DE10032730A1

DE10032730A1 - Trägerplatte und Verfahren zur Durchführung funktioneller Tests

Info

Publication number: DE10032730A1
Application number: DE10032730A
Authority: DE
Inventors: Thomas Joos; Dieter Stoll; Hansjuergen Volkmer; Hugo Haemmerle; Manfred Schmolz
Original assignee: NMI Naturwissenschaftliches und Medizinisches Institut
Current assignee: NMI Naturwissenschaftliches und Medizinisches Institut
Priority date: 2000-07-05
Filing date: 2000-07-05
Publication date: 2002-01-24
Also published as: AU2001281957A1; EP1297339A2; US20040018507A1; WO2002002226A2; WO2002002226A3

Abstract

Eine Trägerplatte (10) zur Durchführung funktioneller Tests an biologischen Zellen (23) ist mit einem Array von Meßpunkten (11) versehen, an denen die Zellen (23) immobilisiert werden, wobei die Meßpunkte (11) durch Bereiche (12) der Trägerplatte (10) voneinander getrennt sind, an denen die Zellen nicht immobilisiert werden können. An den Meßpunkten (11) sind Fängermoleküle (19) immobilisiert, an die die Zellen (23) binden können (Fig. 2). Bei einem Verfahren zur Durchführung funktioneller Tests an biologischen Zellen (23) werden die Zellen (23) auf einer Trägerplatte (10) mit einem Array von Meßpunkten (11) ausgebracht, mit zumindest einem Liganden inkubiert und mit zumindest einer Testsubstanz (22) stimuliert. Die Liganden werden vor dem Ausbringen der Zellen (23) an Meßpunkten (11) immobilisiert, die auf einem im wesentlichen planaren Abschnitt (17) der Trägerplatte (10) angeordnet sind, wobei die Zellen (23) auf den planaren Abschnitt (17) der Trägerplatte (10) ausgebracht werden. Abschließend erfolgt eine ortsaufgelöste Erfassung von solchen Zelleigenschaften, die über die Co-Stimulation durch Ligand und Testsubstanz beeinflußbar sind (Fig. 2).

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Trägerplatte zur Durch führung funktioneller Tests an biologischen Zellen, mit einem Array von Meßpunkten, an denen die Zellen interagieren und bin den können, wobei die Meßpunkte durch Bereiche der Trägerplatte voneinander getrennt sind, an denen die Zellen nicht immobili siert werden können.

Eine derartige Trägerplatte ist aus der US 5,989,835 bekannt.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Durchführung funktioneller Tests an biologischen Zellen, mit den Schritten:
Ausbringen der Zellen auf einer Trägerplatte mit einem Array von Meßpunkten, an denen die ausgebrachten Zellen mit zumindest einem Liganden interagieren,
Stimulieren der Zellen mit zumindest einer Testsubstanz, und
Ortsaufgelöste Erfassung von solchen Zelleigenschaften, die über die Co-Stimulation durch Liganden und Testsubstanz beein flußbar sind.

Derartige Verfahren sind allgemein aus dem Stand der Technik bekannt, sie werden z. B. für Pharmascreening eingesetzt.

Die bekannten Verfahren werden in sogenannten Mikrotiter- Platten durchgeführt, bei denen es sich um kleine Zellkulturge fäße mit normierten, rechteckigen oder runden Abmaßen handelt. Die Zellkulturgefäßen weisen in Reihen und Spalten angeordnete Kavitäten (wells) auf, in die die Liganden, die Zellen und die Testsubstanzen einzeln hineinpipettiert werden müssen. Nach er folgter Inkubation erfolgt eine Analyse des Testergebnisses, indem die Mikrotiter-Platte entweder einzeln oder Kavität für Kavität analysiert wird. Dabei kann u. a. sowohl im Durchlicht- als auch im Auflichtverfahren gemessen werden, wobei als Meßpa rameter z. B. die optische Dichte oder die Fluoreszenz eines Re porterkonstruktes genommen wird.

Auf diese Weise kann die Reaktion von Zellen auf bestimmte pharmazeutische Präparate gemessen werden, wobei die Zellen da bei zusätzlich durch bestimmte Liganden stimuliert werden kön nen.

Bei dem bekannten Verfahren ist vor allem von Nachteil, daß es sehr zeitaufwendig ist und große Mengen an Substanzen erfor dert.

Andererseits ist bei dem bekannten Verfahren von Vorteil, daß es zwischen den einzelnen Kavitäten zu keinem Übersprechen kommt, denn die einzelnen Testlösungen sind durch die Stege zwischen den einzelnen Kavitäten gegeneinander isoliert.

