KR20020042632A - 마이크로어레이 및 이들의 제작 방법 - Google Patents

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KR20020042632A
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fibers
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array
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KR1020027001337A
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노르만 지. 앤더슨
엔. 리이 앤더슨
제임스 에이. 브라츠
Original Assignee
엔. 레이 앤더슨
라지 스케일 프로테오믹스 코포레이션
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Publication date
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Abstract

본 발명은 생반응 분자를 함유하는 마이크로 어레이에 관한 것이며, 마이크로어레이를 제작하는 방법에 관한 것이다. 상기 어레이는 각각 다수의 동일한 어레이를 생성시키는 유일한 반응물질을 함유하는 세관 또는 막대의 다발을 절편화시킴으로써 제작된다.

Description

마이크로어레이 및 이들의 제작 방법{MICROARRAYS AND THEIR MANUFACTURE}
마이크로어레이는 본질적으로 이차원적인 지지물 또는 시트(sheet)이고 상기 지지물 또는 시트의 상이한 부분 또는 셀(cell)(섹터(sector))는 여기에 결합된 누클레오티드, 폴리누클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 당류 또는 다당류와 같은 상이한 생분자 또는 엘리먼트를 가지고 있다. 마이크로어레이는 이러한 마이크로어레이와 연관된 검정이 작은 규모로 수행됨으로써 많은 검정이 병렬적으로 수행될 수 있도록 해주는 것을 제외하고는 다른 고상(solid phase) 검정과 원칙적으로 유사하다. 마이크로어레이는 전형적으로 생물학에서 수많은 분석학적 목적을 위해 사용되고 있다.
마이크로어레이상의 생화학 분자는 마이크로어레이상의 특정 셀(섹터)에서 또는 특정 셀(섹터)상에서 직접 합성되거나, 사전형성된 분자는 화학적 커플링, 흡착 또는 기타 수단에 의해 마이크로어레이의 특정 셀(섹터)에 부착된다. 상이한셀(섹터)의 수 및 따라서 하나 이상의 마이크로어레이상에서 동시에 시험될 상이한 생화학 분자의 수는 수천개가 될 수 있다. 상용 마이크로어레이 플레이트 판독기는 전형적으로 각각의 셀(섹터)에서의 형광성을 측정하며 동시에 수천개의 반응에 대한 데이터를 제공함으로써 시간과 노동력을 절약할 수 있다. 당분야의 특허의 대표적인 예는 미국 특허 제 5,545,531호이다.
현재, 고분자의 이차원적 어레이는 고분자가 표면에 결합하거나 결합되도록 하는 조건하에서 평면상에 작은 분취액을 증착시킴으로써 수행되거나, 고분자는 광-활성화 반응 또는 기타 합성 반응을 사용하여 상기 표면상에서 합성될 수도 있다. 선행 방법은 또한 프린팅 기술을 사용하여 상기 어레이를 생성시키는 것을 포함한다. 어레이를 생성시키기 위한 일부 방법은 문헌[참조: "Gene-Expression Micro-Arrays: A New Tool for Genomics", Shalon, D., in Functional Genomics; Drug Discovery from Gene to Screen, IBC Library Series, Gilbert, S.R. & Savage, L.M., eds., International Business Communications, Inc., Southboro, MA, 1997, pp 2.3.1.-2.3.8; "DNA Probe Arrays: Accessing Genetic Diversity", Lipshutz, R.J., in Gilbert, S.R. & Savage, L.M., supra, pp 2.4.1.-2.4.16; "Applications of High-Throughput Cloning of Secreted Proteins and High-Density Oligonucleotide Arrays to Functional Genomics", Langer-Safer, P.R., in Gilbert, S.R. & Savage, L.M., supra; Jordan, B.R., "Large-scale expression measurement by hybridization methods: from high-densities to "DNA chips", J. Biochem.(Tokyo) 124: 251-8, 1998; Hacia, J.G., Brody, L.C. & Collins, F.S.,"Applicaitons of DNA chips for genomic analysis", Mol. Psychiatry 3: 483-92, 1998; and Southern, E.M., "DNA chips: Analyzing sequence by hybridization to oligonucleotides on a large scale", Trends in Genetics 12: 110-5, 1996]에 기술되어 있다.
기술과 상관없이, 각각의 마이크로어레이는 별도로 개별적으로 제작되었고, 전형적으로는 유일하게 한번씩 사용되었으며 개별적으로 사전에 예비측정되어 평가될 수 없다. 따라서, 기술은 오차없는 어레이를 생성시키기 위한 생성 시스템의 재현성에 의존한다. 이러한 인자는 현재 생성된 바이오칩 또는 마이크로어레이의 고비용의 원인이 되었고, 일상적인 임상학적 사용을 위한 기술의 적용을 고무시켰다.
스캐닝 어레이를 위해, 전하결합소자(CCD) 카메라가 사용될 수 있다. 이러한 장치의 비용은 현재 폭넓게 유용한 적절한 카메라 및 소프트웨어에 의해 꾸준히 낮아지고 있다. 이러한 장치는 일반적으로 광원 또는 흡광도를 검출한다. 하나의 제안된 변형법에서, 어레이는 광섬유의 다른 쪽 말단에 부착된 핵산 또는 항체/항원과 함께 광섬유의 다발의 말단에 위치된다. 그런 다음 형광성의 검출을 광섬유를 통해 수행할 수 있다[참조: 미국 특허 제 5,837,196호].
광섬유 어레이는 유리 또는 플라스틱 섬유가 전부 병렬로 유지되도록 하는 수단으로 병렬로 정렬되도록 생성될 수 있으며, 광학 이미지는 어레이를 통해 전달될 수 있다. 병렬 어레이는 또한 중공(hollow) 유리 섬유로 제작될 수 있으며, 어레이는 광학 이미지를 증폭하기 위해 사용되는 채널 플레이트를 생성시키기 위해섬유의 축에 대해 정상적으로 절편될 수 있다. 이러한 장치는 야시 및 기타 광학 신호 증폭 장비를 위해 사용된다. 채널 플레이트는 채널 플레이트 다발의 절편 후에 채워지는 개별적인 구멍과 구멍의 별도의 그룹에 고정되는 개개의 단백질 또는 핵산과의 결합 반응의 검출을 위해 적용되었다(미국 특허 제 5,843,767호).
중공 다공성 섬유는 예컨대, 신장 투석기에서 생물학적 샘플의 투석 및 정수를 위해 사용되고 있다. 병렬로 섬유를 정렬시키고, 플라스틱을 사용하여 섬유사이에 볼륨을 스며들게 하고, 이러한 어레이의 말단을 절단하기 위한 방법은 문헌[미국 특허 제 4,289,623호)에 기술되어 있다.
고정된 효소는 예컨대, 이탈리아 특허 제 836,462호에 기술된 바와 같이 에멀션으로부터 섬유 형태로 제조될 수 있다. 항체 및 항원은 미국 특허 제 4,031,201호에 기술된 바와 같이 고상 섬유내로 혼입된다. 다수의 기타 상이한 고정 기술이 고상 면역검정, 핵산 하이브리드화 검정 및 고정된 효소의 분야에 공지되어 있다[참조: Hermanson, G.T.,Bioconjugate Techniques. Academic Press, New York. 1995, 785 pp; Hermanson, G.T., Mallia, A.K. & Smith, P.K.Immobilized Affinity Ligand Techniques. Academic Press, New York, 1992, 454 pp; andAvidin-Biotin Chemistry: A Handbook. D. Savage, G. Mattson, S. Desai, G. Nielander, S. Morgansen & E. Conklin, Pierce Chemical Company, Rockford IL, 1992, 467 pp].
현재 유용한 바이오칩은 유일한 클래스의 고정된 반응물질을 포함하며, 유일한 클래스의 반응을 수행한다. 많은 타입의 임상학적 분석 및 기타 분석을 위해,하나의 칩에 상이한 방식으로 고정된 반응물질을 혼입시킬 수 있는 칩이 필요하다.
발명의 요약
본 발명은 각각 상이한 부착된 관심있는 생물학적 작용제를 함유하는 막대 또는 세관을 생성시키고; 병렬 다발의 막대 또는 세관을 정렬 및 유지시키고; 임의로, 절편될 수 있는 부착 물질로 다발을 스며들게 하거나 임베딩시키고; 임의로, 다발의 모든 엘리먼트가 스며든 후에 번들의 전체 길이에 걸쳐 일정한 정렬 또는 패턴을 유지하는 것을 점검하고; 다수의 동일한 어레이 또는 칩을 생성시키기 위해 다발을 절편하고; 예컨대, 효소 활성, 면역화학 활성, 핵산 하이브리드화, 및 예컨대, 형광성, 흡광도 또는 화학 발광 신호를 생성시키는 조건하에서의 소분자 결합에 기초하여 개별적인 어레이 또는 칩에 대해 여러가지 상이한 생화학적 정량 분석을 수행하여, 임상학적 및 실험적으로 유용한 데이터를 생성시키기 위해 전자적으로 처리 및 비교될 수 있는 신호의 이미지를 획득하는 방법에 관한 것이다.
한가지 측면에서, 본 발명은 관심있는 작용제를 함유하고, 이에 의해 코팅된 긴 필라멘트 또는 튜브 또는 여기에 임베딩된 관심있는 작용제를 가진 긴 필라멘트 또는 튜브, 및 이들의 제작 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 섬유를 정렬시켜 나머지 모두에 대해 각각의 섬유의 위치가 다발이 전체 길이에 걸쳐 유지되도록 다발을 형성시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 전체 길이에 걸쳐 모든 섬유를 부착 또는 접착시키기 위한 수단 및 방법에 관한 것이다.
관련된 측면에서, 본 발명은 마이크로어레이의 제작에 관한 것이며, 여기서,연장된 필라멘트 및 튜브는 함께 다발을 이루고 마이크로어레이를 형성시키기 위해 짧은 간격으로 가로로 여러번 절단되어 이들의 횡단절편을 생성시키고 이렇게하여 마이크로어레이가 제작된다.
본 발명의 추가적인 측면은 튜브 또는 섬유가 필수적인 마커를 포함하거나 섬유가 이들의 전체 길이를 따라 구별되도록 해주는 중공 섬유에 함유된 매질에 함유된다는 것이다.
본 발명의 추가적인 측면은 다발의 한 쪽 말단에서 개별적으로 섬유를 조사하고, 섬유 정렬의 완전성을 확인하기 위해 광전기적 수단에 의해 다른 쪽 말단을 확인하는 수단을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 관심있는 작용제를 함유하는 섬유를 형성시키거나, 여기에 하나 또는 하나의 클래스의 관심있는 작용제를 고정시키기 위한 수단에 관한 것이다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 생물학적 세포, 조직 또는 감염성 작용제의 전체 또는 단편을 생물학적 물질이 세관의 각각의 섬유의 절단된 말단상에 노출되도록 하는 수단으로 섬유 또는 세관에 임베딩시키거나 부착시키기 위한 수단에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 어레이는 튜브 벽에 부착하는 겔 또는 기타 중합화 물질을 함유하는 세관으로 구성된다.
본 발명의 추가적인 측면에서, 관심있는 작용제는 작은 튜브의 내강내의 중합화 또는 현탁 매질에 부착한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 관심있는 작용제는 중합화 매질중에 현탁된 입자에 부착되며, 이 현탁물은 어레이 다발 및 어레이를 제작하기 위해 사용되는 세관을 채우기 위해 사용된다.
본 발명은 추가로 핵산 서열분석, 리보핵산(RNA) 및 데옥시리보핵산(DNA)의 복합 혼합물의 분석, 및 동일물을 함유하는 섬유 또는 튜브의 긴 다발을 절편화함으로써 단백질, 다당류, 유기 중합체 및 저분자량 피분석물을 포함하는 기타 피분석물의 검출 및 정량하는데에 사용하기 위한 고정된 핵산 기재 작용제의 동일한 평면 이차원 어레이의 대규모 생성을 위한 방법에 관한 것이다.
관련된 측면에서, 본 발명은 하나 내지 다수의 관심있는 작용제의 다수의 샘플의 대량 스크리닝을 위해 마이크로어레이를 이용하는 것에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 제작 후에 각각의 섬유에 대해 품질 대조 검정을 수행하여 충분히 기능성인 섬유만을 섬유 다발에 포함시킬 수 있다.
추가의 관련된 측면에서, 본 발명은 임의적으로 구분된 순서로 수행된 상이한 칩 또는 마이크로어레이상에서의 시험들의 세트의 개발에 관한 것이며, 이것은 사람 질환의 진단의 비용, 지연 및 불편을 감소시키는 반면, 통상적인 시험의 시간 소모적인 계속적인 장벽에 의해 보통 얻어지는 복잡한 데이터를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 몇가지 동일한 어레이가 동일한 슬라이드 및 시험 세편상에 설치되도록 하여, 품질 대조 목적을 위해 교차-비교되도록 해주기에 충분히 저렴한 동일한 어레이의 제조에 관한 것이다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 어레이의 물질에 비형광성 염료 또는 기타 흡광 물질을 혼입시켜 형광성을 여기시키기 위해 사용된 광이 어레이를 관통하는 깊이를 제어함으로써, 형광성 피분석물이 검출되는 깊이를 제어하고, 셀의 용량내로 너무 깊이 확산하여, 확산되지 않는 형광성 피분석물이 검출되지 않음을 확인하는 것에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 세관이 지지물 매질을 완전히 채웠는지 및 공백 또는 공기 방울이 없는지를 결정하기 위한 방법에 관한 것이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 유체정역학적 힘 또는 원심분리 힘을 사용하여 지지 매질로 작은 튜브를 완전히 채우기 위한 방법 및 장치에 관한 것이다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 생체분석을 위한 바이오칩 또는 마이크로어레이의 재생가능한 제작에 관한 것이다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 어레이의 디자인 및 생성에 관한 것이며, 이것은 특정 질환을 검출하고 진단하기 위해 특별히 디자인된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 멀티웰 플레이트 및 이드의 제작 방법에 관한 것이다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 시간의 경과에 따라 형광도 및 흡수치를 연속 측정하고, 시간의 경과에 따라 어레이의 각각의 엘리먼트의 형광도 및 흡수치의 변화율을 결정하기 위한 수단을 제공함으로써 다중-병렬 검정의 동적 범위를 증가시키는 것에 관한 것이다.
하나 이상의 바이오칩이 각각의 분석, 및 통상적이고 병렬로 동시에 수행될 대조군 및 표준으로 사용될 수 있도록 저렴하고 충분히 표준화된 바이오칩을 생성시키는 것은 본 발명의 추가적인 측면이다. 추적된 품질 보증을 위해, 다발의 상이한 부분 또는 상이한 말단으로부터의 절편이 사용될 수 있다. 다발의 상이한 부분으로부터 절편화하는 한 가지 방법은 중앙에서 다발을 절단하거나 굽히고 두개의 절반을 정렬시켜 단일의 더 큰 다발을 형성시킴으로써 각각의 섬유가 두번식 표시되는 절편을 생성시키는 것이다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 어레이 엘리먼트 또는 셀(섹터)이 튜브, 지지 매질, 고정 표면의 조성에서 서로 상이할 수 있거나 관심있는 작용제의 클래스가 상이한 셀(섹터)에서 상이할 수 있는 칩의 생성에 관한 것이다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 상이한 타입의 반응이 면역학적, 효소학적 또는 하이브리드화 반응을 포함하는 반응과 함께, 어레이의 각각의 셀(섹터)의 표면에서 수행될 수 있는 칩의 생성에 관한 것이다.
본 발명의 추가적인 측면은 별도로 저장될 수 있는 일차원적인 리본형 어레이를 형성시키기 위해 설 부탁하는 섬유 또는 세관의 서브어레이의 생성에 관한 것이다. "리본"은 이차원적 어레이내로 조립되기 전에 품질 대조 분석을 위해 처리될 수 있다. 상이한 일차원적 어레이는 상이한 어레이를 조립하기 위해 사용될 수 있어서, 특정 연구 및 임상학적 요건을 충족시키는 통상적으로 제조된 어레이를 생성시키는 선택권을 제공할 수 있다.
본 발명은 추가로 온도 민감성 반응을 생리학적 온도에서 수행하여, 온도에서의 증가 후에 하이브리드화 반응이 일어나도록 해줄 수 있도록 계속적으로 증가하는 온도와 관련된 다중 병렬 칩-기재 방법의 개발에 관한 것이다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 하나의 화합물을 함유하는 각각의 섬유를 가진 화합물의 라이브러리를 제조하는 것에 관한 것이다. 어레이는 특정 화학적 또는 생물학적 활성을 위해 동시에 모든 화합물을 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1은 마이크로어레이를 생성하기 위한 과정에서 중간 생성물들의 개략도를 도시한 것이다.
도 2는 겔에 임베딩된 고정된 리간드를 갖는 비드를 함유하는 개별적인 세관의 개략도를 도시한 것이다.
도 3은 겔에 부착된 리간드를 갖는 겔을 함유하는 개별적인 세고나의 개략도를 도시한 것이다.
도 4는 셀의 내벽에 부착된 리간드를 갖고, 마이크로웰의 세트를 형성하기 위해 어레이의 하나의 표면을 닫는 수단을 갖는 어레이의 개략도를 도시한 것이다.
도 5는 다발이 절편화되기 전에 모든 섬유가 이들의 올바른 패턴으로 유지되는 것을 보장하기 위한 수단의 개략도를 도시한 것이다.
도 6은 어레이를 확인하는 수단의 개략도를 도시한 것이다.
도 7은 어레이를 스캐닝하기 위한 개략도를 도시한 것이다.
도 8은 섬유 다발을 형성시키는 대안적인 방법을 도시한 것이다.
본 발명은 생반응 분자를 함유하는 마이크로어레이에 관한 것이며, 이를 사용하여 마이크로어레이를 제작하는 방법에 관한 것이다. 상기 어레이는 각각 다수의 동일한 어레이를 생성시키기 위한 유일한 반응물질을 함유하는 세관(tubule) 또는 막대(rod)의 다발을 절편화시킴으로써 제작된다.
용어 "결합 성분", "관심있는 분자", "관심있는 작용제", "리간드" 또는 "수용체"는 다수의 상이한 분자, 생물 세포 또는 응집물일 수 있으며, 이 용어들을 상호교환가능한 것으로 사용하였다. 각각의 결합 성분은 어레이의 셀, 섹터, 부위 및 엘리먼트에 고정되고 검출될 피분석물에 결합한다. 그러므로, 특정 결합 성분을 함유하는 엘리먼트 또는 셀의 위치는 결합될 피분석물이 무엇인지를 결정한다. 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 핵산(누클레오티드, 올리고누클레오티드 및 폴리누클레오티드), 항체, 리간드, 당류, 다당류, 세균, 진균 및 바이러와 같은 미생물, 수용체, 항생제, 시험 화합물(특히 조합 화학에 의해 생성된 화합물들), 식물 및 동물 세포, 세포소기관 또는 각각 및 기타 생물학적 존재물의 분획물 각각은 칩상에 고정되는 경우 결합 성분이 될 수 있다. 또한 각각은 동일물이 칩상의 결합 성분에 결하는 경우 피분석물로서 생각될 수도 있다.
관심있는 분자가 높은 분자량을 가지는 경우, "고분자"라고 칭한다. 일부 생중합체의 용어에서, 높은 분자량은 아미노산, 누클레오티드 또는 당 분자의 길이가 100개를 훨씬 넘는 것을 칭한다.
용어 "결합하다"는 임의의 물리적인 부착 또는 근접 결합을 포함하며, 이는 영구적이거나 임시적일 수 있다. 일반적으로, 수소 결합, 소수성 힘, 반 데르 발스 힘, 공유 및 이온 결합 등의 상호작용은 관심있는 분자와 측정될 피분석물 사이의 물리적인 부착을 촉진시킨다. "결합" 상호작용은 결합이 화학 반응을 일으키는 경우의 상황에서처럼 간단할 수도 있다. 즉 결합 성분이 효소이고 피분석물이 이 효소의 기질인 경우에 전형적이다. 결합제와 피분석물간의 접촉으로부터 생성된 반응은 또한 본 발명의 목적을 위한 결합의 정의에 속한다.
본 출원에서의 용어 "셀", "섹터", "부위" 또는 "엘리먼트"는 유일한 주소에 의해 확인되는 어레이의 단위 성분을 칭하며, 이것은 일반적으로 위치 뿐만 아니라 함량에 의한 그 밖의 셀, 섹터, 부위 또는 엘리먼트와 상이하다. 생물학적 세포는 일반적으로 타입, 예컨대, 미생물, 동물 및 식물 세포에 의해 칭해진다.
용어 "섬유"는 필라멘트 및 중공 모세관 둘 모두를 포함한다. 필라멘트 또는 막대는 단단한 다공성 또는 혼합 형태, 또는 응집 형태의 고체 가닥일 수 있다. 전형적으로 다수의 섬유가 리본 또는 다발에 서로 인접하여 결합함으로써 "섬유 다발"이 형성된다. 섬유 다발은 리본으로서 사용되는 실제 다발의 부분을 구성할 수 있다. 섬유의 횡단면은 둥근 모양, 삼각형, 사각형, 직사각형 또는 다각형과 같은 임의의 모양일 수 있다.
용어 "입자"는 구형, 실형, 브러쉬형 및 많은 불규칙적인 형태를 포함하는, 임의 배치의 다수의 불용성 물질을 포함한다. 입자는 흔히 내부에 규칙적 또는 무작위의 채널을 가진 다공성이다. 예로서 실리카, 셀룰로오스, 세파로오스 비드, 폴리스티렌(고체, 다공성 및 유도체화된) 비드, 제어된-포어 유리, 겔 비드, 졸, 생물학적 세포, 서브셀룰라 입자, 미생물(원생동물, 세균, 효모, 바이러스 등) 미셀, 리포솜, 사이클로덱스트린, 2상 시스템(예컨대, 왁스중의 아가로오스 비드) 등 및 물질을 캡슐화시키는 그 밖의 구조가 있다. 관심있는 단백질을 발현시키는 재조합 숙주 및 바이러스가 특히 바람직하다. 중합체 및 복합체와 같은 특정 고분자량 물질이라도 "입자"를 구성하는 고정 구조로서 역할할 수 있다.
