialien, Auswahlkriterien und Testen
-
Dieser
Abschnitt beschreibt Materialien, Auswahlkriterien und schnelle
Tests zum Vereinfachen eines Auswählens eines Cycloolefins für die hierin
beschriebenen Multi-Well-Platten und Plattformen.
-
Materialien
-
Die
Erfinder führten
eine umfassende Forschung bezüglich
unterschiedlicher Polymere in Suche von Polymeren durch, die die
geeigneten Eigenschaften zum Nachweisen von spektroskopischen Signalen,
insbesondere Fluoreszenzsignalen, bieten. Die erfindungsgemäß verwendeten
Materialien wurden nicht in den käuflich erhältlichen Platten, die in Tabelle
1 aufgelistet sind, verwendet. Überraschenderweise bieten
diese Materialien herausragende Eigenschaften, einschließlich niedriger
intrinsischer Fluoreszenz, was hierin zum ersten Mal gezeigt wurde. "Cycloolefine" betreffen im Allgemeinen
Cycloolefin-Polymere, wenn nicht anderweitig in dem Zusammenhang
ihrer Verwendung modifiziert, und beinhaltet Copolymere wie diejenigen,
die hierin so spezifiziert sind. "Cycloolefin-Copolymere" betreffen im Allgemeinen
Cycloolefin-Copolymere, wenn nicht anderweitig in dem Zusammenhang
ihrer Verwendung modifiziert.
-
Typischerweise
werden Cycloolefine als entweder Folien oder Harze verwendet, um
verschiedene erfindungsgemäße Ausführungsformen
herzustellen. Harze und Folien auf der Basis von Cycloolefin-Polymeren können in
verschiedenen Herstellungsverfahren verwendet werden, die auf dem
relevanten Gebiet bekannt und hierin beschrieben sind. Auswahlkriterien
für Cycloolefinfolien
oder -harze sind vollständiger
nachstehend beschrieben. Im Allgemeinen sind Cycloolefinfolien oder
-harze, die UV-Strahlungsabsorbierungsmittel, aromatische Gruppen,
Styrolgruppen enthalten, nicht bevorzugt.
-
Geeignete
Cycloolefine für
viele erfindungsgemäße Ausführungsformen
beinhalten diejenigen, die in den
US-PSen
5,278,238 (Lee B. L. et al.),
4,874,808 (Minami et al.),
4,918,133 (Moriya et al.),
4,935,475 (Kishimura et
al.),
4,948,856 (Minchak
et al.),
5,115,052 (Wamura
et al.),
5,206,306 (Shen),
5,270,393 (Sagane et al.),
5,272,235 (Wakatsuru et
al.),
5,278,214 (Moriya
et al.),
5,534,606 (Gennett
et al.),
5,532,030 (Hirose
et al.),
4,689,380 (Nahm
et al.) und
4,899,005 (Lane
et al.) beschrieben sind. Cycloolefine, die von Hoechst erhältlich sind,
sind bevorzugt, insbesondere Cycloolefin (z.B. Cyclopenten, Cyclohexan
und Cyclohepten) und deren Polyethylen-Copolymere als auch die thermoplastischen
Olefin-Polymere von amorpher Struktur (TOPAS-Linie).
-
Laminate
mit vielen Schichten sind bevorzugt, wenn vielfältige funktionelle Anforderungen
schwierig von einem einzigen Laminat (z.B. Schicht oder Folie) zu
erhalten sind. Die Eigenschaften einer Transmission, Rigidität, Heißsiegelfähigkeit,
Fluoreszenz, Feuchtigkeitsdurchtritt können durch die Verwendung von
Folien unterschiedlicher Harze gemischt werden. Gemischte Harze,
die bekannt sind und zu- künftig
entworfen werden, können
verwendet werden, wenn Multilaminatfolien oder gemischte Harze Eigenschaften
aufweisen, die mit denjenigen der Erfindung konsistent sind. Zum
Beispiel beschreibt die
US-PS
5,532,030 (Hirose et al.) die Herstellung von bestimmten
Cycloolefinfolien, sowohl einzeln als auch Multilaminat, die für eine Verwendung in
den hierin beschriebenen Vorrichtungen angepasst werden können.
-
Auswahlkriterien und Testen
-
Wünschenswerte
Eigenschaften für
Cycloolefinfolien und -harze, die erfindungsgemäß verwendet werden, werden
abhängig
von der Art an gewünschter
Multi-Well-Platte
oder Plattform abhängen.
Im Allgemeinen werden die Materialien ausgewählt, um ein Endprodukt mit
niedriger Fluoreszenz, hoher Transmission, ausreichender Rigidität, um einer
Deformation zu widerstehen und eine im Wesentlichen einzige Fläche zu ermöglichen
(insbesondere für
spektroskopische Ausführungsformen),
guter chemischer Inertheit, relativ geringer Cytotoxizität, geringer
Wasserabsorption, Hitzewiderstandsfähigkeit/-ableitung bis zu etwa
150°C und
Widerstandsfähigkeit
gegenüber
Säuren
und Basen zu erreichen. Ausgangsmaterialien mit guten Formeigenschaften
sind besonders wünschenswert.
-
Die
Fluoreszenz der Folien oder des Endprodukts kann leicht gemessen
werden. Solche Messungen schreiten schnell voran und eine Reihe
von Folien (z.B. 20 bis 80 Folien) oder Prototypprodukte können schnell innerhalb
von Stunden oder Tagen, gewöhnlich
weniger als einer Personenwoche, getestet werden. Demzufolge können Folien
oder Harze, die zum Herstellen von Endprodukten verwendet werden,
schnell für
die gewünschten
Eigenschaften ausgewählt
werden, die in einer spezifischen Anwendung wichtig sind. Die Fluoreszenzmessungen
können
verwendet werden, wie sie hierin beschrieben sind, oder sie können diejenigen
sein, die bekannt sind, sofern die Messungen hinsichtlich Empfindlichkeit
zu den hierin beschriebenen Messungen vergleichbar (oder besser)
sind. Ein Standardbezugspunkt für
eine relative Fluoreszenz, wie der hierin beschriebene Standard,
ist zum Vergleichen von verschiedenen Cycloolefinen und zum Bestimmen
ihrer Verwendbarkeit für
bestimmte Anwendungen besonders nützlich. Relative Fluoreszenzeigenschaften,
die hierin beschrieben sind, sind insbesondere wünschenswert. In ähnlicher
Weise kann die Transmission unter Verwendung von bekannten Techniken
gemessen werden.