Insbesondere für die Durchführung einer Vielzahl von Messungen mit Zellen, die z. B. aus einer Biopsie stammen und daher nicht in beliebiger Anzahl zur Verfügung stehen, ist das bekannte Verfahren nicht geeignet.

Um die eingesetzte Substanzmenge zu reduzieren, beschreibt die eingangs erwähnte US 5,989,835 die Verwendung einer sogenannten Mikroplatte von 20 × 30 mm Größe und mit Meßpunkten von 100 bis 200 µm Durchmesser und 500 µm Mittenabstand. Die Mikroplatten bestehen aus koplanaren Schichten aus Materialien, an die die zu untersuchenden Zellen adhärieren. Auf diesen Schichten ist ein Muster von weiteren Materialien angebracht, an die die Zel len nicht adhärieren. Der genaue Aufbau dieser Mikroplatten ist in diesem Dokument nicht beschrieben, es wird lediglich er wähnt, daß die Mikroplatten auch eine dreidimensionale Oberflä che mit einem entsprechenden Muster aufweisen können, also im wesentlich Mikrotiter-Platten mit verkleinertem Abmaßen sind.

Das verglichen mit den Mikrotiter-Platten kleinere Format führt dazu, daß die Menge an eingesetzten Substanzen minimiert und die Lagerung sowie Handhabung während der Versuche erleichtert wird. Ferner ist eine bessere optische Auflösung erreichbar, wenn die Mikroplatte als Ganzes mit einer CCD-Kamera optisch vermessen wird.

Diese Mikroplatten werden gemäß dieser Druckschrift in einem automatisierten Verfahren für die Analyse von fluoreszenzmar kierten Zellen eingesetzt, deren Reaktion auf verschiedene Sub stanzen z. B. im Rahmen der Pharmakaforschung getestet werden soll.

Die adhärenten Zellen werden dazu mit einer oder mehreren Sub stanzen behandelt und nach der Inkubation an jedem Meßpunkt mit einem Fluoreszenzmikroskop bildmäßig erfaßt. Die optischen Da ten werden dann digitalisiert und daraufhin ausgewertet, welche Wirkung die Substanz auf die getestete biologische Funktion hat.

Zwar erwähnt das genannte Dokument die Anordnung von Meßpunkten auf koplanaren Schichten, in den Ausführungsbeispielen werden jedoch Mikrotiter-Platten mit verkleinertem Format eingesetzt. Diese Mikroplatten weisen zwar den genannten Vorteil bei der Substanzeinsparung und Handhabung auf, die sehr kleinen Kavitä ten bringen jedoch auch Nachteile mit sich.

Nach Erkenntnis der Erfinder der vorliegenden Anmeldung erhöhen sich bei immer kleiner werdenden Kavitäten zum einen die Ober flächenspannungen, wodurch auf die untersuchten Zellen ein gro ßer Streß ausgeübt wird. Zum anderen ist es schwierig bis unmöglich, in kleine Kavitäten von 100 bis 200 µm Durchmesser noch eine homogene Verteilung von Zellen einzubringen, so daß im Gegensatz zu der Aussage in diesem Dokument die Handhabung insbesondere beim Pipettieren erheblich erschwert wird.

Vor diesem Hintergrund ist es Aufgabe der vorliegenden Erfin dung, eine Trägerplatte sowie ein Verfahren der eingangs ge nannten Art bereitzustellen, bei der/dem die oben genannten Nachteile vermieden werden. Insbesondere soll es möglich sein, funktionelle Messungen an biologischen Zellen durchzuführen, ohne daß große Mengen an Substanzen eingesetzt werden müssen. Darüber hinaus sollen eine Vielzahl von unterschiedlichen Mes sungen und Tests durchführbar sein, ohne den Handhabungsaufwand zu erhöhen.

Bei der eingangs genannten Trägerplatte wird diese Aufgabe er findungsgemäß dadurch gelöst, daß an den Meßpunkten Fängermole küle immobilisiert sind, an die die Zellen mittels ihrer Zelloberflächenmoleküle binden können.

Bei dem eingangs genannten Verfahren wird diese Aufgabe erfin dungsgemäß dadurch gelöst, daß die Liganden vor dem Ausbringen der Zellen an Meßpunkten immobilisiert werden, die auf einem im wesentlichen planaren Abschnitt der Trägerplatte angeordnet sind, und daß die Zellen auf den planaren Abschnitt der Träger platte aufgebracht werden.

Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird auf diese Wei se vollkommen gelöst.