용어 "소결"은 전체 섬유를 실제로 용해시키기 않으면서 섬유의 표면의 부착을 칭한다. 소결은 화학적 또는 열적일 수 있으며 활성화될 수 있는 자신의 부착 성분과 연관될 수도 있다.
용어 "어레이" 및 "마이크로어레이"는 어느정도 상호교환가능한 것으로 사용되며 일반적인 크기에서만 상이하다. 본 발명은 이들 중 어느 것을 제작하고 사용하기 위한 동일한 방법에 관한 것이다. 각각의 어레이는 전형적으로 많은 셀(전형적으로 100-1,000,000+)을 함유하며, 여기서, 각각의 셀은 공지된 위치에 존재하고 관심있는 특이적인 성분을 함유한다. 그러므로 각각의 어레이는 수많은 상이한 관심있는 성분을 함유한다.
본 발명은 핵산 단편, 누클레오티드, 항원, 항체, 단백질, 펩티드, 탄수화물, 리간드, 수용체, 약물 표적물, 생물학적 세포 또는 이들의 하위 분획물(예컨대, 분쇄된 세포, 세포소기관, 용매 추출물 등), 감염원 또는 이들의 하위 분획물, 약물, 독성제 또는 천연 생성물과 같은 생물학적 분자 및 존재물을 포함하는, 고정된 결합 성분을 함유하는 작은 플라스틱 막대, 섬유, 튜브 또는 세관의 다발을 절편화시킴으로써 마이크로어레이, "칩" 또는 "바이오칩"을 제작하는 것이다. 임베딩 매질은, 본 발명에 있어서, 작은 튜브내에 중합되거나 고형화될 수 있거나, 막대 또는 시트로 주조될 수 있다.
튜브는 유리, 금속, 세라믹 또는 플라스틱과 같은 물질일 수 있다. 고정된 결합 성분, 예컨대, 핵산, 단백질, 세포 등은 마이크로튜브의 내부 또는 외부상에서 코팅될 수 있고, 마이크로튜브내 겔중에 함유되거나, 튜브를 채우고 있는 작은 입자 또는 비드에 부착되거나 임베딩된다. 입자 또는 비드는 겔화 물질의 성분일수 있거나 다양한 합성 플라스틱(폴리스티렌 등)으로 만들어진 라텍스 비드와 같은 별도의 성분일 수 있다. 개별적인 섬유가 고체 막대 또는 필라멘트인 경우, 관심있는 작용제는 필라멘트가 거푸집을 통해 주조, 성형 또는 압출되기 전에 플라스틱상 또는 플라스틱내에 혼입된다. 각각의 절단된 절편은 다양한 결합 분석에 사용하기 위한 마이크로어레이를 구성한다.
경제적 장점을 제공하는 본 발명의 핵심적인 측면은 섬유 또는 세관이 장기관 사용하기에 안정한 기능성을 제공하는 방법만을 사용하여 제조된다는 것이다. 매번 새로 제조되어야 하는 액체를 함유하는 단백질과 관련된 그 밖의 방법과 달리, 고정된 단백질은 비교적 건조한 형태로 종종 냉동시킬 필요없이, 장기간 동안 안정하게 유지된다.
섬유내/섬유상에 개별적으로 차후 마이크로어레이의 각각의 성분의 제조는 어레이에 혼입되기 전에 각각의 성분의 기능성 또는 반응성을 검정하고 평가할 수 있도록 해준다. 스포팅(spotting) 기술 및 동일계내 합성 기술 둘 모두는 완료전에 시험하지 못한다. 또한, 품질 대조 검사는 이러한 마이크로어레이의 작은 부분만을 견본으로 시험할 수 있으며, 이는 각각의 섬유가 시험될 수 있는 본 발명과 다른 점이다.
본 발명의 여러 측면을 도 1 내지 도 7에 도시하였다.
일반적인 원리는 도 1에 도시하였으며 여기서 막대 또는 튜브(1)은 관심있는 작용제를 혼입하고 있다. 막대 또는 튜브는 평탄한 병렬 어레이(2)내로 결합될 수 있고, 다음으로 다중 평탄한 어레이는 다중 병렬 다발(3)내로 연결된다. 대안적으로, 다발(3)은 일련의 막대(1)로부터 한 단계로 제작될 수 있다. 다발(3)의 말단은 전체 다발내에 각각의 막대 또는 튜브의 하나의 작은 절편(5)을 함유하는 최종 어레이(4)를 생성시키기 위해 절단 또는 절편화된다. 긴 다발(3)을 만들고, 매우 작은 절편(4)을 절단함으로써, 다수의 동일한 어레이 또는 칩이 형성된다. 예를 들어, 다발(3)이 미터 길이이고, 절편이 10 미크론 두께인 경우, 100,000개의 동일한 칩이 생성될 수 있다.
중공 유리 섬유의 경우, 채널 플레이트내의 섬유와 같이, 중공 섬유는 고정된 반응물을 포함하는 겔 또는 입자로 채워질 수 있고, 전체 다발은 톱질되어 어레이로 될 수 있다.
절편화된 다발을 포함하는 막대 또는 세관은 8개 이상의 클래스로 분류되며, 각 클래스는 아류를 가진다.
제 1 클래스는 막대 또는 필라멘트의 조합물의 부분인 고정된 결합 성분을 가진 고체 막대 또는 필라멘트로 구성된다. 본 발명의 관심있는 작용제는 매우 폭넓은 범위의 화학물질, 복합체, 조직, 생물학적 세포 또는 이들의 분획물을 포함할 수 있다. 핵산, 당, 단백질은 유기 용매중에서의 용해도를 향상시키기 위해 세제로 변형되거나 코팅될 수 있고, 폭넓은 범위의 유기 화합물은 플라스틱을 생성시키기 위해 사용된 것과 같은 중합화 혼합물내로 혼입될 수 있다. 올리고누클레오티드 및 핵산은 예컨대, 메틸렌 클로라이드중에 가용성이고 따라서 중합화 동안 아크릴수지중에 포함될 수 있다.
수많은 중합화 임베딩 작용제가 조직학적 및 조직화학적 연구를 위해 개발되고 있으며, 이 중 일부를 조성, 경화 온도, 사용된 용매 및 점도에 대한 데이터와 함께 표 1에 기재하였다.
표 I
수지* 타입 경화 온도 용매 점도
듀르큐판(Durcupan) - 40℃ 물 중
나노플라스트(Nanoplast) 멜라민 60℃ 물 저
퀘톨651(Quetol641) 에폭시 60℃ 물 저
런던 수지 골드(London Resin Gold) 아크릴수지, UV 경화성 -25℃ 물, EtOH 저
로위크릴 K4M 폴라(Lowicryl K4M Polar) 아크릴수지, UV 경화성 -35℃ 물, EtOH 저
로위크릴 모노스텝 K4M 폴라(Lowicryl Monostep K4Mpolar) 아크릴수지, UV 경화성 -35℃ 물, EtOH 저
로위크릴 K11 폴라(Lowicryl K11 Polar) 아크릴수지, UV 경화성 -60℃ EtOH 저
JB-4 GMA 실온 물 저
JB-4 플러스 메트아크릴레이트 실온 물 저
이뮤노베드(ImmunoBed) GMA 실온 물 저
폴리프리즈(PolyFreeze) 폴리올(Polyol) -15℃ 물 저
* 폴리사이언시스(Polysciences)로부터 입수가능함
고체 섬유를 스며들게 하기 위한 그 밖의 방법은 기전력을 사용하여 고체 섬유의 매트릭스를 통해 관심있는 작용제를 고정시키는 것을 포함한다.
섬유의 제 2 클래스는 동종이 아니며 중합화 또는 겔화 물질은 또한 겔을 더욱 강하게 하기 위해 필라멘트, 분지된 엘리먼트 등과 같은 고체 구조적 엘리먼트를 함유할 수 있고 또한 관심있는 작용제를 위한 부착 부위를 제공할 수 있다. 따라서, 첨가된 성분은 겔을 강하게 하는 역할을 하며 덴드리머 분지된 폴리핵산, 분지되거나 가교된 중합 물질, 금속 또는 유리 섬유를 포함하는 함유물을 위한 부착 부위를 제공할 수 있다. 구조적 엘리먼트의 실, 실형 배치 및 브러쉬형 배치는 강도를 제공하고 섬유가 더욱 쉽게 조작되거나 건조되도록 하기 위해 긴 섬유로 주조될 수 있다. 구조적 엘리먼트는 요망되는 결합 성분을 위해 섬유내에서 고정 성분으로서 역할할 수 있다.
따라서, 본 발명에서 현재 유용한 성형 기술을 사용하여 각각 상이한 관심있는 작용제를 함유하는 아크릴 또는 기타 플라스틱의 긴 섬유를 생성시키는 것은 기술적으로 실현가능하다. 섬유의 절단된 말단은 활성 그룹을 노출시키기 위해 희석 용매로 간단히 처리될 수 있다.
섬유의 제 3 클래스는 성형되거나 주조된 플라스틱을 포함하며, 이것은 제 2 상을 포함한다. 제 2 상은 예컨대, 탄화수소, 수성 또는 플루오로탄소 미세방울, 당의 입자 또는 기타 수용성 물질, 또는 칼슘 카보네이트 입자와 같은 무기 입자의 형태일 수 있으며, 이것은 활성 그룹을 노출시키기 위해 묽은 산에 용해될 수 있다. 용매에 대한 칩의 절단된 표면의 간단한 노출은 함입물의 일부를 용해시킬 것이고 관심있는 작용제를 함유하는 지지 플라스틱의 표면 지역을 증가시킬 것이다.
또한 고체 플라스틱은 단백질 또는 핵산이 부착된 폴리스티렌 라텍스 또는 기타 플라스틱 입자를 혼입하도록 제조될 수 있다. 조건은 지지 플라스틱이 수 미크론의 깊이로 부식되어 활성의 하위입자 표면이 노출되고 지지 플라스틱 라텍스 비드를 용해시키지 않도록 정렬된다. 예를 들어, 플루오르화된 그룹으로 유도체화된 단백질은 테플론(등록상표)(Teflon®) 미세입자에 강하게 부착한다. 예컨대, 아크릴 플라스틱 또는 그 밖의 적합한 임베딩 매질중의 이렇게 유도체화된 테플론(등록상표) 입자는 희석 아크릴 용매, 예컨대, 메틸렌 클로라이드 및 에틸 알콜의 조합에 의해 플라스틱 표면에 부분적으로 노출될 수 있다. 또한, 입자는 다공성 매트릭스내에 임베딩될 수 있다.
관심있는 작용제가 부착된 비드는 세파덱스(Sephadex), 바이오겔(Biogel) 및 나머지와 같은 크로마토그래피에 사용되는 다공성 겔 비드 또는 크로마토그래피에 사용되는 것과 같은 고체 비드일 수 있다. 이러한 지지 구조물을 유도체화시키고 여기에 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 폴리누클레오티드, 당류, 다당류 및 소분자를 결합시키기는 다양한 방법이 개발되고 있으며 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 세관의 제작을 도 2에 도시하였으며 여기서 세관(6)은 입자(9)를 지지하는 겔(8)을 함유하는 튜브(7)로 구성된다. 세관의 단면도(10) 및 확대도(11)는 절단된 말단에서 노출된 입자(12)를 보여준다. 노출된 입자(12)의 표면상에 고정된 반응물질(15)의 존재를 도시하기 위해 14에 지역(13)을 추가로 확대하여 도시하였다.
기술된 모든 막대는 강도를 증가시키고 조작하기 더 용이한 막대를 만들기 위해 이의 중심을 통해 줄 또는 실로 주조될 수 있음에 주목해야 한다.
섬유의 제 4 클래스는 높은 표면 대 질량 비를 가진 다공성 물질을 형성시키기 위해 유리 또는 플라스틱 비드를 소결시킴으로써 제조된다. 이러한 물질은 통상적으로 유리, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE)(Teflon®), Teflon®AF, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌으로부터 제조되며, 폴리스티렌 및 기타 여러 플라스틱으로부터 제조될 수 있다. 열, 압력 또는 용매 증기에 대한 노출은 플라스틱을 소결시킬 수 있다. 소결된 물질은 시트 또는 절단된 막대로 유도체화될 수 있다. 폴리스티렌은 여기에 관심있는 작용제를 커플링시킨다는 점에서 편리하다. 폴리스티렌 유도체화를 위해, 아미노기, 카복실기, 또는 이들의 설프하이드릴기에 의해 단백질의 부착을 가능하도록 해주는 방법은 기술되었다. Teflon®은 기타 플라스틱이 부착하여 유도체화될 수 있는 그룹을 생성시키는 유기 용매중의 금속성 나트륨의 용액을 사용하여 활성화될 수 있다. 폴리에틸렌 및 폴리스티렌은 코로나 플라즈마 방전 또는 전자빔 방사에 의해 활성화될 수 있다. 유리한 접근법은 폴리스티렌과 폴리에틸렌의 소결된 조합물을 만드는 것이다. 또한 나이론 비드가 소결되어 유도체화될 수 있다. 그 밖의 소결된 물질은 공지되어 있거나 개발중에 있으며, 이들 중 다수는 본원에서 적용법을 발견할 것이다.
관심있는 분자는 소결 전 또는 후에 고체 물질에 부착될 수 있다. 리간드의 부착을 위해, 막대는 부착될 물질을 함유하고 있는 튜브에 침지되거나 막대는 띠 로터의 일반적 배치를 갖는 중공 바울 원심분리 로터 내부에 코일링될 수 있지만(참조: Anderson, N.G., Natl. Cancer Inst. Monograph No. 21), 이것은 원심분리적으로 배출될 수 있다. 그런 다음 부착될 물질의 용액을 먼저 소결된 덩어리내로 원심분리시키고, 그런 다음 이의 외부로 원심분리시킨 후에 필요에 따라 세척하였다. 그런 다음 소결된 막대를 건조시키고, 적절한 부착제로 코팅시키고, 다발로 조립하고 절편화시킬 수 있다.
또한, 비드에 부착된 관심있는 작용제 및 아이템을 갖는 비드는 감압하에 성형되어 막대를 형성할 수 있고 막대는 이후 서로 소결될 수 있다. 조립된 튜브들은 다양한 시멘트 또는 중합가능 플라스틱과 함께 결합될 수 있다. 튜브의 외부는 여기에 시멘트 또는 중합가능 플라스틱이 부착되도록 변경 또는 처리될 수 있다.
섬유의 제 5 클래스는 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, Teflon®또는 폴리비닐 클로라이드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 플라스틱으로부터 전형적으로 형성된 중공 불투과성 세관으로 구성되며, 관심있는 작용제가 직접적으로 부착되는 겔 또는 그 밖의 중합화 물질로 완전히 채워진다. 튜브의 외부 표면은 다발화된 튜브에 서로 결합하기 위해 사용되는 부착제를 수용하기 위해 화학적 또는 물리적으로 변형될 수 있다. 또한 내부 표면은 튜브내로 도입된 겔 또는 중합화 혼합물이 바람직하게는 공유 결합에 의해 부착되도록 변형될 수 있다. 아크릴아미드 유도체는 벽에 연결되어 아그릴 아미드를 부착시킬 수 있지만, 젤라틴, 아가 또는 아가로오스 유도체는 각각의 겔과 연결하기 위해 유사하게 부착될 수 있다. 단백질 및 핵산과 같은 관심있는 작용제를 선형 아크릴아미드, 젤라틴 및 아가로오스에 연결시키는 방법은 널리 공지되어 있으며, 유도체화된 분자는 주조를 위해 사용되는 겔내로 혼입될 수 있다. 아크릴아미드는 화학적으로 또는 광활성화를 사용하여 실온에서 겔로 제조될 수 있지만, 저온 겔화 세파로오스는 유용하다. 젤라틴은 주위보다 낮은 온도에서 서서히 응고된다. 튜브를 채우기위해 사용된 중합체는 전형적으로 동종이지만, 관심있는 작용제를 함유할 수 있으며, 이는 중합화 매질에 부착하게 된다. 예로서는 젤라틴에 공유적으로 연결된 아크릴아미드 겔 및 단백질내로 혼입되는 아크릴아미드 사슬을 짧게하기 위한 단백질의 공유적 결합이 포함된다. 따라서, 겔은 유용하거나 변성된 온도에 이들을 노출시키지 않으면서 변하기 쉬운 생분자를 함유하도록 생성될 수 있다. 이러한 튜브의 구조를 도 3에 도시하였으며, 여기서 튜브(16)는 관심있는 작용제(18)가 부착된 가교된 겔(17)로 채워진다. 절편화된 튜브의 측면도(19) 및 단면도(21)은 고정된 작용제(21)의 유용성을 예증한다.
중공 섬유를 사용하여 제조된 어레이는 어레이가 조립되기 전에 공유적으로 또는 적절한 중합체 코팅제 또는 겔중에 생분자로 코팅된 섬유의 내부를 가질 수 있다. 전부는 아니지만 이들의 대부분의 하이드록실기가 폴리이소시아네이트 그룹을 가지고 있는 옥시에틸렌-기재 디올 또는 폴리올과 같은 이소시아네이트 중합체가 적합하다. 일부 이러한 중합체는 폴리우레아/우레탄 중합체로 구성될 수 있다. 중합체는 잘 수화되며 하이드로겔의 범주에 속한다. 적절한 출발 물질에는 글리세롤, 트리메틸프로판 및 트리에탄올아민과 같은 트리올, 테트올 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다. 적절한 폴리이소시아네이트에는 디이소시아네이트 등이 포함된다. 폴리이소시아네이트는 방향족, 지방족 또는 사이클로지방족일 수 있다[참조: Braatz et al., U.S. Patent 5,169,720 and Braatz, J. Biomaterials Applications 9:71-96 (1994)]. 또한, 다발화된 어레이는 개별적인 중공 섬유가 겔이 절편화되기 이전에 용액중에서 생중합체로 채워질 수 있다.
섬유 또는 튜브의 제 6 클래스는 내부 표면에 부착된 관심있는 분자를 갖는 비어있는 불투과성 튜브를 포함하지만, 그렇지 않으면 비어있거나 비어있게 된다. 도 4에 도시한 바와 같이, 절편화된 칩(22)는 중심(26)이 비어있는, 튜브의 내벽에 부착된 관심있는 작용제(25)를 갖는, 지지 플라스틱(24)에 임베딩된 절편화된 플라스틱 튜브(23)로 구성된다. 측면으로 도시된 결과(27)은 절편화된 플라스틱 튜브(23), 고정된 작용제(25), 생성된 빈 구멍(26)을 가지고 있으며 모두 지지 물질(24)에 의해 함께 모여있다. 칩은 초미세역가 플레이트로서 생각될 수 있으며 예컨대, 고정된 친화도 리간드 기술에 기초한 분석을 통한 흐름[참조: Hermanson et al., Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press, 1992, p 407], 고정된 올리고누클레오티드의 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭, 또는 예컨대, 미국 특허 제 5,843,767호에 기술된 바와 같이, 그러한 규모로 수행될 수 있는 기타 검출 반응 등을 위해 사용될 수 있다. 튜브가 친수성이 되도록 내부 또는 외부 표면을 갖는 Teflon®으로 제조되는 경우, 절단된 말단은 소수성으로 남을 것이다. 친수성 시험 용액이 칩의 표면을 가로질러 퍼지는 경우, 용액은 자가-제어 용적측정량으로 구멍으로 흐르는 경향을 나타내고, 유체의 전체량이 적절하게 제어되는 경우, 인접한 셀에 영향을 미치지 않을 경향을 나타낸다. 그런 다음 높은 표면 및 낮은 표면은 적절한 부착 테이프로 봉합될 수 있고, 전체를 예컨대, DNA의 중합효소 연쇄 반응 증폭에 대한 반응으로 처리할 수 있다. 또한 도 4의 칩(33)을 포함하는 샌드위치 구조(32)는 튜브의 말단을 봉합하기 위해 유리 또는 석영(34)과 같은 두 조각의 물질을 사용할 수 있고, 마이크로챔버(35)를 생성시킬 수 있다. 형광성 또는 흡광도(36)에서의 변화는 투명한 말단 창, 및 후속되는 비색계 또는 형광측정 반응을 통해 각각의 튜브 엘리먼트에서 검출될 수 있다.
그 밖의 여러 반응들은 마이크로어레이 내부 또는 마이크로어레이를 제조하기 위해 사용된 중공 섬유 내부에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드, 다당류 또는 폴리누클레오티드는 동일계내에서 합성될 수 있고/있거나 제조된 에스테르, 아미드, 카복실레이트 등과 같은 조합적인 소분자의 라이브러리로 합성될 수 있다. PCR을 포함하여, 동일 반응은 섬유가 반응물질에 대해 충분히 투과성인 경우 고체 섬유를 포함하는, 임의의 다른 타입의 섬유에서 수행될 수 있다.
중공인 경우, 마이크로어레이는 마이크로어레이상 또는 마이크로어레이내에 고정된 어떠한 관심있는 작용제도 갖지 않을 수 있다. 이러한 상황에서, 연구자는 그 자체로 상용 생성물인 매우 작은 멀티웰 플레이트를 갖게 된다. 고정 여부에 상관없이, "비어있는" 중공 섬유내에 생물학적 세포를 위치시킴으로써; 연구자는 특정 작용제에 대한 세포 반응을 결정하기 위해 마이크로어레이를 사용할 수 있다. 연구자는 접촉시에 검출가능한 생성물의 생성을 자극하거나 특정 피분석물과 상호작용하는 생물학적 세포와 함께 기질 또는 반응물질을 동시고정시킬 수도 있다.