-
In
dem Endprodukt werden Schichten von allgemein etwa 20 bis 500 Mikrons
höchstwahrscheinlich die
wünschenswerten
Eigenschaften für
eine Verwendung in den hierin beschriebenen Vorrichtungen verleihen,
insbesondere niedrige Fluoreszenz und hohe Transmission. Trotzdem
können
dünnere
oder dickere Folien wie 10 bis 1500 Mikrons in Anwendungen verwendet
werden, bei denen die Anforderungen für Folien mit extrem niedriger
Fluoreszenz und hoher Transmission weniger strikt sind oder bei
denen ein geringer Verlust bei den gewünschten Eigenschaften als eine
Funktion der Foliendicke auftritt. Vorzugsweise beträgt die Foliendicke
etwa 30 bis 200 Mikrons für
Multi-Well-Platten-Anwendungen und mehr bevorzugt etwa 80 bis 200
Mikrons und am meisten bevorzugt etwa 80 bis 200 Mikrons. Vorzugsweise
beträgt
die Foliendicke etwa 30 bis 600 Mikrons für Gerüstanwendungen, bei denen die
Folie typischerweise eine strukturelle Funktion an die Vorrichtung
verleiht, die gewöhnlich
eine größere Festigkeit
oder Rigidität
verlangt, mehr bevorzugt etwa 100 bis 500 Mikrons und am meisten
bevorzugt etwa 120 bis 200 Mikrons. Vorzugsweise beträgt die Foliendicke
etwa 75 bis 600 Mikrons für
die dünneren
Bereiche von injektionsgeformten Anwendungen, bei denen die Folie
typischerweise zu einer strukturellen Funktion beiträgt, und
mehr bevorzugt etwa 100 bis 500 Mikrons und am meisten bevorzugt
etwa 120 bis 200 Mikrons. Die Foliendicke betrifft die Dicke der
verwendeten Folie (oder Materialiendicke). Die Schichtdicke beträgt im Allgemeinen
etwa 100 bis 200 % der Foliendicke, vorzugsweise etwa 100 bis 150
% der Foliendicke und mehr bevorzugt etwa 100 bis 125 % der Foliendicke.
-
In
dem Endprodukt werden Bruchspannungen (kg/cm2 bei
22°C) von
allgemein etwa 400 bis 3000 kg/cm2 höchstwahrscheinlich
die wünschenswerten
Eigenschaften für
eine Verwendung in den hierin beschriebenen Vorrichtungen verleihen,
insbesondere rigide Vorrichtungen niedriger Fluoreszenz und hoher
Transmission. Trotzdem können
schwächere
oder stärke
Folien wie etwa 200 bis 3500 kg/cm2 in unterschiedlichen
Anwendungen verwendet werden, basierend auf den Anforderungen für die Bruchspannung
der Vorrichtung. Zum Beispiel muss die Bruchspannung der Folie im
Allgemeinen nicht so groß für die Böden der
Multi-Well-Platten sein im Vergleich zu Anwendungen, bei denen die
Folie Teil des Rahmens ist, entweder in einer Multi-Well-Platte
oder in einer Reaktionsplattform, die im Wesentlichen aus der Folie
selbst hergestellt ist. Vorzugsweise beträgt die Bruchspannung etwa 500
bis 2000 kg/cm2 für Multi-Well-Platten-Anwendungen
und mehr bevorzugt etwa 800 bis 1600 kg/cm2 und
am meisten bevorzugt etwa 900 bis 1400 kg/cm2.
Vorzugsweise ist die Bruchspannung für Plattform/Gerüstanwendungen
etwa 15–60
% höher
als für
Multi-Well-Platten-Anwendungen. Bruchspannungen können durch
Standardtechniken, wie sie auf dem Gebiet bekannt sind, gemessen
werden.
-
Herstellungsverfahren
-
Erfindungsgemäß ist ein
Verfahren zum Herstellen von auf einem Cycloolefin basierenden Multi-Well-Platten
und Plattformen eingeschlossen. Eine Vielzahl von Verfahren kann
verwendet werden, einschließlich
Hitzeverschweißen,
zweistufigem Spritzgießverfahren,
Spritzgießen
und anderen Verfahren, die hierin beschrieben sind und auf dem Gebiet
bekannt sind. Ein Verfahren umfasst ein Hitzeverschweißen an eine
Polymerplattform einer Schicht mit niedriger Fluoreszenz und hoher
Transmission, umfassend ein Cycloolefin-Copolymer. Verfahren verwenden
typischerweise ein Cycloolefin-Copolymer, ausgewählt aus der Gruppe von Cyclopenten-Polyethylen-Copolymer,
Cyclohexan-Polyethylen-Copolymer und Cyclohepten-Polyethylen-Copolymer. Das Verfahren
kann alternativ dazu oder gegebenenfalls den Schritt eines Aussetzens
der Schicht und des Polymers gegenüber einer ausreichenden Menge
an Hochfrequenzenergie, um das innere Erhitzen der Schicht und des
Polymers zu beschleunigen, oder Ultraschallverschweißen umfassen.
Alternativ dazu kann das Verfahren ein Erhitzen der Schicht und
des Polymers, das die Wells bildet, auf etwa 320°C für eine ausreichende Zeitspanne,
um eine Fusion der Polymere zu ermöglichen, beinhalten. Druck
kann angewendet werden, um das Verschweißungsverfahren zu beschleunigen
(z.B. etwa 6,89 bis 68,9 bar (100 bis 1000 psi) an Druck gegenüber der
Schicht und dem Polymer für
Niedrigdruckverfahren unter Verwendung von Monomerlösungen mit
niedriger Viskosität
und etwa 689 bis 1724 bar (10 000 bis 25 000 psi) für Hochdruckverfahren
wie einem zweistufigen Spritzgießverfahren.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
wird erfindungsgemäß ein Verfahren
zum Herstellen von Multi-Well-Platten durch Spritzgießen oder
zweistufiges Spritzgießen
bereitgestellt. Spritzgießtechniken,
die auf dem Gebiet bekannt sind oder zukünftig entwickelt werden, können angewendet
werden. Das Verfahren umfasst ein zweistufiges Spritzgießen mindestens
eines Wells bis zu einem Boden des Wells der Multi-Well-Platte,
wobei der Boden ein Cycloolefin-Copolymer ist. Unter Verwendung
dieses Verfahrens können
Cycloolefinfolien an die tragende Struktur (z.B. Wellwände) im
Wesentlichen Hitze fusioniert werden, um eine Platte herzustellen.
Das gesamte Well oder die gesamte Platte kann auch aus einem Cycloolefin
hergestellt sein. Spritzgießen
kann zwischen etwa 195 und 350°C
erfolgen, vorzugsweise werden Harze auf 260 bis 320°C erhitzt. Verwendete
Drücke
betragen typischerweise 689 bis 1724 bar (10 000 bis 25 000 psi)
und vorzugsweise etwa 1034 bis 1517 bar (15 000 bis 22 000 psi).
-
Verfahren
zum Herstellen von Cycloolefinen und ihren Polymeren wurden beschrieben. Ältere Verfahren
und Cycloolefine wurden in
US-PSen
4,002,815 ,
4,069,376 ,
4,110,528 ,
4,262,103 und
4,380,617 (von Robert J. Minchak und
Mitarbeitern) beschrieben. Eine Reihe von Katalysatoren kann bei
der Herstellung von Cycloolefinen verwendet werden, wie auf dem
Gebiet bekannt oder zukünftig
entwickelt, und können
zum Herstellen von Materialien für
verschiedene erfindungsgemäße Ausführungsformen
verwendet werden. Solche Katalysatoren beinhalten diejenigen, die
in den
US-PSen 5,278,238 (Lee
et al.) und
5,278,214 (Moriya
et al.) beschrieben sind. Ungeachtet der exakten Art an verwendetem
Katalysatorsystem können
Cycloolefin-Monomere
in Gegenwart eines Katalysators und der auf Ethylen basierenden
funktionellen Copolymere polymerisiert werden, um die erfindungsgemäßen Ausführungsformen,
die für
Spritzgießen
geeignet sind, herzustellen. Eine Polymerisation kann vorzugsweise
in Masse erfolgen. Polymerisation in Masse, einschließlich Reaktionsspritzgießen (RIM),
Flüssigspritzgießen (LIM),
Reaktionsspritzgießen
mit verstärktem
Kunststoff (RRIM) und Harzspritzgießen (RTM), und Kombinationen
davon sind bekannt, wie auch diejenigen Techniken, die zukünftig entwickelt
werden. Polymerisation in Masse ist eine Polymerisation, die ohne
Lösungsmittel
oder Verdünnungsmittel
durchgeführt
wird. Reaktionsspritzgießen
ist eine Art von Polymerisation in Masse, wobei ein Monomer in einem
flüssigen
Zustand in eine Form überführt oder
in sie injiziert wird, wobei eine Polymerisation des Monomers in
Gegenwart eines Katalysatorsystems stattfindet. RIM ist kein herkömmliches
Spritzgießen für geschmolzene
Polymere und ist leicht davon zu unterscheiden.