Durch die Immobilisierung der zu untersuchenden biologischen Zellen über ihrerseits immobilisierte Fängermoleküle können mit dem neuen Verfahren sowie der neuen Trägerplatte nicht nur ad härente Zellen, sondern auch nicht adhärente Zellen wie z. B. T-Zellen untersucht werden, die über Oberflächenrezeptoren mit tels Fängermolekülen immobilisiert werden können.

Die Handhabung wird dadurch deutlich erleichtert, daß die Zel len nicht mehr nacheinander auf die Meßpunkte aufgebracht wer den müssen, sondern daß sie lediglich auf die Trägerplatte auf gegeben werden müssen, die z. B. als Bodenplatte eines Zellkul turgefäßes ausgebildet sein kann. Auf diese Weise ist lediglich ein einziger Pipettierschritt erforderlich, um sämtliche Meß punkte eines Arrays mit Zellen zu versorgen.

Die Meßpunkte befinden sich jetzt in einer großen Kavität, so daß das aus dem Stand der Technik bekannte Problem der Oberflä chenspannung beseitigt ist, wobei andererseits auch eine homo gene Verteilung der Zellen in dieser großen Kavität leicht er reichbar ist, ohne daß die Zellen einem mechanischen Streß aus gesetzt werden müssen.

An den Testpunkten können jetzt identische oder unterschiedli che Fängermoleküle sowie identische oder unterschiedliche Test substanzen immobilisiert werden.

Auf diese Weise ist es z. B. möglich, ein Array von Meßpunkten bereitzustellen, mit dem an identischen Zellen zeitgleich die unterschiedlichsten Messungen durchgeführt werden können. Dabei wird die Co-Stimulation durch die Fängermoleküle, die die Li ganden aufweisen, sowie die Testsubstanzen erfaßt.

Ferner ist es auch möglich, die Testsubstanzen in Lösung zuzu geben, sie also nicht an den Meßpunkten zu immobilisieren.

Es ist beispielsweise möglich, aus einer nicht homogenen Zell suspension unterschiedliche Zellen über zellspezifische Fänger moleküle an einzelne Meßpunkte zu binden. Es ist z. B. möglich, das Neuritenwachstum in An- und Abwesenheit von Integrinspezi fischen Antikörpern zu messen oder die Cytokin-Sekretion von T- Zellen zu erfassen.

Im Rahmen eines Allergietestes ist es auch möglich, bestimmte Allergene auf den Meßpunkten zu immobilisieren und Vollblut oder Zellfraktionen als Zellsuspension zu verwenden, um zu überprüfen, ob das Individuum, von dem das Vollblut stammt, auf die Allergene reagiert.

Wenn die Reaktion einer bestimmten Zellinie auf eine bestimmte Testsubstanz überprüft werden soll, werden unterschiedliche Fängermoleküle an den Meßpunkten immobilisiert, um die Reaktion auf die Testsubstanz bei unterschiedlicher Interaktion mit der Umgebung testen zu können.

Selbstverständlich muß die Anordnung der verschiedenen Fänger moleküle und/oder Testsubstanzen in dem Array bekannt sein. Hierzu wird das Array mit konventionellen Geräten für Kontakt printing oder Inkjettechnologie hergestellt, die die Erzeugung von Meßpunkten mit sehr kleinen Durchmessern und sehr geringen Randabständen zulassen.

In diesem Zusammenhang beschreibt die US 5,985,551 die Herstel lung eines Arrays von funktionalisierten Bindungsstellen auf einer Trägeroberfläche. Dabei wird auf einer kovalent gebunde nen Schicht von inertem Siloxam ein Array von 10 bis 10⁴ Stel len/Quadratzentimeter definiert, an denen die kovalent gebunde ne Schicht nicht vorhanden ist. Die Stellen haben einen Durch messer von 50-2000 µm, wobei sich chemische Reaktionslösungen in Folge von Oberflächenspannungen an diesen Meßstellen lokali sieren.

Als Anwendung werden Oligonucleotid-Sonden-Arrays sowie Peptid- Arrays beschrieben, mit denen verschiedene Analysen durchführ bar sind. Das Übersprechen wird hier dadurch verhindert, daß jede Meßstelle von einem eigenen, hydrophoben Wall umgeben ist.

Bei der neuen Trägerplatte ist in diesem Zusammenhang bevor zugt, wenn die Meßpunkte einen Durchmesser zwischen etwa 200 µm und etwa 4000 µm aufweisen, wobei die Meßpunkte vorzugsweise einen Randabstand zwischen etwa 300 µm und etwa 700 µm aufwei sen.