통상이 기술이 마이크로어레이를 형성하기 위해 절단되기 전에 섬유 내부에 분자 또는 생물학적 성분을 위치시키는 것인 반면, 본 발명의 구체예는 마이크로어레이가 형성된 이후에 중공 섬유내부에 분자 또는 생물학적 세포를 위치시키는 것이다. 하나의 예는 마이크로어레이에 희석 현탁물을 첨가함으로써 생물학적 세포, 바이러스 또는 기타 입자를 클로닝하기 위해 이러한 마이크로어레이를 사용하는 것이다. 많은 개별적인 관심있는 작용제를 첨가하는 것은 지루하지만 허용할 수 있는 방법이다. 인접한 어레이 셀내로 잠재적인 유출을 보충하기 위해, 연구자는 간단하게 관심있는 작용제로 "채워질" 각각의 어레이 셀 사이에 하나 이상의 비어있는 열을 남겨둘 수 있다.
기술한 작은 튜브의 내부 표면은 폴리누클레오티드, 폴리펩티드, 다당류 또는 그 밖의 분자가 직접적으로 또는 링커를 통해 부착되도록 화학적으로 변형될 수 있다. 분자가 부착하고, 이로써 튜브 내부에 반응 부위의 수는 증가한다. DNA 및 RNA가 통상적으로 작은 폴리스티렌 비드상에서 합성되기 때문에, 핵산 어레이에 대한 대부분의 직접적인 접근법은 부착된 상이한 순서를 가진 비드의 상이한 회분으로, 작은 폴리스티렌 비드상에서 올리고누클레오티드를 합성하고, 그런 다음 작은 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌 또는 그 밖의 플라스틱으로 채우고, 금속 또는 세라믹 튜브를 비드를 사용하여 아래로 채워서 튜브를 완전히 채우는 것이다. 비드는 동일물을 소결시키기 위해 이들의 주의깊은 가열에 의해 적절히 유지될 수 있거나 잔여 라텍스를 튜브에 첨가하고 튜브를 통해 공기 펌프질하여 적절히 건조된다.
튜브 또는 섬유의 제 7 클래스는 투과성 벽을 가진 세관을 포함한다. 신장 투석 기계에서 사용하고 분자량 분획화를 위해 중공의 선택적으로 투과성인 섬유를 생성시키기 위한 방법 및 과정은 개발되었고(참조: 미국 특허 제 4,289,623호, 미국 특허 제 3,976,576호) 현재 널리 사용되고 있다. 고체 절편가능한 플라스틱중에 이러한 섬유를 임베딩시키기 위한 방법이 또한 개발되었고 투석기 말단에서 튜빙시에 섬유를 부착시키기 위해 사용된다.
투과성 중공 섬유는 두 가지 방법으로 본 발명에서 사용될 수 있다. 첫째로, 섬유는 반응물질 보유 겔로 채워지지만, 이미 플라스틱에 임베딩되어 있다.주조 부분으로 섬유를 조심스럽게 펼침으로써, 각각의 튜브는 앞서 기술한 바와 같이 선택적으로 채워질 수 있다. 이 기술은 작은 어레이를 신속하게 생성시키고, 별도의 중공 섬유를 생성시키고, 반응 물질로 동일물을 채우고, 어레이에 동일물을 정렬시키고 지지 플라스틱으로 동일물을 침투시키기 위해 필요한 모든 단계를 거칠 필요없는 새로운 검정법을 개발한다는 장점을 제공한다.
제 2의 사용 방법은 플라스틱내에 임베딩되기 전에 중공 섬유를 채우는 것과 관련있다. 기술은 투과성 튜브의 벽 투과성을 제어하기 위해 개발되었다. 이것은 겔화 동안 유입 및 유출 단량체 및 겔화 작용제가 제어될 수 있도록 해주고, 투석가능한 작용제가 겔화 후에 제거되도록 해준다. 예를 들어, 아크릴아미드 겔은 리보플라빈의 존재하에서 자외선으로 가교시킴으로써 아크릴아미드 및 비스아크릴아미드로부터 생성될 수 있다. 이 기술은 특정 결합 성분이 열 민감성이거나 기타 화학물질에 대해 민감성인 경우에 바람직하다. 후속하는 형광성 측정을 방해하는 촉매는 중합화 후에 튜빙 벽을 통한 투석에 의해 제거될 수 있다.
또 다른 겔화 물질은 물과의 접촉시에 중합하는 이소시아네이트 함유 예비중합체이고 중합화의 부산물로서 이산화탄소만을 생성한다. 결합 성분은 우선 고상(들)상에서 혼입될 수 있거나 그렇지 않으면 섬유내에 위치되고, 그런 다음 이것은 중합화되고/되거나 건조되어 겔의 수화시에 사용될 결합 성분을 혼입할 수 있다.
투과성 지지 튜빙은 또한 튜브 내부의 겔이 반응물질을 더욱 안정하도록 만드는 물질을 침투하도록 하여, 겔의 물리적 강도를 증가시키고 절편화를 용이하도록 해준다. 예를 들어, 락토오스, 트레할로오스, 글리세롤, 프럭토오스 및 기타폴리하이드릭 알콜과 같은 당은 단백질을 안정화시키기 위해 혼입될 수 있고 절편시에 보조하도록 겔에 고체를 첨가할 수 있다. 첨가제는 함입된 반응성 그룹이 유용하도록 만들기 위해 사용되는 동안 칩의 노출된 표면으로부터 부분적으로 제거될 수 있다. 겔내로 확산된 첨가제는 또한 건조된 후에 겔의 강도 및 체적을 증가시키기 위해 사용될 수 있다.
또한, 리간도 또는 수용체를 함유한 입자가 섬유에 임베딩된 경우, 임베딩된 매질은 마이크로어레이가 형성된 후에 제거가능하도록 가용성일 수 있다. 임베딩된 매질을 제거함으로써, 입자상의 더욱 활성인 부위가 결합을 위해 노출된다. 이러한 변이는 입자가 실제로 도 3의 (17)의 가교된 중합체와 유사한 그 위의 고정된 리간드 또는 수용체를 갖는 미세필라멘트의 미세섬유 또는 미세브러쉬임 경우 적합하다.
일단 튜브가 각각의 겔 및 반응물질로 채워지면, 튜브의 외부는 세척되고, 반응물질로 처리하여 침투하는 지지 플라스틱의 부착을 증가시킬 수 있고 그런 다음 절편화를 위한 생성물을 생성시키기 위해 다발화될 수 있다.
튜브 또는 섬유의 제 8 클래스는 더 큰 블록, 바람직하게는 디스크로부터 절단됨으로써 합성된 것들을 포함한다. 우선 관심있는 분자를 함유하는 섬유 물질가 디스크로서 주조된 다음 긴 섬유가 회전하는 디스크의 원주로부터 벗겨진다. 이 기술은 특정 공간 및 길고 얇은 섬유 이상의 장점을 가진다. 또한 이러한 디스크는 특히, 활성 성분이 특정 조건, 예컨대, 냉동, 완충액중 침지, 암조건 등 하에서 유지될 필요가 있는 경우, 더욱 쉽게 보관된다.
어레이 또는 병렬 섬유는 많은 기술에 의해 함께 부착될 수 있다. 증기 소결에 의한 것이 바람직하다. 증기, 아마도 뜨거운 용매는 특정 기간동안 어레이와의 상호작용을 가능하게 해주며, 그런 다음 배출에 의해 제거된다. 열 소결에서, 어레이는 측면 압축하에 위치되고 어레이는 플라스틱의 연화된 부분에 대해 가열된다. 또 다른 수단은 갈륨과 같은 낮은 융점 금속을 사용하는 것이다. 낮은 융점은 결합 성분의 생리학적인 온도에서 또는 그 온도 부근의 온도를 의미한다.
다양한 조직학적 임베딩 매질이 반응성 형태로 생물학적 분자를 보존하도록 개발되었다. 예를 들어, 듀르큐판, 나노플라스트 및 퀘트롤651은 매우 온화한 가열에 의해 경화될 수 있고; JB-4 및 이뮤노베드는 실온에서 중합될 수 있고; 수용성 아크릴 중합체, 런던 수지 골드 및 로위크릴은 자외선에 의해 동결 온도 이하에서 중합될 수 있다(모두 폴리사이언스 인코포레이티드로부터 입수가능함). 통상적인 임베딩 매질은 용매 및 왁스를 사용하며, 왁스는 적어도 부분적으로 분석 이전에 제거되어야만 한다.
그러므로 임베딩 및 절편화 방법은 특정 생물학적 분자를 확인하고 위치결정하기에 유용하다. 핵산의 경우에, 특정 핵산 표적은 예컨대, 동일계내 하이브리드화 및 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의한 특정 서열의 증폭 및 기타 핵산 증폭 기술(LCR, RCA, SDS 등)에 의해 검출될 수 있다.
임베딩 방법은 생물학적 세포에 있어서 결합 성분의 요망되는 특징 또는 특징들을 보존하는 방법이다. 따라서, 항체가 셀에 고정된 경우 이것은 요망되는 항체의 항원-결합 특이성이며, 고정 방법은 항체의 항원-결합 능력을 보유하는 방법이 될 것이다. 어레이를 형성시키기 위해 섬유를 부착하는 방법 및 수단은 또한 항체의 항원-결합 능력을 보유하는 방법이다.
유사하게, 셀이 호르몬 수용체에 결합하기 위한 후보 분자를 함유하는 경우, 고정 및 부착 방법 및 수단은 호르몬 수용체에 의해 인식 및 결합이 가능하도록 해주는 후보 분자의 배치를 보유하는 방법 및 수단이다.
또한, 많은 단백질 또는 탄수화물 항원은 면역학적 시약을 사용하여 검출될 수 있다. 검출은 일반적으로 형광성일 수 있는 불용성 염료를 생성시키는 피분석물 또는 샌드위치 검정의 제 2 층내로 형광물을 혼입시키거나 피분석물 또는 샌드위치 검정의 제 2 또는 제 3 층에 효소를 커플링시킴으로써 수행된다.
일부 고상 표면은 반응물질을 고정시키기 위해 직접 사용될 수 있고; 나머지는 이러한 첨가가 가능하도록 변형되어야만 한다. 항체는 많은 기타 단백질들과 같이, 깨끗한 폴리스티렌 표면에 부착할 것이다(참조: Van Oss, C.J., & Singer, J.M. The binding of immune globulins and other proteins by polystyrene latex particles. J. Reticuloendothelial Society 3: 29040, 1966.). 마이크로역가 플레이트 또는 비드 형태의 폴리스티렌은 폴리누클레오티드, 폴리펩티드 및 다당류와 같은 생물학적 분자에 결합하도록 변형되어왔다. 폴리테트라프루오로에틸렌(PTFE), 폴리비닐플루오라이드, 폴루비닐리덴 디플루오라이드 및 퍼플루오로데칼린을 포함하는, 퍼플루오로탄소(Teflon®로서 공지된 플루오로탄소 중합체와 같은) 표면은 단백질 또는 기타 생물학적 분자에 결합한다(참조:미국 특허 제 5,270,193호). 이러한 표면은 플루오르화된 계면활성제를 포함하도록 제조될 수 있으며, 이것은 표면을 친수성 또는 포지티브 또는 네가티브 하전되도록 만든다. 제어된 포어 유리를 포함하는, 유리는 항체, 항원, 다당류, 폴리누클레오티드, 핵산 등의 공유 결합이 가능하도록 변형될 수 있다. 플라스틱 표면은 코로나 플라즈마 방전 또는 전자빔 방사를 사용하여 비특이적으로 변형될 수 있으며, 그런 다음 고분자가 부착되는 다양한 코팅제 또는 부착제로 코팅될 수 있다. 생물학적 분자의 더욱 특이적인 공유 결합은 다양한 변형에 의해 달성될 수 있으며, 반응성 그룹이 폴리스티렌 또는 아크릴 표면에 부착하며, 이 그룹은 연장 링커의 존재 여부에 관계없이, 온화한 조건하에서 생중합체와 커플링할 것이다.
또한 다양한 크로마토그래피 매질이 고정된 생반응물질을 지지하기위해 적용되어왔다. 이러한 매질에는 연질 겔 비드가 포함되며, 일반적으로 아크릴아미드, 아가로오스, 세파로오스로 구성되고, 이것은 화학적으로 가교될 수 있으며, 고압 크로마토그래피를 위해 디자인된 약하게 압축가능한 비드이다. 고정 지지물로서 유용한 천연 생성물은 셀룰로오스이고, 이것은 분말 형태로 바로 이용가능하다. 지지물은 공유적인 생반응물질 결합이 가능하도록 화학적으로 변형될 수 있거나, 부착될 준비가 된 변형된 형태로 구입가능하다.
긴 DNA 또는 RNA 분자는 겔중에 중합됨으로써 고정될 수 있고 물리적 망구조물에 의해 순수하게 보유된다. 예로서 아가 또는 아크릴아미드 겔내에 DNA의 보유가 있다. 또한, 폴리펩티드, 단백질, 다당류 또는 핵산과 같은 기타 생물학적 분자는 겔에 임베딩된 경우, 확산이 일어나지 않고 생물학적 분자가 가용성 반응물질과의 반응을 위해 유용하게 남아있도록 긴 중합체와 공유적으로 연결될 수 있다. 예에는 단백질 또는 핵산을 폴리에틸렌 글리콜(소위, PEGylation) 또는 선형 아크릴아미드 사슬에 결합시키는 것이 포함된다.
관심있는 수용체 또는 분자가 고정되고 피분석물에 결합하기 위해 사용되는 방법에 추가적으로, 일반적인 방법이 반응물질의 하나의 클래스의 구성원을 고정시키기 위해 존재한다. 예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G는 고정되고 후속적으로 특정 면역글로불린에 결합하기 위해 사용될 수 있으며, 이어서 이것은 특정 피분석물에 결합할 것이다. 더욱 일반적인 접근법은 아비딘 및 바이오틴과 같은 기타 리간드 및 수용체간의 강하고 특이적인 반응을 일으키는 것이다. 아비딘은 고체 지지물상에 고정되거나 겔에 부착될 수 있고 바이오틴이 공유적으로 연결된 항체 또는 기타 반응물질에 결합하기 위해 사용될 수 있다. 이것은 표면의 생성이 다양한 반응물질이 신속하게 부착될 수 있도록 해준다(참조: Savage et al.,Avidin-Biotin Chemistry:A Handbook. Pierce Chemical Company, 1992).
고정된 관심있는 분자 및 가용성 반응물질 사이의 반응을 검출하기 위해 매우 다양한 방법이 개발되고 있다. 상기 방법들은 신호를 생성시키기 위해 사용된 메카니즘 및 이 신호를 생성시키기 위해 직접 또는 간접적으로 함께 샌드위치되어야 하는 상이한 시약들의 수에 있어서 본질적으로 상이하다. 예에는 피분석물에 공유적으로 부착된 형광성 태그를 사용하는 형광성(지연된 형광성을 포함함), 가용성 염료와 연관된 형광성, 이는 피분석물, 및 유사한 염료에 결합하며 여기서, 이의 형광성은 피분석물에 결합한 후에 상당히 증가한다. 후자는 핵산을 검출하기위해 사용될 수 있다. 소위 샌드위치 검정을 포함하여, 더욱 복잡한 시스템에서, 결과는 가용성 기질과 결합하여 바람직하게는 형광성일 수 있는 불용성 염료를 생성시키는 효소의 검출 복합체의 고정이다. 또한, 결합된 피분석물에 부착된 검출 복합체는 많은 형광 염료 분자에 부착된 분지한 DNA를 포함하는, 수상돌기 분자를 포함할 수 있다.
브러쉬형 배치를 제공하기 위해 부착된 짧은 가로 섬유를 갖는 치실을 제조하는 방법은 반응물질이 부착하도록 변형될 수 있다. 실 또는 섬유상의 정보를 확인하는 것을 엔코딩하는 패턴은 작은 선형으로 정렬된 점의 형태로 사용될 수 있다. 멀티섬유 내시경 어레이의 개발에 있어서, 어레이를 검사하는 방법은 광선 또는 래스터 이미지를 빛이 각각의 섬유를 순차적으로 조명하는 방식으로 섬유 다발의 한쪽 말단에 도입시키는 것으로 발달하였다. 그런 다음 다른 쪽 말단에 존재하는 방출된 빛의 패턴을 결정한다. 동일한 경우, 어떠한 섬유도 잘못 놓이지 않은 것이다.
액체로 채워진 튜빙에서 기포 또는 공백상태를 검출하는 기술은 공지되어 있고 개개의 튜브에 따라 측정된 굴절률, 흡광도 또는 형광성에서의 차이에 달려있다.
점성의 매질로 짧은 길이의 튜빙을 채우기 위해 원심력을 사용하는 기술은 당분야에서 훈련된 기술임이 명백하다.
임베딩 매질 일부 또는 전부를 제거하기 위해 자동으로 슬라이드를 처리하고, 일련의 시약에 대해 슬라이드를 체계적으로 노출시키기 위해, 절편을 유리 또는 플라스틱 슬라이드에 부착하기 위한 다양한 기술 및 정렬방법으로서, 종종 임베딩 물질(예컨대, 왁스)의 블록내의 연질 조직에서부터 뼈까지의 샘플을 함유할 수 있는 조직 블록을 절편하기 위한 마이크로톰이 시판되고 있다.
튜브의 조립된 다발을 얇은 절편으로 절단하고, 절편화 후에 튜브 성분의 방향을 유지시킬 수 있는 마이크로톰 및 그 밖의 절편화 또는 절단 장치는 공지되어 있다. 블레이드 절단법은 마이크로어레이의 셀 사이에 결합 성분의 오염을 감소시킬 수 있다.
마이크로어레이는 이들의 예상 용도에 의해 필요에 따라 임의의 두께일 수 있다. 또 다른 결정 인자는 섬유 다발의 견고성일 수 있다. 절편의 두께는 1 cm 미만이 적당하다. 절편의 두께는 50 mm 미만이 적당하다. 이하 더욱 상세하게 예시되는 바와 같이, 절편의 두께는 약 수 미크론이 될 수 있다.
절편(마이크로어레이 칩과 같이)은 유연한 필름, 또는 유리 슬라이드와 같은 고체 표면상의 부착성 표면에 직접 결합될 수 있다. 또한 이것은 그 사이에 번갈아 포개져있는 다른 것들과 함께, 필름 세편을 따라 간격을 두고 절편(단어 "절편"을 "칩" 대신에 본원에 사용하였다)을 부착시키기에 용이하다. 따라서, 상이한 약 12개 이상의 절편의 세트를 필름을 따라 반복적으로 위치시킬 수 있고, 그런 다음 필름을 절단하여 하나의 세트를 생성시킬 수 있다. 연속적인 연구를 위해, 하나의 DNA삽입서열을 증폭, 표지시키고, 절편의 큰 세트에 대한 이들의 하이브리드화 패턴을 검사할 수 있다.
변형될 수 없는 섬유의 다발을 사용함으로써, 연구자는 다발을 가로로 절단하거나 톱질함으로써 완벽하게 재정렬될 수 있는 다수의 동일한 플레이트를 형성시킬 수 있다. 이것은 고도로 일치하면서 재현가능한 어레이가 되도록 해준다. 하나 이상의 섬유에 대해 쉽게 검출할 수 있는 상이한 물질을 사용함으로써, 마이크로어레이 정렬을 등록하는 수단과 같이, 재정렬이 수월해질 수 있다.
대부분의 면역화학적 또는 경쟁 검정은 피분석물 보다는 시약에 의해 생성된 신호에 의존한다. 그러나, 복합체 혼합물중의 지방족 아미노기를 함유하는 단백질과 같은 항원을 형광물질로 표지시키는 방법은 재현 및 정량가능하도록 개발되었다. 예를 들어, 어머샴 라이프 사이언스(Amersham Life Science)에 의해 공급되는 CyDye, 특히, Cy2, Cy3 및 Cy5가 유용한다. 이러한 표지된 혼합물의 성분이 고정된 항체의 어레이와 반응하는 경우, 각각의 특이적인 항체는 형광물질로 표지된 피분석물 중 하나에 결합하며, 각각의 특이적으로 결합된 표지된 피분석물의 존재는 형광성에 의해 검출될 수 있다. 이 방법은 결합된 항체 어레이를 공지된 서브포화시키는 양의 각각의 피분석물 단백질을 비형광성 형태로 함유하는 용액에 노출시키고, 어레이를 세척하고, 어레이를 표지된 단백질의 시험 혼합물에 노출시켜서 다중 경쟁 검정을 생성시킴으로써 추가로 개선될 수 있다.
고정된 결합 파트너와 연관된 임의의 통상적인 결합 검정 포맷은 본 발명의 마이크로어레이 시스템과 함께 사용될 수 있다. 요약하면, 마이크로어레이는 다수의 리간드 또는 다수의 수용체를 가질 수 있으며 피분석물은 다수의 리간드 또는 다수의 수용체일 수 있다. 피분석물 또는 마이크로어레이 셀에 결합하는 유능한 엘리먼트가 첨가될 수 있다. 샘플은 표지될 수 있고/있거나 유능한 엘리먼트는 표지될 수 있고/있거나 마이크로어레이 셀은 표지될 수 있다. 표지물은 서로 상호작용하여 검출가능한 신호 또는 생성물을 만들어내거나, 신호 또는 생성물을 켄칭할 수 있다. 상이한 조합의 수는 12개이고 임의의 조합이 마이크로어레이의 상이한 셀에 대한 상이한 조합 뿐만 아니라 본 발명에 사용될 수 있다.