-
RIM
ist ein Niedrigdruck-, Einschritt- oder Einstufenmischen und Einspritzen
von zwei oder mehreren flüssigen
Komponenten in eine geschlossene Form, wo eine schnelle Polymerisation
auftritt, was zu einem geformten Plastikprodukt führt. RIM
unterscheidet sich von herkömmlichem
Spritzgießen
in einer Reihe von wichtigen Aspekten. Herkömmliches Spritzgießen erfolgt
bei Drücken
von etwa. 689 bis 1379 bar (10 000 bis 20 000 psi) in der Formhöhlung durch
Schmelzen eines festen Harzes und Befördern desselben in eine Form,
die bei einer Temperatur von weniger als der Schmelztemperatur des
Harzes gehalten wird. Bei einer Einspritztemperatur von etwa 150
bis 350°C
beträgt
im Allgemeinen die Viskosität
des geschmolzenen Harzes bei einem herkömmlichen Spritzgießverfahren
50 000 bis 1 000 000 und typischerweise etwa 200 000 cps. Bei dem Spritzgießverfahren
tritt eine Verfestigung des Harzes in etwa 10 bis 90 Sekunden auf,
abhängig
von der Größe des geformten
Produkts, wonach das geformte Produkt von der Form entfernt wird.
Es gibt keine chemische Reaktion, die bei einem herkömmlichen
Spritzgießverfahren
auftritt, wenn das Harz in eine Form eingebracht wird.
-
Bei
einem RIM-Verfahren beträgt
die Viskosität
der zu einer Mischkammer zugeführten
Materialien etwa 1 bis 10 000 cps, vorzugsweise 1 bis 1500 cps,
bei Einspritztemperaturen, die von Raumtemperatur bis etwa 100°C für verschiedene
Cycloolefin-Monomer-Systeme variieren. Formtemperaturen in einem
RIM-Verfahren betragen etwa 50 bis 150°C und. Drücke in der Form betragen im
Allgemeinen etwa 3,45 bis 10,3 bar (50 bis 150 psi). Mindestens
eine Komponente in der RIM-Formulierung
ist ein Monomer, das an ein Polymer in der Form polymerisiert wird.
Der Hauptunterschied zwischen herkömmlichem Spritzgießen und
RIM besteht in der Tatsache, dass bei RIM eine chemische Reaktion
beim Mischen unter optionalem Erhitzen gestartet und in der Form
vervollständigt
wird, um Monomere zu einem polymeren Zustand zu transformieren.
Für praktische Zwecke
muss die chemische Reaktion schnell in weniger als etwa zwei Minuten
stattfinden. Ein herkömmliches Spritzgießen kann
auch verwendet werden, um verschiedene erfindungsgemäße Ausführungsformen
herzustellen. Der Begriff Spritzgießen betrifft sowohl herkömmliches
Spritzgießen
als auch die anderen Arten von Spritzgießen, die hierin beschrieben
und bekannt sind oder auf dem Gebiet entwickelt werden.
-
Ein
LIM-Verfahren ist ähnlich
zu einem RIM-System mit der Ausnahme, dass im Allgemeinen ein Prallkopf
nicht verwendet wird. Anstelle wird ein einfacher Mischer wie ein
statischer Mischer, ein rührender
Mischer und dergleichen verwendet. Außerdem erfolgt in einem LIM-System
der Spritzgießzyklus über eine
längere Zeitspanne
und folglich kann die chemische Reaktion in einer Zeitspanne von
bis zu etwa 5 oder 10 Minuten stattfinden.
-
Verschiedene
verstärkende
Partikel können
auch verwendet werden, d.h. mit der Lösung injiziert werden, wenn
entweder das RIM- oder das LIM-Verfahren verwendet wird. Als ein
praktisches Verfahren ist das RIM-Verfahren nicht immer geeignet
und daher werden verstärkende
Partikel im Allgemeinen lediglich in einem LIM-Verfahren verwendet,
d.h. einem Spritzgießverfahren
mit verstärkter
Flüssigkeit.
Eine weitere Alternative ist die Verwendung eines Vlieses, das bereits
in einer Form vorhanden ist, z.B. ein Glasfaservlies oder dergleichen.
Demzufolge werden solche Systeme RMRIM, RMLIM oder RTM bezeichnet.
Aufgrund der Reaktionsaushärtungszeitspannen
als auch Spritzgießzeitspannen
ist das RMLIM-System im Allgemeinen für einige Anwendungen bevorzugt,
RMRIM oder RTM für
andere.
-
Daher
können
Gemische oder Beimischungen von Cycloolefinen und geeigneten Copolymeren
in einem jeglichen der vorstehend beschriebenen Systeme einer Polymerisation
in Masse als auch Variationen davon verwendet werden. Insofern die
vorstehenden Systeme allgemein herkömmlich oder auf dem Gebiet
als auch in der Literatur bekannt sind, wurden sie nicht im Detail
beschrieben, sondern eher kurz hierin für Zwecke der Knappheit beschrieben.
-
Die
US-PS 4,426,502 , Minchak,
beschreibt Polymerisation in Masse (z.B. RIM) von Cycloolefinen
unter Verwendung eines modifizierten Co-Katalysators mit einem Katalysator,
wobei eine Polymerisation der Cycloolefin-Monomere ohne ein Lösungsmittel
oder ein Verdünnungsmittel
erfolgen kann. Der Alkylaluminiumhalogenid-Co-Katalysator ist dahingehend modifiziert,
dass er sich mit einem Alkohol oder einer aktiven hydroxyhaltigen
Verbindung vorher umsetzt, um ein Alkoxyalkylaluminiumhalogenid
oder ein Aryloxyalkylaluminiumhalogenid auszubilden, das sodann
in der Polymerisationsreaktion verwendet wird. Die Vorreaktion kann
unter Verwendung von Sauerstoff, eines Alkohols oder eines Phenols
erreicht werden. Eine solche Modifikation des Co-Katalysators führt zu einer
Verminderung seines Reduktionspotentials des Katalysators.