Auf diese Weise lassen sich sehr kompakte Mikroarrays mit sehr kleinen Meßpunkten erzeugen, die jedoch auf einem im wesentli chen planaren Abschnitt der Trägerplatte angeordnet sind, so daß sie keine Kavitäten bilden, sondern in einer großen Kavität liegen.

Auf diese Weise wird zum einen der Einsatz der Substanzen mini miert, zum anderen aber werden die Nachteile vermieden, die mit kleinen Kavitäten verbunden sind und das Handling beim Pipet tieren sowie die Oberflächenspannungen und den Streß für die Zellen betreffen.

Dabei kann jeder Assay, der ortsaufgelöst über Zelleigenschaf ten Auskunft gibt, zum Auslesen eingesetzt werden. Es können z. B. GFP-Reporterassays, morphometrische Analysen (Neuriten wachstum, Differenzierung, Proliferation), Cytoskelettverände rungen, Bewegungen etc. beobachtet werden.

Ferner können Funktionstests für Zellkulturzellen nach Gen transfer implementiert werden, um zu untersuchen, welches Gen produkt die Morphologie verändert. Darüber hinaus ist ein Adhä sions- und Proliferationsscreening, z. B. zur Charakterisierung von Krebszellen, möglich. Ferner kann das Potential zur Me tastasierung abgeschätzt und der Differenzierungszustand be stimmt werden. Neben der Diagnostik und dem Krebszellscreening können auch Substanzen getestet werden oder die Beeinflussung von second messenger Systemen über ECM-Rezeptoren untersucht werden.

Insgesamt bietet das neue Verfahren, besonders dann wenn es mit der neuen Trägerplatte durchgeführt wird, eine unbegrenzte Mög lichkeit für funktionelle Untersuchungen an biologischen Zellen mit geringem Substanzeinsatz und einfachem Handling.

Dabei ist es bevorzugt, wenn die Fängermoleküle ausgewählt sind aus der Gruppe: Proteine, wie z. B. Komponenten extrazellulärer Matrixproteine (Fibronectin, Laminin, Collagen, Zelloberflä chenproteine, Rezeptoren, Liganden), Poly-Lysin, Peptide aus Lamininsequenzen, Kontrollpeptide, Kontrollproteine, Peptidomi metica, Polymere, Lektine, Antikörper, Antigene und Allergene.

Die Testsubstanzen sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe: Pharmazeutische Präparate, Antikörper, Substanzen, die die Zelleigenschaften beeinflussen, Botenstoffe, Wachstumsfaktoren, Antigene.

Besonders bevorzugt ist es, wenn die Trägerplatte aus einem Ma terial gefertigt ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe: Glas und Kunststoff, insbesondere Polystyrol.

Bei dieser Maßnahme ist von Vorteil, daß sich auf einfache Wei se auch Durchlichtmessungen durchführen lassen, wobei sich auf Glas und Kunststoff in bevorzugter Weise funktionalisierte Oberflächen vorsehen lassen, auf denen die Fängermoleküle und/oder Testsubstanzen leicht immobilisiert werden können. Ferner ist es auf einfache Weise möglich, die funktionalisier ten Oberflächen in den Bereichen zwischen den Meßpunkten zu blocken, so daß dort keine Zellen adhärieren können.

Die funktionalisierte Oberfläche ist dabei ausgewählt aus der Gruppe: Aldehydaktivierte Glasoberfläche, aminosilanisierte Glasoberfläche, Poly-D-Lysin beschichtete Glasoberfläche.

Besonders ist es bevorzugt, wenn der die Meßpunkte aufweisende planare Abschnitt nach Art eines Zapfens erhaben ausgeführt ist, wobei vorzugsweise mehrere erhabene, im wesentlichen planare Abschnitte vorgesehen sind.

Auf diese Weise ist es möglich, die Trägerplatte nach dem Inku bieren der aufgetragenen Zellen mit dem planaren Abschnitt nach unten von oben in ein Gefäß mit einer die Testsubstanz enthal tenden Lösung einzutauchen, um die Zellen zu stimulieren.

Auf diese Weise wird die Möglichkeit des Übersprechens weiter reduziert, denn nicht immobilisierte/adhärente Zellen gehen durch die Schwerkraftwirkung von der Trägerplatte ab, so daß nach der Inkubation mit der Testlösung und der Entnahme der Trägerplatte auf den Meßpunkten nur immobilisierte Zellen vor handen sind, die durch Ligand und Testsubstanz co-stimuliert wurden.

Weiter ist es bevorzugt, wenn nicht immobilisierte Zellen vor dem Erfassen der Zelleigenschaften durch Waschen von der Trä gerplatte entfernt werden.