종종 몇가지 상이한 임상학적 시험이 특정 질환을 규정하기 위해 필요하다. 다중 시험은 종종 연속으로 수행되는데, 일련의 시험중 하나의 시험 또는 멤버는 또 다른 것을 제안하고, 이어서 시험의 제 3 시험 또는 그룹을 제안하며, 이들 중 일부는 로컬 실험실에서 거의 수행되지 않는다. 그러므로 시간에 대해 안정하고, 현재의 임상학적 분석 시스템에 비해 작고 저렴할 수 있는 장치에 의해 판독되는 기계로 판독가능한 형태로 정확한 수적인 결과를 생성시키는 방법을 사용하여, 동시에 수행되는 연속된 일련의 분지된 시험의 수행을 위해 저렴한 칩이 필요하다.
많은 생화학적 분석은 분석학적 과정이 광범위한 동적인 범위를 가질 필요가 있다. 따라서, 효소 및 면역화학적 검정은 종종 시간에 따른 반응의 경과를 결정하거나, 일련의 희석물에 대해 다중 분석을 수행함으로써 수행된다. 이러한 분석은 현상 시약의 피분석물 혼합물에 대한 노출 동안 간격을 두고 마이크로어레이를 "판독"함으로써 수행될 수 있다. 또한, 표준 및 블랭크(대조군)를 사용하는 병렬 분석이 필요하고 포함된다. 다수의 표준화된 저렴한 바이오칩이 이러한 요건을 충족시키기 위해 필요할 것이다. 바이오칩은 예컨대, 하원, 약물, 핵산 또는 기타 피분석물을 검출 및 측정할 수 있는 상이한 클래스의 반응물질을 혼입할 수 있다.
어레이는 생활성 특징들을 결정하는 것 이외에 수많은 용도를 갖는다. 화학적 상호작용 및 반응이 마찬가지로 시험될 수 있다. 이러한 검정은 예컨대, 부식, 전기화학적 반응 또는 그 밖의 상호작용을 결정하기 위한 시험 물질 또는 재료에 대해 동시헤 상이한 반응 화학물질을 시험할 수 있도록 해줄 수 있다. 이것은 화장품, 페인트, 윤활제 등에서와 같은 다수의 물질의 화학적 제형에 특히 장점적이다. 또한, 연구자는 피분석물과 어레이내의 관심있는 분자 전부 사이의 바람직한 상호작용에 대해 검정할 수 있다.
반응물질의 고정을 위해 겔을 사용시에 일반적인 문제는 겔 고정된 관심있는 작용제에 부착할 수 있는 반응물질이 겔내로 및 겔 밖으로 확산하기 위해 상당한 시간을 필요로 한다는 것이다. 검출이 형광성에 의한 것일 경우, 겔내로 여기된 광을 흡수하는 염료의 함입은 표면에 가까운 영역에 대한 검출을 제한한다. 아크릴 임베딩 매질중의 자외선 흡수 단량체, 4-메트아크릴옥시-2-하이드록시벤조페논(폴리사이언스, 인코포레이티드)의 함입은 문제를 해결할 수 있다. 형광성 방출 이전에 진동성 여기된 부분을 수용하는 DABSYL 또는 DABCYL과 같은 켄칭 분자의 첨가가 또한 유용하다.
연구자가 마이크로어레이의 섬유내 입자의 표면 지역상에서 피분석물과 결합 파트너 사이의 결합을 향상시키고자 하는 경우, 연구자는 각각의 섬유의 임베딩 매트릭스를 에칭시킴으로써 마이크로어레이의 각각의 섬유의 입자의 더 많은 표면 지역을 노출시킬 수 있다.
결합 검정을 수행하는 경우, 연구자는 마이크로어레이 셀내로 피분석물의 확산을 촉진시켜 리간드/수용체 결합(민감성)을 증가시키고, 마이크로어레이를 양적으로 더욱 재현가능하도록 만들고, 마이크로어레이를 통해 광을 통과시킴으로써 수행되는 경우 스펙트로포토메트리에 의한 검출을 향상시킬 수 있다. 마이크로어레이를 통한 확산을 향상시키기 위해, 연구자는 마이크로어레이 겔 물질을 통해 리간드를 집어넣을 수 있다. 이것은 다공성 막상에 마이크로어레이를 장착하거나 유체역학, 전기영동 또는 기계적 수단에 의해 마이크로어레이를 통해 리간드 및/또는 리간드 용액을 통과시킴으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 막의 각각의 면 상에서의 압력 차이에 의해 마이크로어레이를 통해 흐를 수 있다. 또한 유체는 막의 뒷면에 종이 타울 더미를 간단하게 적용함으로써 마이크로어레이를 통해 유체를 끌어당길 수 있다. 전기영동 수단을 위해, 전체 마이크로어레이를 통과하거나 마이크로어레이의 단일 셀 또는 셀의 그룹의 양면상에 위치된 단일 지점 전극을 사용하여 마이크로어레이를 통해 전위가 적용된다. 기계적인 수단은 차별적인 압력을 제공함으로써 마이크로어레이를 통해 유체를 기계적으로 밀거나 당기는 다양한 배치의 펌프와 연관될 수 있다.
또한 다공성 막을 사용하는 것은 마이크로어레이가 낮은 백그라운드를 달성하도록 하는 확실한 장점을 가진다. 다공성 입자 또는 실형 성분이 섬유내에 임베딩되는 경우, 다공성 입자 또는 실형 성분을 통한 절편화는 생성된 구조물을 더욱 다공성으로 만들 수 있고 더 큰 표면 지역이 두 시약 모두에 접촉하고 세척될 수 있도록 해준다. 임베딩 매질 또는 모세관의 에칭은 또한 다공도 및 고정된 관심있는 분자에 대한 노출을 증가시킨다.
다공성 입자가 바람직하게는 2회 절편되는 경우, 더 많은 유체가 통과하도록해주는 더 큰 채널이 존재할 수 있다. 절편된 입자를 가진 섬유는 투과성 막 지지물 또는 고상 지지물의 구성위에 장착될 수 있다. 이러한 결과는 유체가 마이크로어레이의 셀을 통해 통과하도록 해준다.
본 발명을 사용함으로써, 연구자는 고상위에 각가그이 셀을 개별적으로 스포팅하거나 각각의 셀에 화합물을 형성시키는 어려움을 피하게 된다. 전자의 바업은 양적으로 소량의 액체를 측정하는 능력 뿐만 아니라 사람 개재 및 장치에 의해 제한된다. 후자 기술은 고상에서 합성될 수 있는 화합물의 타입에 의해 제한된다. 두 선행 기술 모두는 고가이고 각각의 어레이를 개별적으로 생성시켜야 하기 때문에 정교한 자동화된 장치 또는 지루한 노동을 필요로 한다. 이와는 대조적으로, 본 발명은 "회분"이 수천 내지 수백만개의 마이크로어레이로 존재하는 경우, 기술적으로 간단하고 신속하다. 각각의 마이크로어레이를 위해 필요한 바로 그 개개의 노력은 절단하는 단계이다.
보관된 시약의 세트로부터 또는 기본 칩상의 상이한 반응성 서열 또는 화합물의 합성에 의해 제조된 마이크로어레이는 품질 대조에 있어서 상이한 문제점이 존재한다. 큰 어레이에 있어서, 최종 형태중의 각각의 시약은 사용되기 전에 별도로 검정될 수 없거나, 어레이의 하나의 세트가 제조된 후까지 보장된 동일계내 합성된 순서를 수정할 수 없다. 오류 또는 서브표준 성분이 어레이의 회분에서 발견된 경우, 모두 폐기해야만 한다. 이러한 문제점은 일상적인 임상학적 연구에서 "바이오칩"의 사용을 제한한다.
고정된 단백질 및 핵산은 용액중에서 보다 특히 건조 상태에서 더욱 안정하다고 공지되었다.
본 발명의 관심있는 작용제는 매우 폭넓은 범위의 화학물질, 복합체, 생물학적 세포 또는 이들의 분획물을 포함할 수 있다. 핵산, 많은 단백질, 변형된 단백질 또는 소듐 도데실 설페이트와 같은 세제로 코팅된 단백질은 유기 용매 및 폭넓은 범위의 유기 화합물중에 가용성이고 따라서 플라스틱을 생성시키기 위해 사용되는 것과 같은 중합 혼합물내로 혼입될 수 있다. 따라서, 본 발명의 실시를 위해 현재 유용한 성형 기술을 사용하여 상이한 관심있는 작용제를 각각 함유하는 아크릴 또는 기타 플라스틱의 긴 섬유를 생성시키는 것은 기술적으로 수월하다.
다수의 상이하고 잠재적으로 새로운 활성 화합물은 섬유의 고정, 다발화, 절편화 및 마이크로어레이의 형성에 의해 동시에 스크리닝될 수 있다. 식물 추출물과 같은 분리물로부터의 피크 분획물이 동시에 수집되어 마이크로어레이를 형성시키기 위해 사용될 수 있다. 그런 다음 마이크로어레이는 선택한 어떤 활성이든지 존재하는 모든 화합물을 스크리닝하기 위한 시간과 노력을 극적으로 감소시키는 다수의 검정 시스템에서 동시에 사용될 수 있다.
질량 기술에 의해 생성된 다수의 단백질 또는 펩티드가 특히 바람직하다. 천연 공급원으로부터 분리 기술에 의한 상이한 분획물은 많은 상이한 단백질 및 펩티드의 공급원을 제공한다. 많은 화합물의 혼합물을 분리하기 위한 수많은 분획 방법이 공지되어 있다. 상이한 분획물 또는 특정 조성물은 단일 섬유를 형성시키기 위해 사용될 수 있다. 혈청 및 기타 조직 및 천연 공급원으로부터의 이차원 전기영동 겔은 겔상에 분리된 수천개의 상이한 단백질을 제공한다. 각각은 겔로부터개별적으로(예컨대, 절단, 용리 등) 제거될 수 있고 단일 섬유를 형성시키기 위해 관심있는 분자로서 사용될 수 있다. 이러한 방법에서, 상이한 샘플로부터 형성되는 상이한 다발에 있어서, 상이한 샘플들간의 단백질 차이가 바로 비교될 수 있다.
고정된 고분자가 항체인 경우, 마이크로어레이는 다양한 단백질-기재 이형을 진단할 수 있다. 관심있는 단백질에 대해 표지된 이차 항체는 추가로 세포를 강조하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 어레이는 감염성 작용제를 고정시키기 위해 사용될 수 있으며, 이것은 고정화 이전 또는 고정화 이후에 염색된다. 따라서, 생물학적 샘플, 예컨대, 혈청 또는 혈장으로부터의 미생물은 농축되고, TOTO-1 또는 YOPRO-1과 같은 형광성 핵산 염색을 사용하여 염색된 다음 어레이상에서 일치하는 항체를 찾도록 할 수 있다. 그런 다음 결합된 피분석물은 형광성에 대한 스캐닝에 의해 검출되고 위치가 확인될 수 있다.
이것은 미생물 또는 그 밖의 관심있는 분자를 고정시키고 공정화된 시약을 사용하여 개체로부터의 유체로부터 항체의 위치를 결정한 다음 형광성 항사람 항체를 사용하여 후자의 위치를 발견함으로써 제 1 위치에서 항체 생성을 일으키는 질환을 진단하는 본 발명의 부분과 동일하다.
어레이는 합성 올리고누클레오티드, 또는 범위가 제한되는, 디스플레이된 항원 또는 항체를 사용하여, 특정 유전자로부터의 삽입서열을 갖는 파지 디스플레이를 사용하여 제조된다. 본 적용에서, 펩티드 또는 항체 디스플레이 파지의 군집은 각각의 디스플레이 파지가 단일 섬유를 제조하기 위해 사용되는 경우 사용될 수 있다. 이러한 정렬에서, 파지는 각각의 표면 분자의 일부분이 겔 또는 플라스틱내에임베딩되어 남아있게 될 만큼 충분히 크지만, 나머지 부분은 노출될 것이다. 관심있는 분자는 그 자체로 섬유에 결합되어, 매트릭스내부에 걸려있거나 고상 입자 또는 섬유내 또는 섬유상에 있는 작은 구조물에 결합될 수 있다. 또한 파지, 재조합 세균 또는 그 밖의 복잡한 생구조물이 고착될 수 있고 원하는 경우, 글루타르알데히드 또는 유사한 고착제를 사용하여 가교된 단백질을 함유할 수 있다.
각각의 섬유는 관심있는 분자의 혼합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, 화학 합성 동안, 수많은 이성질체가 제조된다. 일부 환경에서 섬유를 형성시키기 전에 이성질체를 분리시키기 않는 것은 편리하다. 마찬가지로, 혼합물을 분획화시키는 경우, 수용체의 혼합물로 섬유를 형성시키는 것은 전체로서 허용될 수 있고 완전한 단리는 어렵고 시간 소모적이다.
섬유의 수집이 사용되는 경우, 또는 예컨대, 섬유를 형성시키기 위해 입자가 매트릭스에 임베딩되는 기타 구체예에서, 다발의 길이를 따라 섬유의 상대적인 위치를 유지시키는 충전 물질이 바람직할 수 있다. 다양한 접착제 및 부착제가 당분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 오일 구성성분을 포함하는 충전 조성물은 600이상의 상대적으로 높은 분자량의 지방족 탄화수소이고, 유기 구성성분 및 블록 공중합체는 두께를 증가시키고 물질의 점도를 감소시킨다. 산화방지제가 또한 포함될 수 있다. 미국 특허 제 5,187,763호를 참조하라.
절편화된 충전 물질은 레지스터내에 섬유를 유지하고 있고, 절단될 수 있으며 마이크로어레이가 노출되는 임의의 다운스트림 과정을 방해하지 않는다. 예를 들어, 사용될 수 있는 그 밖의 물질은 폴리아크릴아미드와 같은 중합가능한 물질이다.
섬유를 위한 임베딩 매트릭스는 검정, 불투명 또는 그렇지 않으면 표지물의 방출된 신호에 대해 흡착성이어서 칩내의 셀 사이의 크로스 토크를 감소시킨다. 또한, 섬유사이의 임의의 부착제는 마이크로어레이의 셀사이의 백그라운드를 감소시키기 위해 동일한 부착 물질을 함유할 수 있다. 임의적으로, 물질의 특정 층은 다발이 형성되기 전에 섬유 사이에 위치될 수 있다. 중공 섬유가 사용되는 경우, 불투명 물질은 중공 섬유 쉘 자체내로 혼입될 수 있다.
어레이는 증여된 혈액을 수혈을 위해 제공하기 전에 보편적인 혈액 매개 질환에 대해 혈액 샘플을 스크리닝하기 위해 대조군을 따라 다양한 셀에 항원/항체 등의 전체 세트를 가질 수 있다. 마찬가지로, 특정 징후는 어레이 사용에 대해 동시에 스크리닝될 수 있는 수많은 보편적인 원인을 가진다. 예를 들어, 요로감염증은 보편적인 것이고 다양한 항생제에 대해 다양한 민감성을 나타내는 수많은 상이한 세균에 의해 유발될 수 있다. 수많은 상이한 인자에 대한 동시 시험은 상당한 시간 및 비용을 절약할 것이다.
본 발명의 칩을 사용하는 과정에서, 다양한 공지된 기술 및 재료들이 비특이적 반응을 감소시키기 위해 사용되었다. 따라서, 단백질-기재 검정의 경우에, 관심있는 결합 성분으로부터의 섬유 또는 필라멘트의 물질, 임베딩 물질 및 필수적으로 모든것들에 의해 제공된 칩상의 비특이적 부위는 알부민 또는 우유와 같은 차단제와 반응할 수 있어서, 차단제는 리간드, 피분석물, 리포터 분자 또는 당분야에 공지된 바와 같이, 결합 성분에 특이적으로 결합하는 어떤 물질과 반응할 수 있는결합 성분을 함유하지 않는 지역에 결합할 것이다.
어레이는 상이한 섬유로 제조되지만, 동일한 결합 작용제를 함유하는 두 개 이상의 동일한 셀을 가질 수 있다. 이것은 어레이에 대한 내부적인 품질 보장을 제공한다. 또한, 셀중 일부가 피분석물의 양적 측정을 위한 상이한 농도의 결합 성분을 제공하는 것이 바람직하다. 이것들은 질적인 검출 및 양적인 검출 둘 모두에 대한 마이크로어레이에 대한 내부적인 표준을 제공한다. 예를 들어, 일련의 셀은 사이한 농도의 항생제를 함유할 수 있다. 샘플 미생물이 셀과 접촉하여 배양되는 경우, 하나의 셀에서의 성장의 부재 및 또 다른 셀에서의 성장의 존재는 대략적인 최소 억제 농도를 제공한다. 트리판 블루 또는 플루오레세인 아세테이트와 같은 생염료를 사용하여 염색된 경우 최소 살균 농도를 결정하기 위해 동일하게 수행될 수 있다. 마이크로어레이는 수천개의 셀을 함유할 수 있기 때문에, 연구자는 수많은 항생체에 대한 항생제 감수성을 동시에 결정할 수 있다. 겔에 고정된 리간드 또는 수용체를 사용하는 다른 생물학적 활성의 양적인 결정이 사용될 수 있다.
본질적으로 동일한 섬유는 동일한 마이크로어레이에서 여러번 사용될 수 있다. 이것은 내부적인 품질 대조 검사를 제공하며 결합 검정에서 신뢰도를 향상시킨다. 또한 이것은 이러한 검정이 정밀함을 향상시키기 위해 수행되는 경우 추가적인 양적인 측정을 제공한다. 블랭크 섬유, 즉 섬유에 어떤 관심있는 분자도 결합되지 않은 섬유는 우수한 네가티브 대조군을 제공하며 매번 마이크로어레이에서 사용되어야 한다.
긴 필라멘트, 모세관 또는 동축 2-물질 필라멘트는 병렬로 정렬된 다음 소결되거나 부착 결합되어 바람직하게는 변형에 내성인 다발을 형성하고, 각각의 가닥 또는 모세관은 하나에서 다른 것까지 연속적이다. 섬유 또는 모세관의 위치적 정렬은 다발 전체에 걸쳐 동일하게 유지되어야 한다. 동축 형성에서 두 가지 상이한 타입의 물질로 구성된 필라멘트가 사용될 수 있다. 중심 물질은 용해될 수 있는 물질로 제조되고, 씌워진 것은 동일한 용해 조건에 대해 내성이다. 예를 들어, 강알칼리는 특정 타입의 유리를 용해시킬 수 있지만 나머지에 대해선 그렇지 않다. 용해 단계는 존재하는 물질에 따라 절편화 전 또는 더욱 바람직하게는 후에 일어날 수 있다.
또한, 씌워진 것은 용해될 수 있고 중심은 안감 시트에 결합된 마이크로어레이상에서 단리된 "아일랜드(island)"로 남아있는 내성이다. 두 상황중 어느 상황에서, 용해 단계에 의해 남겨진 공간은 빈공간으로 남겨지거나 다양한 물질로 채워질 수 있다. 다공성 물질을 생성시키기 위한 부분적인 용해는 또한 본 발명의 부분이다. 다공성 물질은 표면 지역을 증가시키며, 이것은 결합 검정을 위해 특히 바람직하다.
입자, 특히 다공성 비드는 또한 필라멘트, 시트 또는 모세관의 내부를 형성하기 위해 "화학적으로 소결"될 수 있다. 이 기술은 또한 서로 상이한 섬유를 부착시키기 위해 사용될 수 있다. 차단제는 입자상의 임의의 남아있는 활성 부위 또는 부착 지역을 차단하기 위해 첨가될 수 있다. 그 때까지 수행되지 않은 경우, 비드가 튜브 또는 중공 섬유에 쌓인다. 그런 다음 비드상에 차단제 및/또는 관심있는 분자 및/또는 무반응 부위를 가교시키거나 커플링시키는 화학적으로 반응성인화합물이 첨가되고 비드가 접촉한 위치에서 화학적 부착이 일어난다. 튜브 또는 중공 섬유는 그 자리에 남아있거나 제거될 수 있다. 비드의 내부 포어내의 관심있는 분자는 접촉하지 않았으므로 현저하게 변경되지 않는다. 또한, 비드의 포어는 친수성 용액으로 채워질 수 있고 비드 사이의 공간이 소수성 부착제 또는 세팅 액체로 채워지는 동안 모세관 작용에 의해 유지될 수 있다.
화학적 소결의 대표적인 예는 다공성 비드상에 단백질 G를 흡착시킨 다음 젤라틴 차단제를 첨가하는 것이다. 생성된 비드를 1 mm 플라스틱 튜브에 채운 다음 단백질 가교제, 예컨대, 카보디이미드 를 첨가한다. 반응이 완료된 후에, 반응하지 않은 시약을 세척한 다음 임의의 적절한 관심있는 항체를 여기에 첨가하여 단백질 G에 결합시킴으로써 마이크로어레이를 제조하기 위한 다발화 및 절단을 위해 적합한 섬유를 형성시킨다.
또한, 입자의 표면은 우선 바이오티닐화될 수 있고 아비딘은 가교제로서 사용될 수 있다. 연구자는 단백질 G를 비드에 부착시키는 대신 아비딘 표지된 항체를 사용할 수 있다. 또 다른 대안법은 비교적으로 큰 다공성 비드 및 비드사이의 공간을 채우기 위해 부착제 또는 임베딩 매질을 사용하는 것이다. 섬유를 절편화하는 경우, 비드는 절단될 만큼 커서 노출될 관심있는 결합된 분자에 대해 비드의 내부를 비울 수 있다. 중공 비드 또는 마이크로기구는 여기에 캡슐화된 관심있는 분자가 비드이 절단시에 노출되기 때문에, 다공성 비드 대신 사용될 수 있다. 이러한 개념은 세포내 특징을 노출시키고 가시화시키기 위해 조직 또는 임베딩된 세포를 절편화시키는 것과 동일한 것이다.
