PT921857E - Placas de múltiplos poços com ruído de fundo reduzido para medições de fluorescência de amostras biológicas e bioquímicas - Google Patents

Description

ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Placas de múltiplos poços com ruído de fundo reduzido para medições de fluorescência de amostras biológicas e bioquímicas"

Referência a Pedidos Relacionados 0 presente pedido reivindica o direito de uma data de apresentação anterior para os pedidos de patente dos Estados Unidos: pedido U.S. 08/867567, apresentado a 2 de Junho de 1997; pedido U.S. 08/868018, apresentado a 3 de Junho de 1997; pedido U.S. 08/867584, apresentado a 2 de Junho de 1997; e pedido U.S. 08/868049, apresentado a 3 de Junho de 1997; cada um dos quais é aqui incorporado por referência.

Campo Técnico O presente invento refere-se genericamente a placas de múltiplos poços e plataformas feitas com ciclo-olefinas para utilização em medições espectroscópicas e a métodos de produção de tais dispositivos. As placas de múltiplos poços e plataformas são particularmente úteis para medições de fluorescência de amostras químicas e biológicas.

Introdução Várias placas de múltiplos poços estão comercialmente disponíveis para cultura de células ou realização de ensaios químicos ou celulares. Embora muitas destas placas de múltiplos poços ofereçam as características desejáveis de biocompatibilidade, facilidade de fabrico e substancial integridade estrutural, os inventores do presente invento verificaram geralmente que estas placas, especialmente as placas com fundos poliméricos, sofrem de um grau substancialmente elevado de fluorescência. A quantidade relativamente elevada de fluorescência de fundo inerente às placas comercialmente disponíveis com fundos poliméricos torna estas placas geralmente não adequadas para medições de fluorescência altamente sensíveis associadas a muitos ensaios, particularmente ensaios de volumes de microlitros ou menos.

Os inventores do presente invento reconheceram a necessidade nas especialidades química e biológica de placas de múltiplos poços e plataformas para eventos químicos ou 2 ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ biológicos, tais como ensaios de ligação ou ensaios baseados em células. Os inventores prepararam critérios de selecção para os materiais adequados para a produção das placas de múltiplos poços e plataformas para tais aplicações. Como exemplo chave dos critérios de selecção, que é aqui descrito de forma mais completa, os inventores investigaram as propriedades espectrais de vários polímeros, incluindo a sua fluorescência e transmitância, quanto à compatibilidade com as medições espectroscópicas de acontecimentos químicos e biológicos. Tais materiais teriam também desejavelmente, mas não necessariamente dependendo da aplicação, biocompatibilidade, relativa inércia química e suficiente rigidez para a aplicação manual e facilidade de fabrico. Os inventores seleccionaram uma variedade de polímeros para testes baseados, em parte, nas características estruturais dos polímeros, que são aqui descritos de forma mais completa. A pesquisa de polímeros pelos inventores incluiu a pesquisa de campos não associados a medições espectroscópicas, incluindo especialidades associadas a polímeros de ciclo-olefinas, tais como as especialidades da electrónica e da gravação áudio. Os inventores compararam uma variedade de materiais com folhas de sílica fundida (p.ex., vidro) que possuem uma fluorescência inerente relativamente menor. De várias películas testadas, os inventores verificaram surpreendentemente que as películas de ciclo-olefinas possuem propriedades de fluorescência e transmitância que se aproximam (ou mesmo superam) as do vidro de sílica fundida.

Tal como aqui descrito os inventores desenvolveram pela primeira vez novas placas de múltiplos poços utilizando ciclo-olefinas que oferecem características de desempenho excelentes nos ensaios. Tais placas de múltiplos poços podem ser utilizadas em placas convencionais de 96 poços ou de formatos de maior densidade. Os inventores descrevem também aqui pela primeira vez novas plataformas que podem ser utilizadas para ensaios ou locais de reacção que são particularmente passíveis de fabrico com ciclo-olefinas. Tais placas e plataformas podem também ser utilizadas para outras aplicações tais como para diagnóstico ou síntese de químicos. 3 ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ

Sumário Ο presente invento inclui dispositivos para medições espectroscópicas, tais como placas de múltiplos poços e plataformas. Tipicamente, tais dispositivos compreendem uma camada de baixa fluorescência e elevada transmitância, compreendendo um polímero de ciclo-olefina e um ou mais poços de uma placa de múltiplos poços ou uma plataforma para segurar a camada.

As placas de múltiplos poços do presente invento compreendem uma camada de baixa fluorescência e elevada transmitância, compreendendo um polímero de ciclo-olefina e um ou mais poços para segurar, ou formar, a camada. A ciclo-olefina compreende normalmente pelo menos uma porção de uma superfície do fundo de um poço da placa de múltiplos poços.

As plataformas do presente invento compreendem uma camada, ou janela, de baixa fluorescência e elevada transmitância, compreendendo normalmente um polímero de ciclo-olefina ou outro material de baixa fluorescência e uma armação ou moldura para segurar, ou formar, a camada. A janela possui uma dimensão predeterminada e pode ser disposta como uma variedade de janelas na moldura em qualquer arranjo geométrico, incluindo séries bidimensionais. Nalgumas concretizações a janela permite a detecção de acontecimentos espectroscópicos, onde a luz passa frequentemente através da janela. Noutras concretizações a janela é basicamente um local de reacção ou de ensaio que pode permitir a detecção de uma reacção química ou de um ensaio. 0 presente invento inclui também métodos para detecção e fabrico que se relacionam com as placas de múltiplos poços e plataformas do presente invento.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