Auch auf diese Weise kann verhindert werden, daß Zellen sozusa gen von einem zum anderen Meßpunkt wandern und auf diese Weise ein falsches Ergebnis vortäuschen.

Die neuen Trägerplatten können für bestimmte Assays vorbereitet und als solche kommerziell vertrieben werden. Dabei ist es mög lich, Trägerplatten für Allergietests, Krebszellscreening etc. vorzubereiten, indem die Trägerplatten mit bestimmten Fängermo lekülen versehen werden, wobei ferner zusammen mit den Fänger molekülen auch Testsubstanzen auf den Meßpunkten immobilisiert sein können. Es ist jedoch auch möglich, die Testsubstanzen nach Art eines Kits zusammen mit den Trägerplatten auszulie fern.

Bei den Trägerplatten ist es dabei bevorzugt, wenn sie vorzugs weise durch Bestrahlen mit UV-Licht oder Gamma-Strahlung steri lisiert sind, wobei sie weiter vorzugsweise durch Inkubieren mit PBS rehydriert und ferner vorzugsweise feucht verpackt sind.

Auf diese Weise ist es möglich, eine vorbereitete Trägerplatte über Wochen und Monate vorrätig zu halten, ohne daß eine Kontamination oder das Risiko des Austrocknens besteht.

Mit der neuen Trägerplatte ist es somit erstmals möglich, stan dardisierte Assays durchzuführen und die dazu verwendeten Trä gerplatten sowie möglicherweise auch die Testsubstanzen in Lö sung als Kit zu erwerben.

Weitere Vorteile ergeben sich aus der Beschreibung der beige fügten Zeichnung.

Es versteht sich, daß die vorstehend genannten und die nach stehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den jeweils angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinatio nen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in der Zeichnung dargestellt und werden in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 eine neue Trägerplatte mit Meßpunkten in schemati scher Draufsicht;

Fig. 2 einen nicht maßstabsgetreuen Schnitt durch die Trä gerplatte aus Fig. 1; und

Fig. 3 in einer Darstellung wie Fig. 2 ein zweites Ausfüh rungsbeispiel einer neuen Trägerplatte.

In Fig. 1 ist mit 10 eine rechteckige Trägerplatte bezeichnet, auf der hier beispielhaft einige Meßpunkte 11 angeordnet sind, an denen in Fig. 1 nicht dargestellte biologische Zellen immo bilisiert werden können. Zwischen den Meßpunkten 11 sind Berei che 12 der Trägerplatte 10 vorgesehen, an denen die biologi schen Zellen nicht immobilisieren.

Die Meßpunkte 11 haben einen Durchmesser 14 von 600 bis 800 µm und einen Randabstand 15 von 400 bis 200 µm, so daß sich ein Mittenabstand von 500 µm ergibt. Auf diese Weise sind auf einer Trägerplatte 10 mit einer Kantenlänge von 1 cm 100 Meßpunkte unterzubringen.

Wie es in der prinzipiellen Seitenansicht der Fig. 2 gezeigt ist, kann die Trägerplatte 10 als Bodenplatte eines Zellkultur gefäßes 16 ausgebildet sein. Die Trägerplatte 10 trägt auf ih rem planaren Abschnitt 17 eine funktionalisierte Oberfläche 18, an der in den Meßpunkten Fängermoleküle 19 immobilisiert sind. Über immobilisierte Linker 21 sind in den Meßpunkten ferner Testsubstanzen 22 immobilisiert.

An die Fängermoleküle 19 sowie die Testsubstanzen 22 binden biologische Zellen 23, deren Reaktion auf die Co-Stimulierung durch die Fängermoleküle 19 sowie die Testsubstanzen 22 unter sucht werden sollen.

In den Bereichen 12 zwischen den Meßpunkten 11 ist die funktio nalisierte Oberfläche 18 durch Moleküle 24 geblockt, so daß die Zellen 23 nur im Bereich der Meßpunkte 11 immobilisiert werden können.

In Fig. 3 ist ein weiteres Ausführungsbeispiel der Trägerplat te 10 gezeigt, die hier erhabene Bereiche in Form von Zapfen 25 trägt, auf denen jeweils ein planarer Abschnitt 17 vorgesehen ist, der wie in Fig. 2 gezeigt mit einer funktionalisierten Oberfläche versehen ist, auf der einzelne Meßpunkte 11 ausge bildet sind.

Die Meßpunkte 11 umfassen hier nur Fängermoleküle 19, an die sich Zellen 23 anlagern, die Testsubstanzen 22 befinden sich in einer Lösung 26, die in einem Kulturgefäß 27 enthalten ist.