또한, 연구자는 두 개의 상이한 세트의 비드를 사용할 수 있다: 한가지 세트는 다공성이고 여기에 결합된 수용체/수용체 결합 물질을 가지며, 두 번째 세트는 고도로 반응성인 물질로 코팅되거나 비드의 제 1 세트에 결합하거나 그 위헤 코팅되는 반응성 그룹으로 변형된다. 우선 튜브는 건조 형태로 두 비드 모두로 채워지고, 튜브를 쉐이킹시킨 다음 유체를 반응이 일어나도록 펌핑하여 비드의 고체 섬유를 형성시킨다. 또한, 비드의 제 1 세트가 매우 큰 경우, 비드는 우선(유체의 존재 또는 부재하에) 첨가될 수 있고 나중에 제 2 세트를 첨가하여 큰 비드사이의 공간을 통해 비드를 여과시키고 이에 따라 반응시킨다. 비드간의 반응은 특정 결합 부분 또는 비특이적 결합 반응에 의해 절편가능한 고체내로 비드의 가교를 형성시킬 수 있다. 제 2 비드는 형광성 검출에서 스트레이 광을 감소시키기 위해 검정일 수 있다.
다발내의 섬유가 융합되거나 그렇지 않으면 서로 고착된 패턴으로 부착된 후에, 다발은 가로로 또는 많은 얇은 디스크 및 부분이 임의적으로 원하는 경우 용해되는 각으로 절단된다. 중공 모세관이 사용되는 경우, 생성된 디스크는 광학 이미지 및 광 파이프의 증폭을 위한 채널 플레이트로서 사용될 수 있다. 막대 또는 섬유가 사용되는지에 상관없이, 얇은 디스크는 또한 일정한 구멍 크기때문에 필터로서 사용될 수 있다.
절편화된 이차원 어레이에서 각각의 섬유 절편은 DNA, RNA 또는 단백질 분자와 같은 비교적으로 많은 수의 결합 성분을 함유할 것이다. 최종 어레이를 사용하는 제 1 단계와 같이, 어레이의 플라스틱 표면을 매우 서서히 부식시킬 수 있는 용액을 표면에서 세척하였다. 이것은 유리되는 임의의 생중합체 분자를 제거하는 속도로 수행된다. 그런 다음 세척을 계속하고, 플라스틱을 부식시키지 않는 용액내로 침지시켰다. 그런 다음 어레이는 건조되어 사용전까지 보관되거나 한꺼번에 사용될 수 있다. 플라스틱내의 반응성의 관심있는 작용제를 노출시키는 것을 돕기 위해, 표면상의 입자를 용해시켜, 용액을 형성시키고 분자를 노출시킨다.
각각의 섬유가 마이크로어레이에 존재하는 것과 동일한 형태로 관심있는 분자를 가지기 때문에, 연구자는 전체 마이크로어레이를 사용하기 보다는 섬유 자체에 대해 품질 대조 검사를 수행할 수 있다. 이것은 마이크로어레이가 진단 목적으로 사용되는 경우 특히 중요하다. 회분으로부터의 샘플링 마이크로어레이는 품질 대조 검사일 수 있지만 실제로 판매되는 마이크로어레이를 검사하는 것이 아니다. 대조적으로, 섬유 자신들의 작은 슬라이스가 본 발명에서 사용된다. 섬유 자체를 검정하는 것은 마이크로어레이 셀로서 섬유의 슬라이스를 가진 모든 마이크로어레이의 실제적인 시험을 대표한다.
대조적으로, 마이크로어레이의 각각의 셀상의 관심있는 분자의 직접적인 고상 동일계내 합성에 있어서, 관심있는 분자를 함유하여 사용된 실제 조성물은 합성 후에 실제로 시험되지 않는다. 고상에 액체 방울을 스포팅함으로써 마이크로어레이를 제작하는 데 있어서, 연구자는 품질 대조 검사로서 액체를 시험할 수 있다. 그러나, 액체 샘플은 슬라이드상에 고정된 건조 관심있는 분자의 품질을 대표하지는 않는다. 그러므로, 품질 대조 검사는 판매되는 실제 생성과 동일하지 않다. 판매되는 마이크로어레이의 셀내의 실제 조성물에 대한 어떤 품질 보장이 결여된것이다.
본 발명의 품질 대조를 위해, 섬유는 개별적으로 검정되거나 리본 또는 소그룹으로 검정되거나 슬라이싱 전에 전체 다발의 부분으로써 검정될 수 있다. 또한, 하나의 최종 마이크로어레이를 시험함으로써, 연구자는 최종 생성물의 부분과 동일한 섬유의 조성물로서 마이크로어레이의 전부를 효과적으로 시험될 수 있다.
임상학적 시험을 위해, 시험 및 시스템의 조절 승인 및 동일문을 제조하기 위한 방법이 필요하다. 칩이 사진석판술 및 제조하는 전자 칩으로부터 유도된 그 밖의 기술을 사용하여 제작되는 경우, 개개의 칩의 비용은 매우 높고, 칩이 개별적으로 제조되는 경우 오류의 가능성은 매우 높다. 칩이 개별적으로 제조되어 한번만 사용되기 때문에, 품질 대조는 어려우며, 임의의 소정의 칩이 만족스러움을 증명하는 우수한 방법은 없다. 수행될 수 있는 최선의 방법은 무작위로 회분의 큰 분획을 시험하는 것이다. 본 발명에 있어서, 수많은 절편은 하나의 조합 조립체, 및 상호비교된 인접한 절편 뿐만 아니라 어느 정도 거리가 떨어진 절편으로부터 제조될 수 있다. 통계학적 분석은 일어날 수 있는 오류의 비율을 예측할 수 있을 것이다. 그러나, 절편이 다수로 제조될 수 있고 매우 저렴하게 제조될 수 있다는 사실이 훨씬 중요하기 때문에, 임상학적 샘플에 대한 반복 분석, 및 중요한 진단 결과가 수득되는 경우 확정 분석을 수행하기기 수월할 것이다. 그러므로 본 발명은 의학의 실행시에 유전학적 분석의 폭넓고 일상적인 적용을 수월하게 만든다.
섬유의 관심있는 핵심 작용제 성분은 여기에 고정됨으로써 섬유에 의해 보유된다. 고정화는 아미노, 하이드록시, 설프하이드릴 또는 카복실 부분을 통해 연결부분을 통해, 매트릭스 및 화학적 커플링에서의 포착과 같은, 그 자체로 공지된, 수많은 기술에 의해 수행될 수 있다. 단량체에 화학물질을 화학적으로 결합시키거나 중합될 단량체로서 사용되는 것은 또한 성분을 효과적으로 혼입한다. 결합은 또한 항체 결합을 위한 단백질 A 또는 단백질 G, 바이오틴-아비딘, HIV-CD4, 당-렉틴 또는 디곡시게닌-안티디곡시게닌과 같은 수용체를 갖는 리간을 통해서와 같은 리간드/수용체 쌍과 같은 수많은 친화도 기술에 의해 수행될 수 있다. 다른 한편으로는, 어떠한 특이적인 결합도 겔 또는 겔 부재, 왁스와 같은 겔화 매트릭스, 실리콘 중합체 및 실리콘 에멀션이 사용되는 상황을 위해 필요치 않다. 액체 왁스 또는 겔화 작용제는 간단하게 핵심 성분과 혼합되고 냉각되어 주조 또는 성형에 의해 고체 섬유를 형성한다.
어레이는 단일 단계로 조립될 필요가 없다. 나란히 정렬된 튜브의 세트로 구성된 평탄한 어레이가 우선 제조될 수 있고, 어레이의 말단이 절편되고 시험될 수 있다. 그런 다음 평탄한 어레이는 적절한 부착제로 함께 결합되어 삼차원적 다발을 생성시킬 수 있다. 중간생성물 평탄한 어레이의 용도는 이것이 제조되어 보관될 수 있음을 의미하며, 통상의 이차원 어레이는 상이한 일차원 어레이를 선택하고 함께 결합시킴으로써 제조될 수 있다. 점차적인 조립 과정은 각 단계에서 정밀검사를 제공하여, 오류 또는 하나의 막대 또는 세관의 낮은 결합 효능으로 인한 손실을 최소화시키며, 새로운 패턴의 반응물질을 조립하기 위한 유연성을 제공한다.
일반적인 임상학적 용도를 위해, 칩을 보유한 슬라이드상에 확인장치를 갖는 것이 중요하며, 확인장치는 칩 자체와 통합될 수 있다. 도 5는 어레이엘리먼트(41), 확인 및 방향을 제공하기 위해 하나의 테두리를 따라 인쇄된 바코드(42)를 갖는 칩(40)을 도시한 것이다. 또한, 작은 농도의 염료(통상적으로 형광성이 없는)는 예컨대, 하나 이상의 수 또는 하나 이상의 글자의 패턴 43 내지 44가 존재하도록 제조된 선택된 튜브로부터의 중합체내로 혼입될 수 있다. 형광성 염료를 혼입하고 형광성 측정을 정밀검사하기 위해 역할하는 수개의 셀 또는 엘리먼트를 갖는 것이 또한 유용하다. 염료를 선택된 튜브의 성분내로 도입시켜 추가적으로 이들을 확인하는 것이 또한 수월하다. 대각선 43-44는 조립된 어레이로부터 튜브의 수평 열이 적절한 순서로 존재함을 추가로 가르킴에 주의하라. 어레이내의 튜브가 하나의 라인에 하나의 튜브 또는 막대의 상실을 일으키는 정렬외에 존재하는 경우, 전체 패턴이 잘못된 정렬을 보여줄 것이기 때문에 이것은 쉽게 관찰될 수 있다.
다발화된 배치로 튜브를 보유하기 위해 사용된 임베딩 물질 또는 부착제는 불투명할 수 있지만, 튜브 및 바람직하게는 이들의 성분은 전체 길이를 따라 광을 인도할 것이다. 어레이 엘리먼트의 방향에 대한 최종 검사시에, 다발의 한쪽 말단에 한번에 하나의 엘리먼트가 조명될 수 있고, 광이 검출되고 도 6에 도시한 바와 같이 나머지 말단에 엘리먼트에서 어레이 위치와 관련되고, 도 6에서 섬유(51)을 갖는 다발(50)은 렌즈(54)에 의해 다발의 원위 말단상에 초점을 둔 음극선 튜브(CRT)(52) 생성된 래스터(53)에 의해 조명되고, 전달된 광은 CCD 카메라(55)에 의해 기록된다. 개개의 스팟(56)은 검출되는 신호(57)를 발생시킨다.
형광(epifluorescence)을 사용하는 검출을 위한 정렬을 도 7에 도식으로 나타냈고 도 7에서 칩(60)은 램프(62)에 의해 생성된 빔(61)에 의해 조명되고, 이것은 형광성을 여기시키기 위한 최적의 파장의 광을 단리하기 위해 필터(63)를 통해 통과한다. 스플릿-빔 프리즘(64)은 칩(60)을 향해 여기 광을 처리한다. 방출된 광은 방출된 파장이 필터(65)에 의해 단리되고 CCD 카메라(66)에 의해 검출된 후에 스플릿-빔 프리즘을 통해 뒤로 통과시킨다. 칩상의 형광 패턴을 검출하기 위한 상이한 시스템은 당업자에게 공지되어 있다.
다발화 전에 섬유를 형성시키는 대안적인 방법으로서, 연구자는 우선 큰 물질로부터 이들을 절단함으로써 섬유를 형성시킬 수 있다. 도 8에서, 부착 물질(70)의 시트는 단일 리간드 또는 수용체로 포착된다. 이것은 용액중에 화합물을 용해시킨 다음 부착 페이퍼(예컨대, 필터 페이퍼)의 시트를 포착함으로써 수행될 수 있다. 가교제는 수용체를 페이퍼 또는 기타 지지물의 셀룰로오스 베이스에 결합시키기 위해 첨가될 수 있다. 또한, 연구자는 페이퍼 펄프를 수용체에 가교시킨 다음 페이퍼 또는 펠트의 시트를 형성시킬 수 있다. 이러한 대안적인 기술은 더욱 일관되고 일정한 분포를 제공하지만 많은 양의 수용체를 필요로 한다. 어느 방법이든, 시트(70)가 생성된다. 많은 상이한 시트가 제조되는데, 여기서 각각의 시트는 상이한 수용체를 함유한다.
그런 다음 시트는 부착제를 사용하여 서로(책처럼) 포개지며 임의적으로 페이퍼의 각각의 시트사이에 스페이서로서 불활성 시트(포착되지 않음, 바람직하게는 검정색)가 사용된다. 이것은 책(71)을 형성한다. 그런 다음 책을 페이퍼 절단기 또는 유사한 절편화 장치로 옮기고 매우 얇은 세편(72)이 절단되며, 이는 도 1의 "리본", 물체(2)와 유사하다. 과정의 나머지는 도 1에 도시한 바와 유사하다. 상이한 책으로부터의 다중 세편(72)은 포개져 다발(73)을 형성한 다음 가로로 절단되어 마이크로어레이(74)를 형성한다. 바람직하게는 이들을 부착시키기 위해 리본에 부착제가 첨가된다. 또한, 부착제는 절편하기 전에 고상 또는 다발의 말단 및 다발에 부착된 고상에 적용될 수 있다.
나이론 필름과 같은, 단백질을 부착시킨 그 밖의 필름이 사용될 수 있다. 이종이중작용성 광활성 가교 시약을 사용하여 활성화되는, 폴리올레핀과 같은 불활성 필름, 또는 써메딕스(Thermedics)의 필름과 같은 간단한 폴리우레탄 필름이 사용될 수 있다. 연구자는 시트 또는 필름의 상이한 면에 상이한 단백질을 사용할 수 있고 최종 마이크로어레이의 셀(섹터) 및 신호를 분리하기 위해 불활성 시트로 시트를 분리할 수 있다.
섬유 물질은 바람직하게는 유리, 금속, 플라스틱 또는 그 밖의 중합 물질이다. 동축 조합 섬유를 위해, 용해될 수 있는 성분은 매우 폭넓게 다양한 물질로 제조될 수 있다. 각각의 물질은 둘 이상의 성분의 조합물일 수 있다. 섬유는 표면상에서 일어나는 화학적 및 생물학적 반응에 관한 위치적 정렬 및 정보를 전달하기 위한 광 파이프 또는 전체 내부 반사 광섬유로서 역할할 수 있다. 섬유 물질은 바람직하게는 셀 및 올리고누클레오티드, 펩티드 및 다당류와 같은 관심있는 분자의 결합을 지지하기 위해 선택된다. 중공 섬유는 신선하거나, 냉동되거나 건조된 상태로 셀을 보관하기 위해 사용될 수 있다. 섬유, 특히 모세관과 같은 중공 섬유내부에 반응 또는 성분으로부터 직접 또는 간접적으로 방출된 광 및 전자는 증폭될수 있으며 섬유 물질이 유리 또는 기타 투명하거나 반투명한 물질로 제조되는 경우 쉽게 검출될 수 있다. 섬유 물질은 섬유에서 일어나는 성분 또는 반응으로부터 방출하는 광, 전자 또는 기타 화학 성분과 반응하거나 검출하거나 다른 형태로 변환시키는 성분을 포함할 수 있다. 섬유내 또는 섬유상에서의 화학발광 반응의 검출이 적절한 방법이다.
본 발명에 사용된 겔화 물질은 다수의 이러한 공지된 물질로부터 선택될 수 있다. 아가로오스, 젤라틴, 콜라겐, 크산텐, 카라게난, 알진산염, 또는 열경화성, 열가소성, 케모세팅(chemosetting) 또는 UV 중합화 중합체와 같은 중합체가 사용될 수 있다. 왁스 및 점토를 포함하는 비중합 겔화 물질이 사용될 수 있다. 하이드로겔은 반응이 관심있는 작용제와 수성 환경을 필요로하는 지 조사를 위해 첨가된 물질 사이에 일어나는 경우 특히 바람직하다. 중합 작용제 또는 경화 작용제는 섬유가 작용제의 용액중에 주조물을 침지시키고 섬유 주조물 외부를 따라 작용제를 통과시킴으로써 주조된 후에 첨가될 수 있다.
하이드로겔은 가변적인 겔 다공도, 중합화 동안 또는 후에 단백질에 결합하는 능력, 낮은 비특이적 결합, 투명도, 무해한 중합화 부산물, 제어가능한 중합화 공백시간, 다양한 용매로 사용가능함 등과 같은 많은 바람직한 특징을 가지고 있다. 이소시아네이트 폴리우레탄 액체 예비중합체가 바람직하다.
이것들은 증점제, 검(gum), 경화 작용제 및 가교제, 가소제 및 겔화 물질의 다양한 조합물을 사용함으로써 추가로 변형될 수 있다. 일반적으로, 겔화 물질은 결합 성분과 피분석물사이의 상호작용을 방해하지 않을 만큼 충분히 불활성이어야한다.
본 발명에서, 관심있는 작용제는 유기 용매내로 추출되며, 이것은 열경화성 혼합물, 또는 화학적으로 또는 UV에 의해 또는 이온화 방사선에 의해 중합된 것과 혼합될 수 있다. 이것은 작용제를 세척제 또는 기타 시약으로 코팅함으로써 수행되며, 이것은 소정의 조건하에서 용해도를 향상시킬 것이다. 그런 다음 혼합물은 긴 섬유내로 성형되거나 섬유내로 주조된다. 섬유는 섬유의 말단상의 태그 또는 섬유를 가진 롤(roll)상의 태그, 및/또는 여기에 상이한 염료를 혼입함으로써 확인될 것이다. 또한 바코드는 섬유의 말단 근처에 직접 인쇄될 수 있다. 열가소성 중합체는 임베딩된 생성물이 충분히 열안정한 경우 사용될 수 있다. 일부 섬유는 어레이에서 특정 리간드의 위치결정에 있어서 도움을 주기 위해 또는 어레이 자체를 확인하기 위해 상이하게 착색될 수 있다.
용매는 겔화 물질에 혼합될 수 있거나 다공성 최종 생성물을 만들기 위해 성형가능성 또는 휘발성일 수 있다. 다공성 생성물은 자가 지지형인 고체 필라멘트 섬유에 있어서 특히 바람직하다.
또한 섬유 똔느 이들의 겔화 물질은 각각의 셀의 표면상의 피분석물/결합 성분만 가시화되도록 하기 위해 염료 또는 기타 흡광제를 함유할 수 있다. 이러한 향상은 온도, 시간, 캐리어 액체의 타입 등으로 변할 수 있는 겔 또는 다공성 물질을 통한 확산율의 효과를 감소시킨다. UV 또는 방출된 형광성을 흡수하는 염료는 표면 부재 피분석물/결합 성분 반응으로부터의 형광성을 감소시킬 것이다.
상이한 염료(형광성 또는 비형광성)는 개개의 섬유내로 혼입될 수 있다. 이차원 어레이내의 개개의 섬유의 위치가 확정될 수 있다.
섬유를 포함하는 고체 필라멘트 또는 모세관 튜브는 다양한 기술에 의해 서로 부착될 수 있다. 성분이 충분히 열안정한 경우, 섬유는 함께 소결될 수 있다. 또한, 시아노아크릴레이트 부착제를 포함하여, 수많은 부착제가 공지되어 있다. 섬유들간의 공간은 부착제 또는 중합되는 단량체에 의해 완전히 채워질 수 있다. 열가소성 및 겔화 물질은 또한 수많은 섬유가 블록내로 함께 보유되도록 함으로써 부착제를 구성할 수 있다. Teflon®튜브와 같은 불활성 물질이라도 표면을 에칭시키는 탄화수소 용매중의 나트륨 금속을 사용하여 반응성이 되는 이들의 표면을 가질 수 있다. 섬유를 융합시키기 위해 섬유를 통해 전기 전류를 통과시키는 것과 같은 비화학적 수단이 또한 사용될 수 있다.
모세관의 개방 말단은 표면에 대해 변형되지 않는 물질을 압축하거나, 표면상의 플라스틱(예컨대, 파랄렌)을 증발시키거나, 열가소성 또는 열경화성 플라스틱 물질과 같은 화학물질로 봉합함으로써 평탄한 플레이트에 대해 봉합될 수 있다.
상기 섬유로부터 이차원 어레이를 제조하기 위한 두 가지 기본적인 선택사항이 존재한다. 첫째는 리본을 제조하고 평가한 다음 긴 직사각형 바(bar)내로 리본의 세트를 형성시키는 것인 반면, 두번째는 처음에 바를 제조한 다음 모든 섬유를 함께 하나의 단계로 수행하는 것이다. 전자 선택사항은 완전한 어레이로 형성되기 전에 리본이 개별적으로 평가될 수 있기 때문에 더욱 장점적인 것 같다. 일단 이차원 어레이 바가 형성되면, 통상적인 마이크로톰을 사용하여 절편하여 예컨대, 유리, 금속 또는 플라스틱에 부착될 수 있는 수많은 슬라이스를 형성할 수 있다. 또한, 다발을 절편하기 전에 다발의 말단에 고상 물질을 우선 부착시킬 수 있다. 이것은 우선 섬유 다발의 말단 또는 고상을 필요한 경우, 시아노아크릴레이트와 같은 부착제 또는 절편전 또는 절편후 소결로 코팅시킴으로써 수행될 수 있다.
염색된 섬유는 확인 및 방향을 확정하기 위해 이러한 어레이에서 가시화될 것이다. 또한, 섬유는 어레이가 정확하게 제조된 경우, 가시적인 패턴이 형성되도록 하는 수단으로 염색될 수 있으며, 상기 패턴은 이름 또는 숫자를 포함할 수 있다.
본 시스템의 장점은 수많은 어레이가 절단될수 있고, 일부 분획물이 표준화를 위해 사용될 수 있다는 것이다. 예를 들어, 100 cm 길이의 바가 제작된 경우, 그리고 바가 100 미크론 간격으로 절단된 경우, 10,000 개의 어레이가 유용할 것이다. 절편의 두께가 10 미크론인 경우, 어레이의 수는 100,000개가 될 것이다.