Definições A menos de definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que é vulgarmente entendido por uma pessoa competente na matéria à qual este invento pertence. Geralmente, a nomenclatura aqui utilizada e os procedimentos de laboratório 4 ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ em espectroscopia, descoberta de fármacos, cultura de células, genética molecular, fabrico de plásticos, química de polímeros, diagnóstico, química de aminoácidos e ácidos nucleicos, e química de açúcares descritos abaixo são aqueles bem conhecidos e vulgarmente empregues na especialidade. Técnicas padrão são tipicamente utilizadas para a preparação de plásticos, detecção de sinais e métodos de ácidos nucleicos recombinantes, síntese de polinucleótidos e cultura e transformação (p.ex., electroporação e lipofecção) microbianas. As técnicas e procedimentos são geralmente efectuados de acordo com métodos convencionais na especialidade e várias referências gerais (ver geralmente, Sambrook et al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, e Lakowicz, J.R. "Principies of Fluorescence Spectroscopy", New York; Plenum Press, 1983, para técnicas de fluorescência, que são aqui incorporadas por referência) que são proporcionadas ao longo deste documento. Técnicas padrão são utilizadas para sínteses químicas, análises químicas e ensaios biológicos. Tal como empregue ao longo da divulgação, os seguintes termos, a menos que indicado de outro modo, devem ser entendidos como tendo os seguintes significados: "Porção dadora de fluorescência" refere-se ao radical de um composto fluorogénico que pode absorver energia e é capaz de transferir a energia para outra molécula ou parte de um composto fluorogénico. Moléculas fluorogénicas dadoras adequadas incluem, mas não se limitam a, cumarinas e corantes relacionados, corantes de xanteno tais como fluoresceínas, rodóis e rodaminas, resorufinas, corantes de cianina, bimanes, acridinas, isoindoles, corantes de dansilo, hidrazidas aminoftálicas tais como derivados de luminol e isoluminol, aminoftalimidas, aminonaftalimidas, aminobenzofuranos, aminoquinolinas, diciano-hidroquinonas e complexos de európio e térbio e compostos relacionados. "Extintor" refere-se a uma molécula ou parte de um composto cromofórico que é capaz de reduzir a emissão de um dador fluorescente quando ligada ao dador. A extinção ocorre através de qualquer um de vários mecanismos incluindo transferência de energia de ressonância de fluorescência, transferência de electrões foto-induzida, melhoramento 5 ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ paramagnético de cruzamento inter-sistemas, acoplamento de permuta de Dexter e acoplamento de excitação tal como a formação de complexos escuros. "Aceitador" refere-se a um extintor que opera através de transferência de energia de ressonância de fluorescência. Muitos aceitadores podem reemitir a energia transferida como fluorescência. Exemplos incluem cumarinas e fluoróforos relacionados, xantenos tais como fluoresceinas, rodóis e rodaminas, resorufinas, cianinas, difluoroboradiazaindacenos e ftalocianinas. Outras classes químicas de aceitadores geralmente não reemitem a energia transferida. Exemplos incluem índigos, benzoquinonas, antraquinonas, compostos azo, compostos nitro, indoanilinas, di- e trifenilmetanos. "Par de ligação" refere-se a duas porções (p.ex., químicas ou bioquímicas) que possuem uma afinidade de uma pela outra. Exemplos de pares de ligação incluem antigénio/anticorpos, lectina/avidina, polinucleótido alvo/ oligonucleótido sonda, anticorpo/anti-anticorpo, receptor/ ligando, enzima/ligando e semelhantes. "Um membro de um par de ligação" refere-se a uma porção do par, tal como um antigénio ou um ligando. "Corante" refere-se a uma molécula ou parte de um composto que absorve frequências específicas de luz, incluindo mas não se limitando à luz ultravioleta. Os termos "corante" e "cromóforo" são sinónimos. "Fluoróforo" refere-se a um cromóforo que fluoresce. "Derivado que permeia a membrana" refere-se a um derivado químico de um composto que possui uma maior permeabilidade de membrana em comparação com um composto não derivatizado. Exemplos incluem derivados éster, éter e carbamato. Estes derivados são tornados mais capazes de atravessar as membranas celulares, i.e. permeiam a membrana, porque os grupos hidrófilos são mascarados para proporcionar mais derivados hidrófobos. Também, os grupos de máscara são desenhados para serem clivados de um precursor (p.ex., precursor de um substrato fluorogénico) dentro da célula para gerar intracelularmente o substrato derivado. Como o substrato é 6 ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ mais hidrófilo que ο derivado que permeia a membrana este fica agora aprisionado dentro das células. "Alquilo" refere-se a grupos alifáticos lineares, ramificados e cíclicos geralmente de 1 a 8 átomos de carbono, de preferência 1 a 6 átomos de carbono e de maior preferência 1 a 4 átomos de carbono. 0 termo "alquilo inferior" refere-se a grupos alquilo de cadeia linear e ramificada de 1 a 4 átomos de carbono. "Alifático" refere-se a grupos alquilo saturados e insaturados geralmente de 1 a 10 átomos de carbono, de preferência 1 a 6 átomos de carbono e de maior preferência 1 a 4 átomos de carbono. "Soldadura de fusão térmica" refere-se a uma soldadura induzida pelo calor. A fonte de calor pode ser qualquer fonte suficiente para promover algum grau de ligação entre as duas porções (separadas ou outras) de um ou mais materiais, incluindo uma reacção química, uma fonte de calor externa (p.ex., uma placa aquecida, ultra-sons ou ar) ou aquecimento interno (p.ex., aquecimento por radiofrequência). "Polinucleótido isolado" refere-se a um polinucleótido de origem genómica, de ADNc ou sintética ou alguma combinação destes, que em virtude da sua origem o "polinucleótido isolado" (1) não está associado à célula na qual o "polinucleótido isolado" se encontra na natureza, ou (2) está operativamente ligado a um polinucleótido ao qual não está ligado na natureza. "Proteína isolada" refere-se a uma proteína de origem em ADNc, ARN recombinante ou sintética ou alguma combinação destes, que em virtude da sua origem a "proteína isolada" (1) não está associada a proteínas com as quais se encontra normalmente na natureza ou (2) é isolada da célula na qual normalmente ocorre ou (3) é isolada livre de outras proteínas da mesma fonte celular, p.ex. livre de proteínas humanas ou (4) é expressa por uma célula de uma espécie diferente ou (5) não ocorre na natureza. "Proteína de ocorrência natural isolada" refere-se a uma proteína que em virtude da sua origem a "proteína de ocorrência natural isolada" (1) não está 7 ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ associada a proteínas com as quais se encontra normalmente na natureza ou (2) é isolada da célula na qual normalmente ocorre ou (3) é isolada livre de outras proteínas da mesma fonte celular, p.ex., livre de proteínas humanas. "Polipéptido" tal como aqui se utiliza como termo genérico refere-se a uma proteína, fragmentos ou análogos de uma sequência polipeptídica nativa. Assim, a proteína, fragmentos e análogos nativos são espécies do género polipeptídico. "Ocorrência natural" tal como aqui se utiliza, aplicado a um objecto, refere-se ao facto de um objecto poder ser encontrado na natureza. Por exemplo, um polipéptido ou uma sequência polinucleotídica que está presente num organismo (incluindo vírus) que pode ser isolado a partir de uma fonte na natureza e que não foi intencionalmente modificado pelo homem no laboratório é de ocorrência natural. "Operativamente ligado" refere-se a uma justaposição em que os componentes assim descritos estão numa relação que lhes permite funcionar do modo pretendido. Uma sequência de controlo "operativamente ligada" a uma sequência de codificação está ligada de um tal modo que a expressão da sequência de codificação é alcançada sob condições compatíveis com as sequências de controlo. "Sequência de controlo" refere-se a sequências polinucleotídicas que são necessárias para efectuar a expressão das sequências de codificação e não codificantes às quais estão ligadas. A natureza de tais sequências de controlo difere dependendo do organismo hospedeiro; em procariotas, tais sequências de controlo incluem geralmente um promotor, o local de ligação ao ribossoma e a sequência de terminação da transcrição; em eucariotas, geralmente, tais sequências de controlo incluem promotores e uma sequência de terminação da transcrição. 0 termo "sequências de controlo" pretende incluir, no mínimo, componentes cuja presença pode influenciar a expressão e pode também incluir componentes adicionais cuja presença é vantajosa, por exemplo, sequências líder e sequências de parceiros de fusão. 8 ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ "Polinucleótido" refere-se a uma forma polimérica de nucleótidos de pelo menos 10 bases de comprimento, ribonucleótidos ou desoxinucleótidos ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleótido. O termo inclui formas de ADN de cadeia simples e dupla. "Corresponde a", refere que uma sequência polinucleotidica é homóloga a (i.e., é idêntica, não estritamente evolutivamente relacionada) a toda ou a uma porção de uma sequência polinucleotidica de referência ou que uma sequência polipeptidica é idêntica a uma sequência polipeptidica de referência. Por contradição, o termo "complementar a" é aqui utilizado para significar que a sequência complementar é homóloga a toda ou a uma porção de uma sequência polinucleotidica de referência. Para ilustração, a sequência nucleotidica "TATAC" corresponde a uma sequência de referência "TATAC" e é complementar a uma sequência de referência "GTATA". "Fragmento polipeptidico" refere-se a um polipéptido que possui uma deleção amino-terminal e/ou carboxi-terminal, mas onde a restante sequência de aminoácidos é normalmente idêntica às posições correspondentes na sequência de ocorrência natural deduzida, por exemplo, a partir de uma sequência de ADNc inteira. Os fragmentos têm tipicamente pelo menos 5, 6, 8 ou 10 aminoácidos de comprimento, de preferência pelo menos 14 aminoácidos de comprimento, de preferência pelo menos 20 aminoácidos de comprimento, normalmente pelo menos 50 aminoácidos de comprimento e ainda de maior preferência pelo menos 70 aminoácidos de comprimento. "Placa" refere-se a uma placa de múltiplos poços, a menos que de outro modo modificado pelo contexto da sua utilização. "Modulação" refere-se à capacidade de aumentar ou inibir uma propriedade funcional da actividade ou processo biológico (p.ex., actividade enzimática ou ligação ao receptor); tal aumento ou inibição pode ser contingente na ocorrência de um acontecimento especifico, tal como activação de uma via de transdução de sinal e/ou pode ser manifestado apenas em determinados tipos celulares. 9 ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ Ο termo "modulador" refere-se a um composto químico (de ocorrência natural ou de ocorrência não natural), tal como uma macromolécula biológica (p.ex., ácido nucleico, proteína, não péptido ou molécula orgânica), num extracto feito a partir de materiais biológicos tais como bactérias, células ou tecidos vegetais, de fungos ou animais (particularmente de mamífero). Os moduladores são avaliados quanto a potencial actividade como inibidores ou activadores (directamente ou indirectamente) de um processo ou processos biológicos (p.ex., agonista, antagonista parcial, agonista parcial, antagonista, agentes antineoplásicos, agentes citotóxicos, inibidores de transformação neoplásica ou de proliferação celular, agentes promotores da proliferação celular e semelhantes) através da inclusão nos ensaios de pesquisa aqui descritos. A actividade de um modulador pode ser conhecida, desconhecida ou parcialmente conhecida. 0 termo "químico de teste" refere-se a um químico a testar através de um ou mais métodos de pesquisa do presente invento como putativo modulador. 0 termo "marcador" ou "marcado" refere-se à incorporação de um marcador detectável, p.ex., através da incorporação de um aminoácido marcado radioactivamente ou da ligação a um polipéptido de porções biotinilo que podem ser detectadas através de avidina marcada (p.ex., estreptavidina contendo um marcador fluorescente ou actividade enzimática que pode ser detectada através de métodos ópticos ou colorimétricos). Vários métodos de marcação de polipéptidos e glicoproteínas são conhecidos na especialidade e podem ser utilizados. Exemplos de marcadores para polipéptidos incluem, mas não se limitam aos seguintes: radioisótopos (p.ex., 3H, 14C, 35S, 125I, 131I), marcadores fluorescentes (p.ex., FITC, rodamina, fósforos de lantanídeo), marcadores enzimáticos (ou genes repórter) (p.ex., peroxidase de rábano, β-galactosidase, β-lactamase, luciferase, fosfatase alcalina), quimioluminescentes, grupos biotinilo, epítopos polipeptídicos predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (p.ex., sequências de pares de fechos de leucina, locais de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação a metais, etiquetas de epítopos). Nalgumas concretizações, os 10 ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ marcadores são ligados a braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir um potencial impedimento espacial. "Marcador fluorescente" refere-se à incorporação de um marcador detectável, p.ex., através da incorporação de uma porção fluorescente numa entidade quimica que se liga a um alvo ou ligação a um polipéptido de porções biotinilo que podem ser detectadas através de avidina (p.ex., estreptavidina contendo um marcador fluorescente ou actividade enzimática que pode ser detectada através de métodos de detecção de fluorescência). Vários métodos de marcação de polipéptidos e glicoproteinas são conhecidos na especialidade e podem ser utilizados. Exemplos de marcadores para polipéptidos incluem, mas não se limitam a corantes (p.ex., FITC e rodamina), proteínas intrinsecamente fluorescentes e fósforos de lantanídeo. Nalgumas concretizações, os marcadores são ligados através de braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir um potencial impedimento espacial. "Gene repórter" refere-se a uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína que é facilmente detectável através da sua presença ou da sua actividade, incluindo, mas não se limitando a luciferase, proteína fluorescente verde, cloranfenicol-acetil-transferase, β-galactosidase, fosfatase alcalina placentária segregada, β-lactamase, hormona de crescimento humana e outros repórteres enzimáticos segregados. Geralmente, os genes repórter codificam um polipéptido não produzido de outro modo pela célula hospedeira que é detectável através de análise da(s) célula(s), p.ex., através de análise fluorométrica directa, radioisotópica ou espectrofotométrica da(s) célula(s) e de preferência sem necessidade de remover as células para análise do sinal de um poço. De preferência, o gene codifica uma enzima que produz uma alteração nas propriedades fluorométricas da célula hospedeira que é detectável através de função qualitativa, quantitativa ou semi-quantitativa da activação da transcrição. Enzimas exemplares incluem esterases, fosfatases, proteases (activador do plasminogénio tecidual ou uroquinase) e outras enzimas cuja função pode ser detectada através de substratos cromogénicos ou fluorogénicos apropriados conhecidos dos peritos na especialidade. As proteínas, particularmente enzimas, de genes repórter podem também ser utilizadas como 11 ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ sondas em ensaios bioquímicos, por exemplo após conjugação correcta com o alvo ou com uma entidade química que se liga ao alvo. "Transmitância" refere-se a uma fracção de luz incidente que passa através de um meio a um dado comprimento de onda. Pode também ser considerada a razão entre a energia radiante transmitida através de um meio e a energia radiante incidente no meio a um determinado comprimento de onda.

Outros termos químicos são aqui utilizados de acordo com a utilização convencional na especialidade, tal como exemplificado pelo "The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms" (ed. Parker, S., 1985), McGraw-Hill, San Francisco, aqui incorporado por referência).

Concretizações do Invento

Como introdução não limitante do âmbito do presente invento, o presente invento inclui vários aspectos gerais e úteis, incluindo: 1) placas de múltiplos poços com os fundos dos poços de ciclo-olefinas que são úteis em medições de fluorescência, 2) plataformas com camadas ou janelas de ciclo-olefinas que são úteis em medições de fluorescência, 3) métodos de produção de (1) e (2), e 4) métodos e sistemas de detecção baseados, em parte, em (1) e (2) .

Estes aspectos do presente invento, bem como outros aqui descritos, podem ser alcançados através da utilização de métodos e composições da matéria aqui descrita. Para ter uma apreciação completa do âmbito do presente invento, será ainda reconhecido que vários aspectos do presente invento podem ser combinados para produzir concretizações desejáveis do presente invento.

Placas de múltiplos poços e plataformas 0 presente invento inclui dispositivos de medições espectroscópicas, tais como placas de múltiplos poços e plataformas. Tipicamente, tais dispositivos compreendem uma 12 ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ camada de baixa fluorescência e elevada transmitância, compreendendo um polímero de ciclo-olefina e um ou mais poços de uma placa de múltiplos poços ou uma plataforma para manter a camada. Tanto as placas de múltiplos poços como as plataformas são descritas abaixo.

Placas de múltiplos poços

As placas de múltiplos poços do presente invento compreendem uma camada de baixa fluorescência e elevada transmitância, compreendendo um polímero de ciclo-olefina e um ou mais poços para segurar, ou formar, a camada. A ciclo-olefina constitui normalmente pelo menos uma porção de uma superfície do fundo de um poço da placa de múltiplos poços. Em muitas concretizações, para facilitar a facilidade de fabrico, a ciclo-olefina constituirá substancialmente o fundo inteiro. A ciclo-olefina pode também ser utilizada para formar as paredes da placa, o que é um segundo modo de reduzir a fluorescência inerente de uma placa. Nalgumas concretizações moldadas do presente invento, a ciclo-olefina constituirá opcionalmente qualquer porção de uma placa, incluindo o fundo da placa, as paredes dos poços, os membros estruturais inter-poços que interligam os poços, os lados da placa, as superfícies superior e inferior da placa, bem como as tampas da placa.

As placas de múltiplos poços podem oferecer qualquer número de poços em qualquer disposição em qualquer formato ou área de múltiplos poços. Tipicamente, os poços serão dispostos em duas séries lineares bidimensionais e possuem normalmente entre cerca de 96 e 9600 poços, de preferência o número de poços é um múltiplo de 96. Um grande número de poços ou uma maior densidade de poços podem também ser facilmente alcançados uma vez que os polímeros de ciclo-olefinas podem ser facilmente produzidos numa variedade de formas e tipos de poços de pequena dimensão e volume. Outros números de poços vulgarmente utilizados incluem 1536, 3456 e 9600. O volume dos poços varia tipicamente de 500 nanolitros a mais de 200 microlitros, dependendo da profundidade e da área de secção transversal dos poços. São vulgarmente utilizados volumes de poços de 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 e 500 microlitros. Os poços podem ser produzidos com qualquer forma de secção 13 ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ transversal (na perspectiva horizontal) incluindo a quadrada, circular e hexagonal, e combinações destas. Os poços podem ser feitos com qualquer forma de secção transversal (na perspectiva vertical) incluindo paredes verticais simples com fundos planos ou redondos, paredes cónicas com fundos planos ou redondos e paredes verticais curvas com fundos planos ou redondos e combinações destes. Em aplicações do presente invento que podem utilizar luz focada, a ciclo-olefina pode ser utilizada para formar uma lente que faça parte do fundo do poço. As lentes variarão em espessura e curvatura dependendo da aplicação.