-
Ungeachtet
der Tatsache, ob das Halogenidmetathese-Katalysatorsystem oder das
halogenfreie Metathesekatalysatorsystem verwendet wird, wird die
Reaktionsgeschwindigkeit allgemein durch Verwenden der vorstehend
beschriebenen Alkohole verringert. Folglich kann abhängig davon,
ob wenig oder kein Alkohol verwendet wird, das Halogenidmetathese-Katalysatorsystem
die verschiedenen Cycloolefine in Minuten oder sogar Sekunden aushärten. Falls
hohe Mengen an Alkohol verwendet werden, kann die Aushärtung eine
Frage von Stunden oder sogar Tagen sein.
-
Es
ist wichtig, die Reduktionskraft des Co-Katalysators jedes Metathesesystems
zu vermindern, um solche Reaktionen einer Polymerisation in Masse
praktikabel zu machen. Wenn ein mit einem nicht modifizierten Alkylaluminium-Co-Katalysator
verdünntes
Monomer mit einem Monomer-verdünnten
Katalysator gemischt wird, um ein Cycloolefin zu polymerisieren,
ist die Reaktion sehr schnell. In solchen Systemen ist die Polymerisation
gewöhnlich
nicht annehmbar, da Polymer, das an den Grenzflächen oder den zwei Strömen während eines
Mischens gebildet wird, ein gründliches
Mischen verhindert und zu schlechten Umwandlungen führt. Ein
Modifizieren des Co-Katalysators durch Vorumsetzung mit hydroxyhaltigen
Materialien vermindert die Aktivität des Co-Katalysators bis zu
dem Punkt, an den ein adäquates
Mischen der flüssigen
Komponenten auftreten kann und annehmbare Polymerprodukte hergestellt
werden können.
Manchmal wird ein cycloolefinisches Monomer verschiedene Verunreinigungen
enthalten, die natürlicherweise
die Aktivität
des Co-Katalysators
vermindern. In solchen Fällen
ist es nicht notwendig, aktive hydroxyhaltige Materialien zuzusetzen,
um die Aktivität
des Co-Katalysators zu vermindern. Mit dem modifizierten Co-Katalysator
kann ein Mischen der Cycloolefine und anderen Komponenten bei niedrigeren
Temperaturen wie Raumtemperatur durchgeführt werden, ohne sofort eine
Polymerisation zu starten. Der Co-Katalysator kann so formuliert
sein, um eine annehmbare Topfzeit bei Raumtemperatur und thermischer
Aktivierung in der Form der gemischten flüssigen Komponenten zu ermöglichen.
Der Co-Katalysator kann auch so formuliert sein, um mischgestartete
RIM-Systeme zu ergeben.
-
Wenn
ein Verfahren einer Polymerisation in Masse verwendet wird, können das
Gemisch der Cycloolefin-Monomere und der auf Ethylen basierenden
funktionellen Copolymere als auch der Katalysator und jegliche optionale
Additive darin zu einer Form für
Polymerisation in Masse gegeben werden, die eine Temperatur aufweist,
gut unterhalb des Tg-Werts der polymerisierten Cycloolefin-Polymere.
Dies ist besonders wünschenswert,
da die Reaktion gewöhnlich
exotherm ist und zu einer Temperaturzunahme der Form von bis zu etwa
120°C führen kann.
Die Endtemperatur der Form wird folglich etwa 50°C bis etwa 200°C, im Allgemeinen etwa
50°C bis
etwa 150°C
und vorzugsweise etwa 50°C
bis etwa 90°C,
betragen. Natürlich
werden solche Temperaturen abhängig
von der spezifischen Art an verwendetem Katalysatorsystem, der spezifischen
Art an Cycloolefin-Monomeren und dergleichen variieren. Wenn die
hierin vorstehend beschriebenen Katalysatorsysteme verwendet werden,
weist das Gemisch aus dem Cycloolefin-Monomer und dem auf Ethylen
basierenden funktionellen Copolymer eine gute Lagerfähigkeit
auf, die bis zu etwa 24 Stunden beträgt. Sollten längere Zeitspannen
wünschenswert
sein, wird das Katalysatorsystem nicht zu dem Gemisch gegeben, sondern
davon separat gehalten. Folglich wird an dem Zeitpunkt eines Durchführens der
Polymerisation der Cycloolefin-Monomere das Katalysatorsystem zu
dem Gemisch gegeben und in Masse polymerisiert. Ein bevorzugtes
Polymerisationsverfahren beinhaltet das vorstehend beschriebene
RIM-Verfahren.
-
Verfahren zum Nachweisen von
Signalen aus Proben
-
Erfindungsgemäß wird auch
ein Verfahren zum Nachweisen eines Signals bereitgestellt, umfassend ein
In-Kontakt-Bringen einer Probe mit einer Vorrichtung für spektroskopische
Messungen, umfassend: eine Schicht mit niedriger Fluoreszenz und
hoher Transmission, umfassend ein Cycloolefin-Copolymer, und eine Plattform,
um die Schicht zu halten, wobei die Plattform zum Nachweisen eines
Signals aus einer Probe ist und mit der Maßgabe, dass, wenn die Plattform
eine Mikrotiterplatte mit einer Grundfläche einer Standard-96-Well-Mikrotiterplatte
mit Mikrotiterwells ist, die Anzahl der Mikrotiterwells nicht 864
Mikrotiterwells übersteigen
wird, und Nachweisen eines Signals von der Probe. Vorzugsweise umfasst
das Nachweisen ein Nachweisen von Epifluoreszenz unterhalb der Multi-Well-Platte
oder Plattform. Der Nachweisschritt kann auch eine optische Anordnung
verwenden, die der Dichte und Anordnung von Wells in der Multi-Well-Platte
entspricht. Verschiedene Markierungen können in Tests, die die Erfindung
verwenden, verwendet werden. Oft wird es wünschenswert sein, Anbindungsstellen
in einer Multi-Well-Platte oder Plattform für eine Verwendung als Teil
des Testsystems bereitzustellen. Solche Markierungen können direkt
oder indirekt an die Polymeroberfläche angebunden sein. Unterschiedliche
spektroskopische Techniken können
erfindungsgemäß verwendet werden,
wie kolorimetrische, spektrophotometrische, lumineszierende und
Fluoreszenzverfahren. Nicht spektroskopische Verfahren, die auf
Strahlung basieren, können
verwendet werden, wie Brechungs- und Reflexionsverfahren.
-
Fluoreszenzmessungen
-
Es
wird anerkannt, dass unterschiedliche Arten von Fluoreszenzüberwachungssystemen
verwendet werden können,
um die Erfindung mit fluoreszierenden Sonden durchzuführen, wie
fluoreszierende Farbstoffe oder Substrate. Vorzugsweise werden Systeme
verwendet, die für
ein Screening mit hohem Durchsatz geeignet sind, z.B. Mikrotiterplatten
mit 96 Wells oder mehr. Verfahren zum Durchführen von Tests auf fluoreszierende
Materialien sind bekannt und in z.B. Lakowicz, J. R., Principles
of Fluorescence Spectroscopy, New York: Plenum Press (1983); Herman,
B., Resonance Energy Transfer Microscopy, in: Fluorescence Microscopy of
Living Cells in Culture, Part B, Methods in Cell Biology, Band 30,
Hrsg. Taylor, D. L. & Wang,
Y.-L., San Diego: Academic
Press (1989), S. 219–243;
Turro, N. J., Modern Molecular Photochemistry, Menlo Park: Benjamin/Cummings
Publishing Col, Inc. (1978), S. 296–361 und der Katalog von Molecular
Probes (1997), OR, USA, beschrieben.