개개의 섬유의 지경이 100 미크론인 경우, 리본 당 100개의 섬유가 존재하고, 1 cm 사각형의 횡단면 지역을 가진 섬유의 바에 10,000개가 존재할 것이다. 리본 당 330개가 존재하는 경우, 전체 수는 108,900개, 즉 대략적으로 사람 지놈에 존재하는 가정된 발현되는 유전자의 수일 것이다.
본 발명은 칩상에 공유적으로 결합하는 결합 작용제없이 마이크로어레이상의 단위 지역 당 상이한 다수의 상이한 셀을 가진 제 1 어레이이다. 어레이의 1cm 사각형 당 100개 이상, 더욱 바람직하게는 250, 500, 1,000, 5,000, 10,000, 100,000 또는 백만개 이상의 셀을 가지는 것이 본 발명을 위해 바람직하다. 이것은 시판되는 마이크로어레이에서 마이크로유체역학에 의해 형성된 부착된 셀보다 훨씬 더 높은 농도이다.
1cm 사각형 당 셀의 수를 이렇게 높은 수 이상으로 증가시키기 위해, 연구자는 비교적 큰 섬유를 사용하여 큰 섬유 다발을 제조하고 다발을 신장시키거나 늘릴 수 있다. 이것은 개개의 섬유를 더 얇게 만들지만, 서로에 대한 기본적인 조성 또는 방향 및 횡단면 기하학은 변경되지 않을 것이다. 이 기술은 하나가 더 많은 마이크로어레이 및 더 작은 마이크로어레이를 만들도록 해준다는 한 쌍의 장점을 가진다. 통상적인 5 미크론 다공성 입자(하기 실시예에서와 같이) 및 낮은 융점의 왁스와 같은 플라스틱 임베딩 매질을 사용함으로써, 그 결과는 직경이 20 미크론 미만으로 매우 얇게 늘릴 수 있는 변형가능하거나 가단성 섬유이다. 열가소성 물질을 늘리는 기술 분야는 그 자체로 널리 공지되어 있다. 실제로 틀을 통해 늘릴 수 없는 경우라도, 연구자는 롤러사이에 플라스틱 물질을 당기고 성형하여 신장시키고 섬유의 직경을 감소시킬 수 있다. 온화한 열을 임의로 적용하여, 신장시키고 횡단면 지역을 감소시킨 동일물을 생성시키기 위해 섬유 다발의 말단을 당기만 하면 된다. 더 작은 다공성 입자에 대해, 섬유를 더 얇은 치수로 늘려서 마이크로어레이가 마이크로어레이의 1 cm 사각형 당 약 천만개 이상의 셀이 되도록 할 수 있다.
광섬유 분야에서, 광섬유의 다발은 가열되고 다발내에 레지스트리를 보유하면서 극도로 얇은 광섬유내로 늘려진다. 마찬가지로, 횡단면 디자인을 가진 캔디 케인 및 캔디는 큰 블록을 늘림으로써 제조된다. 수백년 동안 사용된 유리 비드조차도 또한 이러한 기술에 의해 제조된다.
마이크로어레이의 높은 농도의 셀(섹터)은 관심있는 분자가 마이크로어레이 셀상에서 합성되는 사진석판술을 사용하여 달성된다. 그러나, 사진화학에 의해 생성된 화합물은 제한된다. 또한, 화학적으로 결합된 화합물은 자유롭게 현탁되는 경우 동일 화합물로부터 상이하게 상호작용한다. 생물학적 시스템에서, 활성 부분은 결합에 대해 자유롭게 유용하지 않을 수 있다. 대조적으로, 본 발명의 결합 작용제는 매트릭스에서 포착되어, 모든 화학적 및 생물학적 활성을 완전히 보유할 수 있다.
다공성 입자를 사용하고 다공성 입자 내부에 관심있는 분자를 고정화시키는 경우, 포어 내부에 적합한 유체를 보유하고 혼합되지 않은 임베딩 매질을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 정렬에 있어서, 임베딩 매질은 관심있는 분자와 비공존성일 수 있거나 결합 검정에 사용할 수 있지만, 여전히 사용가능하다. 예를 들어, 수용액은 단백질을 보호하기 위해 사용할 수 있고 낮은 융점 왁스는 다공성 입자를 임베딩시키기 위해 사용된다.
문헌[참조: Fodor et al., Nature 365:555-6(1993); Hacia et al., Molecular Psychiatry 3:483-92(1998); and Fodor et al., Science 251: 767-773(1991)]에 공지된 광화학적 방법은 지지 칩에 공유적으로 결합된 짧은 펩티드 및 올리고누클레오티드를 제조한다. 핵산 또는 누클레오티드 합성의 방법은 결합된 올리고머의 실제 길이를 본질적으로 제한한다. 칩상의 전체 단백질 또는 유전자의 합성은 비실용적이다. 또한, 단백질의 이차, 삼차 및 사차 구조가 중요할 수있다. 대조적으로, 본 발명은 이를 허용한다.
많은 상이한 어레이가 궁극적으로 요구될 수 있으며, 일부, 특히 감염성 작용제의 확인을 위해 개발된 것들은 짧은 간격으로 변화될 필요가 있다. 또한, 새로운 질환-관련 대립형질이 새로운 어레이내로 혼입될 필요가 있을 것이다. 이러한 요건을 충족시키고 어레이에서의 변화 및 추가를 허용하기 위해, 개별적인 안정한 유용한 섬유 롤, 및 명백하게 확인된 롤을 가지는 것이 중요하다. 각각의 롤은 롤을 따라 짧은 간격으로 적용된 마이크로 세관을 사용하여 확인될 수 있다. 또한, 상이한 튜브는 상이한 색을 가질 수 있으며, 확인장치로서 역할하기 위해 겔내로 혼입된 비형광성 염료 또는 바 코딩은 개개의 섬유상에 인쇄될 수 있다.
본 발명의 칩은 특징적인 핵산 서열을 확인함으로써 감염성 작용제를 확인하기 위해 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 예컨대, 칩은 고정화된 특이적인 항체의 어레이를 사용하여 본래의 세균, 마이코플라즈마, 효모, 나노세균 및 바이러스를 확인하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 마이크로밴딩 튜브에 의해 단리된 바이러스 또는 기타 감염성 입자의 확인을 위해 사용될 수 있다. 이러한 마이크로밴딩 튜브는 적절한 원심분리 방법 이후에 작은 체적의 생물학적 엘리먼트를 바람직한 낮은 농도가 되도록 하는 튜브의 개방 말단 내지 폐쇄 말단의 직경을 단계적으로 감소시키는 특별한 원심분리 튜브이다. WO 99/46047호를 참조하라. 따라서, 생물학적 샘플, 예컨대, 혈청 또는 형장으로부터의 미생물은 농축시키고 TOTO-1 또는 YOPRO-1과 같은 형광성 핵산 염료로 염색시킨 다음, 어레이상에서 일치하는 항체를 발견하도록 해줄 수 있다. 그런 다음 이들은 형광성에 대한 스캐닝에 의해 검출되고 위치에 의해 확인될 수 있다. 기술된 침에서 미생물 또는 기타 관심있는 분자를 고정시키고, 체액으로부터 항체를 국부화시키기 위해 상기 칩을 사용한 다음, 형광성 항사람 항체를 사용하여 후자의 위치를 발현함으로써, 항체 생성을 유발시키는 질환을 진단하는 것은 본 발명의 일부분과 동일하다.
다발이 유지되기 때문에, 추가적인 섬유 또는 리본이 추가적인 어레이를 절편하기 전에 필요에 따라 다발에 첨가도리 수 있다. 이것은 완전히 새로운 다발을 재생성시키지 않고 새롭게 발견된 출현 질환, 새로운 단백질, 유전자 또는 화합물을 검출 및 측정할 수 있도록 해준다.
본 발명은 다발이 사용자 위치에 보관되고, 필요에 따라 어레이가 슬라이싱되는 대안적인 유형으로 적용될 수 있다. 이러한 정렬은 동일한 어레이가 장기간에 걸쳐 필요하지만, 소수만이 한번에 필요한 경우 연구 목적을 위해 유용할 수 있다.
다발을 슬라이싱하고 별도의 마이크로어레이로서 이들의 절편을 사용하는 또 다른 대안법은 직접적으로 다발의 말단을 사용하여 검정을 수행하는 것이다. 제 1 샘플을 절단된 횡단면 표면에 적용시키고, 세척하는 검정이 수행된 후에, 검출기는 결과를 이미지화시킬 수 있다. 그런 다음 마이크로톰 장치에 다발을 장착할 수 있다(검정전에 검정이 이렇게 장착되지 않은 경우). 그런 다음 블레이드는 다발의 사용된 표면을 제거하여 다음 검정을 위한 새로운 표면을 노출시킬 수 있을 것이고, 이것은 동일한 단계로 반복될 것이다. 따라서 다발은 차례로 수행된 100,000회 이상의 일련의 검정 동안 하나의 기계에서 사용될 수 있다. 이러한 정렬은 광학 또는 전기적 검출이 광섬유 또는 전도성 섬유를 가진 다발 자체를 통해 수행될 수 있기 때문에 명백한 장점을 가진다. 검출 시스템은 시험을 위해 사용될 말단에 더욱 일반적인 광 또는 전기 에너지를 적용하면서 다발에 계속적으로 부착될 수 있다. 특히 도 6은 시험 기술이 검출 시스템에 적용될 수 있음을 도시한 것이다.
본 발명은 또한 상이한 고정화 기술, 고정된 관심있는 작용제의 상이한 클래스, 피분석물의 상이한 클래스 및 상이한 타입의 검출 방법이 동일한 칩상에 사용되도록 해준다.
채널이 플레이트사이에서 재생성될 수 있기 때문에, 각각의 채널 또는 셀의 위치는 기계적 수단에 의해 적확히 결정될 수 있다. 연마된 모서리 또는 적절한 위치상의 참조 마킹은 추가로 어레이내의 각각의 셀을 확인한다. 현재 시판되는 충분히 정확인 컴퓨터 유래된 이차원 드라이브를 사용하여 각각의 셀을 가시화시키거나 개별적으로 시험할 수 있거나, 물질이 여기에 첨가되거나 여기로부터 제거될 수 있다.
각각의 플레이트의 절단된 표면은 매칭되는 플레이트가 교차 누출의 가능성이 거의 없이 서로에 대해 반대일 수 있도록 연마될 수 있다. 결국 각각의 셀 내부에 위치될 유체에 반발하는 물질을 사용한 표면 처리는 교차 누출을 추가로 감소시킨다. 예를 들어, 플루오르화(Teflonizing) 또는 실란화 작용제는 물에 반발하며 이로써 수용액으로 채워진 셀의 교차 누출을 감소시키기에 충분한 표면 장력을 생성시킨다.
절편이 다발로부터 절단된 후에, 절편은 일반적으로 고체 지지물에 결합되어 구조적 지지물 및 조작의 용이성을 제공한다. 고체 지지물은 기타 물질이 사용될 수 있지만 전형적으로는 플라스틱 또는 금속의 시트이다. 결합은 일반적으로 영구적인 부착제 또는 열 융합에 의해 수행된다.
어레이내의 개개의 셀은 전하결합소자(CCD)를 사용하여 전체 어레이 또는 이들의 부분(예컨대, 하나 또는 수개의 셀)을 스캐닝하거나 콘덴서 렌즈 및 대물 렌즈에 의해서와 같이, 한번에 하나 또는 수개의 채널을 조명함으로써 검출되거나 가시화될 수 있다. 따라서 광의 흡수 및 방출이 검출될 수 있다. 마이크로어레이로 정렬되고 등록된 광섬유 다발은 마이크로어레이의 셀간의 차이를 광학적으로 검출하기 위해 사용될 수 있다.
검출은 방사선, 효소, 발광물질, 흡광성 염료, 자석, 표지된 스핀, 산화제 또는 환원제, 화학발광물질, 또는 마이크로어레이의 관심있는 작용제와 상호작용하는 검출가능한 성분과 상호작용하는 간접 표지물을 포함하는 다수의 검출가능한 표지물에 기초할 수 있다. 적절한 검출가능한 표지 시스템은 형광성, 보편적으로 형광(epifluorescence)에 기초한다. 이것은 질의 샘플이 하나 이상의 형광성 염료로 표지될 것을 요구한다. 필요한 시험 물질의 양은 염료가 얇은 희석 필름으로서 어레이에 적용될 것이기 때문에 매우 작다. 핵산의 하이브리드화는 주의깊게 제어된 엄격한 조건하에서 수행될 것이다.
선택된 채널을 구별하기 위해, 선택된 채널을 개봉하고/하거나 쉽게 검출될 수 있는 물질로 채널을 채울 수 있다. 상이한 색깔의 잉크, 염료 및 색깔을 띤 물질은 그 밖의 셀에서 검출되는 검출가능한 성분(들)과 유사하거나 반대인 검출가능할 뿐만 아니라 특히 적합한 성분이다. 건조 잉크 또는 잉크를 함유한 플라스틱, 승화물, 용매, 또는 잉크-젯 프린팅을 사용한 인쇄 방법이 사용될 수 있다. 이렇게 형성된 인디시아는 어레이가 사용될 때 더 우수한 정렬 또는 쉽게 검출가능한 마칭을 가능하도록 한다. 이것은 쉬운 시각적 정렬을 가능하게 한다.
일단 마이크로어레이가 결합 검정에 사용되고 리간드가 수용체에 결합하면, 특정한 경우에 리간드의 추가적인 확인을 제공하는 것이 유용할 수 있다. 특정 조건에서, 연구자는 특이적으로 리간드에 결합하는 수용체로부터 리간드의 전체 구조를 알지 못한다. 예를 들어, 리간드가 셀, 고분자 복합체 또는 리간드 등으로서 작용하는 유도체화된 부분을 갖는 유도체화된 분자 등인 경우, 추가 분석이 바람직할 수 있다. 이러한 상황에서, 연구자는 마이크로어레이로부터 리간드를 용리시키고 추가 분석을 위해 리간드를 수집할 수 있다. 항체/항원 결합을 위해, pH 2-3 환경 또는 기타 조건이 리간드를 분리시킨다. 핵산 하이브리드화를 위해, 온도를 높이는 것은 리간드를 분리시킨다. 이러한 결합을 끊기 위한 다양한 그 밖의 화학적, 물리적 및 전기적 기술은 그 자체로 공지되어 있다.
용리 과정에 대한 특이성을 향상시키기 위해, 기질은 특정 셀(섹터)에서 관심있는 생물학적 작용제의 포착을 향상시키는 전하를 유지하도록 배치될 수 있다. 예를 들어, 관심있는 작용제가 핵산인 경우, 각각의 셀은 포지티브 전하를 가지도록 배치될 수 있다. 카운터전극은 반대 전하를 가진다. 그런 다음, 필요한 경우, 특정 매질이 셀내에 위치되고 전극의 전하를 바꿈으로써 예컨대, 핵산에서 리간드가 그 위치에서 방출된다. 카운터전극은 또한 부분일 수 있거나 여기에 추가된 셀로부터 방출된 엘리먼트를 수집하기 위한 마이크로피펫을 함유할 수 있다(참조: 미국 특허 제 5,434,049호). 바람직하게는, 연구자는 다공성 막을 사용하고 막의 반대면에 전류를 적용시킨다.
용리물을 분석하기 위해 사용된 방법은 모세관 전기영동, 질량 스펙트로메트리 또는 제 2 결합 검정일 수 있다. 질량 스펙트로메트리가 편리하고, 마이크로어레이 자체는 결합된 분자가 탈착되어 분석되는 질량 스펙트로메트리내로 혼입된 레이져-매트릭스 탈착 시스템내로 도입될 수 있다.
일단 피분석물이 마이크로어레이로부터 분리되면, 마이크로어레이는 재사용될 수 있다. 이러한 재사용 방법은 시간에 걸쳐 여러 대조군에 의해 표준화되는 장점을 갖는다.
또한, 수용체가 절단될 수 있는 링커에 의해 마이크로어레이의 매트릭스에 결합된 경우, 연구자는 링커를 절단함으로써 피분석물을 단리시킬 수 있다. 마이크로어레이의 상이한 셀은 상이한 링커 또는 동일한 링커를 가질 수 있고 후속하는 정제가 추가적인 분석 이전에 필요할 수도 있다.
단백질 칩을 제조하는 선행 방법은 용액중에 다수의 단백질의 제조, 사용 및 재사용을 필요로 한다. 용액중의 단백질, 핵산, 생물학적 세포, 기타 화학물질 및 복합체는 불안정하고 시간이 지나면 저하된다. 냉동된 경우라도, 반복된 사용은 특정 단백질을 변성시키는 반복된 냉동-해동 사이클과 연관될 수 있다. 대조적으로, 고정된 단백질은 장기간 동안 안정한 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "기판"은 채널 플레이트의 개방 말단을 칭하는 "주요 표면"을 갖는 유리 모세관 어레이를 칭하며 "결합 시약"은 DNA, 단백질 또는 항체(집합적으로 고분자), 세포/미생물/세포계 또는 그 밖의 관심있는 작용제를 칭한다.
하기 실시예는 본 발명의 특정한 일면을 예증할 목적으로 포함되며 제한된 것으로 해석되어서는 않된다.
실시예 1: 마이크로어레이의 형성 및 분석
항체를 각각 고정된 항체에 가역적으로 결합시킴으로써 친화도 정제에 의해 제조하였고 후속적으로 인테그랄(Integral) 100Q 바이오크로마토그래피 워크스테이션의 미립자 지지물(Poros G, PE Biosystems 제조)상에 고정시켰다.
각각의 항체 지지물을 Poros G(Fc 도메인에 의해 많은 면역글로불린에 결합할 수 있는 세균성 단백질인 단백질 G로 예비 코팅된 Poros 입자는 시판중임)의 컬럼상에 항체를 포착시킴으로써 제조하고, 후속하여 항체와 단백질 G를 디메틸피멜리미데이트와 가교시켜(하기 PE Biosystems 프로토콜) Poros 입자상에 항체를 공유적으로 고정하였다. 상기 항체 컬럼을 감법 모드로 100회 이상 (결합된 항원의 산성 용리로) 재사용할 수 있었고, 그러므로 매우 안정적이었다. 각각의 항체 지지물을 특징화하여 단일 항원에 대한 특이성을 증명하였다.
사람 혈청 알부민(HSA), 트랜스페린(Tf) 및 햅토글로빈(Hp)에 대한 항체를 사용하였다. 세 가지 지지물의 혼합물을 혈청 감법에 사용하기 위해 제조하였다.세 지지물 전체를 1)토끼 안티 HSA, 2)토끼 항사람 Tf 및 토끼 항사람 Hp 및 3)혼합된 안티-HSA, Tf 및 Hp로 시험에 사용하였다. 변형되지 않은 BA Poros(시판되는 스트렙타비딘 코팅된 Poros)를 항체 부재 대조군으로서 사용하였다. 따라서, 모두 4개의 지지물을 사용하였다.
Poros 입자를 거친 구형이고 고도의 그물모양(많은 내부 틈을 갖는)이고, 약 5 미크론의 직경을 갖는다. 결합된 단백질은 입자의 외부 표면 뿐만 아니라 내부 표면에 걸쳐 분포되어 있다. 적절한 매질중에 입자를 임베딩시킴으로써, 항체가 고정되어 있고 상당히 일정하게 분포된 슬라이싱될 수 있는 고체 매트릭스를 생성시켰다. 지지물의 삼차원 성질을 사용함으로써, 이들 입자를 함유하는 슬라이스는 현재 마이크로어레이에 사용되는 것과 같이 단순한 평탄한 표면 보다 더 큰 용적(항체를 위한 따라서 항원 결합을 위한)을 제공한다.
항체 보유 입자의 4가지 타입 각각을 인산염 완충 염수(PBS) 중에 용해된 대략적으로 동일한 부피의 0.75% 아가로오스와 혼합하였다. 토끼 안티-HSA 비드를 위한 아가로오스는 녹색 식품 색소를 함유하였다. 마찬가지로, 안티-Tf 및 Hp 아가로오스는 청색으로 착색되고, 혼합된 안티-HSA, Tf 및 Hp 아가로오스는 노랑으로 착색되고 Poros BA 함유 아가로오스는 백색(무색)이었다. 각각의 용해된 아가로오스/비드 조합물을 1 ml 시린지가 부착된 10 cm 길이의 1 mm 직경의 플라스틱 튜빙내로 빨아들이고 얼음물에 플런지시켰다. 수 분에, 아가로오스는 약 50% Poros 비드를 함유하는 젤리형 막대내로 겔화되었다. 따라서 수득된 4개의 막대(각각은 상이한 단백질 코팅제를 가진 상기 4가지 비드 타입 중 하나를 함유한다)를 더욱 용해된 아가로오스를 사용하여 알루미늄 채널내로 넣어 아가로오스의 사각형 단면으로 임베딩된 2x2 병렬 막대의 어레이를 형성하였다.
바가 겔화된 후에, 겔을 알루미늄 채널 주형으로부터 제거하고, 가로 절편을 바(및 필라멘트)의 축에 대해 수직으로 얇은 슬라이스를 슬라이싱함으로써 제조하고 유리 슬라이드상에 올려놓았다. 절편을 현미경법에 의해 아가로오스의 깨끗한 임베딩 매트릭스에 의해 둘러싸인 (고정된 단백질을 가진) 임베딩된 미립자 물질을 함유하는 4개 원형 지역(필라멘트)의 패턴을 밝혔다. 임베딩된 비드의 원형 지대는 더욱 안정하였고 분리되지 않았다.