Die Trägerplatte 10 ist mit den planaren Abständen 17 nach un ten von oben auf das Kulturgefäß 27 aufgelegt, so daß die Zap fen 25 in die Lösung 26 hineinragen. Durch die Schwerkraft lö sen sich jetzt nicht immobilisierte Zellen 23 von den Zapfen 25 ab, während die an den Meßpunkten 11 immobilisierten Zellen 23 mit den frei in der Lösung 26 vorhandenen Testsubstanzen 22 in teragieren.

Nach Ende der Inkubation wird die Trägerplatte 10 nach oben von dem Kulturgefäß 27 abgenommen, wobei auf den Zapfen 25 nur sol che Zellen 23 verbleiben, die eine Co-Stimulierung durch die Fängermoleküle 19 und die Testsubstanzen 22 erfahren haben. Auf diese Weise wird ein Übersprechen zwischen benachbarten Meß punkten 11 vermieden.

Beispiel 1 Herstellen von Trägerplatten mit Meßpunkten

Als Trägerplatten werden aldehydaktivierte Glasobjektträger verwendet, auf denen als Fängermoleküle Peptide immobilisiert werden.

Die Peptide werden dazu synthetisiert, wobei vor jeder Aktivie rungsreaktion potentiell nicht verlängerte Peptide durch eine Acetylierungsreaktion blockiert werden, so daß sie nicht mehr verlängert werden können. Bei der letzten Kupplung wird die Gruppe, über die die Anbindung des Peptides an das Trägermate rial erfolgen soll, an das Peptid auf dem Harz gekoppelt. Durch diesen Schritt wird eine aufwendige HPLC-Aufreinigung vermie den, da unvollständige Sequenzen nicht gekoppelt werden können.

Die Herstellung des Arrays von Meßpunkten kann nach zwei Metho den erfolgen:

1. Peptide werden vor dem Aufbringen kovalent an Trägerpro teine (BSA, Poly-Lysin) gebunden und zusammen mit den er forderlichen anderen Komponenten auf den aldehydaktivier ten Objektträger gespottet (10 bis 30 nl/Meßpunkt, 0,1- 35 mg/ml). Die Immobilisierung der Peptide erfolgt über Ausbildung von Schiffbasen, die mittels NaCNBH₃ zu Amin reduziert werden.
2. Poly-Lysin-Lösung (10-30 nl, 1 mg/ml) wird auf den alde hydaktivierten Objektträger gespottet. Anschließend werden die Aminogruppen des aufgebrachten Poly-Lysins mit SMPB umgesetzt, wozu der komplette Träger mit 5 mM sulfo-SMPB (2,3 mg/ml in destilliertem Wasser) für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend zweimal für 5 Minuten mit destilliertem Wasser gewaschen wird. Da das SMPB nur mit Aminogruppen des Poly-Lysins reagiert, werden die restlichen Aldehydgruppen auf dem Träger hierbei nicht umgesetzt. Über diese Aldehydgruppen können in einem zwei ten Schritt beispielsweise Komponenten von extrazellulären Matrixproteinen als Testsubstanzen kovalent auf den Glas träger gebunden werden.
Das Spotten erfolgt mittels konventioneller Geräte für die Inkjettechnologie oder das Kontaktprinting.
Für die Kopplung der Peptide an die SMPB-aktivierten Poly- Lysin-Spots wird der Objektträger in dem Gerät so ju stiert, daß die zu spottenden Peptide punktgenau auf die SMPB-aktivierten Poly-Lysin-Spots plaziert werden können. Die Peptide werden dazu in 10% DMF/90% PBS (in DMF ge löst).
Auf nicht mit Poly-Lysin besetzte Bereiche der Meßpunkte werden ECM-Komponenten, Laminin, Fibronectin, Collagen oder Poly-Lysin gespottet (10-30 ml, 1-25 mg/ml).

Nicht kovalent gebundene Peptide oder Proteine werden durch Wa schen des Trägers entfernt und freie Aldehydgruppen mit Serin (1 mg/ml) oder H₂N-PEG (2 mg/ml) in NaCNBH₃ (0,1 M) geblockt. Diese Gruppen verhindern/minimieren eine Adhäsion der biologi schen Zellen außerhalb der Meßpunkte.

Zur Sterilisation wird der Objektträger mit dem Array für 5 Mi nuten unter der Sterilbank mit UV-Licht bestrahlt. Anschließend wird das Array in einer Petrischale mit PBS für 10 Minuten re hydriert und dann feucht verpackt.