-
Fluoreszenz
in einer Probe kann unter Verwendung eines hierin beschriebenen
oder für
Multi-Well-Platten bekannten Detektors gemessen werden. Im Allgemeinen
tritt Anregungsstrahlung von einer Anregungsquelle mit einer ersten
Wellenlange gegebenenfalls durch Anregungsoptiken. Die Anregungsoptiken bewirken,
dass die Anregungsstrahlung die Probe anregt. In Antwort darauf
emittieren fluoreszierende Sonden in der Probe Strahlung, die eine
Wellenlänge
aufweist, die von der Anregungswellenlänge unterschiedlich ist. Sammeloptiken
sammeln sodann die von der Probe emittierte Strahlung. Die Vorrichtung
kann ein Temperatursteuerungssystem beinhalten, um die Probe bei
einer spezifischen Temperatur zu halten, während sie gescannt wird. Gemäß einer
Ausführungsform
bewegt ein Verschiebetisch mit vielen Achsen (z.B. ein geeigneter X,
Y-Positionierer) eine Mikrotiterplatte, die eine Vielzahl von Proben
trägt,
um unterschiedliche Wells, die belichtet werden sollen, zu positionieren.
Der Verschiebetisch mit vielen Achsen, das Temperaturkontrollsystem, das
Autofokussierungsmerkmal und die Elektronik, die mit einer Bildgebung
und Datensammlung assoziiert sind, können durch einen geeignet programmierten
Digitalcomputer gesteuert werden. Der Computer kann auch die während des
Tests gesammelten Daten in ein anderes Format für eine Darstellung transformieren.
-
Vorzugsweise
wird FREI (Fluoreszenzresonanzenergietransfer) als ein Weg zum Überwachen
von Sonden in einer Probe (zellulär oder biochemisch) verwendet.
Der Grad an FREI kann durch ein jegliches spektrales oder Fluoreszenzlenbenszeitcharakteristikum
des angeregten Konstrukts bestimmt werden, z.B. durch Bestimmen
der Intensität
des Fluoreszenzsignals von dem Donor, der Intensität des Fluoreszenzsignals von
dem Akzeptor, dem Verhältnis
der Fluoreszenzamplituden nahe der Emissionsmaxima des Akzeptors
zu den Fluoreszenzamplituden nahe des Emissionsmaximums des Donors
oder der Lebenszeit des angeregten Zustands des Donors. Zum Beispiel
erhöht
eine Spaltung des Linkers die Fluoreszenzintensität von dem
Donor, erniedrigt die Fluoreszenzintensität von dem Akzeptor, vermindert
das Verhältnis
von Fluoreszenzamplituden von dem Akzeptor zu denen des Donors und
erhöht
die Lebenszeit des angeregten Zustands des Donors.
-
Vorzugsweise
werden Signaländerungen
als das Verhältnis
von Fluoreszenz bei zwei unterschiedlichen Emnissionswellenlängen bestimmt,
ein Verfahren, das als "Verhältnisbildung
(rationing)" bezeichnet
wird. Unterschiede in der absoluten Menge einer Probe (oder eines
Substrats), von Zellen, Anregungsintensität und Trübung oder anderen Hintergrundabsorptionen
zwischen adressierbaren Wells kann das Fluo reszenzsignal beeinflussen.
Daher ist das Verhältnis
der zwei Emissionsintensitäten
ein robusteres und bevorzugtes Maß einer Aktivität als die
Emissionsintensität
allein.
-
Ein
ratiometrisches Fluoreszenzsondensystem kann erfindungsgemäß verwendet
werden. Zum Beispiel weist das Reportersystem, das in der PCT-Veröffentlichung
WO 96/30540 (Tsien) beschrieben
ist, signifikante Vorteile gegenüber
bestehenden Reportern für
eine Genintegrationsanalyse auf, da es einen empfindlichen Nachweis
und eine Isolierung von sowohl exprimierenden als auch nicht exprimierenden
lebenden Einzelzellen erlaubt. Dieses Testsystem verwendet ein nicht
toxisches, nicht polares fluoreszierendes Substrat, das leicht beladen
und sodann intrazellulär
gefangen wird. Eine Spaltung des fluoreszierenden Substrats durch β-Lactamase
ergibt eine Verschiebung der Fluoreszenzemission, wie das Substrat
in das Produkt umgewandelt wird. Da das Auslesen des β-Lactamasereporters
ratiometrisch ist, ist es einzigartig unter den Reportergentests
in der Art, dass es Variablen wie die Menge an in die einzelnen
Zellen beladenem Substrat steuert. Das stabile, leicht nachgewiesene
intrazelluläre
Auslesen vereinfacht Testabläufe
durch Eliminieren des Bedarfs für
Waschschritte, was ein Screening mit Zellen unter Verwendung der
Erfindung vereinfacht.
-
Detektor
-
In
einer Ausführungsform
wird erfindungsgemäß ein Detektor
zum Überwachen
von spektroskopischen Ereignissen mit den Multi-Well-Platten oder
Plattformen bereitgestellt. Vorzugsweise ist der Detektor ein Fluoreszenzdetektor
und mehr bevorzugt von der Art, die für Epifluoreszenz verwendet
werden kann. Für
einige erfindungsgemäße Ausführungsformen,
insbesondere für
Platten mit 96, 192, 384 und 864 Wells pro Platte ist eine Reihe
von Detektoren erhältlich.
Solche Detektoren sind in der
US-PS
5,589,351 (Harootunian),
US-PS
5,355,215 (Schroeder) und in der PCT-Patentanmeldung
WO 93/13423 (Akong) beschrieben. Alternativ
dazu kann eine gesamte Platte unter Verwendung eines Imagers wie
eines Fluorimagers 595 von Molecular Dynamics "ausgelesen" werden. Für erfindungsgemäße Plattformanwendungen
können
herkömmliche
optische Plattenlesegeräte,
wie sie auf dem relevanten Gebiet bekannt sind, für eine spektroskopische
Analyse als auch zum Messen von gebrochener oder reflektierter Strahlung
angepasst werden.
