DE10122836A1

DE10122836A1 - Faser, Faden und Verfahren zur Markierung und Identifizierung

Info

Publication number: DE10122836A1
Application number: DE10122836A
Authority: DE
Inventors: Hans Kosak
Original assignee: November AG Novus Medicatus Bertling Gesellschaft fuer Molekular Medizin
Current assignee: November AG Novus Medicatus Bertling Gesellschaft fuer Molekular Medizin
Priority date: 2001-05-11
Filing date: 2001-05-11
Publication date: 2002-11-28
Also published as: DE10292112D2; AU2002312885A1; WO2002093504A2; US20050214532A1; WO2002093504A3

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Faser zur Markierung und Identifizierung, wobei Nukleinsäuremoleküle (N) mit ihrem einen Ende an die Faseroberfläche gebunden sind und ihr anderes Ende frei ist, so daß an die Nukleinsäuremoleküle (N) komplementäre Nukleinsäuremoleküle (N') bindbar sind.

Description

Die Erfindung betrifft eine Faser zur Markierung und Identi fizierung von Objekten, einen Faden mit einer derartigen Fa ser, ein Verfahren zur Markierung und Identifizierung sowie ein Verfahren zur Herstellung von Mikroanordnungen von Nu kleinsäuren.

Es ist bekannt, Gegenstände mit Markierungen zu sichern, die erst unter Einsatz eines bestimmten Nachweisstoffes nachge wiesen werden können. Zweck dieser Markierungen ist es, die Echtheit eines Gegenstandes auf unwiderlegbare Weise festzu stellen. Voraussetzung dafür ist es, daß die Markierung nicht durch Dritte verändert oder beseitigt werden kann.

Aus EP 90 401 938.7 ist ein Verfahren zur verborgenen Sicher heitsmarkierung von Gegenständen bekannt, bei dem eine chemi sche Verbindung auf den Gegenstand aufgetragen wird. Als che mische Verbindung wird eine Nukleinsäure mit ausgewählter Se quenz vorgeschlagen, die in Lösung auf den Gegenstand aufge bracht wird. Die Nukleinsäure kann anschließend mit einem ge eigneten Nachweismittel nachgewiesen werden, wodurch der Ge genstand identifiziert wird. Dieses Verfahren hat jedoch den Nachteil, daß die aufgebrachten Nukleinsäuren in den Gegen stand inkorporiert werden, was insbesondere durch Imprägnie ren des Gegenstandes mit der Nukleinsäure-haltigen Lösung ge schehen soll. Das setzt jedoch voraus, daß der Gegenstand die Nukleinsäure aufnehmen kann. Alternativ wird vorgeschlagen, die Nukleinsäure auf einen Träger aus einem geeigneten Mate rial aufzutragen und diesen Träger dann in den Gegenstand zu inkorporieren. Das hat jedoch den Nachteil, daß es ver gleichsweise einfach möglich ist, den imprägnierten Träger und den Gegenstand voneinander zu trennen, wodurch eine Iden tifizierung des Gegenstandes verhindert wird. Grundlegender Nachteil beider Varianten ist es, daß eine durch Imprägnieren aufgebrachte Nukleinsäure beispielsweise durch Lösungsmittel entfernt werden kann.

Neben der Markierung von Gegenständen werden Nukleinsäuren in der Analytik und Diagnostik zum Nachweis komplementärer Mole küle als sogenannte Nukleinsäure-Mikroarrays eingesetzt. Nu kleinsäure-Mikroarrays sind Anordnungen von Nukleinsäuren auf einer Oberfläche, wobei jeweils eine bekannte Nukleinsäure an jeweils einer bekannten Position befestigt ist. Als Oberflä che werden überwiegend feste Glas- und Kunststoffoberflächen verwendet, wobei auch Membranen oder Partikel als Matrix die nen können. Die Nukleinsäuren werden durch eine Nukleinsäure synthese oder in Form eines Mikrotropfens auf die Oberfläche aufgetragen. Ein wesentliches Problem bei der Herstellung von Nukleinsäure-Mikroarrays ist das Aufbringen der Nukleinsäuren an definierten Orten, die einen definierten und kleinen Durchmesser von oft nur wenigen Mikrometern besitzen. Um die se Feinstrukturierung zu erreichen, werden aufwendige und teure Verfahren angewendet.

Aufgabe der Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen. Es sollen insbesondere eine Mög lichkeit zur sicheren und einfacheren Markierung und Identi fizierung von Objekten angegeben werden. Weiterhin soll ein Verfahren zur kostengünstigen und einfachen Herstellung von Mikroarrays angegeben werden.

Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1, 12, 16 und 19 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen der Erfindungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 11, 13 bis 15 sowie 17 und 18.

Nach Maßgabe der Erfindung ist eine Faser zur Markierung und Identifizierung vorgesehen, wobei Nukleinsäuremoleküle (N) mit ihrem einen Ende an die Faseroberfläche gebunden sind und ihr anderes Ende frei ist, so daß an die Nukleinsäuremoleküle (N) komplementäre Nukleinsäuremoleküle (N') bindbar sind.