Os materiais para fabrico da placa serão tipicamente poliméricos, uma vez que estes materiais prestam-se para técnicas de fabrico em massa. Os materiais poliméricos podem facilitar particularmente o fabrico da placa através de métodos de moldagem conhecidos na especialidade e a desenvolver no futuro. Os polímeros que são compatíveis com a ciclo-olefina devem ser utilizados em regiões da placa em contacto físico com a ciclo-olefina. Nalgumas concretizações, os poços da placa podem ser fabricados com um material diferente de um polímero de ciclo-olefina e a ciclo-olefina pode ser ligada, soldada ou de outro modo fundida com o segundo material. Polímeros com temperaturas de transição do vidro adequadas para fusão induzida pelo calor com a ciclo-olefina podem ser seleccionados para o fabrico dos poços e de outras porções da placa. De preferência, são seleccionados polímeros que possuem baixa fluorescência ou outras propriedades aqui descritas. A placa inteira, excepto o fundo, pode ser feita de um segundo polímero e depois soldada com calor a uma película de ciclo-olefina com as dimensões apropriadas utilizando métodos conhecidos na especialidade ou a desenvolver no futuro. É também preferido fazer uma porção substancial ou a placa inteira de ciclo-olefina. Tais utilizações de segundos polímeros podem também ser utilizadas como guia para a formação de outras concretizações do presente invento.

Uma vez que a maioria das medições não irão tipicamente requerer que a luz passe através da parede do poço, os polímeros podem incluir pigmentos para escurecer as paredes dos poços ou absorver luz. Tais aplicações de pigmentos 14 ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ ajudarão a reduzir a fluorescência de fundo. Os pigmentos podem ser introduzidos através de qualquer meio conhecido na especialidade, tal como revestindo ou misturando durante o processo de polimerização. A selecção do pigmento pode ser baseada numa mistura de pigmentos para eliminar todo o fundo inerente ao polímero ou um único pigmento ou conjunto de pigmentos seleccionado para filtrar ou absorver luz a comprimentos de onda desejados. Os pigmentos podem incluir negro de carbono. Tal pigmentação não é geralmente desejada em concretizações onde a luz é dirigida através das paredes do poço como um método para iluminação dos conteúdos dos poços. Tais técnicas podem também ser aplicadas a concretizações de plataformas do presente invento. A espessura da ciclo-olefina que constitui o fundo da placa pode variar dependendo das propriedades globais requeridas para o fundo da placa que podem ser ditadas por uma determinada aplicação. Tais propriedades incluem a quantidade de fluorescência intrínseca, a rigidez, a força de quebra e requisitos de fabrico em relação à ciclo-olefina utilizada na placa. As camadas de ciclo-olefina do fundo do poço têm tipicamente uma espessura de cerca de 30 a 500 micrómetros de espessura e de preferência cerca de 50 a 300 micrómetros de espessura. Tais valores de espessura podem também ser utilizados como guia para a formação de outras concretizações do presente invento.

Uma das espantosas características das placas de múltiplos poços do presente invento é a sua baixa fluorescência intrínseca. A camada do fundo constituída por ciclo-olefina produz tipicamente cerca de 400 porcento a 200 porcento ou menos da fluorescência em comparação com sílica fundida de 150 micrómetros de espessura. O vidro de sílica fundida é tipicamente utilizado como um "padrão de ouro" para comparação da fluorescência relativa. A fluorescência e a fluorescência relativa podem ser medidas utilizando qualquer técnica de confiança conhecida ou desenvolvida na especialidade, de preferência são utilizadas as técnicas aqui descritas. De preferência, o padrão de sílica fundida aqui utilizado para mostrar a surpreendentemente baixa fluorescência da ciclo-olefina é utilizado como padrão. De preferência, a camada do fundo constituída por ciclo-olefina 15 ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ produz tipicamente cerca de 100 a 50 porcento ou menos da fluorescência em comparação com sílica fundida de cerca de 150 micrómetros de espessura. A quantidade de fluorescência intrínseca pode ser ditada, em parte, pela espessura da camada. Nalgumas aplicações que podem tolerar camadas particularmente finas, tais como aplicações onde a camada não requer uma força estrutural significativa, a espessura da camada pode ser bastante fina (p.ex., 20 a 80 micrómetros) para reduzir a fluorescência que surge da camada. A espessura de uma camada é também habitualmente equilibrada contra a dificuldade de soldar uniformemente ou gerar camadas mais finas nos processos de fabrico. A baixa fluorescência relativa dos dispositivos de ciclo-olefina está habitualmente presente a comprimentos de onda de excitação entre cerca de 300 a 400 nm e a comprimentos de onda de emissão entre cerca de 300 a 800 nm. Tais valores de fluorescência relativa podem também ser utilizados como guia para a formação de outras concretizações do presente invento.

As placas de múltiplos poços do presente invento podem incluir revestimentos ou modificações da superfície para facilitar várias aplicações da placa tal como aqui descritas e conhecidas ou desenvolvidas na especialidade relevante. Os revestimentos podem ser introduzidos utilizando qualquer método adequado conhecido na especialidade, incluindo técnicas de impressão, vaporização, energia radiante, ionização ou imersão. Modificações da superfície podem também ser introduzidas através da derivatização de modo apropriado de um polímero antes ou após o processo de fabrico e através da inclusão de um polímero derivatizado apropriado na camada de ciclo-olefina. O polímero derivatizado pode então reagir com uma porção química que seja utilizada numa aplicação da placa. Antes da reacção com uma porção química, tal polímero pode então ser proporcionado em locais de ligação covalente ou não covalente na ciclo-olefina. Tais locais na ciclo-olefina ou à superfície da ciclo-olefina podem ser utilizados para ligar porções, tais como componentes de ensaio (p.ex., um membro de um par de ligação), componentes da reacção química (p.ex., componentes da síntese de sólidos para síntese de aminoácidos ou de ácidos nucleicos) e componentes de cultura celular (p.ex., proteínas que facilitam o crescimento ou a adesão). Exemplos de polímeros derivatizados incluem os descritos na 16 ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ

Patente U.S. 5583211 (Coassin et al.) . As concretizações particularmente preferidas são baseadas em derivados de polietileno e polipropileno que podem ser incluídos como copolímeros de ciclo-olefina. A camada de ciclo-olefina pode também incluir uma variedade de células vivas. Tais concretizações são úteis para os ensaios baseados em células aqui descritos e para a criação de células utilizando métodos de cultura. As placas do presente invento podem incluir um revestimento (p.ex., polilisina) para aumentar a fixação das células.

As utilizações das placas de múltiplos poços são conhecidas nas especialidades relevantes e incluem ensaios de diagnóstico, ensaios de ligação químicos ou bioquímicos, ensaios de filtração, locais de síntese química, locais de armazenamento e semelhantes. Tais utilizações podem também ser aplicadas ao presente invento. Será reconhecido que alguns tipos de placas de múltiplos poços para medições espectroscópicas podem ser frequentemente utilizadas para outras aplicações de placas de múltiplos poços. Tipicamente, uma placa de múltiplos poços é utilizada para detecção de um sinal a partir de uma amostra. Diferentes tipos de medições de sinal são aqui discutidos.

Noutra concretização, o presente invento proporciona uma placa de múltiplos poços para medições espectroscópicas, compreendendo uma variedade de poços e cada poço compreendendo uma parede e um fundo com uma porção de baixa fluorescência e elevada transmitância compreendendo um copolímero de ciclo-olefina, e uma moldura, em que os poços são dispostos numa moldura. A placa de múltiplos poços pode ser utilizada para detecção de um sinal a partir de uma amostra. A placa de múltiplos poços nalgumas concretizações não possui a área de uma placa de microtítulo de 96 poços padrão (i.e., "áreas não padronizadas"). A área de uma placa de microtítulo de 96 poços padrão é de 12,7 cm de comprimento por 8,5 cm de largura. A área padrão geralmente aceite para uma placa de microtítulo de 96 poços padrão para aplicações robóticas é de 12,77 ± 0,25 cm de comprimento e 8,55 ± 0,25 cm de largura (ver T. Astle, "Standards in Robotics and Instrumentation", J. of Biomolecular Screening, Vol. 1, páginas 163-168, 1996). Em EP 0 921 857/PT 17 nenhum caso a área padrão será superior ou inferior aos intervalos de comprimentos e larguras apresentados na Tabela 1, que é um máximo de 12, 83 cm e um minimo de 12,63 cm para o comprimento e um máximo de 8,63 e um minimo de 8,37 cm para a largura. Em áreas não padrão, a placa de múltiplos poços pode ter 864 poços ou mais (p.ex., 1536, 3456 e 9600).

Tabela 1

Cat. Fabr.= Nome do Fabr. Dimensões Exteriores Poços Comprimento Largura Altura Poços Forma Cor Material Fundo AGTC 128,118 85,319 41,148 est ireno 1 ml AIM 127,762 85,598 41,504 estireno 1 ml AIM 127,635 85,141 40,945 propileno 1 ml Beckman 127,93 85,55 41,84 96 redonda transparente est ireno redondo Beckman 127,93 85,55 41,84 96 redonda translúcida propileno redondo 373660 Beckman 127,787 85,573 14,224 transparente est ireno plano 25870 Corning/Costar 127,68 85,12 14,2 96 redonda transparente est ireno plano (bisel) 35207 Corning/Costar 127,61 85,166 14,224 transparente estireno plano 35205 Corning/Costar 127,33 85,014 14,224 transparente est ireno Fundo em U Corning/Costar 127,6 85,2 14,3 96 redonda transparente est ireno cónico 7000003 Corning/Costar 127,1 85,3 14,3 96 redonda preta estireno plano 7000004 Corning/Costar 127,6 85,47 14,2 96 redonda preta est ireno plano 7000008 Corning/Costar 126, 7 84,62 14,45 96 redonda translúcida propileno redondo 7000010 Corning/Costar 127,83 85,42 14,53 96 redonda transparente estireno plano 35203 Corning/Costar 127,508 85,319 14,224 transparente estireno plano 35202 Corning/Costar 85,42 14,326 transparente estireno plano A/2 35190 Dynatech 127,889 85,649 14,173 transparente estireno plano 35189 Dynatech 127,838 85,522 14,097 transparente estireno Fundo em V 35194 Evergreen 127,483 85,344 14,376 transparente estireno plano 35192 Evergreen 127,483 85,217 14,275 transparente estireno Fundo em U 35191 Evergreen 127,432 85,268 14,3 transparente estireno Fundo em V 35197 Falcon 127,381 85,471 14,351 transparente estireno plano 7000017 Genetix 128,38 86,31 10,17 384 redonda transparente estireno plano 35188 Immulon 127,406 85,344 14,402 transparente estireno plano 35176 Interlab 127,914 85,852 13,665 transparente estireno Fundo em V Iwaki 127,279 35,065 14,021 estireno plano 35181 LabSystems 127,838 85,598 15,291 preta propileno plano 35187 MicroFluor 127,406 85,217 12,224 branca propileno plano 35184 MicroFluor 127,508 85,42 4, 275 preta propileno plano 35183 MicroFluor 127,533 85,42 14,224 branca propileno plano A/2 35185 MicroLite 127,584 85,369 14,148 branca propileno plano 35186 MicroLite 2 127,635 85,471 14,199 branca propileno plano Millipore 128,016 85, 75 14,859 branca propileno plano Millipore 137,813 85,598 14,605 transparente estireno plano 35177 NBT 127,838 85,598 14,3 transparente estireno Fundo em U 7000001 Nunc 127, 6 83,7 14,4 96 redonda transparente estireno plano 7000006 Nunc 127, 7 85,6 14,5 384 quadrada transparente estireno plano 63765 Nunc 127,559 85,573 14,351 transparente estireno plano 35201 Nunc 127,432 85,344 14,097 transparente estireno Fundo em U 18 ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ

Cat. Fabr.= Nome do Fabr. Dimensões Exteriores Poços Comprimento Largura Altura Poços Forma Cor Material Fundo 35200 Nunc 126,314 84,379 14,351 propileno Fundo em U 35199 Nunc 127,305 85,395 14,402 transparente estireno Fundo em V 35210 Packard 127,762 85,471 14,275 branca propileno GF/B 35209 Packard 127,963 85,776 14,351 branca propileno GF/C 35203 Pa 11 127,635 85,598 14,325 branca propileno plano 7000005 Polyf iltronics 127, 5 85,8 44,03, 96 quadrado translúcida propileno redonda 7000009 Polyf iltronics 127,09 85,12 30,43 96 redonda translúcida propileno filtro 7000011 Polyf iltronics 127, 3 85,25 16 96 redonda translúcida propileno cónico 7000012 Polyf iltronics 127, 8 85,69 9,56 384 redonda translúcida propileno cónico 35175 Polyf iltronics 127,787 85,552 15,24 branca propileno plano 35174 Polyf iltronics 127,483 85,547 15,189 preta propileno plano 35173 Polyf iltronics 127,991 85, 7 15,24 branca propileno transparente- plano 35179 Polyfiltronics 127,559 85,344 14,351 branca propileno GF/B 35180 Polymetrics 127,533 85,369 14,097 translúcida propileno em V agudo Sumilon 127,33 85,395 14,503 estireno plano 35178 Tilertek 127,381 85,319 14,224 transparente estireno plano

Tipicamente, a placa de múltiplos poços possui poços com uma distância do centro de um poço ao centro de outro poço de menos de cerca de 9 a 6 mm, de preferência menos de cerca de 3 mm e por vezes menos de cerca de 1 mm. Distâncias do centro de um poço ao centro de outro poço menores são preferidas para volumes menores. Tais placas têm tipicamente uma espessura do polimero de ciclo-olefina de entre cerca de 20 e 200 micrómetros, de preferência cerca de 30 a 80 micrómetros. De preferência, o polimero de ciclo-olefina possui baixa fluorescência a partir de luz de excitação de cerca de 300 a 500 nm e a porção de baixa fluorescência e elevada transmitância é substancialmente o fundo inteiro. Frequentemente os poços e opcionalmente a moldura são feitos de um polimero de ciclo-olefina, que ajuda a reduzir a fluorescência. O presente invento inclui opcionalmente a condição de que quando a placa de múltiplos poços é uma placa de microtitulo com uma área de uma placa de microtitulo de 96 poços padrão e possui poços de microtitulo, o número dos poços de microtitulo não excederá os 864 poços de microtitulo.

Plataformas 19 ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ

As plataformas do presente invento compreendem uma camada, ou janela, de baixa fluorescência e elevada transmitância, compreendendo normalmente um polímero de ciclo-olefina ou outro material de baixa fluorescência e uma armação ou moldura para segurar, ou formar, a camada. A janela possui uma dimensão predeterminada e pode ser disposta numa variedade de janelas na moldura em qualquer arranjo geométrico, incluindo séries bidimensionais. Nalgumas concretizações a janela permite a detecção de acontecimentos espectroscópicos, onde a luz passa frequentemente através da janela. Noutras concretizações a janela é basicamente um local de reacção ou de ensaio que pode permitir a detecção de uma reacção quimica ou de um ensaio, por exemplo através da medição da refracção ou reflectância da luz. Quando a janela é um local de reacção ou de ensaio, a luz não tem necessariamente que passar através da janela. A ciclo-olefina constitui normalmente pelo menos uma porção da janela. Em muitas concretizações, para facilitar a facilidade de fabrico, a ciclo-olefina constituirá substancialmente a janela inteira e a plataforma. A ciclo-olefina pode também ser utilizada para formar a armação ou a moldura que forma a plataforma, o que é um segundo modo de reduzir a fluorescência inerente de uma placa. Nalgumas concretizações moldadas do presente invento, a ciclo-olefina constituirá opcionalmente qualquer porção de uma plataforma, incluindo o fundo da plataforma, as paredes, os membros estruturais inter-janelas que interligam os poços, os lados da plataforma, as superfícies superior e inferior da plataforma bem como as tampas da plataforma. Outros polímeros podem substituir a ciclo-olefina dependendo dos requisitos espectroscópicos ou outros do ensaio ou da reacção.

Numa concretização, a plataforma compreende uma armação para uma matriz de locais de ensaio espacialmente predeterminados numa camada e a armação não interfere substancialmente com a detecção de um sinal dos locais de ensaio. A camada possui tipicamente uma espessura de cerca de 40 a 300 micrómetros. Os locais de ensaio têm tipicamente cerca de 10 micrómetros quadrados a 200 micrómetros quadrados de área, embora locais maiores superiores a 200 micrómetros estejam contemplados (p.ex., 500 a 2000 micrómetros ou 20 ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ maiores) e locais menores inferiores a 10 micrómetros estejam contemplados (p.ex., 5 a 0,5 micrómetros ou menores). A camada pode ser derivatizada para a ligação de entidades químicas tal como aqui descrito. Os locais de ensaio podem também ser impressos na camada. Tais plataformas podem ser utilizadas e fabricadas em muitos casos como as placas de múltiplos poços aqui descritas. De preferência, a plataforma compreende um copolímero de ciclo-olefina.

As concretizações do presente invento não incluem meios de gravação de informação ópticos, tipicamente utilizados para armazenamento e recuperação de informação (p.ex., CDs (discos compactos) para gravações áudio ou dados de computador). Tais meios de gravação ópticos possuem uma camada de gravação. A camada de gravação compreende normalmente (1) deformações físicas predeterminadas (p.ex., invaginações ou concavidades) à superfície da camada de gravação formadas através de irradiação da camada de gravação em locais exactos predeterminados ou (2) locais predeterminados de índice refractivo ou reflectância alterado à superfície da camada de gravação formados através de irradiação da camada de gravação em localizações exactas predeterminadas. As camadas de gravação são tipicamente feitas de um metal de baixo ponto de fusão (p.ex., Te) e podem conter outros elementos para as propriedades desejadas (p.ex., Cr, C e H). A camada de gravação é normalmente depositada no substrato compreendendo um polímero, tal como ciclo-olefina. Em contraste, o presente invento é dirigido a meios de gravação de informação não ópticos e à utilização de ciclo-olefinas de baixa fluorescência e elevada transmitância para utilização nas especialidades químicas e biológicas, em oposição às especialidades de computadores e áudio. Em muitas destas concretizações a luz passa frequentemente através da camada de ciclo-olefina em contraste com os meios de gravação de informação ópticos, onde a luz é reflectida pela camada de gravação. Os meios de gravação de informação ópticos convencionais são também diferentes do presente invento porque as camadas de gravação de tais meios contêm uma camada metálica mole. A camada metálica mole é normalmente uma característica desvantajosa para a medição de acontecimentos químicos ou biológicos. Em muitos casos, uma tal camada de gravação não será compatível com muitas reacções químicas ou 21 ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ porções biológicas. Entende-se, contudo, que algumas concretizações do presente invento podem conter ou armazenar informação, bem como proporcionar locais para a ocorrência de acontecimentos químicos ou biológicos no formato de CD ou no formato de um CD modificado de acordo com as dimensões e outras características do presente invento. Nalguns casos, tais acontecimentos químicos e biológicos podem proporcionar um sinal que pode ser medido como uma alteração na refracção ou reflexão da luz. Entende-se também que algumas concretizações do presente invento podem incluir locais para acontecimentos químicos ou biológicos que podem permitir o armazenamento e a recuperação de informação num formato que se assemelhe ao formato de um disco compacto convencional. 0 presente invento também não inclui ciclo-olefinas produzidas como bolsas de bolhas ("blister") ou material de empacotamento.

Materiais, Critérios de Selecção e Testes

Esta secção descreve materiais, critérios de selecção e testes rápidos para facilitar a escolha de uma ciclo-olefina para as placas de múltiplos poços e plataformas aqui descritas.

Materiais

Os presentes inventores conduziram muita investigação em diferentes polímeros na pesquisa de polímeros que ofereçam as propriedades apropriadas para a detecção de sinais espectroscópicos, particularmente sinais de fluorescência. Os materiais utilizados no presente invento não foram utilizados nas placas comercialmente disponíveis listadas na Tabela 1. Surpreendentemente, estes materiais oferecem propriedades excepcionais, incluindo baixa fluorescência intrínseca, que foi aqui demonstrada pela primeira vez. "Ciclo-olefinas" refere-se geralmente a polímeros de ciclo-olefina, a menos que de outro modo modificado no contexto da sua utilização e incluem copolímeros tais como os aqui especificados. "Copolímeros de ciclo-olefina" refere-se geralmente a copolímeros de ciclo-olefina, a menos que de outro modo modificado no contexto da sua utilização. 22 ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ

Tipicamente, as ciclo-olefinas são utilizadas como películas ou resinas para produzir várias concretizações do presente invento. As resinas e películas baseadas em polímeros de ciclo-olefina podem ser utilizadas em vários processos de fabrico conhecidos na especialidade relevante e aqui descritos. Os critérios de selecção para as películas ou resinas de ciclo-olefinas são descritos de forma mais completa abaixo. Geralmente, as películas ou resinas de ciclo-olefinas que contêm absorventes de raios UV, porções aromáticas, contêm porções de estireno, não são as preferidas.

Ciclo-olefinas adequadas para muitas concretizações do presente invento incluem as descritas nas Patentes U.S. 5278238 (Lee B.L. et al.); 4874808 (Minami et al.); 4918133 (Moriya et al.); 4935475 (Kishimura et al.); 4948856 (Minchak et al.); 5115052 (Wamura et al.); 5206306 (Shen); 5270393 (Sagane et al.); 5272235 (Wakatsuru et al.); 5278214 (Moriya et al.); 5534606 (Bennett et al.); 5532030 (Hirose et al.); 4689380 (Nahm et al.); e 4899005 (Lane et al.). As ciclo-olefinas disponíveis em Hoechst são preferidas, especialmente a ciclo-olefina (p.ex., ciclopenteno, ciclo-hexano e ciclo-hepteno) e seus copolímeros de polietileno, bem como polímeros de olefinas termoplásticos de estrutura amorfa (linha TOPAS).

Os laminados de multicamadas são preferidos quando múltiplos requisitos funcionais são difíceis de obter a partir de um único laminado (p.ex., camada ou película). As propriedades da transmitância, rigidez, capacidade de selagem térmica, fluorescência e penetração de humidade podem ser misturadas através da utilização de películas de diferentes resinas. As resinas de mistura conhecidas na especialidade e a desenvolver no futuro podem ser utilizadas quando as películas multilaminadas ou as resinas de mistura têm propriedades consistentes com as do presente invento. Por exemplo, a Patente U.S. 5532030 (Hirose et al.) descreve o fabrico de certas películas de ciclo-olefinas, tanto de laminado único como de multilaminado, que podem ser adaptadas para utilização nos dispositivos aqui descritos.