-
Der
Detektor ist vorzugsweise für
Emissionsmessungen in dem Bereich von 400 bis 800 nm geeignet. Typischerweise
umfasst der Detektor ein Mittel zum Fluoreszenzanregen in dem Bereich
von 350 bis 800 nm. Der Detektor ist oft für viele unterschiedliche Anwendungsmodi
geeignet, die Anforderungen an einen Arzneimittelauffindungstest
vereinfachen. Diese Anwendungsmodi können beinhalten: Anregung bei
einer einzelnen Wellenlange mit einem Nachweis einer Emission bei
einer einzelnen Wellenlange, Anregung bei einer einzelnen Wellenlange,
Nachweis einer Emission bei zwei Wellenlängen, Anregung bei zwei sequentiellen
Wellenlängen
mit einem Nachweis einer Emission bei zwei Wellenlängen und
Verhältnismessungsbestimmung,
Anregung bei zwei sequentiellen Wellenlängen mit einem Nachweis einer
Emission bei vier Wellenlängen
und Verhältnismessungsbestimmung,
homogene zeitaufgelöste
Fluoreszenz mit Anregung bei einer einzelnen Wellenlänge und
Nachweis einer Emission bei einer einzelnen Wellenlange, homogene
zeitaufgelöste
Fluoreszenz mit Anregung bei einer einzelnen Wellenlänge und
Nachweis einer Emission bei zwei Wellenlängen und Verhältnisbestimmungsmessung,
homogene zeitaufgelöste
Fluoreszenz mit Anregung bei zwei sequentiellen Wellenlängen und
Nachweis einer Emission bei zwei Wellenlängen und Verhältnisbestimmungsmessung,
Anregung bei zwei sequentiellen Wellenlängen und Nachweis einer Emission
bei einer einzelnen Wellenlänge
mit Verhältnisbestimmungsmessung,
Lumineszenzmessung bei einer einzelnen Wellenlänge mit Lumineszenzmessung
bei zwei Wellenlängen,
Lumineszenzmessung bei zwei Wellenlängen mit einer Verhältnisbestimmung
und zeitaufgelöste
Fluoreszenzemission (intrinsische Farbstoffeigenschaften mit oder
ohne einem Bindungsereignis). Der Detektor funktioniert vorzugsweise
in dem Epifluoreszenzmodus, bei dem die bevorzugte Bestrahlung von
dem Boden der Platte erfolgt und die bevorzugte Sammlung auch von
dem Boden der Platte erfolgt. Der Detektor kann in allen der vorstehend
beschriebenen Modi mit einer Bodenansicht der Platte funktionieren.
-
Der
Verhältnismodus
des Detektors ermöglicht Änderungen
in Signalniveaus hinsichtlich relativer Signalniveaus, die beobachtet
werden sollen, ohne komplexe Kalibrierung. Der Verhältnismodus
des Detektors ist gegenüber
Unterschieden hinsichtlich der Mengen an isolierten Zielen, Zellen
oder Farbstoffbeladung in Zellen tolerant. Daher können Unterschiede
zwischen Wells hinsichtlich der Zellen und Farbstoffmengen vorhanden
sein, aber innerhalb eines einzelnen Wells können diese Unterschiede zu
einer relativen. Änderung der
Intensitäten
normalisiert sein. Ohne einen ratiometrischen Nachweis können absolute
Signalniveaus die kleinen Änderungen
innerhalb jedes Wells verdecken.
-
Die
Auswahl von verschiedenen Anwendungsmodi des Detektors basiert oft
auf der Art des durchzuführenden
Tests. Folglich ist der Detektor gewöhnlich mit zahlreichen Anwendungsmodi
ausgebildet, um Flexibilität
bei dem Nachweis bereitzustellen. Jeder Modus wird basierend auf
seiner Kompatibilität
mit einem spezifischen Satz an Fluoreszenzsonden und Reagenzien
ausgewählt.
Der Nachweis wird sodann maßgeschneidert,
um die Bedürfnisse
des Tests und der Sonde zu erfüllen.
-
Erfindungsgemäß wird auch
ein System für
spektroskopische Messungen bereitgestellt. Das System umfasst Reagenzien
für 1)
einen Test, 2) eine Vorrichtung, umfassend eine Schicht mit niedriger
Fluoreszenz und hoher Transmission, umfassend ein Cycloolefin-Copolymer,
und eine Plattform, um die Schicht zu halten. Das System kann ferner
einen Detektor umfassen.
-
BEISPIELE
-
Beispiel 1 Fluoreszenzeigenschaften von
Cycloolefinen im Vergleich zu Glas und anderen polymerischen Materialien
-
Um
die Fluoreszenzeigenschaften von verschiedenen ausgewählten Folien
zu untersuchen, wurden unterschiedliche polymerische Folien hinsichtlich
Fluoreszenzemission bei vorbestimmten Anregungswellenlängen getestet
und mit zwei Arten von Quarzglasplatten (Standard) verglichen. Diese
Experimente erfolgten unter Verwendung eines SPEX-Fluorolog 111-Fluorimeters
mit Anregungswellenlängen
zwischen 315 und 425 nm. Die Folien und Glasmaterialien wurden auf
einer Halterung angeordnet. Die Probe wurde so positioniert, dass
der Anregungsstrahl senkrecht zu der Probenoberfläche war.
Die Fluoreszenzemission von der Probe wurde von einem Winkel bei
etwa 12,5 Grad gesammelt. Die Fluoreszenzemission des Materials
wurde von einem Spiegel und auf einen Monochromator reflektiert.
Die Emissionsstrahlung wurde durch das monochromatische Gitter ausgewählt. und
durch die Fotomultiplierröhre
des Instruments nachgewiesen. Das SPEX-Fluorolog 111-Fluorimeter
verwendet Raman-Strahlungslinien von Wasser zur Kalibrierung und
korrigiert den Hintergrund der Instrumentsmessungen von Tag zu Tag.
Diese Hintergrundkorrektur erfolgte jeden Tag vor einer Instrumentenverwendung
für eine
Kalibrierung. Die Kalibrierungsdatei wird mit den Messungen, die
an diesem Tag erfolgten, gespeichert und sodann können die
nachfolgenden Messungen mit dem SPEX-Instrument direkt verglichen
und hinsichtlich einer Instrumentenfluktuation verbessert werden.
-
Die
getesteten Materialien waren 1) Quarzglasplatten (Corning Glass
Works Deckgläser
Nr. 1 (Katalog-Nr. 2935/583331) 2) Polystyrolfolien (ps1, ps2 (von
Plastic Suppliers) und ps3 (von Dow Chemical Company), 3) Polycarbonatfolien
(pc1 (von General Electric Corporation) und pc2 (von Plastic Suppliers),
4) nicht aromatische Alkylpolymere (nap, erhalten von Mobil Oil
Company), 5) Cycloolefin-Copolymer-Folie (coc, erhalten von Hoechst,
Topas) und 6) Aclar (ein Fluorcarbonmaterial von Allied Signal).