Unter Nukleinsäuremolekülen im Sinne der vorliegenden Erfin dung werden organische Moleküle verstanden, die eine spezifi sche Affinität zu dazu komplementären organischen Molekülen aufweisen. Die spezifische Affinität bewirkt eine spezifische Bindung solcher Moleküle. Es kann sich z. B. um einen Strang einer DNA handeln, welcher mit einem komplementären Ge genstrang hybridisiert. Weitere geeignete Nukleinsäuremolekü le sind z. B. RNA, PNA, Proteine, Peptide, synthetische Olgi gonukleotide und dgl..

Die vorgeschlagene Faser ist wegen der daran gebundenen Nu kleinsäuremoleküle (N) zur sicheren Markierung und Identifi zierung geeignet. Die Nukleinsäuremoleküle (N) können in de finierten Positionen an die Faseroberfläche gebunden sein. Eine Bindung erfolgt vorzugsweise dort, wo die Faseroberflä che eine entsprechende funktionelle Gruppe aufweist. Die an die Faseroberfläche gebundenen Nukleinsäuremoleküle (N) kön nen mittels komplementärer Nukleinsäuremoleküle (N') spezi fisch nachgewiesen werden.

Die Faser kann grundsätzlich aus jedem faserförmigen Material gebildet sein. Vorteilhafterweise ist die Faser aus einem na türlichen oder synthetischen Polymer gebildet. Das natürliche Polymer ist zweckmäßigerweise aus der folgenden Gruppe ausge wählt: Cellulose, Chitin, Seide, Wolle, Baumwolle, Hanf, Flachs oder Derivate dieser Polymere. Das synthetische Poly mer ist zweckmäßigerweise aus der folgenden Gruppe ausge wählt: Nylon, Polypropylen, Polyvinylidenfluorid, Polycarbo nat, Polystyrol oder Derivate dieser Polymere.

Daneben kann die Faser auch aus anorganischen Materialien wie beispielsweise Glas, Quarz oder einem Metall, insbesondere Gold oder Platin, bestehen.

Die Art der Bindung der Nukleinsäuremoleküle (N) an die Fa seroberfläche hängt von der chemischen Natur des Fasermateri als und dem Verwendungszweck der Faser ab. Vorzugsweise sind die Nukleinsäuremoleküle (N) über eine definierte Bindung mit der Faser verbunden. Unter einer definierten Bindung wird in diesem Zusammenhang eine bekannte chemische Bindung verstan den. Undefinierte Bindungen, wie sie beispielsweise in UV- vernetzter DNA an Nylon vorkommt, sind demgegenüber Bindun gen, bei denen es nicht möglich ist, die Atome der Nuklein säuremoleküle anzugeben, von welchem aus die Bindung an die Faser erfolgt. Außerdem ist die Anzahl der Bindungen, mit de nen ein Nukleinsäuremolekül an die Faser gebunden ist, unbe kannt. Die Bindung der Nukleinsäuremoleküle (N) an die Faser über definierte Bindungen bietet den Vorteil, daß die Art der Bindung aller Nukleinsäuremoleküle an die Faser identisch ist. Die Nukleinsäuremoleküle (N) können an definierten Posi tionen mit der Faser verknüpft werden, so daß die durch die Bindung verursachte Änderung der Aktivität und der Zugäng lichkeit der Nukleinsäuremoleküle (N) gleich und bekannt ist.

Das Nukleinsäuremolekül (N) kann über eine kovalente Bindung an die Faseroberfläche gebunden sein. Der hohe Bindungs koeffizient einer kovalenten Bindung verhindert ein einfaches Entfernen der Nukleinsäure von der Faseroberfläche durch die Verwendung eines Lösungsmittels. Vorzugsweise ist das Nu kleinsäuremolekül (N) über eine Carboxy-, Phosphat-, Amino-, Thiol, Psoralen-, Cholesteryl- oder Digoxigeningruppe an die Faseroberfläche gebunden.

Alternativ kann das Nucleinsäuremolekül (N) über eine nicht kovalente Bindung wie eine Biotin/Spreptavidin-Bindung an die Faseroberfläche gebunden sein. Diese Art der Bindung ist auf grund ihrer hohen Affinitätskonstante besonders bevorzugt. Die Bindung kann selbst unter Verwendung einer starken Base wie Natronlauge nicht gelöst werden.

Die Bindung der Nukleinsäuremoleküle (N) an Quarz/Glas-Fasern kann über derivatisierte Silane erfolgen. Dazu wird die Fa seroberfläche silyliert. An Gold-Fasern können Nukleinsäure moleküle binden, die SH-Gruppen enthalten.

Nicht alle für eine Bindung mit einem Nukleinsäuremolekü le (N) geeigneten Oberflächengruppen der Faser müssen mit ei nem Nukleinsäuremolekül gesättigt sein. Die nach der Anbin dung der Nukleinsäuremoleküle an die Faseroberfläche verblei benden, freien funktionellen Gruppen können in diesem Zustand bleiben oder durch geeignete Reaktionen gesättigt werden. Freie Thiolgruppen können beispielsweise zu Disulfiden oxi diert oder mit niedermolekularen Stoffen wie Jodacetamid um gesetzt werden.