Beispiel 2 Messungen an Hühnchentectumzellen

Eine Zellsuspension von Hühnchentectumzellen wird in 0,5 ml Lö sung auf das Array aufgebracht und parallel oder anschließend werden Testsubstanzen zugegeben, die mit Neuritenwachstum in terferieren. Nach 24 Stunden werden nicht gebundene Zellen weg gewaschen.

Die gebundenen Zellen werden hinsichtlich ihrer spezifischen Adhärenz auf den Meßpunkten sowie hinsichtlich Vitalität und bestimmter Differenzierungsmerkmale (Proliferation/Neuriten wachstum) beurteilt.

Dazu werden die Zellen fixiert und mit einem gegen ein neuro nenspezifisches Oberflächenantigen gerichteten Antikörper fluo reszenzmarkiert. Auf diese Weise kann das Neuritenwachstum au tomatisch ausgelesen und quantifiziert werden.

Das Neuritenwachstum läßt sich mit diesem Assay in An- und Ab wesenheit von integrinspezifischen Antikörpern testen. Dabei konnte gezeigt werden, daß der Antikörper W1B10 (Anti-β 1 Inte grin) β1-abhängiges Neuritenwachstum auf Laminin und Fibro nectin verhindert, daß N-CAM und N-Cadherin-abhängiges Neuri tenwachstum jedoch nicht beeinflußt wird.

Beispiel 3 T-Zellaktivierung

Hier soll die T-Zellantwort nach Antigenstimulierung gemessen werden. Dazu wird das Antigen in bereits beschriebener Weise auf der Trägerplatte immobilisiert, wobei eine Signalverstär kung erreicht wird, indem das Antigen zusammen mit dem T-Zell stimulierenden Oberflächenrezeptor-Antikörper (Anti-CD28 Co- Stimulator) immobilisiert wird. Es ist bekannt, daß Anti-CD28 allein keine T-Zellstimulierung verursacht.

Als Meßparameter dient die Cytokin-Bestimmung nach Aktivierung der T-Zellen. Diese Bestimmung kann über den Nachweis von se zernierten Cytokinen mit Standard-Elisa-Tests oder über die Messung des intrazellulär angehäuften Cytokins nach Freiset zungs-Blockade (Brefeldin A) erfolgen.

Wird durch Zugabe von sekretionblockierenden Agentien die Cyto kinfreisetzung, nicht aber die Cytokinsynthese unterbunden, kann das von der T-Zelle synthetisierte, aber nicht sekretierte Cytokin in der Zelle nachgewiesen werden. Wenn unterschiedliche Antigene in den Meßpunkten immobilisiert werden, kann die T- Zellantwort auf die unterschiedlichen Antigene ortsaufgelöst beobachtet werden.

Claims

1. Trägerplatte zur Durchführung funktioneller Tests an bio logischen Zellen (23), mit einem Array von Meßpunkten (11), an denen die Zellen (23) interagieren und binden können, wobei die Meßpunkte (11) durch Bereiche (12) der Trägerplatte (10) voneinander getrennt sind, an denen die Zellen (23) nicht immobilisiert werden können, dadurch gekennzeichnet, daß an den Meßpunkten (11) Fänger moleküle (19) immobilisiert sind, an die die Zellen (23) mittels ihrer Zelloberflächenmoleküle binden können.

2. Trägerplatte nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Fängermoleküle (19) Liganden für Zelloberflächenrezep toren umfassen.

3. Trägerplatte nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch ge kennzeichnet, daß an den Meßpunkten (11) identische Fän germoleküle (19) immobilisiert sind.

4. Trägerplatte nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich net, daß an den Meßpunkten unterschiedliche Fängermoleküle (19) immobilisiert sind.

5. Trägerplatte nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ge kennzeichnet, daß an den Meßpunkten eine Testsubstanz (22) immobilisiert ist.

6. Trägerplatte nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß an den Meßpunkten (11) identische Testsubstanzen (22) im mobilisiert sind.

7. Trägerplatte nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß an den Meßpunkten (11) unterschiedliche Testsubstanzen (22) immobilisiert sind.

8. Trägerplatte nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch ge kennzeichnet, daß sie vorzugsweise durch Bestrahlen mit UV-Licht oder Gamma-Strahlen sterilisiert ist.

9. Trägerplatte nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch ge kennzeichnet, daß sie vorzugsweise durch Inkubieren mit PBS rehydriert ist.

10. Trägerplatte nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch ge kennzeichnet, daß sie feucht verpackt ist.

11. Trägerplatte nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie zumindest einen im wesentlichen planaren Abschnitt (17) aufweist, auf dem das Array ange ordnet ist.

12. Trägerplatte nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der planare Abschnitt (17) nach Art eines Zapfens (25) er haben ausgeführt ist.