마이크로어레이를 형성하는 절편의 4가지 원형 지대내의 비드에 결합하는 특이적인 단백질을 시험하기 위해, 시판되는 HSA 및 Tf 단백질을 셀라이트(Sigma로부터 입수)상의 형광체 이소티오시아네이트(FITC)로 표지시켰다. 셀라이트는 불용성 FITC에 대한 사용 캐리어이다. 단백질을 0.4M 중탄산 나트륨 완충액(약 pH 8.3) 약 4 ml중에 용해시키고 다음과 같은 양으로 셀라이트상에 건조 FITC를 첨가하였다:
HSA 약 4.5 mg 셀라이트상에 FITC 약 30 mg
Tf 약 2.8 mg 셀라이트상에 FITC 약 18 mg
혈청 단백질(20㎕)약 4.5 mg 셀라이트상에 FITC 약 10 mg
반응을 실온에서 30분 동안 수행하였다. 셀라이트를 원심분리에 의해 제거하고, 상층액 단백질 및 반응하지 않은 염료는 원심분리 단백질 집중기에 위치되며, 여기서 단백질은 반복 희석에 의해 세척되고 완충액중에 재농축된다. 유체를원심분리시켜 셀라이트를 제거하고 상층액이 맑아질 때까지 중탄산 나트륨 완충액 4 ml을 사용하여 재원심분리시켰다.
4-필라멘트 어레이의 절편을 유리 현미경 슬라이드상에 평탄하게 놓고 형광적으로 표지된 HSA 용액에 노출시켰다. 절편의 노출 동안, 단백질은 두 개의 필라멘트(절편상의 둥근 지역)상에 존재하는 항체와 특이적으로 상호작용할 것으로 예상되었고: 두 개의 필라멘트는 HSA 및 혼합된 안티-HSA, Tf 및 Hp에 대한 항체를 보유하고 있었다. 표지된 HSA는 Tf 단독 또는 스트렙타비딘을 단독으로 갖는 필라멘트에 대한 항체를 갖는 필라멘트와 상호작용할 것으로 예상되지 않았다.
절편을 형광체 형광성 검출을 위한 500 nm 저통과 필터 및 510 nm 고통과 필터 및 35 nm 카메라가 장착된 형광(epifluorescence) 현미경하에서 검사하였다.
광범위한 세척 전에, 4개의 원형 Poros 지역 모두는 식별할 수 없는 차이로 밝은 형광성을 나타내었다. Poros 지역이 필라멘트 주변의 아가로오스 매트릭스 보다 높은 형광성을 나타내었다는 사실은 Poros 입자의 포어가 방해없이 남아있고 따라서 입자-함유 지역이 절편내로 표지된 HSA의 자유 확산을 가능하게 함을 가르키는 것이다.
그런 다음 절편을 PBS로 광범위하게 세척하고 형광 현미경하에서 재검사하였다. 35 mm 유색 슬라이드상에서 포착된 생성된 이미지를 통해 세척 후에, 표지된 알부민인 HAS 항체를 함유하는 두 가지 필라멘트에 특이적으로 결합하고 나머지 두 개로부터 제거됨으로써, 개객의 단백질을 검출하기 위한 절편의 능력을 특이적으로 확립시켰음이 증명되었다. 두 가지 특이적으로 표지된 필라멘트는 2x2 어레이에서서로 대각선으로 반대였으며, 이것은 안티-HSA 및 혼합된 안티-HSA, Tf 및 Hp 아가로오스 필라메트의 대각선으로 반대인 위치와 일치하였다.
실시예 2: 미토콘드리아 또는 리소좀 단백질에 대한 자가항체를 검출하는 진단 어레이의 제작 및 용도
전체 단리된 래트 및 마우스 간 미토콘드리아, 리소좀 및 발현된 단백질의 현탁물을 수성 완충액중에 10 mg/ml 농도로 현탁시키거나 용해시키고, 임의적으로 글루타르알데히드(1%)로 고정시켰다. 각 제조물 1 ml를 키트 지침에 따라 촉매 0.17 g을 함유하는 단량체 A 20 ml을 혼합함으로서 제조된 JB-4(Polysciences) 촉매된 침투 수지 20 ml과 혼합하였다. 완전히 혼합시킨 후에, 촉매 0.17 g을 함유하는 단량체 B 40 mL을 교반중에 첨가하였다. 완전히 용해되었을 때, 가속화제 0.8 g을 첨가하고, 혼합물을 시린지에 넣고 혐기성 조건하에서 Teflon 튜빙 직경의 0.0625 인치 간격으로 주입하였다. 중합화를 실온에서 약 50분 동안 일으켰다. 그런 다음 튜브의 말단을 가열 봉합하고 사용시까지 차갑게 보관하거나, 섬유 다발을 제조하는데 사용하기 위해 즉시 성형시켰다. 다발을 10개 이상의 섬유를 병렬로 놓음으로써 제조하여, 신장된 Teflon 박스에 단일층 어레이를 만들었다. 그런 다음 단백질이 없는 추가적인 JB-4 수지를 붓고, 박스를 부드럽게 빼내어 기포를 제거하고 수지가 세팅되도록 하였다. 그런 다음 수개의 이러한 평탄한 어레이를 병렬로 포개어 삼차원 그룹을 만들고, 전체 그룹을 추가로 진공 포착시켜 삼차원 다발을 형성시켰다. 중합후에, 다발을 강철 또는 유리 마이크로톰 나이프로 절단하여 5 내지 20 미크론 두께의 절편을 생성시키고 이 절편을 유리 슬라이드위에 위치시켰다. 절편을 플라스틱 마운트(Plastic Mount®)를 사용하여 마운팅시키거나, 건조시키고 폴리-마운트(Poly-Mount®)(Polysciences로부터 입수가능함)를 사용하여 마운팅시켰다.
자가항체에 대한 시험을 각각의 칩상에 사람 혈청의 1:10 희석물 0.25 mL을 위치시키고 25℃에서 20분 동안 인큐베이션시킴으로써 수행하였다. 그런 다음 어레이를 인산염 완충 염수로 4회 세정한 다음 호세라디시 페록시다제와 컨쥬게이션된 염소 항사람 글로불린의 용액중에 침지시켰다. 추가로 20분 인큐베이션시킨 후에, 어레이를 완충액으로 4회 세척한 다음 시트르산 완충액중의 수소 페록시드 용액(0.02%)가 첨가된 유기 베이스중의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘의 용액에 위치시켰다. 불용성 청색은 자가항체의 존재를 가르킨다.
실시예 3: 조직학적 임베딩 지지물을 사용한 진단 어레이의 제작 및 용도
어레이를 감염의 히스토리에서 후기에 나타나는 회복기 항체를 검출하기 위해 사용되는 고정된 감염성 입자를 혼입하여 제조하였다. 이것은 어떤 감염이 발생하였는지를 결정하기 위한 이후 감시 군집에 중요하다.
이뮤노-베드 GMA 물-혼합가능한 임베딩 매질은 직접(Polysciences Inc.) 제조되며 작은 회분은 고정된 선택된 바이러스(평균 역가 109/ml) 또는 고정된 세균 세포(평균 107입자/ml)의 상이한 현탁물과 혼합된다. 현탁물은 시린지에 넣어져 1/16 인치의 내부 직경의 Teflon®튜빙내 압을 가함으로써 실온에서 중합가능하도록 하였다. 튜빙을 유기 매질중의 금속성 나트륨으로 사전-처리하여 표면을 제공하였고, 이것은 에폭시 수지에 부착할 것이다. 중합된 섬유는 코일링된 Teflon®튜빙으로 내장 보관하였다.
어레이를 에폭시 수지로 침투시킨 후에 어레이를 지그를 사용하여 다발에서 조립하여 병렬 어레이에 섬유를 보유시켰다. Teflon®튜빙의 절편을 포함하는 마무리된을 절편화시키고 절편을 에폭시 수지 마운팅 매질을 사용하여 유리 슬라이드상에 마운팅시켰다. 절편을 재수화시키기 위해 세척한 다음 회복기 항혈청에 노출시켰다. 그런 다음 칩을 광범위하게 세척하고 공유적으로 결합된 형광성 염료 형광체를 사용하여 염소 항사람 IgG에 노출시켰다. 회복기 항체의 확인을 CCD 카메라를 사용하여 형광성을 검출하고 측정함으로써 수행하였다.
실시예 4: 소결된 세편을 사용하는 진단 어레이의 제작
1/16 인치 두께인 소결된 폴리스티렌 시트를 사각형 단면 세편으로 절단하고 각각을 라이노바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 인플루엔자 바이러스 타입 A, 호흡기 신시티움 바이러스, 수두대상포진 바이러스(수두), 마이코박테리움 투버큘로시스, 사이토메갈로바이러스, 엡스타인 바 바이러스, B형 간염 바이러스(표면 항원 및 별도의 코어 항원) 폴리오바이러스(3가지 균주) 등과 같은 바이러스를 포함하는 일련의 감염성 작용제에 대한 하나의 모노클로날 항체의 희석 용액에 노출시켰다. 세편을 세정, 거조 및 아크릴로니트릴 부착제와 함께 접착시켜 삼차원 어레이를 형성시켰고 이를 절편하여 5-100 미크론 두께의 어레이를 생성시켰다. 바이러스 질환에 걸린 개체로부터의 감염성 바이러스를 함유하는 생물학적 샘플을 핵산 특이적인 염료 YOYO-1(Molecular Probes)를 사용하여 형광 염색시키고 단리시키고 원심분리 마이크로밴딩(상기 WO 99/46047호 참조)을 사용하여 농축시키고, 감염성 입자를 마이크로리터 부피로 농축시켰다. 농축된 바이러스를 어레이에 적용시키고 기계적으로 교반시켜 1시간 동안 바이러스 입자를 어레이에 걸쳐 이동시켰다. 그런 다음 어레이를 세척하고, 초과 유체를 빨아내어 제거하고 490 nm의 자외선 광으로 조명하였다. 이미지를 520 nm 필터를 사용하는 Apogee CCD 카메라로 포착하였다. 정량적인 데이터를 PMIS 이미지 분석 프로그램을 사용하여 처리된 이미지로부터 수득하였다.
실시예 5. 고정된 올리고누클레오티드를 가진 진단 어레이의 제작 및 용도:
공유적으로 결합된 올리고누클레오티드를 사용하는 고상 올리고누클레오티드 합성으로부터 폴리스티렌 비드(10-50 미크론 직경)를 완충액중에 현탁시키고 처음에 유체정역학적 압력에 이어서 500 psi이하의 대기압하에서 500 미크론 내부 직경의 중공 유리 섬유내에 채워서 지지 액체를 배출시켰다. 그런 다음 섬유를 성분을 부분적으로 소결시키는 제어된 조건하에서 일시적으로 가열하였다. 그런 다음 섬유의 어레이를 간헐적인 진공을 사용하여 낮은 점도의 에폭시 수지내로 임베딩시켜 기포를 제거한 다음 세팅되도록 하는 상기 실시예들의 방법으로 제조하였다. 다발을 다이아몬드 톱을 사용하여 절편하였다. 어레이를 흐름을 통한 정렬에 사용하여 그 위의 물질이 상기 미국 특허 제 5,843,767호에 기술된 바와 같이 큰 멀티웰 마이크로역가 플레이트로 수행되는 것과 유사한 형태로 조작될 수 있도록 하였다.
실시예 6: 멀티웰 플레이트의 제작
시판된느 유리 모세관 어레이(GCA)(Galileo)는 2.5 cm x 2.5 cm x 0.5 mm 두께를 가진 얇은 디스크 모양이다. GCA는 50 μ 구멍으로 구성된 약 50%의 지역 또는 약 0.1 ml의 전체 부치를 가지는 약 156,000 구멍을 갖는다. GCA의 바닥 표면은 시아노아크릴레이트 부착제(SUPERGLUE)를 사용하여 Teflon®시트에 접착되어 있다.
실시예 7: 유리 모세관 어레이에서의 클로닝 및 리플리카 플레이팅
스트렙토코쿠스 피로게네스 그룹 A의 콜로니 및 그룹 B의 콜로니를 플레이트로부터 취하여 영양배지에서 서로 혼합시켜 세균 세포(그 밖의 미생물, 동물 또는 식물세포도 동일하게 적용가능함)의 현탁물을 형성시키고 배양 배지 1 ml 당 약 20,000 세포의 농도로 희석하였다. 현탁물 약 0.1 ml을 GCA의 표면에 적용하였다. 이것은 단일 세포 클론 결과만을 보증하기 위해 100개의 구멍 당 약 1개의 세포를 생성시켰다. GCA를 멸균한 페트리 디시에 위치시키고, 뚜껑을 덮고 37℃에서 밤새 배양시켰다.
바닥에 Teflon®시트가 없는 두 개의 추가적인 멸균한 GCA를 1% 아가로오스를 보충한 가열한 액체 배양 유체 0.1 ml로 채우고, 거의 고형화될 때까지 냉각시키고 각각의 GCA로부터의 구멍이 레지스터내에 존재하도록 하기 위해 클로닝된 세균 세포를 갖는 GCA의 위에 직접 포갰다. Teflon®의 상단 시트를 단단히 누르고 스택을 서로 고정시켰다. 전체 스택을 거꾸로 놓고 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 전체 스택을 옆으로 놓고 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 그런 다음 스택을 수직으로 놓고 고정을 풀고 개개의 GCA를 분리하였다. 본래의 GCA는 추가 사용을 위해 보관하였다.
두 개의 첨가된 GCA 각각을 유리 플라스크내에 위치시키고, 동결건조제에 부착시키고 1시간 동안 진공 건조시켰다. GCA를 제거하고 스트렙토코쿠스 그룹 A(DIFCO)에 대한 FITC 컨쥬게이션된 항체 0.1 ml를 각각의 GCA에 첨가하고 실온에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. 그런 다음 각각의 GCA를 부착 조직(KIMWIPE)상에서 블로팅하여 유체를 제거하였다. 마이크로어레이를 PBS중에 침지시켜 세척하고 블로팅하고 건조시켰다. GCA내 형광성 구멍 및 본래의 GCA내 구멍을 함유하는 세균을 12.5μ 픽셀을 제공하고 세포 클론을 함유하는 구멍을 검출하기 위해 필요한 25μ의 해상도가 가능한 CCD 스캐너를 사용하여 검출하였다.
스캐너를 형광성에 이어서 흡수도에 대해 스캐닝하도록 처음에 세팅함으로써 세균 클론의 존재를 검출하였다. 흡수도는 두개의 GCA의 구멍을 정렬하기 위해 세균의 존재를 나타내기 위해 사용된다. 형광성을 본래의 GCA의 세균 클론을 함유하는 전부는 아니지만 일부 구성에서 검출하였고 그룹 S 세균의 존재와 상응하였다.
실시예 8: 모노클로날 항체의 선택
현탁물중의 모노클로날 항체-분비 하이브리도마를 RPMI 1640 + 5% 우태아혈청 배양 용액 1 ml 당 약 20,000 세포로 희석시키고 0.1 ml를 실시예 6의 GCA에 첨가하고 실시예 7의 방법을 반복하되 CO2인큐베이터에서 2일 동안 37℃로 인큐베이션시키고 GCA를 10% 우태아 혈청으로 30분 동안 사전처리하였다. 추가적인 GCA를 단백질 부재 염수로 채우고 포개고 고정시켰다. 스택을 전혀 돌리지 않고 실온에서 15분 동안 인큐베이션시키고, 고정을 푼 다음 이전과 같이 진공 건조시켰다. FITC-컨쥬게이션된 염소 항마우스 면역글로불린 0.1 ml을 추가적인 GCA에 첨가하고, 인큐베이션시키고, 제거하고, 세척하고, 이전과 같이 형광성을 스캐닝하였다. 항체 분비 하이브리도마를 GCA상의 형광성의 위치로부터 추정하였다.
실시예 9: 생물학적 특성에 대한 단백질의 라이브러리의 스크리닝
사람 혈청 단백질을 문헌[참조: Baekkeskov et al., Diabetes 38(9): 1133-41 (1989)]에 따라 이차원 전기영동에 의해 분리하였다. 2백개의 스팟을 겔로부터 천공하고 개개의 단백질을 PBS 1ml중에 투석하였다. 단백질 용액 1 ml을 촉매를 사용하여 아크릴아미드 단량체 40 mg과 혼합하고 1 mm 내부 직경의 1 미터 길이 폴리프로필렌 튜브내로 펌핑하고, 말단을 가열 봉합시키고 각각의 튜브를 태깅하였다. 수많은 대조 튜브를 형성되었을 때 마이크로어레이의 정확한 방향을 쉽게 확인하도록 다양한 염료를 사용하여 제조하였다. 아크릴아미드를 밤새 중합되도록 하였다. 튜브를 선반에 정렬시키고 상기와 같이 열사이를 접착시켰다. 다발을 냉동 조건하에서 마이크로톰에 의해 10 마이크로미터 두께의 슬라이스로 절단하고 마이크로어레이를 플라스틱 시트상에 즉시 고착시켰다.
하기 항원(Vector Labs)에 대한 마우스 모노클로날 항체를 개별적으로 별도의 마이크로어레이와 접촉시키고, 인큐베이션시키고, 세척하고, 건조시킨 다음 FITC-컨쥬게이션된(형광체-표지됨) 염소 항마우스 IgG와 접촉시키고 상기 실시예 8에서와 같이 스캐닝하였다. 인슐린, 칼시토닌, 글루카곤, 표피 성장 인자, 인터페론, CEA, 전립선 산성 포스파타제 및 사람 IgG가 시험된 보편적인 항원이다. 호르몬 레벨 및 종양 항원 레벨 둘 모두는 세미-정량적 방법으로 결정된다.
실시예 10: 신속한 항체 민감성 시험
마이크로어레이를 실시예 2에 따라 제조하되, 각각의 튜브를 하기 배치로 다양한 항생제와 혼합된 영양 배지로 채웠다. 5개의 2배 희석물을 항생제, 에리트로마이신, 페니실린 V, 테트라사이클린, 앰피실린, 트리메토프림/설파메티오졸, 세파클러, 오플록사신 및 니트로프란토닌의 유용한 농도의 효과적인 범위로 통과시키고 34개의 새로운 화합물 중 10개의 2배 희석물, 항생제로서 사용하기 위한 각각의 후보물질을 사용하였다.
환자의 소변으로부터 성장된 대장균의 공지되지 않은 샘플의 콜로니를 형광체 아세테이트 및 트리판 블루가 보충된 영양 브로쓰 1 ml중에 현탁시키고 각각 두 개의 마이크로어레이상에 위치시키고 37℃에서 인큐베이션시켰다. 마이크로어레이를 인큐베이션 시작시 및 30분 후에 형광성 및 흡수도에 대해 스캐닝하였다. 형광성에서의 검출가능한 증가를 갖는 마이크로어레이 셀(스캐닝된 형광도는 초기 스캐닝한 형광도를 뺀 것이다)은 성장중인 세포를 가지고 있다고 생각되었다. 시작시 내지 30분의 트리판 블루 흡수도에서의 증가를 갖는 마이크로어레이 셀은 사멸한 세포를 가진 것으로 생각되었다. 따라서 최소 억제 농도(MIC) 및 최소 살균 농도(MBC)를 결정하였다. 새로운 후보 화합물의 가능한 효과를 마찬가지로 추정하였다. 대장균의 공지되지 않은 샘플의 또 다른 현탁된 콜로니를 함유하는 염수의또 다른 1 ml을 통상적인 뮐러-힌톤 플레이트상에 항생제 디스크와 함께 플레이팅하고 밤새 인큐베이션 시켰다. MIC은 억제 구역의 직경에 기초하여 다음날 결정되었다. 예를 들어, 니트로푸란토닌의 경우, 밀리미터에서 300 mcg로부터의 구역 직영은 17 mm 초과 감수성, 15-16 mm 중간 및 14 미만 내성이었고 이는 각각 32 미만, 64 및 128 초과의 mcg/ml로의 MIC에 상응하였다. 마이크로어레이에서 니크로푸란토닌의 2배 희석물은 16, 32, 64, 128 및 256 mcg/ml이었다.
본 방법을 공지된 상이한 레벨의 항생제 내성을 갖는 대장균의 공지된 균주 및 상이한 레벨의 항생제 내성을 갖는 많은 상이한 보편적인 미생물로 반복수행하였다. 결과는 34개 후보 화합물이 잠재적인 항생제로서 추가로 시험된 것임을 가르킨다.
실시예 11: 항암 진단 및 약물 스크리닝
마이크로어레이를 백혈병 환자, 수개의 백혈병 세포주(ATCC의 HTB와 같은), 정상 말초 백혈구 세포 및 정상 골수 세포를 사용하여 실시예 2의 방법에 따라 제조하였다. 마이크로어레이를 열 변성시키고 N-myc, C-myc, K-ras, p53, HER-2/neu에 대한 디옥시게닌-표지된 DNA 프로브 및 진단 목적의 후보 DNA 프로브를 여기에 적용하였다. 텍사스 레드-표지된 안티-디곡시게닌 항체를 첨가하고 결합의 패턴 및 양을 결정하였다.
실시예 12: 간염 시험
가장 잘 처리한 환자에 대해 간염 바이러스의 타입 및 감염의 단게를 알려주는 것이 바람직하다. 마이크로어레이를 실시예 2에서와 같이 제조하되, HAV,HBsAg, HBcAg, HCV, HDV 및 HEV에 대한 마우스 모노클로날 항체의 10개의 2배 희석물 및 동일한 항원의 2배 희석물을 사용하였다. 각각 3개의 튜브를 제조하고 대조군의 패턴에 따라 마이크로어레이에 사용하였다. 혈청 샘플중 약 3개의 드롭이 마이크로어레이와 접촉하였고 37℃ 항온조에서 10분 동안 인큐베이션시키고 PBS로 4회 세척하였다. 각각의 항원의 비-오버랩핑 에피토프에 대한 형광체 표지된 모노클로날 항체, 형광체 표지된 마우스 항사람 IgG 및 로다민 표지된 항사람 IgM의 시약 약 1 ml을 마이크로어레이에 첨가하고, 37℃ 항온조에서 10분 동안 인큐베이션시키고 PBS로 4회 세척하였다. 마이크로어레이를 형광체의 파장 및 로다민 방출 둘 모두에서 형광성에 대해 스캐닝하였고 결과는 마이크로어레이의 셀이 형광성, 빛의 파장 및 이들의 레벨을 증명하는 지에 대해 결정하였다.