Critérios de Selecção e Testes 23 ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ

As propriedades desejáveis para as películas e resinas de ciclo-olefinas utilizadas no presente invento variarão dependendo do tipo de placa de múltiplos poços ou plataforma desejado. Geralmente, os materiais são seleccionados para produzir um produto final com baixa fluorescência, elevada transmitância, suficiente rigidez para resistir à deformação e para permitir um plano substancialmente único (especialmente para concretizações espectroscópicas), boa inércia química, citotoxicidade relativamente baixa, baixa absorção de água, resistência/deflexão ao calor até 150°C e resistência a ácidos e bases. Materiais de partida com boas propriedades de moldagem são particularmente desejáveis. A fluorescência das películas ou do produto final pode ser facilmente medida. Tais medições prosseguem rapidamente e várias películas (p.ex., 20 a 80 películas) ou produtos protótipo podem ser rapidamente testados numa questão de horas ou dias, normalmente menos de uma pessoa-semana. Consequentemente, as películas ou resinas utilizadas para produzir produtos finais podem ser rapidamente seleccionadas quanto às propriedades desejadas que são importantes numa determinada aplicação. As medições de fluorescência podem ser utilizadas tal como aqui descrito ou como conhecido na especialidade, desde que as medições sejam comparáveis (ou melhores) na sensibilidade às medições aqui descritas. Um ponto de referência padrão para a fluorescência relativa, tal como o padrão aqui descrito, é particularmente útil para a comparação de diferentes ciclo-olefinas e para a determinação da sua aplicabilidade a certas aplicações. As propriedades da fluorescência relativa aqui descritas são particularmente desejáveis. De modo semelhante, a transmitância pode ser medida utilizando técnicas conhecidas na especialidade relevante.

No produto final, é muito provável que uma espessura de camada de geralmente cerca de 20 a 500 micrómetros confira as propriedades desejáveis para utilizar nos dispositivos aqui descritos, especialmente baixa fluorescência e elevada transmitância. No entanto, películas mais finas ou mais espessas tais como de cerca de 10 a 1500 micrómetros podem ser utilizadas em aplicações onde as exigências de películas de fluorescência extremamente baixa e transmitância elevada sejam 24 ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ menos rigorosas, ou quando exista pouca perda nas propriedades desejadas em função da espessura das películas. De preferência, a espessura da película é de entre cerca de 30 a 200 micrómetros para as aplicações de placas de múltiplos poços e de maior preferência entre cerca de 80 a 200 micrómetros e ainda de maior preferência entre cerca de 80 a 200 micrómetros. De preferência, a espessura da película é de entre cerca de 30 a 600 micrómetros para aplicações de armações onde a película contribui tipicamente para uma função estrutural no dispositivo que exige normalmente mais força ou rigidez, de maior preferência entre cerca de 100 a 500 micrómetros e ainda de maior preferência entre cerca de 120 e 200 micrómetros. De preferência, a espessura da película é de entre cerca de 75 a 600 micrómetros para as regiões mais finas de aplicações de moldes injectados onde a película contribui tipicamente para uma função estrutural e de maior preferência entre cerca de 100 a 500 micrómetros e ainda de maior preferência entre cerca de 120 a 200 micrómetros. A espessura da película refere-se à espessura da película utilizada (ou espessura do material). A espessura da camada é geralmente de cerca de 100 a 200 porcento da espessura da película, de preferência cerca de 100 a 150 porcento da espessura da película e de maior preferência cerca de 100 a 125 porcento da espessura da película.

No produto final, é muito provável que forças de ruptura (Kg/cm2 a 22°C) de geralmente cerca de 400 a 3000 Kg/cm2 confiram as propriedades desejáveis para utilizar nos dispositivos aqui descritos, especialmente dispositivos rígidos de baixa fluorescência e elevada transmitância. No entanto, películas mais fracas ou mais fortes, tais como de cerca de 200 a 3500 Kg/cm2, podem ser utilizadas em diferentes aplicações baseadas nas exigências da força de ruptura do dispositivo. Por exemplo, a força de ruptura da película não necessita geralmente de ser tão grande para os fundos das placas de múltiplos poços em comparação com aplicações onde a película faz parte da moldura, quer numa placa de múltiplos poços quer numa plataforma de reacção substancialmente feita da própria película. De preferência, a força de ruptura está entre cerca de 500 e 2000 Kg/cm2 para aplicações de placas de múltiplos poços e de maior preferência entre cerca de 800 a 1600 Kg/cm2 e ainda de maior preferência entre cerca de 900 a 25 ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ 1400 Kg/cm2. De preferência, a força de ruptura para aplicações de plataforma/armação é cerca de 15 a 60 porcento superior que para aplicações de placas de múltiplos poços. As forças de ruptura podem ser medidas através de técnicas padrão conhecidas na especialidade. Métodos de Fabrico O presente invento inclui um processo para produzir placas de múltiplos poços e plataformas baseadas em ciclo-olefinas. Pode ser utilizada uma variedade de processos incluindo soldadura por calor, moldagem de inserção, moldagem de injecção e outros processos aqui descritos e conhecidos na especialidade. Um processo compreende a soldadura por calor a uma plataforma de polímero de uma camada com baixa fluorescência e elevada transmitância, compreendendo um copolímero de ciclo-olefina. Os processos utilizam tipicamente um copolímero de ciclo-olefina seleccionado a partir do grupo de copolímeros de ciclopenteno e polietileno, copolímeros de ciclo-hexano e polietileno, e copolímeros de ciclo-hepteno e polietileno. O processo pode alternativamente, ou opcionalmente, compreender o passo de exposição da camada e do polímero a uma quantidade suficiente de energia de radiofrequência para promover o aquecimento interno da camada e do polímero, ou soldadura por ultra-sons. Alternativamente, o processo pode abranger o aquecimento da camada e do polímero que formam os poços a cerca de 320°C durante uma quantidade de tempo suficiente para permitir a fusão dos polímeros. Pode ser aplicada pressão para aumentar o processo de soldadura (p.ex., cerca de 6,89 - 68,9 bar (100 e 1000 psi) de pressão à camada e ao polímero para processos de baixa pressão utilizando soluções de monómeros de baixa viscosidade e cerca de 689 -1724 bar (10 000 a 25 000 psi) para processos de elevada pressão tais como moldagem de inserção).

Noutra concretização, o presente invento proporciona um processo para a produção de placas de múltiplos poços através de moldagem de injecção ou moldagem de inserção. Podem ser aplicadas as técnicas de moldagem de injecção conhecidas na especialidade ou a desenvolver no futuro. O processo compreende a moldagem de inserção de pelo menos um poço ao fundo de um poço de uma placa de múltiplos poços, em que o fundo é um copolímero de ciclo-olefina. Utilizando este método 26 ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ as películas de ciclo-olefinas podem ser basicamente fundidas por calor à estrutura de suporte (p.ex., paredes dos poços) para fazer uma placa. 0 poço inteiro ou a placa podem também ser feitos de uma ciclo-olefina. A moldagem de inserção pode ser efectuada entre cerca de 195 e 350°C, de preferência as resinas são aquecidas até de 260°C a 320°C. As pressões utilizadas são tipicamente de entre 689-1724 bar (10 000 e 25 000 psi) e de preferência de cerca de 1034-1517 bar (15 000 a 22 000 psi).

Os métodos para a preparação de ciclo-olefinas e seus polímeros foram descritos. Métodos e ciclo-olefinas mais antigos foram descritos nas Patentes U.S. 4002815; 4069376; 4110528; 4262103 e 4380617 (por Robert J. Minchak e colegas). Vários catalisadores podem ser utilizados no fabrico de ciclo-olefinas tal como conhecido na especialidade ou a desenvolver no futuro e podem ser utilizados para fabricar materiais para várias concretizações do presente invento. Tais catalisadores incluem os descritos nas Patentes U.S. 5278238 (Lee et al.) e 5278214 (Moriya et al.). Independentemente do tipo exacto de sistema catalisador utilizado, os monómeros de ciclo-olefina podem ser polimerizados na presença de um catalisador e dos copolímeros funcionais baseados em etileno para produzir concretizações do presente invento adequadas para moldagem de injecção. A polimerização pode ser realizada de preferência em bruto. A polimerização em bruto incluindo moldagem de injecção de reacção (RIM), moldagem de injecção líquida (LIM), moldagem de injecção de reacção reforçada (RRIM) e moldagem de transferência de resina (RTM) e combinações destas são conhecidas na especialidade bem como as técnicas a desenvolver no futuro. A polimerização em bruto é a polimerização conduzida na ausência de um solvente ou de um diluente. A moldagem de injecção de reacção é um tipo de polimerização em bruto em que um monómero num estado líquido é transferido ou é injectado num molde onde a polimerização do monómero ocorre na presença de um sistema catalisador. A RIM é uma moldagem de injecção não convencional para polímeros derretidos e é facilmente distinguível desta. A RIM é uma mistura e injecção de baixa pressão, num único passo ou num único disparo, de dois ou mais componentes líquidos num molde fechado onde ocorre a rápida polimerização 27 ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ resultando num produto plástico moldado. A RIM difere da moldagem de injecção convencional em vários aspectos importantes. A moldagem de injecção convencional é conduzida a pressões de cerca de 689-1379 bar (10 000 a 20 000 psi) na cavidade do molde através da fusão de uma resina sólida e transportando-a para um molde mantido a uma temperatura inferior à temperatura de fusão da resina. A uma temperatura de injecção de cerca de 150°C a 350°C, a viscosidade da resina fundida no processo de moldagem de injecção convencional está geralmente no intervalo de 50 000 a 1 000 000 e tipicamente cerca de 200 000 cps. No processo de moldagem de injecção, a solidificação da resina ocorre em cerca de 10 a 90 segundos, dependendo do tamanho do produto moldado, após o que o produto moldado é removido do molde. Não existe reacção química a ocorrer num processo de moldagem de injecção convencional quando a resina é introduzida num molde.

Num processo RIM, a viscosidade dos materiais alimentados a uma câmara de mistura é de cerca de 1 a 10 000 cps, de preferência de 1 a cerca de 1500 cps, a temperaturas de injecção que variam da temperatura ambiente em cerca de 100°C, para diferentes sistemas de monómeros de ciclo-olefina. As temperaturas do molde num processo RIM estão no intervalo de cerca de 50°C a 150°C e as pressões no molde estão geralmente no intervalo de 3,45-10,3 bar (50 a 150 psi). Pelo menos um componente na formulação de RIM é um monómero que é polimerizado num polímero no molde. A principal distinção entre a moldagem de injecção convencional e a RIM reside no facto de na RIM a reacção química ser iniciada na mistura, com aquecimento opcional, e ser completada no molde para transformar os monómeros num estado polimérico. Para fins práticos, a reacção química tem de ocorrer rapidamente em menos de cerca de 2 minutos. A moldagem de injecção convencional pode também ser utilizada para fazer várias concretizações do presente invento. O termo moldagem de injecção refere-se tanto à moldagem de injecção convencional como a outros tipos de moldagem de injecção aqui descritos e conhecidos ou a desenvolver na especialidade.

Um processo LIM é semelhante a um sistema RIM excepto que geralmente não é utilizada uma cabeça de impacto. Em vez disso, é utilizado um misturador simples tal como um 28 ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ misturador estático, um misturador de agitação e semelhantes. Para além disso, o ciclo de moldagem de injecção é realizado ao longo de um periodo de tempo e assim a reacção quimica pode ocorrer num periodo de até cerca de 5 a 10 minutos. Várias partículas de reforço podem também ser utilizadas, isto é, injectadas com a solução quando se utiliza o processo RIM ou o processo LIM. De modo prático, o processo RIM nem sempre é adequado e assim as partículas reforçadas são geralmente utilizadas apenas num processo LIM, que é um processo de moldagem de injecção líquida reforçada. Outra alternativa é utilizar um tapete que já exista no molde, por exemplo um tapete de fibra de vidro ou semelhante. Assim, tais sistemas são designados RMRIM, RMLIM ou RTM. Devido aos tempos de cura da reacção bem como aos tempos de moldagem de injecção, o sistema RMLIM é geralmente preferido para algumas operações, RMRIM ou RTM para outras.