-
Tabelle
2 zeigt die normalisierten Fluoreszenzemissionsdaten über 400
bis 650 nm bei drei unterschiedlichen Anregungswellenlängen. Die
Daten sind auf Quarzglas normalisiert und hinsichtlich einer Instrumentenfluktuation
korrigiert. Polystyrol, das oft als eine Komponente von Multi-Well-Platten
verwendet wird (vgl. Tabelle 1), erzeugte hohe Hintergrundfluoreszenzniveaus,
was mit seiner aromatischen Struktur konsistent ist. Überraschenderweise
war Polycarbonat, das oft ein biokompatibles Polymer ist, im Allgemeinen
besser als Polystyrol, insbesondere bei längeren Wellenlängen. Überraschenderweise
war das nicht aromatische Alkylpolymer im Allgemeinen das zweitbeste
Polymer über
den gesamten Bereich von getesteten Wellenlängen. Auch überraschenderweise erzeugte
das Cycloolefin-Copolymer die besten Ergebnisse und reichte nahe an
die extrem niedrigen Fluoreszenzniveaus von Quarzglas heran. Tabelle 2
| Material |
| Ex
= 315 | Em
= 400 | Em
= 425 | Em
= 450 | Em
= 475 | Em
= 500 | Em
= 550 | Em
= 600 | Em
= 650 |
| Glas | 0.22513 | 0.25824 | 0.26817 | 0.30459 | 0.33107 | 0.38735 | 0.51316 | |
| pc1-5m | 3.31071 | 2.10230 | 2.01953 | 1.78778 | 1.41036 | 0.66876 | 0.60588 | |
| pc2-5m | 11.04128 | 7.04943 | 6.11517 | 5.18091 | 3.79367 | 1.70432 | 1.05317 | |
| ps1-2m | 2.45986 | 1.98447 | 1.93714 | 1.78340 | 1.52374 | 1.02494 | 1,18893 | |
| ps2-2m | 2.20826 | 1.72697 | 1.69866 | 1.64204 | 1.48633 | 1.07582 | 1.18906 | |
| ps3-2m | 4.55807 | 3.29823 | 3.00096 | 2.72352 | 2.34132 | 1.57409 | 1.98743 | |
| Nap-1.5m | 1.01919 | 0.75307 | 0.62850 | 0.52942 | 0.50110 | 0.56622 | 1.12111 | |
| Nap-1.5m | 0.52658 | 0.48978 | 0.42466 | 0.37654 | 0.38220 | 0.50960 | 1.00787 | |
| Coc-klar | 0.40485 | 0.40485 | 0.34256 | 0.31142 | 0.31142 | 0.41817 | 0.83234 | |
| Aclar-75m | 0.08473 | 0.08875 | 0.07664 | 0.07368 | 0.07503 | 0.09701 | 0.22497 | |
| Aclar-3m | 0.27245 | 0.28586 | 0.25367 | 0.26522 | 0.29309 | 0.44479 | 1.03199 | |
| |
| Ex
= 350 | Em
= 400 | Em
= 425 | Em
= 450 | Em
= 475 | Em
= 500 | Em
= 550 | Em
= 650 | |
| Glas | 0.30790 | 0.20526 | 0.23837 | 0.17547 | 0.16222 | 0.17878 | 0.25492 | |
| pc1-5m | 0.77802 | 0.62572 | 0.60586 | 0.50323 | 0.42708 | 0.31452 | 0.33769 | |
| pc2-5m | 3.96354 | 2.74616 | 2.20826 | 1.61373 | 1.24568 | 0.75024 | 0.62264 | |
| ps1-2m | 1.28801 | 1.44858 | 2.22754 | 2.06013 | 1.78340 | 1.06594 | 0.84387 | |
| ps2-2m | 1.01919 | 1.34477 | 1.85437 | 1.84021 | 1.64204 | 1.08997 | 0.89180 | |
| ps3-2m | 2.13182 | 2.68388 | 3.47092 | 3.14252 | 2.68388 | 1.57692 | 1.29381 | |
| Nap-1.5m | 0.95408 | 0.80120 | 0.81536 | 0.59170 | 0.53508 | 0.58321 | 0.79554 | |
| Nap-1.5m | 0.53791 | 0.48695 | 0.55206 | 0.39918 | 0.39918 | 0.48129 | 0.69079 | |
| Coc-klar | 0.42466 | 0.38220 | 0.43033 | 0.31142 | 0.31142 | 0.38503 | 0.56056 | |
| Aclar-75m | 0.08889 | 0.08710 | 0.08689 | 0.07327 | 0.07224 | 0.08050 | 0.10733 | |
| Aclar-3m | 0.24045 | 0.23323 | 0.24974 | 0.21981 | 0.23375 | 0.31373 | 0.43756 | |
| |
| Ex
= 400 | Em
= 400 | Em
= 425 | Em
= 450 | Em
= 475 | Em
= 500 | Em
= 550 | Em
= 600 | Em
= 650 |
| Glas | | | 0.29134 | 0.21520 | 0.25492 | 0.18540 | 0.26817 | 0.43039 |
| pc1-5m | | | 0.38073 | 0.30459 | 0.32114 | 0.22844 | 0.31783 | 0.48667 |
| pc2-5m | | | 0.65115 | 0.59736 | 0.62284 | 0.43033 | 0.53791 | 0.77855 |
| ps1-2m | | | 0.55347 | 0.55347 | 0.67646 | 0.43731 | 0.61155 | 0.91561 |
| ps2-2m | | | 0.49344 | 0.50960 | 0.60869 | 0.46996 | 0.65115 | 1.00221 |
| ps3-2m | | | 0.75873 | 0.80120 | 0.97107 | 0.63417 | 0.86065 | 1.24568 |
| Nap-1.5m | | | 0.57754 | 0.59170 | 0.67663 | 0.50110 | 0.72476 | 1.08431 |
| Nap-1.5m | | | 0.41900 | 0.39635 | 0.50394 | 0.42466 | 0.66248 | 1.05883 |
| Coc-klar | | | 0.32558 | 0.33407 | 0.41900 | 0.37087 | 0.55489 | 0.87198 |
| Aclar-.75m | | | 0.06295 | 0.06295 | 0.07121 | 0.06966 | 0.10010 | 0.15686 |
| Allar-3m | | | 0.14138 | 0.14654 | 0.17750 | 0.20433 | 0.32405 | 0.47988 |
-
Beispiel 2 Fluoreszenzeigenschaften von
Cycloolefinen im Vergleich zu Glas und anderen polymerischen Materialien
-
Um
weiter Fluoreszenzeigenschaften von verschiedenen ausgewählten Folien
zu untersuchen, wurden unterschiedliche polymerische Folien hinsichtlich
Fluoreszenzemission bei vorbestimmten Anregungswellenlängen getestet
und mit zwei Arten von Quarzglasplatten (Standard) verglichen. Diese
Experimente erfolgten, um biochemische oder auf Zellen basierte
Tests zu simulieren, die wässrige
Medien einbe ziehen. Daher wurden Folien auf horizontale Plastikhalterungen
angebracht, um einen Zusatz eines Tropfens von wässrigem Medium zu ermöglichen.
3 ml Wasser wurden auf die Folie verteilt und die Fluoreszenz unter
Verwendung eines Invert-Fluoreszenzmikroskops
von Zeiss aufgezeichnet. Hintergrund ohne eine Folie wurde aufgezeichnet und
von Signalen in Gegenwart einer Folie subtrahiert.
-
Die
getesteten Materialien waren 1) Quarzglasplatten (Fisher-Deckgläschen Nr.
1 (Fisher Katalog-Nr. 12-542-B (1996)), 2) Polystyrolfolien (ps1,
ps2 (von Plastic Suppliers) und ps3 (von Dow Chemical Company)), 3)
Polycarbonatfolien (pc1 (von General Electric Corporation) und pc2
(von Plastic Suppliers)), 4) nicht aromatische Alkylpolymere (erhalten
von Mobil), 5) Cycloolefin-Copolymer-Folie (coc, erhalten von Hoechst,
Topas), 6) Aclar (ein Fluorcarbonmaterial von Allied Signal) und
7) Syran Wrap.