마이크로어레이를 초기 진단 및 회복기 혈청중의 항원 및 항체를 검출함으로써 치료 및 경감을 모니터링하기 위해 디자인하였다. 2배 희석물 및 각각의 셀에서 형광성의 레벨을 측정하는 것은 정량적 결과를 제공하였다.
실시예 13: 활성 화합물 후보물질의 스크리닝
마이크로어레이를 실시예 2에 따라 제조하되, 380개의 새로운 후보 화합물을 섬유내로 도입시켰다. 글루타메이트 수용체 2를 함유하는 용액 세 방울을 마이크로어레이에 첨가하고 37℃에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. 마이크로어레이를 세척하고 이전과 같이 건조시켰다. 마우스 모노클로날 항체 대 글루타메이트 수용체 2의 1:10 희석물을 첨가하고 인큐베이션시키고 세척하고 이전과 같이 건조시켰다. FITC-컨쥬게이션된 염소 항마우스 IgG를 첨가하고 마이크로어레이를 스캐닝하였다.
형광성 셀은 수용체에 결합한 화합물에 상응한다. 수용체가 신경전달 물질 글루타메이트에 결합함으로써, 학습, 기억, 발작 및 기타 신경학적 조건과 연관되기 때문에, 작용제 및 길항제 모두는 약리학적으로 관심의 대상이다.
실시예 14; 형광성에 의한 마이크로어레이의 형성 및 분석
마이크로어레이를 a)래트 IgG에 대한 고정된 항체를 갖는 마이크로비드, b)사람 IgG에 대한 고정된 항체를 갖는 마이크로비드 및 c)대조군(마이크로비드 부재)을 함유하는 원통형 폴리메트아크릴레이트 섬유로부터 제조하였다. 어레이를 장축을 따라 병렬로 섬유를 정렬시킴으로써 형성시키고, 마이크로톰으로 절편한 다음 절편을 유리 슬라이드로 옮겼다. 슬라이드를 형광성 면역검정법으로 시험하여 다음과 같이 비드에 결합하는 특이적인 단백질을 증명하였다.
울트라링크 고정된 스트렙타비딘 플러스 비드(UltraLink Immobilized Streptavidin Plus bead)(50-80 미크론 직경, 비드의 ml 당 바이오틴-BSA 10 mg의 용적을 가짐, Pierce Chemical Co., Rockford, IL)를 0.05% 나트륨 아지드를 함유하는 인산염 완충 염수 pH 7.2로 세척하였다. 슬라이드를 하나의 컬럼상에 바이오틴 표지된 염소 항사람 IgG 0.5 mg을 함유하는 5개의 1 ml 용액 및 나머지 컬럼상에 바이오틴 표지된 염소 항-래트 IgG 0.5 mg을 사용하여 연속하여 처리하였다. 컬럼을 과잉 바이오틴으로 처리한 다음 PBS로 세척하였다.
사용된 임베딩 물질은 제조업자의 지시에 따라 제조된 이뮤노베드(ImmunoBed; Polysciences, Inc. Warrington, PA)였다. 염료 촉매(225 mg)를 이뮤노베드 용액 A 25 ml중에 용해시켰다. 이 용액에 이뮤노베드 용액 B 1ml을 첨가하였다. 혼합물을 차갑게 유지시킨 다음 튜빙에 결합된 시린지를 사용하여 4개의 풋 길이의 Teflon 튜빙(1/32 인치 ID)내로 도입시켰다. 이뮤노베드 수지로 채워진 튜빙을 실온에서 밤새 세워놓았다. 중합된 섬유를 단일 칼날 블레이드를 사용하여 튜빙의 말단을 절개함으로서 Teflon 튜빙으로부터 제거하여 섬유를 노출시킬 수 있고, 그런 다음 튜빙으로부터 섬유를 온화하게 당길 수 있다.
사람 IgG 및 래트 IgG에 대한 항체를 함유하는 울트라링크 비드를 상기 기술한 바와 같이 제조하였다. 각각 약 0.5 ml을 2000 rpm으로 10분 동안 원심분리에 의해 수집한 다음상기 기술한 바와 같이 제조된 차가운 이뮤노베드 용액(용액 A + 촉매 + 용액 B) 5 ml과 혼합하였다. 그런 다음 비드를 5℃에서 2000 rpm으로 10분 동안 원심분리시켰다. 이를 3회 반복하였다. 그런 다음 펫렛화된 비드를 이뮤노베드 용액 1 ml중에 재현탁시키고 1/32 인치 ID Teflon 튜빙내로 늘렸다. 튜빙을 다발내로 포개고, 원심분리 선반내에 위치시킨 다음 2500 rpm으로 10분 동안 원심분리시켰다. 선반을 제거하고 실온에서 밤새 정치시켜 이뮤노베드가 중합되도록 하였다. 다발을 포갠 부분의 상단을 절단함으로써 절편으로 절단하고 실을 성형하였다.
두 개의 대조 섬유 및 두 개의 실험 섬유를 각각 1.5 cm의 길이로 절단하였다. 섬유를 장축을 따라 정렬시키고 Teflon 블록의 홈에 위치시켰다. 유리 슬라이드를 섬유위에 놓고 적절히 고정시켜 각각의 섬유 약 1 mm를 노출시켰다. 이뮤노베드 용액(용액 A + 촉매 + 용액 B)을 섬유의 노출된 팁에 도입시키고 유리 슬라이드아래의 흐름이 섬유주위 및 섬유 사이의 공간을 채우도록 하였다. 이 구조물을 실온에서 밤새 정치시켜 완전히 중합되도록 하였다. 어레이를 주형으로부터 제거하고 레이카 모델 RM-2155 마이크로톰에서 절편하였다. 얇은 절편(10 미크론)을 물 20㎕ 방울을 함유하는 유리 슬라이드로 옮기고 물을 실온에서 증발시켰다. 이것은 절편이 유리 슬라이드에 견고히 결합되도록 한다. 50 미크론 두께의 절편은 더욱 많은 백그라운드 형광성을 생성시킨다.
상기 제조되어 유리 슬라이드상에 마운팅된 10 미크론 절편을 PBS로 1:50 희석된 정상 래트 혈청(IgG 함유) 100㎕, 1 mg/ml BSA를 함유하는 실온에서 60분 동안 처리하였다. 용액을 슬라이드로부터 배출시키고, 100 ㎕ PBS/BSA로 1회 세정한 다음 배출되기 5분 전에 100 ㎕ PBS/BSA로 3회 세척하였다. 마지막 세척후에, PBS/BSA로 1:100 희석된 래트 IgG(H+L)(Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, MD)에 대한 R-파이코에리쓰린-표지된 친화도 정제된 염소 항체 100㎕를 첨가하고 실온에서 60분 동안 세워놓았다. 그런 다음 용액을 배출시키고 이전과 같이 4회 세척하였다. 형광성 면역염색후에, 절편을 녹색 필터(여기 필터 510-550 nm, 차단 필터 590 nm)를 사용하는 올림푸스 모델 BX-40 형광 현미경(Olympus America, Inc., Melville, N.Y.)에서 관찰하였다. 10 미크론 슬라이스를 포함하는 4개의 원형 슬라이스는 2개의 대조 슬라이스를 포함하며, 하나의 슬라이스는 항사람 IgG를 갖는 비드를 함유하며 하나의 슬라이스는 항래트 IgG를 갖는 비드를 함유한다. 래트 IgG에 대한 항체를 함유하는 원형 슬라이스는 항사람 IgG를 함유하는 슬라이스, 및 2개의 대조 슬라이스 보다 훨씬 더 높은 형광성이었으며, 이로써 반응의 특이성이 증명되었다.
데이터 테이블
마이크로어레이 섬유 형광성의 양
성분관찰자 #1*관찰자 #2**
래트 IgG에 대한 항체++++10
대조군(항체 부재)00
사람 IgG에 대한 항체++3
대조군(항체 부재)++2
*0, +, ++, +++ 또는 ++++으로 등급매긴 형광성
**1 내지 10으로 등급매긴 형광성
본 발명의 다양한 변형은 본원에 기술된 구체예에 대해 수행될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 그러므로, 상기 설명은 제한하는 것으로 해석되어서는 안되며, 단지 바람직한 구체예의 예시로서 해석되어야 한다. 당업자는 본원에 청구된 청구항의 범위 및 정신내에서 그 밖의 변형을 생각할 수 있을 것이다.
본원에 인용된 모든 특허 및 참고문헌을 전체로서 참조로 명시적으로 인용하였다.
참고문헌
도서
간행물
특허

Claims (60)

  1. 서로에 대해 고착된 위치에서 서로 부착된 다수의 섬유를 포함하는 섬유 다발로서, 섬유가 상이한 섬유내 또는 섬유상에 고정된 상이한 관심있는 작용제를 갖는 섬유 다발.
  2. 제 1항에 있어서, 100개 이상의 상이한 섬유를 포함함을 특징으로 하는 섬유 다발.
  3. 제 1항에 있어서, 관심있는 작용제가 미생물, 리간드, 항체, 항원, 핵산, 다당류, 수용체, 식물 세포 또는 동물 세포, 세포소기관 및 이들의 분획물로부터 선택됨을 특징으로 하는 섬유 다발.
  4. 제 1항에 있어서, 관심있는 작용제를 고정시키는 다수의 고상을 추가로 포함하며, 고상이 섬유내 또는 섬유상에 고정됨을 특징으로 하는 섬유 다발.
  5. 제 4항에 있어서, 고상이 섬유내에 임베딩된(embedded) 입자형 또는 실형(thread-like) 구조임을 특징으로 하는 섬유 다발.
  6. 제 1항에 있어서, 섬유의 전부 또는 대부분이 상이한 고정된 관심있는 작용제를 함유함을 특징으로 하는 섬유 다발.
  7. 제 1항에 있어서, 하나 이상의 섬유가 염료를 함유함을 특징으로 하는 섬유 다발.
  8. 제 1항에 있어서, 상이한 섬유가 상이한 농도의 관심있는 작용제를 함유함을 특징으로 하는 섬유 다발.
  9. 제 1항에 있어서, 각각의 섬유가 하나의 고정된 관심있는 작용제만를 함유함을 특징으로 하는 섬유 다발.
  10. a) 상이한 섬유내 또는 섬유상에 상이한 관심있는 작용제를 고정시키고,
    b) 섬유들을 섬유 다발로 정렬시키고,
    c) 섬유 다발내의 섬유들의 배열을 고정시키는 것을 포함하여 제 1항에 따른 다발을 형성시키는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 고정시키는 단계가 액체중에 관심있는 작용제를 혼합시키고 액체를 고형화시켜 섬유를 형성시키는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 관심있는 작용제의 액체 혼합물이 섬유로 주조됨을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 11항에 있어서, 액체가 중합체 겔화 물질을 함유함을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 11항에 있어서, 액체가 중합될 수 있는 단량체를 함유함을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 10항에 있어서, 고정시키는 단계가 관심있는 작용제를 사전형성된 섬유에 고정시키는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1항에 따른 섬유 다발을 형성시키고 서로에 대해 고착된 위치가 유지되도록 섬유 다발을 가로로 절단하거나 임의의 각으로 절단하여 절편을 형성시키는 것을 포함하여 어레이를 제작하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 고체 지지물에 절편을 마운팅(mounting)하여 어레이를 형성시키는 것을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 16항에 있어서, 절편의 두께가 1 cm 미만임을 특징으로 하는 방법.
  19. 어레이상의 공지된 위치에 다수의 셀(cell)을 포함하는 어레이로서, 각각의 셀이 섬유의 일부 또는 전부내에 또는 섬유의 일부 또는 전부상에 고정된 관심있는 작용제를 함유하고, 여기서, 상이한 셀들은 섬유의 부분내에 또는 부분상에 고정된 상이한 관심있는 작용제를 함유하는 상이한 섬유 또는 섬유의 부분을 함유하고, 각각의 관심있는 작용제가 공지된 셀에 위치된 어레이.
  20. 제 19항에 있어서, 어레이가 섬유로부터 절편을 절단함으로써 제조된 각각의 섬유의 부분을 함유함을 특징으로 하는 어레이.
  21. 제 20항에 있어서, 셀이 각각 하나의 웰 또는 채널을 함유함을 특징으로 하는 어레이.
  22. 제 16항의 방법에 의해 제작된 어레이.
  23. 제 17항의 방법에 의해 제작된 어레이.
  24. 제 18항의 방법에 의해 제작된 어레이.
  25. 피분석물이 관심있는 작용제에 결합되는 조건하에서 피분석물을 함유하는 것으로 생각되는 샘플을 제 19항에 따른 어레이와 접촉시키고, 피분석물과 어레이의각각의 셀 사이의 결합의 존재 또는 부재를 검출하고, 어레이의 소정의 셀에서 검출되는 임의의 결합의 존재에 의해 피분석물의 존재 또는 부재를 결정하는 것을 포함하여, 어레이에서 하나 이상의 관심있는 작용제에 결합하는 샘플중의 피분석물을 검출하기 위한 결합 검정법.
  26. 제 25항에 있어서, 관심있는 작용제에 결합된 피분석물을 갖는 셀 또는 이렇게 결합된 피분석물을 갖지 않는 셀에 결합할 수 있는 표지된 검출제를 첨가하고(둘 모두 아닌 경우는 제외), 어레이의 하나 이상의 셀에서 표지된 검출제의 존재를 검출하는 것을 추가로 포함함을 특징으로 하는 결합 검정법.
  27. 피분석물이 관심있는 작용제에 결합되는 조건하에서 피분석물을 함유하는 것으로 생각되는 샘플을 제 22항에 따른 어레이와 접촉시키고, 피분석물과 어레이의 각각의 셀 사이의 결합의 존재 또는 부재를 검출하고, 어레이의 소정의 셀에서 검출되는 임의의 결합의 존재에 의해 피분석물의 존재 또는 부재를 결정하는 것을 포함하여, 어레이의 하나 이상의 관심있는 작용제에 결합하는 샘플중의 피분석물을 검출하기 위한 결합 검정법.
  28. 제 27항에 있어서, 관심있는 작용제에 결합된 피분석물을 갖는 셀 또는 이렇게 결합된 피분석물을 갖지 않는 셀에 결합될 수 있는 표지된 검출제를 첨가하고(둘 모두 아닌 경우는 제외), 어레이의 하나 이상의 셀에서 표지된 검출제의 존재를검출하는 것을 추가로 포함함을 특징으로 하는 결합 검정법.
  29. 다발의 한 쪽 말단에서 개별적으로 섬유를 조명하고, 다발의 다른 쪽 말단에서 신호의 위치를 광전자적으로 확인하는 것을 포함하여 제 1항에 따른 다발의 섬유가 정렬되었는지를 결정하는 방법.
  30. 고상 지지물 및 평방센티미터 당 약 500개 이상의 셀(여기서, 각각의 셀은 고상 지지물에 화학적으로 결합되지 않은 관심있는 작용제를 함유한다)을 포함하는 마이크로어레이.
  31. 제 30항에 있어서, 평방센티미터 당 약 1,000개 이상의 셀을 함유함을 특징으로 하는 마이크로어레이.
  32. 고상 지지물 및 평방센티미터 당 약 500개 이상의 셀(여기서, 각각의 셀은 고분자, 미생물, 식물 세포 또는 동물 세포, 세포소기관 또는 생물학적 세포의 분획물인 관심있는 작용제를 함유한다)을 포함하는 마이크로어레이.
  33. 제 32항에 있어서, 평방센티미터 당 약 1,000개 이상의 셀을 함유함을 특징으로 하는 마이크로어레이.
  34. 고상 지지물 및 평방센티미터 당 약 500개 이상의 셀(여기서, 각각의 셀은 고상 지지물과 접촉되기 전에 합성된 관심있는 작용제를 함유한다)을 포함하는 마이크로어레이.
  35. 제 34항에 있어서, 평방센티미터 당 약 1,000개 이상의 셀을 함유함을 특징으로 하는 마이크로어레이.
  36. 고상 지지물 및 평방센티미터 당 약 500개 이상의 상이한 셀(여기서, 각각의 셀은 고상 지지물에 부착된 고체 물질에 의해 형성되고 각각의 고체 물질은 관심있는 작용제를 함유한다)을 포함하는 마이크로어레이.
  37. 제 36항에 있어서, 평방센티미터 당 약 1,000개 이상의 셀을 함유함을 특징으로 하는 마이크로어레이.
  38. 평방센티미터 당 약 500개 이상의 웰을 함유하는 멀티웰 플레이트.
  39. 제 38항에 있어서, 웰의 벽이 웰의 베이스와는 이종인 물질로 제작됨을 특징으로 하는 멀티웰 플레이트.
  40. 관심있는 작용제에 결합된 고상에 스며든 가늘게 연장된 섬유.
  41. 임베딩 매질, 다공성 또는 중공(hollow) 고상 및 관심있는 작용제를 포함하는 고정된 관심있는 작용제를 함유하는 고상 제작물로서, 관심있는 작용제가 다공성 또는 중공 고상의 내부 표면상에 고정되고, 다공성 또는 중공 고상이 임베딩 매질에 임베딩되고, 내부 표면이 개개의 다공성 또는 중공 고상이 다수의 절편으로 절단되도록 절단됨으로써 제작물의 표면에 노출된 고상 제작물.
  42. 각각의 셀이 고상 지지물을 함유하는 다수의 상이한 셀, 다공성 입자의 내부 표면상에 고정된 관심있는 작용제를 함유하는 다공성 입자 및 특정 셀에서 고상 지지물에 입자를 부착시키기 위한 매질을 포함하는 마이크로어레이.
  43. 제 42항에 있어서, 다공성 입자가 절단되어 다공성 입자의 내부 표면상에 관심있는 작용제가 노출됨을 특징으로 하는 마이크로어레이.
  44. 검출가능한 수의 단일의 관심있는 작용제가 섬유 길이의 매 밀리미터마다 존재하도록 섬유상에 또는 섬유내에 고정된 관심있는 작용제를 갖는 연장된 섬유.
  45. 검출가능한 수의 관심있는 작용제를 함유하는 제 44항에 따른 섬유의 횡단절편.
  46. 서로에 대해 병렬배치로 고정되어 있는 제 44항에 따른 두 개 이상의 섬유 및 각각의 섬유가 상이한 관심있는 작용제를 함유하는 섬유내 또는 섬유상에 고정되어 있는 두 개 이상의 관심있는 작용제를 포함하는 섬유 구조물.
  47. 제 46항에 있어서, 두 개 이상의 섬유 각각이 하나의 관심있는 작용제를 함유하지만 그 밖의 관심있는 작용제는 포함하지 않음을 특징으로 하는 섬유 구조물.
  48. 제 46항에 있어서, 10개 이상의 상이한 섬유가 존재함을 특징으로 하는 섬유 구조물.
  49. 제 48항에 있어서, 각각의 섬유가 하나의 관심있는 작용제만을 함유하고, 실질적으로 그 밖의 관심있는 작용제를 포함하지 않음을 특징으로 하는 섬유 구조물.
  50. 제 46항에 있어서, 각각의 섬유가 다수의 관심있는 작용제의 혼합물을 함유하고 각각의 섬유가 다수의 상이한 관심있는 작용제의 상이한 혼합물을 함유함을 특징으로 하는 섬유 구조물.
  51. 두 개 이상의 섬유의 횡단절편을 포함하는 섬유 횡단절편 구조물로서, 각각의 섬유가 또 다른 섬유에 대해 병렬배치로 존재하고, 두 개 이상의 관심있는 작용제가 섬유내 또는 섬유상에 고정되어 있고, 여기서, 각각의 섬유는 상이한 관심있는 작용제를 함유하는 섬유 횡단절편 구조물.
  52. 제 51항에 있어서, 두 개 이상의 섬유 각각이 하나의 관심있는 작용제를 함유하지만 그 밖의 관심있는 작용제는 함유하지 않음을 특징으로 하는 섬유 횡단절편 구조물.
  53. 제 51항에 있어서, 10개 이상의 상이한 섬유가 존재함을 특징으로 하는 섬유 횡단절편 구조물.
  54. 제 53항에 있어서, 각각의 섬유가 하나의 관심있는 작용제만을 함유하고, 실질적으로 그 밖의 관심있는 작용제를 함유하지 않음을 특징으로 하는 섬유 횡단절편 구조물.
  55. 제 51항에 있어서, 각각의 섬유가 다수의 관심있는 작용제의 혼합물을 함유하고 각각의 섬유가 다수의 상이한 관심있는 작용제의 상이한 혼합물을 함유함을 특징으로 하는 섬유 횡단절편 구조물.
  56. 불활성 고체 지지물상의 고체 블록을 포함하는 마이크로어레이로서, 고체 블록이 블록의 표면에 노출된 다수의 셀을 함유하고, 여기서, 각각의 셀은 상이한 관심있는 작용제를 함유하며, 독립적으로 제작되어 불활성 고체 지지물상에 마운팅되기 전에 고체 블록내로 엠베딩된 마이크로어레이.
  57. 제 56항에 있어서, 블록의 두께가 50 ㎛ 미만임을 특징으로 하는 마이크로어레이.
  58. 제 57항에 있어서, 블록의 두께가 20 ㎛ 미만임을 특징으로 하는 마이크로어레이.
  59. 제 56항에 있어서, 블록이 100개 이상의 셀을 함유함을 특징으로 하는 마이크로어레이.
  60. 제 10항에 있어서, 섬유를 섬유 다발로 정렬시키기 전에 각각의 상이한 관심있는 작용제의 존재에 대해 각각의 섬유를 검정하는 것을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
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