Assim, as misturas ou ligas de ciclo-olefinas e copolímeros adequados podem ser utilizados em qualquer um dos sistemas de polimerização em bruto observados acima bem como variações destes. Uma vez que os sistemas de cima são geralmente convencionais ou conhecidos na especialidade bem como na literatura, não foram discutidos em detalhe, mas sim resumidamente aqui discutidos por questões de brevidade. A Patente U.S. N° 4426502 para Minchak descreve a polimerização em bruto (p.ex., RIM) de ciclo-olefinas utilizando um co-catalisador modificado com um catalisador através do qual a polimerização dos monómeros de ciclo-olefina pode ser conduzida na ausência de um solvente ou de um diluente. O co-catalisador de halogeneto de alquilalumínio é modificado através da sua prévia reacção com um álcool ou um composto activo contendo hidroxilo para formar um halogeneto de alquioxialquilalumínio ou um halogeneto de ariloxialquilalumínio que é então utilizado na reacção de polimerização. A reacção prévia pode ser alcançada através da utilização de oxigénio, um álcool ou um fenol. Tal modificação do co-catalisador resulta na redução do seu potencial de redução do catalisador. 29 ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ

Independentemente de se é utilizado o sistema de catalisador de metátese de halogeneto ou de metátese livre de halogéneo, a velocidade de reacção é geralmente abrandada através da utilização dos álcoois acima descritos. Assim, dependendo de se é utilizado pouco ou nenhum álcool, o sistema catalisador de metátese de halogeneto pode curar as várias ciclo-olefinas numa questão de minutos e mesmo de segundos. Se forem utilizadas grandes quantidades de álcool, a cura pode ser uma questão de horas e mesmo de dias. É importante baixar o poder redutor do co-catalisador de ambos os sistemas de metátese para tornar tais reacções de polimerização em bruto práticas. Quando um monómero diluído com co-catalisador de alquilalumínio não modificado é misturado com um catalisador de monómero diluído para polimerizar uma ciclo-olefina, a reacção é muito rápida. Em tais sistemas, a polimerização é habitualmente inaceitável porque o polímero formado nas interfaces ou nas duas correntes durante a miscigenação impede uma mistura homogénea e resulta em fracas conversões. A modificação do co-catalisador através de reacção prévia com materiais contendo hidroxilo reduz a actividade do co-catalisador até ao ponto onde a mistura adequada dos componentes líquidos pode ocorrer e podem ser produzidos produtos poliméricos aceitáveis. Por vezes, um monómero de ciclo-olefina conterá várias impurezas que reduzem naturalmente a actividade do co-catalisador. Em tais casos, não é necessário adicionar materiais contendo hidroxilo activos para reduzir a actividade do co-catalisador. Com o co-catalisador modificado, a mistura das ciclo-olefinas e outros componentes pode ser realizada a temperaturas mais baixas, tais como à temperatura ambiente, sem iniciar imediatamente a polimerização. 0 co-catalisador pode ser formulado para permitir um tempo de utilização razoável à temperatura ambiente e a activação térmica no molde dos componentes líquidos misturados. 0 co-catalisador pode também ser formulado para dar sistemas RIM iniciados com mistura.

Quando se utiliza um método de polimerização em bruto, a mistura dos monómeros de ciclo-olefina com os copolímeros funcionais à base de etileno bem como o catalisador e quaisquer aditivos opcionais aí podem ser adicionados a um molde de polimerização em bruto possuindo uma temperatura bem 30 ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ abaixo da Tg dos polímeros de ciclo-olefina polimerizados. Isto é especialmente desejável uma vez que a reacção é habitualmente exotérmica e pode resultar num aumento de temperatura do molde até cerca de 120°C. A temperatura final do molde é assim de cerca de 50°C a cerca de 200°C, geralmente de cerca de 50°C a cerca de 150°C e de preferência de cerca de 50°C a cerca de 90°C. Claro que tais temperaturas variarão dependendo do tipo específico de sistema catalisador utilizado, do tipo específico de monómeros de ciclo-olefina e semelhantes. Quando se utilizam os sistemas catalisadores descritos acima, a mistura do monómero de ciclo-olefina e do copolímero funcional à base de etileno tem uma boa vida de armazenamento que é de até cerca de 24 horas. Se forem desejáveis tempos mais longos, o sistema catalisador não é adicionado à mistura mas mantido em separado. Assim, após o momento de realização da polimerização dos monómeros de ciclo-olefina, o sistema catalisador é adicionado à mistura e polimerizado em bruto. Um método preferido de polimerização inclui o método rim observado acima. Métodos de Detecção de Sinais a Partir de Amostras O presente invento proporciona também um método de detecção de um sinal, compreendendo o contacto de uma amostra com um dispositivo para medições espectroscópicas, compreendendo: uma camada com baixa fluorescência e elevada transmitância, compreendendo um copolímero de ciclo-olefina e uma plataforma para segurar a camada em que a plataforma é para detecção de um sinal a partir de uma amostra e com a condição de que quando a plataforma é uma placa de microtítulo com uma área de uma placa de microtítulo de 96 poços padrão possuindo poços de microtítulo, o número dos poços de microtítulo não excederá os 864 poços de microtítulo, e a detecção de um sinal a partir da amostra. De preferência a detecção compreende a detecção de epifluorescência a partir do fundo da placa de múltiplos poços ou da plataforma. O passo de detecção pode também utilizar uma série óptica que corresponde à densidade e disposição dos poços na placa de múltiplos poços. Vários marcadores podem ser empregues nos ensaios que utilizam o presente invento. Frequentemente será desejável proporcionar locais de ligação numa placa de múltiplos poços ou plataforma para utilizar como parte do sistema de ensaio. Tais marcadores podem ser directamente ou indirectamente 31 ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ ligados à superfície do polímero. Com o presente invento podem ser empregues diferentes técnicas espectroscópicas, tais como métodos colorimétricos, espectrofotométricos, luminescentes e de fluorescência. Podem ser empregues métodos não espectroscópicos baseados em luz tais como métodos de refracção e reflectância.

Medições de Fluorescência

Reconhece-se que podem ser utilizados diferentes tipos de sistemas de monitorização da fluorescência para praticar o presente invento com sondas fluorescentes, tais como corantes ou substratos fluorescentes. De preferência, são utilizados sistemas dedicados a pesquisa de elevado rendimento, p.ex., placas de microtítulo de 96 poços ou mais. Os métodos de realização de ensaios em materiais fluorescentes são bem conhecidos na especialidade e estão descritos em, p.ex., Lakowicz, J.R., "Principies of Fluorescence Spectroscopy", New York; Plenum Press (1983); Herman, B., Resonance Energy Transfer Microscopy, em: "Fluorescence Microscopy of Living Cells in Culture", Parte B, Methods in Cell Biology, Vol. 30, ed. Taylor, D.L. & Wang, Y-L., San Diego; Academic Press (1989), págs. 219-243; Turro, N.J., "Modern Molecular

Photochemistry", Menlo Park; Benjamin/Cummings Publishing Col., Inc. (1978), págs. 296-361 e o Catálogo da Molecular Probes (1997), OR, USA. A fluorescência numa amostra pode ser medida utilizando um detector aqui descrito ou conhecido na especialidade para placas de múltiplos poços. Em geral, a radiação de excitação, a partir de uma fonte de excitação possuindo um primeiro comprimento de onda, passa opcionalmente através de ópticas de excitação. As ópticas de excitação fazem com que a radiação de excitação excite a amostra. Em resposta, as sondas fluorescentes na amostra emitem radiação que possui um comprimento de onda que é diferente do comprimento de onda de excitação. As ópticas de recolha recolhem então a luz emitida pela amostra. O dispositivo pode incluir um controlador da temperatura para manter a amostra a uma temperatura específica enquanto está a ser varrida. De acordo com uma concretização, uma platina de translação em múltiplos eixos (p.ex., um posicionador X, Y dedicado) move uma placa de microtítulo 32 ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ contendo uma variedade de amostras para posicionar os diferentes poços a expor. A platina de translação em múltiplos eixos, o controlador da temperatura, a caracteristica de auto-focagem e a electrónica associada à recolha de imagem e dados podem ser geridos por um computador digital apropriadamente programado. 0 computador pode também transformar os dados recolhidos durante o ensaio noutro formato para apresentação.

De preferência, é utilizada FRET (transferência de energia de ressonância de fluorescência) como modo de monitorizar sondas numa amostra (celular ou bioquímica). 0 grau de FRET pode ser determinado através de qualquer caracteristica da vida espectral ou de fluorescência da construção excitada, por exemplo, através da determinação da intensidade do sinal de fluorescência do dador, da intensidade do sinal de fluorescência do aceitador, da razão entre as amplitudes de fluorescência próximo dos máximos da emissão do aceitador e as amplitudes de fluorescência próximo do máximo de emissão do dador, ou da vida do estado excitado do dador. Por exemplo, a clivagem do ligante aumenta a intensidade de fluorescência do dador, diminui a intensidade de fluorescência do aceitador, diminui a razão entre as amplitudes de fluorescência do aceitador e as do dador e aumenta a vida do estado excitado do dador.

De preferência, as alterações no sinal são determinadas como a razão de fluorescência em dois comprimentos de onda de emissão diferentes, um processo referido como "racionamento". As diferenças na quantidade absoluta de sonda (ou substrato), células, intensidade de excitação e turbidez ou outras absorvâncias de fundo entre os poços em questão podem afectar o sinal de fluorescência. Portanto, a razão das duas intensidades de emissão é uma medida de actividade mais robusta e preferida que apenas a intensidade de emissão.

Pode ser utilizado com o presente invento um sistema de sondas raciométricas fluorescentes. Por exemplo, o sistema repórter descrito na publicação PCT WO 96/30540 (Tsien) tem vantagens significativas em relação aos repórteres existentes para análise da integração de genes, uma vez que permite a detecção e o isolamento de células vivas individuais que expressam das que não expressam. Este sistema de ensaio 33 ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ utiliza um substrato fluorescente não tóxico e apoiar que é facilmente carregado e depois aprisionado intracelularmente. A clivagem do substrato fluorescente através da β-lactamase produz uma mudança da emissão fluorescente à medida que o substrato é convertido em produto. Como a leitura do repórter β-lactamase é raciométrica, este é único entre os ensaios de genes repórter por controlar variáveis tais como a quantidade de substrato carregado em células individuais. A leitura intracelular estável e facilmente detectada simplifica os procedimentos de ensaio através da eliminação da necessidade de passos de lavagem, o que facilita a pesquisa com células utilizando o presente invento.