13. Trägerplatte nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie mehrere erhabene, im wesentlichen planare Abschnitte (17) aufweist.

14. Trägerplatte nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßpunkte (11) einen Durchmesser (14) zwischen etwa 200 µm und etwa 4000 µm aufweisen.

15. Trägerplatte nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßpunkte (11) einen Randabstand (15) zwischen etwa 300 µm und etwa 700 um aufweisen.

16. Trägerplatte nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Fängermoleküle (19) ausgewählt sind aus der Gruppe: Proteine, wie z. B. Komponenten extra zellulärer Matrixproteine (Fibronectin, Laminin, Collagen, Zelloberflächenproteine, Rezeptoren, Liganden), Poly- Lysin, Peptide aus Lamininsequenzen, Kontrollpeptide, Kon trollproteine, Peptidomimetika, Polymere, Lektine, Anti körper, Antigene und Allergene.

17. Trägerplatte nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Testsubstanzen (22) ausgewählt sind aus der Gruppe: Pharmazeutische Präparate, Antikör per, Substanzen, die die Zelleigenschaften beeinflussen, Botenstoffe, Wachstumsfaktoren, Antigene und Allergene.

18. Trägerplatte nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem Material gefertigt ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe: Glas und Kunststoff, insbesondere Polystyrol.

19. Trägerplatte nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine funktionalisierte Oberfläche (18) aufweist.

20. Trägerplatte nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die funktionalisierte Oberfläche (18) ausgewählt ist aus der Gruppe: Aldehydaktivierte Glasoberfläche, aminosinali sierte Glasoberfläche, Poly-D-Lysin beschichtete Glasober fläche.

21. Trägerplatte nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die funktionalisierte Oberfläche (18) in den Bereichen (12) zwischen den Meßpunkten (11) geblockt ist.

22. Trägerplatte nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Bodenplatte eines Zellkultur gefäßes (16) ausgebildet ist.

23. Verfahren zur Durchführung funktioneller Tests an biologi schen Zellen 23, mit den Schritten:
Ausbringen der Zellen (23) auf einer Trägerplatte (10) mit einem Array von Meßpunkten (11), an denen die ausgebrach ten Zellen (23) mit zumindest einem Liganden interagieren,
Stimulieren der Zellen (23) mit zumindest einer Testsub stanz (22), und
ortsaufgelöste Erfassung von solchen Zelleigenschaften, die über die Co-Stimulation durch Ligand und Testsubstanz beeinflußbar sind,
dadurch gekennzeichnet, daß die Liganden vor dem Ausbrin gen der Zellen (23) an Meßpunkten (11) immobilisiert wer den, die auf einem im wesentlichen planaren Abschnitt (17) der Trägerplatte (10) angeordnet sind, und
die Zellen (23) auf den planaren Abschnitt (17) der Trä gerplatte (10) ausgebracht werden.

24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Testsubstanz (22) vor dem Ausbringen der Zellen (23) an den Meßpunkten (11) immobilisiert wird.

25. Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeich net, daß an den Meßpunkten (11) identische Liganden immo bilisiert werden.

26. Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeich net, daß an den Meßpunkten (11) unterschiedliche Liganden immobilisiert werden.

27. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 26, dadurch ge kennzeichnet, daß an den Meßpunkten identische Testsub stanzen (22) immobilisiert werden.

28. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 26, dadurch ge kennzeichnet, daß an den Meßpunkten (11) unterschiedliche Testsubstanzen immobilisiert werden.

29. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 26, dadurch ge kennzeichnet, daß die Testsubstanz (22) nach dem Inkubieren der Zellen (23) auf den planaren Abschnitt (17) der Trägerplatte (10) aufgebracht wird.

30. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 29, dadurch ge kennzeichnet, daß die Trägerplatte nach dem Inkubieren mit dem planaren Abschnitt (17) nach unten von oben in ein Ge fäß mit einer die Testsubstanz (22) enthaltenden Lösung (26) getaucht wird, um die Zellen (23) zu stimulieren.

31. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 30, dadurch ge kennzeichnet, daß nicht immobilisierte Zellen (23) vor der Erfassung der Zelleigenschaften durch Waschen von der Trä gerplatte (10) entfernt werden.

32. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 31, dadurch ge kennzeichnet, daß als Trägerplatte (10) die Trägerplatte (10) aus einem der Ansprüche 1 bis 22 verwendet wird.

33. Kit mit einer Trägerplatte (10) nach einem der Ansprüche 1 bis 22.

34. Kit nach Anspruch 33, mit einer Testsubstanz (22).