-
Tabelle
3 zeigt die normalisierten Fluoreszenzemissionsdaten bei 460 nm,
bei 350 nm und 405 nm (Anregungswellenlängen). Die Daten sind auf Quarzglas
normalisiert. Polystyrol, das oft als eine Komponente von Multi-Well-Platten
verwendet wird (vgl. Tabelle 1), erzeugte hohe Hintergrundfluoreszenzniveaus,
was mit seiner aromatischen Struktur konsistent ist, wie in Beispiel
1. Im Gegensatz zu Beispiel 1 war Polycarbonat, das oft ein biokompatibles
Polymer ist, schlechter als Polystyrol, insbesondere bei längeren Wellenlängen. Allgemein
konsistent mit Beispiel 1 war das nicht aromatische Alkylpolymer
im Allgemeinen besser als Polystyrol über den Bereich von getesteten
Wellenlängen.
Allgemein konsistent mit Beispiel 1 erzeugte das Cycloolefin-Copolymer
die besten Ergebnisse und übertraf überraschenderweise
die extrem niedrigen Fluoreszenzniveaus von Quarzglas. Aclar-Folie
erzeugte auch überraschenderweise
entweder niedrige oder extrem niedrige Fluoreszenzwerte relativ
zu Quarzglas. Tabelle 3
| Material | 350ex/460em | Rang | Material
4 | 05ex/460em | Rang |
| Fisher
#1 Deckgläschen | 1.02 | 1 | Fisher
#1 Deckgläschen | 1.03 | 1 |
| Polycarbonat
5 mil | 6.91 | 6 | Polycarbonat
5 mil | 19.79 | 6 |
| Polystyrol
2 mil | 3.57 | 5 | Polystyrol
2 mil | 3.36 | 4 |
| NAP
1.5 ml | 2.06 | 3 | NAP
1.5 ml | 5.76 | 3 |
| NAP.1.5
ml | 1.33 | 3 | NAP
1.5 ml | 3.51 | 3 |
| coc#2
2 mil | 1.58 | 2 | coc#2
2 mil | 2.60 | 2 |
| coc#1
2 mil | 1.22 | 2 | coc#1
2 mil | 1.59 | 2 |
| Aclarprobe
(> 2 Jahre alt) | 2.62 | 4 | Aclarprobe
(> 2 Jahre alt) | 9.08 | 5 |
| Material | 350ex/460em | Rang | Material | 405ex/460em | Rang |
| Fisher
#1 Deckgläschen | 1.00 | 5 | Fisher
#1 Deckgläschen | 1.00 | 1 |
| Polycarbonat
5 mil | 5.15 | 9 | Polycarbonat
5 mil | 17.75 | 8 |
| Polystyrol
1 mil | 2.01 | 7 | Polystyrol
1 mil | 2.53 | 7 |
| coc#2
A 2 mil | 1.09 | 6 | coc#2
A 2 mil | 1.71 | 4 |
| coc#2
B 2 mil | 0.89 | 4 | coc#2
B 2 mil | 1.65 | 3 |
| coc#1
2 mil | 0.86 | 3 | coc#1
2 mil | 1.47 | 2 |
| Aclar
3 mil (< 1 Jahr
alt) | 0.71 | 1 | Aclar
3 mil (< 1 Jahr
alt) | 2.34 | 6 |
| Aclar0,75
mil (< 1 Jahralt) | 0.64 | 1 | Aclar0,75
mil (< 1 Jahr alt) | 2.14 | 5 |
| Syran
Wrap | 4.18 | 8 | Syran
Wrap | 22.12 | 9 |
-
Beispiel 3 Cycloolefine sind nicht cytotoxisch
für kultivierte
Zellen
-
Die
Cytotoxizität
von Cycloolefin wurde dadurch evaluiert, dass Zellen in Cycloolefin-Multi-Well-Platten 60
Stunden bei 37°C
inkubiert wurden. 1,8 μl-Volumina
an Medium mit etwa 90 Zellen aus den Ovarien chinesischer Hamster
(CHO) wurden in Cycloolefin-Multi-Well-Platten unter Verwendung
einer spitz zulaufenden Pipette gegeben. Eine Glasabdeckung wurde über die
Wells platziert, um eine Verdampfung zu verhindern. Zellen wurden
in einem Inkubator bei 5 % CO2, 37°C, 90 % RH
60 Stunden inkubiert. Zellen wurden sodann hinsichtlich ihrer Lebensfähigkeit
dadurch getestet, dass sie mit dem Vitalfarbstoff Calcein beladen
wurden. Die CHO-Zellen
wurden durch Inkubation in einer Lösung mit 4 μM Calcein/AM 30 Minuten bei
Raumtemperatur beladen. Zellen wurden unter Verwendung von sowohl
Phasenkontrastmikroskopie zur Bestimmung der Gesamtzellzahl als
auch Fluoreszenzmikroskopie zur Bestimmung der Anzahl von lebenden
Zellen untersucht. Etwa mehr als 95 % der Zellen lebten, wie durch
eine Beladung mit Calceinfarbstoff angezeigt (etwa 200 Zellen pro
Well).
-
Beispiel 4 Cycloolefine sind nicht cytotoxisch
für kultivierte
Zellen und können
für Arzneimittelscreeningtests verwendet
werden
-
Um
die cytotoxischen Eigenschaften von Cycloolefinen zu untersuchen,
wurde eine Cycloolefinfolie unter Verwendung eines Tests für Zelllebensfähigkeit
getestet. CCF2, ein Vitalfarbstoff, wie in der PCT-Veröffentlichung
WO 96/30540 (Tsien) beschrieben,
diffundiert in Zellen und wird durch lebende Zellen eingeschlossen,
die eine Esteraseaktivität
aufweisen, die Estergruppen an den Molekülen spalten, was zu einem negativ geladenen
Molekül
führt,
das in der Zelle gefangen ist. Eingefangener Farbstoff erscheint
grün innerhalb
von lebenden Zellen. CCF2 wurde mit Jurkat-Zellen eine Stunde in
einem 1 Mikroliter-Well mit schwarzen Wanden und einem Cycloolefinboden
inkubiert und die Fluoreszenz wurde geeigneterweise überwacht.
Diese Jurkat-Zellen exprimierten konstitutiv β-Lactamase. Zellen wurden 60
Stunden unter den Bedingungen von Beispiel 3 kultiviert. Nach 60
Stunden wurde die β-Lactamase-Aktivität unter
Verwendung von CCF2 gemessen. Zellen erschienen blau, was anzeigte,
dass β-Lactamase
tatsächlich
in diesen Zellen aktiv war, die normalerweise keine β-Lactamase
enthalten. Diese Ergebnisse zeigen, dass Cycloolefine mit empfindlichen
Fluoreszenztests verwendet werden können, da die Folien niedrige
Fluoreszenzhintergründe
ergeben. Dies ist besonders vorteilhaft, da es kleinere Testvolumina
(z.B. 2 μl
oder weniger) und die Messung von schwächeren Signalen (z.B. von weniger
Zellen oder weniger isolierten biochemischen Zielen) ermöglicht.
-
Veröffentlichungen
-
Alle
Veröffentlichungen,
einschließlich
Patentdokumenten und wissenschaftlicher Artikel, auf die in dieser
Anmeldung Bezug genommen wird, sind durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit
für alle
Zwecke zu dem gleichen Maß eingeschlossen,
als ob jede einzelne Veröffentlichung
einzeln durch Bezugnahme eingeschlossen wäre.
-
Alle Überschriften
dienen dem Komfort des Lesers und sollten nicht verwendet werden,
um die Bedeutung des Texts, der der Überschrift folgt, zu begrenzen,
wenn nicht so spezifiziert.