Detector

Numa concretização o presente invento proporciona um detector para monitorizar acontecimentos espectroscópicos com placas de múltiplos poços ou plataformas. De preferência, o detector é um detector de fluorescência e de maior preferência do tipo que pode ser utilizado para epif luorescência. Para algumas concretizações do presente invento, particularmente para placas com 96, 192, 384 e 864 poços por placa, estão disponíveis vários detectores. Tais detectores estão descritos na Patente U.S. 5589351 (Harootunian), na Patente U.S. 5355215 (Schroeder) e no pedido de patente PCT WO 93/12423 (Akong). Alternativamente, uma placa inteira pode ser "lida" utilizando um gerador de imagens, tal como um Molecular Dynamics Fluor-Imager 595. Para aplicações de plataforma do presente invento, leitores ópticos de disco convencionais tais como conhecidos na especialidade relevante podem ser adaptados para análise espectroscópica, bem como para medir luz refractada ou reflectida. 0 detector é de preferência capaz de medições de emissão de fluorescência no intervalo de 400 a 800 nm. Tipicamente, o detector compreende um meio para excitação da fluorescência no intervalo de 350 a 800 nm. O detector é frequentemente capaz de muitos modos diferentes de operação que facilitam os requisitos dos ensaios de descoberta de fármacos. Estes modos de operação podem incluir: um único comprimento de onda de excitação com detecção de um único comprimento de onda de emissão, um único comprimento de onda de excitação e detecção 34 ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ de duplo comprimento de onda de emissão, duplo comprimento de onda de excitação sequencial com detecção de duplo comprimento de onda de emissão e determinação da medição do rácio, duplo comprimento de onda de excitação sequencial com detecção de quatro comprimentos de onda de emissão e determinação da medição do rácio, fluorescência homogénea resolvida no tempo com um único comprimento de onda de excitação e detecção de um único comprimento de onda de emissão, fluorescência homogénea resolvida no tempo com um único comprimento de onda de excitação e detecção de duplo comprimento de onda de emissão e medição da determinação do rácio, fluorescência homogénea resolvida no tempo com duplos comprimentos de onda de excitação sequenciais e detecção de duplo comprimento de onda de emissão com medição da determinação do rácio, duplos comprimentos de onda de excitação sequenciais e detecção de um único comprimento de onda de emissão com medição da determinação do rácio, medição de luminescência a um único comprimento de onda com medição da luminescência a comprimentos de onda duplos, medição de luminescência a comprimentos de onda duplos com uma determinação do rácio e emissão de fluorescência resolvida no tempo (propriedades intrínsecas do corante com ou sem um acontecimento de ligação). 0 detector funciona de preferência no modo de epifluorescência onde a iluminação preferida é do fundo da placa e a recolha preferida é também do fundo da placa. 0 detector pode funcionar em todos os modos acima mencionados com observação do fundo da placa. 0 modo de rácio do detector permite alterações nos níveis do sinal em relação aos níveis do sinal relativo a observar sem calibração do complexo. 0 modo de rácio do detector é tolerante a diferenças nas quantidades dos alvos isolados, células ou carga de corante nas células. Assim, podem existir diferenças entre os poços para os níveis de células e de corante, mas dentro de um único poço essas diferenças podem ser normalizadas para mudança relativa nas intensidades. Sem detecção raciométrica, os níveis de sinal absolutos podem obscurecer as ligeiras diferenças de cada poço. A selecção de diferentes modos de operação do detector é frequentemente baseada no tipo de ensaio a efectuar. Assim, o detector é normalmente desenhado com numerosos modos de 35 ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ operação para proporcionar flexibilidade na detecção. Cada modo é seleccionado com base na sua compatibilidade com um conjunto particular de sondas e reagentes fluorescentes. A detecção é então feita à medida para verificar os requisitos do ensaio e das sondas. 0 presente invento proporciona também um sistema para medições espectroscópicas. 0 sistema compreende reagentes para (1) um ensaio, (2) um dispositivo, compreendendo uma camada com baixa fluorescência e elevada transmitância, compreendendo um copolimero de ciclo-olefina, e uma plataforma para segurar a camada. 0 sistema pode compreender ainda um detector.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Propriedades de Fluorescência das Ciclo-olefinas em Comparação com Vidro e outros Materiais Poliméricos

Para investigar as propriedades de fluorescência de várias películas seleccionadas, foram testadas diferentes películas poliméricas quanto à emissão de fluorescência a comprimentos de onda de excitação predeterminados em comparação com dois tipos de folhas de vidro de sílica fundida (padrão). Estas experiências foram conduzidas utilizando um Fluorímetro SPEX Fluorolog 111 com comprimentos de onda de excitação entre 315 e 425 nm. As películas e os materiais de vidro foram dispostos num suporte. A amostra foi posicionada com o feixe de excitação perpendicular à face da amostra. A emissão de fluorescência a partir da amostra foi recolhida num ângulo de cerca de 12,5 graus. A emissão de fluorescência do material foi reflectida num espelho e para um monocrómetro. A radiação de emissão foi seleccionada através de uma rede monocromática e foi detectada através do tubo fotomultiplicador do instrumento. 0 Fluorímetro SPEX Fluorolog 111 utiliza linhas de radiação de Raman de água para calibrar e corrigir o ruído de fundo das medições do instrumento de dia para dia. Esta correcção do ruído de fundo foi efectuada todos os dias antes da utilização do instrumento para calibração. 0 ficheiro de calibração é guardado com as medições feitas nesse dia e depois as medições subsequentes com o instrumento SPEX podem ser comparadas directamente e corrigidas quanto à flutuação do instrumento. 36 ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ

Os materiais testados foram (1) folhas de silica fundida (lamelas N° 1 de Corning Glass Works (número de catálogo 2935/583331); (2) películas de poliestireno (psl, ps2 (de

Plastic Suppliers) e ps3 (de Dow Chemical Company)); (3) películas de policarbonato (pcl (de General Electric Corporation) e pc2 (de Plastic Suppliers)); (4) polímeros não aromáticos de alquilo (nap; obtidos em Mobil Oil Company); (5) pelicula de copolimero de ciclo-olefina (coc; obtida em Hoechst, Topas); e (6) Aclar (um material de fluorocarbono de Allied Signal). A Tabela 2 mostra os dados de emissão de fluorescência normalizados ao longo de 400 a 650 nm a três comprimentos de onda de excitação diferentes. Os dados são normalizados para a silica fundida e para corrigir a flutuação do instrumento. O poliestireno, que é frequentemente utilizado como um componente de placas de múltiplos poços (ver Tabela 1), gerou elevados níveis de fluorescência de fundo, consistente com a sua estrutura aromática. Surpreendentemente, o policarbonato, que é frequentemente um polímero biocompatível, foi geralmente melhor que o poliestireno, especialmente em comprimentos de onda maiores. Surpreendentemente, o polímero de alquilo não aromático foi geralmente o segundo melhor polímero ao longo do intervalo de comprimentos de onda testados. Também surpreendentemente, o copolimero de ciclo-olefinas produziu os melhores resultados e quase se aproximou dos níveis de fluorescência extremamente baixos da sílica fundida.

Tabela 2

Material Ex=315 Em=400 Em=425 Em=450 Em=475 Em=500 Em=550 Em=800 Vidro 0,22513 0,25824 0,26817 0,30459 0,33107 0,38735 0,51316 pcl - 5m 3,31071 2,10230 2,01953 1,78778 1,41036 0,66876 0,60586 pc2 - 5m 11,04128 7,04943 6,11517 5,18091 3,79367 1,70432 1,05317 psl - 2m 2,45986 1,96447 1,93714 1,78340 1,52374 1,02494 1,18893 ps2 - 2m 2,20826 1,72697 1,69866 1,64204 1,48633 1,07582 1,18908 ps3 - 2m 4,55807 3,29823 3,00096 2,72352 2,34132 1,57409 1,98743 Nap - 1, 5m 1,01919 0,75307 0,62850 0,52942 0,50110 0,56622 1,12111 Nap - 1, 5m 0,52658 0,48978 0,42466 0,37654 0,38220 0,50960 1,00787 Coc - limpo 0,40485 0,40485 0,34256 0,31142 0,31142 0,41617 0,83234 Aclar - 0,75m 0,08473 0,08875 0,07864 0,07368 0,07503 0,09701 0,22497 Aclar - 3m 0,27245 0,28586 0,26367 0,26522 0,29309 0,44479 1,03199 37 ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ

Ex=350 Em=400 Em=425 Em=450 Em= 4 75 Em=500 Em=550 Em=600 Em=650 Vidro 0,30790 0,20526 0,23837 0,17547 0,16222 0,17878 0,25492 pol - 5m 0,77802 0,62572 0,60586 0,50323 0,42708 0,31452 0,33769 pc2 - 5m 3,96354 2,74616 2,20826 1,61373 1,24568 0,75024 0,62284 psl-2m 1,28801 1,44858 2,22754 2,06013 1,78340 1,06594 0,84387 ps2 - 2m 1,01919 1,34477 1,85437 1,84021 1,64204 1,08997 0,89180 ps3-2m 2,13182 2,68388 3,47092 3,14252 2,68388 1,57692 1,29381 Nap-1,5m 0,95408 0,80120 0,81536 0,59170 0,53508 0,58321 0,79554 Nap - 1,5m 0,53791 0,48695 0,55206 0,39918 0,39918 0,48129 0,69079 Coc - limpo 0,42466 0,38220 0,43033 0,31142 0,31142 0,38503 0,56056 Aclar - 0,75m 0,08689 0,08710 0,08869 0,07327 0,07224 0,08050 0,10733 Aclar - 3m 0,24045 0,23323 0,24974 0,21981 0,23375 0,31373 0,43756 Ex-400 Em=400 Em= 425 Em=450 Em= 4 75 Em=500 Em=550 Em=600 Em=650 Vidro 0,29134 0,21520 0,25492 0,18540 0,26817 0,43039 pcl-5m 0,38073 0,30459 0,32114 0,22844 0,31783 0,48667 pc2 - 5m 0,65115 0,59736 0,62284 0,43033 0,53791 0,77855 psl - 2m 0,55347 0,55347 0,67646 0,43731 0,61155 0,91561 ps2 - 2m 0,49544 0,50960 0,60869 0,46996 0,65115 1,00221 ps3 - 2m 0,75873 0,80120 0,97107 0,63417 0,86065 1,24568 Nap - l,5m 0,57754 0,59170 0,67663 0,50110 0,72476 1,08431 Nap - 1,5m 0,41900 0,39635 0,50394 0,42466 0,66248 1,05883 Coc - limpo 0,32558 0,33407 0,41900 0,37087 0,55489 0,87198 Aclar- 0,75m 0,06295 0,06295 0,07121 0,06966 0,10010 0,15686 Aclar - 3m 0,14138 0,14654 0,17750 0,20433 0,32405 0,47988

Exemplo 2: Propriedades de Fluorescência das Ciclo-olefinas em Comparação com Vidro e Outros Materiais Poliméricos

Para investigar melhor as propriedades de fluorescência das várias películas seleccionadas, diferentes películas poliméricas foram testadas quanto à emissão de fluorescência a comprimentos de onda de excitação predeterminados e comparadas com dois tipos de folhas de vidro de sílica fundida (padrão). Estas experiências foram conduzidas para simular ensaios bioquímicos ou baseados em células que envolvem meios aquosos. Portanto, as películas foram montadas num suporte de plástico horizontal para permitir a adição de uma gota de meio aquoso. Três mililitros de água foram dispensados sobre a película e a fluorescência foi registada utilizando um microscópio de fluorescência invertido Zeiss. 0 ruído de fundo na ausência de 38 ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ película foi registado e subtraído dos sinais na presença de película.

Os materiais testados foram (1) folhas de sílica fundida (lamelas Fisher Número 1 (número de catálogo Fisher 12-542B (1996)); (2) películas de poliestireno (psl, ps2 (de Plastic Suppliers) e ps3 (de Dow Chemical Company)); (3) películas de policarbonato (pcl (de General Electric Corporation) e pc2 (de Plastic Suppliers)); (4) polímeros não aromáticos de alquilo (obtidos em Mobil Oil Company); (5) película de copolímero de ciclo-olefina (coc; obtida em Hoechst, Topas); (6) Aclar (um material de fluorocarbono de Allied Signal); e (7) Syran Wrap. A Tabela 3 mostra os dados de emissão de fluorescência normalizados a 460 nm, a 350 e 405 nm (comprimentos de onda de excitação). Os dados são normalizados para sílica fundida. O poliestireno, que é frequentemente utilizado como um componente de placas de múltiplos poços (ver Tabela 1), gerou elevados níveis de fluorescência de fundo, consistente com a sua estrutura aromática tal como no Exemplo 1. Em contraste com o Exemplo 1, o policarbonato, que é frequentemente um polímero biocompatível, foi pior que o poliestireno, especialmente em comprimentos de onda maiores. Geralmente consistente com o Exemplo 1, o polímero de alquilo não aromático foi geralmente melhor que o poliestireno ao longo do intervalo de comprimentos de onda testados. Geralmente consistente com o Exemplo 1, o copolímero de ciclo-olefinas produziu os melhores resultados e surpreendentemente superou os níveis de fluorescência extremamente baixos da sílica fundida. A película de Aclar também produziu surpreendentemente valores de fluorescência baixos ou extremamente baixos relativamente à sílica fundida. 39 ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ

Tabela 3

Material 350ex/ Pos. 460em Material 405ex/ Pos 460em lamela Fisher #1 1,02 1 lamela Fisher #1 1,03 1 policarbonato 5mil 6,91 6 policarbonato 5mil 19,79 6 poliestireno 2mil 3,57 5 poliestireno 2mil 3,36 4 NAP 1,5 ml 2,06 3 NAP 1,5 ml 5,76 3 NAP 1,5 ml 1,33 3 NAP 1,5 ml 3,51 3 coc#2 2mil 1,58 2 coc#2 2mil 2,60 2 coc#l 2mil 1,22 2 coc#l 2mil 1,59 2 amostra Aclar (>2 anos id.) 2,62 4 amostra Aclar (>2 anos id.) 9,08 5 Material 350ex/ Pos. 460em Material 405ex/ Pos 460em lamela Fisher #1 1,00 5 lamela Fisher #1 1,00 1 policarbonato 5mil 5,15 9 policarbonato 5mil 17,75 8 poliestireno lmil 2,01 7 poliestireno lmil 2,53 7 coc#2 A 2mil 1,09 6 coc#2 A 2mil 1,71 4 coc#2 B 2mil 0,89 4 coc#2 B 2mil 1,65 3 coc#l 2mil 0,86 3 coc#l 2mil 1,47 2 Aclar 3mil (<1 ano id.) 0,71 1 Aclar 3mil (<1 ano id.) 2,34 6 Aclar 0,75mil (<1 ano id.) 0,64 1 Aclar 0,75mil (<1 ano id.) 2,14 5 Syran Wrap 4,18 8 Syran Wrap 22,12 9

Exemplo 3: As ciclo-olefinas não são Citotóxicas para Células em Cultura A citotoxicidade da ciclo-olefina foi avaliada através da incubação de células em placas de múltiplos poços de ciclo-olefina durante 60 horas a 37°C. 1,8 μΐ de volume do meio contendo cerca de 90 células de ovário de hamster chinês (CHO) foram colocados em placas de múltiplos poços de ciclo-olefina utilizando uma pipeta cónica. Uma cobertura de vidro foi colocada sobre os poços para impedir a evaporação. As células foram incubadas durante 60 horas numa incubadora com CO2 a 5%, 37°C, e com HR a 90%. As células foram então testadas quanto à viabilidade através de carga com o corante vital calceina. As células CHO foram carregadas através da incubação numa solução contendo calceina 4 μΜ/ΑΜ durante 30 minutos à temperatura 40 ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ ambiente. As células foram inspeccionadas utilizando microscopia de contraste de fase para determinar o número total de células e microscopia de fluorescência para determinar o número de células vivas. Aproximadamente, mais de 95% das células estavam vivos tal como indicado pela carga com o corante calceina (aproximadamente 200 células/poço).

Exemplo 4: As Ciclo-olefinas não são Citotóxicas para Células em Cultura e podem ser Utilizadas para Ensaios de Pesquisa de Fármacos

Para investigar as propriedades citotóxicas das ciclo-olefinas, foi testada película de ciclo-olefinas utilizando um ensaio da viabilidade celular. CCF2, um corante vital, tal como descrito na publicação PCT WO 96/30540 (Tsien), difunde-se para dentro das células e é aprisionado por células vivas possuindo actividade de esterase que cliva grupos éster nas moléculas o que resulta numa molécula de carga negativa que fica aprisionada dentro da célula. O corante aprisionado aparece verde dentro das células vivas. CCF2 foi incubado com células Jurkat durante uma hora num poço de 1 microlitro possuindo paredes negras e um fundo de ciclo-olefina e a fluorescência foi apropriadamente monitorizada. Estas células de Jurkat estavam a expressar constitutivamente β-lactamase. As células foram cultivadas durante 60 horas nas condições do Exemplo 3. Após 60 horas, a actividade da β-lactamase foi medida utilizando CCF2. As células apareciam azuis indicando que a β-lactamase estava de facto activa nestas células, que normalmente não contêm β-lactamase. Estes resultados demonstram que as ciclo-olefinas podem ser utilizadas com ensaios fluorescentes sensíveis porque as películas produzem baixos ruídos de fundo fluorescentes. Isto é particularmente benéfico porque permite volumes de ensaio menores (p.ex., 2 microlitros ou menos) e a medição de sinais mais pequenos (p.ex., de poucas células ou de um número mais pequeno de alvos bioquímicos isolados).

Publicações

Todas as publicações, incluindo documentos de patentes e artigos científicos, referidas neste pedido são incorporadas por referência na sua totalidade para todos os fins na mesma medida como se cada publicação individual fosse individualmente incorporada por referência. 41 ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ

Todos os títulos são para conveniência do leitor e não devem ser utilizados para limitar o significado do texto que se segue aos títulos, a menos que especificado dessa forma.

Lisboa,

Claims (38)

1. ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ 1/5 REIVINDICAÇÕES 1. Dispositivo para medições espectroscópicas, compreendendo: uma plataforma; e uma camada de polímero com baixa fluorescência e elevada transmitância separadamente depositada na referida plataforma, em que a referida camada de polímero produz cerca de 400 porcento ou menos de fluorescência em comparação com sílica fundida de cerca de 150 micrómetros de espessura a comprimentos de onda de excitação entre 300 e 400 nm e a comprimentos de onda de emissão entre cerca de 300 e 800 nm, e em que a referida camada de polímero compreende um polímero baseado em ciclo-olefina.
2. 2. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, em que a referida plataforma é uma placa de microtítulo com uma área de uma placa de microtítulo de 96 poços padrão e possuindo poços de microtítulo.
3. 3. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, em que a referida plataforma é uma placa de múltiplos poços para detecção de um sinal a partir de uma amostra e a referida camada forma pelo menos uma porção de uma superfície do fundo de um poço da referida placa de múltiplos poços.
4. 4. Dispositivo de acordo com a reivindicação 3, em que a referida placa de múltiplos poços possui entre cerca de 96 e cerca de 3456 poços.
5. 5. Dispositivo de acordo com a reivindicação 4, em que a referida placa de múltiplos poços compreende paredes dos poços feitas com um material diferente de um polímero de ciclo-olefina.
6. 6. Dispositivo de acordo com a reivindicação 5, em que a referida camada compreende uma soldadura por fusão térmica com os referidos poços.
7. 7. Dispositivo de acordo com a reivindicação 6, em que a referida camada possui uma espessura de cerca de 50 a 300 micrómetros. ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ 2/5
8. 8. Dispositivo de acordo com a reivindicação 6, em que a referida camada produz cerca de 200 porcento ou menos de fluorescência em comparação com vidro de sílica fundida de 100 micrómetros de espessura a comprimentos de onda de excitação entre cerca de 300 e 400 nm e a comprimentos de onda de emissão entre cerca de 300 e 800 nm.
9. 9. Dispositivo de acordo com a reivindicação 4, em que a referida placa de múltiplos poços compreende poços feitos com um copolímero de ciclo-olefina.
10. 10. Dispositivo de acordo com a reivindicação 9, em que a referida camada compreende uma soldadura por fusão térmica com os referidos poços.
11. 11. Dispositivo de acordo com a reivindicação 9, em que a referida camada possui uma espessura de cerca de 50 a 200 micrómetros.
12. 12. Dispositivo de acordo com a reivindicação 9, em que a referida camada produz cerca de 200 porcento ou menos de fluorescência em comparação com vidro de sílica fundida de 100 micrómetros de espessura a comprimentos de onda de excitação entre cerca de 300 e 400 nm e a comprimentos de onda de emissão entre cerca de 300 e 800 nm.
13. 13. Dispositivo de acordo com a reivindicação 4, em que a referida camada possui uma espessura de cerca de 20 a 300 micrómetros.
14. 14. Dispositivo de acordo com a reivindicação 13, em que a referida placa de múltiplos poços compreende um pigmento para redução do ruído de fundo.
15. 15. Dispositivo de acordo com a reivindicação 13, em que a referida camada compreende ainda um membro de um par de ligação.
16. 16. Dispositivo de acordo com a reivindicação 13, em que a referida camada compreende ainda uma pluralidade de células vivas. ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ 3/5
17. 17. Dispositivo de acordo com a reivindicação 15, em que a referida camada compreende ainda um revestimento para aumentar a fixação das células.
18. 18. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, em que a referida plataforma é uma armação para uma matriz de locais de ensaio espacialmente predeterminados na referida camada e a referida armação não interfere substancialmente com a detecção de um sinal dos referidos locais de ensaio.
19. 19. Dispositivo de acordo com a reivindicação 18, em que a referida camada possui uma espessura de cerca de 40 a 300 micrómetros.
20. 20. Dispositivo de acordo com a reivindicação 19, em que os referidos locais de ensaio têm de cerca de 10 micrómetros quadrados a 200 micrómetros quadrados de área.
21. 21. Dispositivo de acordo com a reivindicação 19, em que a referida camada é derivatizada para ligação de entidades quimicas.
22. 22. Dispositivo de acordo com a reivindicação 20, em que os referidos locais de ensaio são impressos na referida camada.
23. 23. Dispositivo de acordo com a reivindicação 20, em que os referidos locais de ensaio compreendem um membro de um par de ligação.
24. 24. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, em que a referida plataforma compreende um copolimero de ciclo-olefina.
25. 25. Processo para produção de um dispositivo para medições espectroscópicas de acordo com a reivindicação 1, compreendendo: deposição em separado de uma camada de polímero com baixa fluorescência e elevada transmitância numa plataforma polimérica em que a referida camada de polímero compreende um polímero baseado em ciclo-olefina. ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ 4/5
26. 26. Processo de acordo com a reivindicação 25, em que a referida plataforma é uma placa de microtitulo com uma área de uma placa de microtitulo de 96 poços padrão possuindo poços de microtitulo.
27. 27. Processo de acordo com a reivindicação 25, em que o referido polímero é seleccionado a partir do grupo de copolímero de ciclopenteno e polietileno, copolímero de ciclo-hexano e polietileno e copolímero de ciclo-hepteno e polietileno.
28. 28. Processo de acordo com a reivindicação 25, compreendendo ainda o passo de exposição da referida camada e do referido polímero a uma quantidade suficiente de energia de radiofrequência para promover o aquecimento interno da referida camada e do referido polímero.
29. 29. Processo de acordo com a reivindicação 25, em que a referida deposição compreende a soldadura por calor da referida camada de polímero com a referida plataforma polimérica a uma temperatura de 320 graus.
30. 30. Processo de acordo com a reivindicação 25, compreendendo ainda o passo de aplicação de entre cerca de 1034-1512 bar (15 000 e 22 000 psi) de pressão à referida camada e ao referido polímero.
31. 31. Sistema para medições espectroscópicas, compreendendo: reagentes para um ensaio, e o dispositivo de acordo com a reivindicação 1 em que a referida plataforma é para detecção de um sinal a partir de uma amostra.
32. 32. Sistema de acordo com a reivindicação 31, em que a referida plataforma possui uma área de uma placa de microtitulo de 96 poços padrão possuindo poços de microtitulo.
33. 33. Sistema de acordo com a reivindicação 31, compreendendo ainda um detector.
34. 34. Método de detecção de um sinal, compreendendo: ΕΡ Ο 921 857/ΡΤ 5/5 colocação da amostra em contacto com o dispositivo de acordo com a reivindicação 1 em que a referida plataforma é para detecção de um sinal a partir da referida amostra, e detecção de um sinal a partir da referida amostra.
35. 35. Método de acordo com a reivindicação 34, em que a referida plataforma é uma placa de microtítulo com uma área de uma placa de microtítulo de 96 poços padrão possuindo poços de microtítulo.
36. 36. Método de acordo com a reivindicação 34, em que a referida detecção compreende a detecção de epifluorescência a partir do fundo da referida plataforma.
37. 37. Método de acordo com a reivindicação 34, em que a referida plataforma é uma placa de múltiplos poços e a referida detecção compreende detecção com uma série óptica que corresponde à densidade dos poços na referida placa de múltiplos poços.
38. 38. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, em que a referida camada de polímero produz cerca de 100 a 50 porcento ou menos de fluorescência em comparação com sílica fundida de cerca de 150 micrómetros de espessura. Lisboa,