An die Faseroberfläche können Nukleinsäuremoleküle (N) mit jeweils derselben spezifischen Sequenz oder verschiedene Nu kleinsäuremoleküle (N), das heißt Nukleinsäuremoleküle mit unterschiedlicher Sequenz, gebunden sein. Darüber hinaus kön nen an die Faser weitere Nukleinsäuremoleküle mit unspezifi scher Sequenz gebunden sein. Werden Fasern eingesetzt, an de ren Oberfläche Nukleinsäuremoleküle mit unterschiedlicher Se quenz gebunden sind, sind die Nukleinsäuremoleküle vorzugs weise an definierte Bereiche der Faseroberfläche gebunden.

Der Durchmesser der Fasern kann 100 nm bis 100 µm betragen. Mit solchen Fasern können Fäden unter Einsatz bekannter Ver fahren hergestellt werden. Es ist allerdings auch möglich, das die Nukleinsäuremoleküle (N) erst nach der Herstellung des Fadens an die Faser gebunden werden. Das kann zweckmäßi gerweise durch chemische Synthese geschehen.

Der Faden kann zumindest eine weitere Faser umfassen. Der Zu sammenhalt der Fasern eines Fadens wird durch die geometri sche Anordnung der Fasern, beispielsweise Verdrillung, oder durch chemische Vernetzung der Fasern miteinander herge stellt. Mehrere physikalische Eigenschaften eines Fadens, beispielsweise Länge und Reißfestigkeit, sind größer als die einer Faser. Durch die geeignete Wahl bestimmter Parameter, beispielsweise Anzahl der Fasern pro Faden, Art der Verdril lung und/oder die Verwendung verschiedener Fasern, können die Eigenschaften des Fadens gezielt eingestellt werden. Der er findungsgemäße Faden kann aus Fasern unterschiedlicher Mate rialien gebildet sein. Darüber hinaus können neben nicht mit Nukleinsäuremolekülen modifizierten Fasern auch unterschied lich mit Nukleinsäuren modifizierte Fasern eingesetzt werden. Zweckmäßigerweise beträgt der Durchmesser des Fadens 1 µm bis 1 mm.

Die erfindungsgemäßen Fasern oder Fäden werden zweckmäßiger weise für Textilien verwendet. Die Textilien, die zumindest eine Faser, an deren Oberfläche Nukleinsäuremoleküle (N) ge bunden sind, oder einen Faden mit einer oder mehreren dieser Fasern enthalten, können dabei unterschiedlich mit Nuklein säuremolekülen modifizierte Fasern bzw. Fäden aufweisen. Zur Herstellung der Textilien werden bekannte Verfahren wie Spin nen, Weben, Stricken, Häkeln, Knoten, Knüpfen, Nähen oder Sticken verwendet. Die Nukleinsäure-modifizierten Fasern oder Fäden können dabei ein Muster in dem Textil bilden, das mit tels der komplementären Nukleinsäuremoleküle (N') nachweisbar ist. Dieses Muster kann beispielsweise als geometrisches Mu ster in Form eines Symbols oder eines Strichcodes ausgeführt sein.

Die Möglichkeit der Anbindung von komplementären Nukleinsäu remolekülen (N') an das freie Ende der Nukleinsäuremoleküle (N), die an die Faseroberfläche gebunden sind, kann zum Nach weis der Nukleinsäure-modifizierten Fasern verwendet werden. Ein Verfahren zur Markierung und Identifizierung von Objek ten, umfaßt folgende Schritte:

a) Das Objekt wird mit zumindest einer Faser, an dessen Ober fläche Nukleinsäuremoleküle (N) über eines ihrer Enden gebun den sind, oder einem Faden, der zumindest eine derartige Fa ser enthält, versehen,
b) die Nukleinsäure-modifizierte Faser oder der Faden werden mit einem Nachweisstoff in Kontakt gebracht, der zu den Nu kleinsäuremolekülen (N) komplementäre Nukleinsäuremoleküle (N') enthält, und
c) die Bindung der komplementären Nukleinsäuremoleküle (N') wird nachgewiesen.

Der Nachweis der an die Faseroberfläche gebundenen Nuklein säuremoleküle (N) kann mittels spezifischer Hybridisierung erfolgen. Dabei wird bei einer spezifischen Hybridisierung ein spezifisches Signal wie eine Farb- oder Fluoreszenzreak tion erzeugt. Beispielsweise können sogenannte "Molecular Be acons" verwendet werden, die jeweils spezifisch für eine ver wendete Sequenz der Nukleinsäuremoleküle sind und die ihre Fluoreszenz nach einer spezifischen Bindung mit einer komple mentären Nukleinsäure ändern. Auch andere zum Nachweis der Nukleinsäuremoleküle (N) im Rahmen der In-situ-Hybridisierung und des Southern- oder Northern-Blottings bekannte Verfahren können verwendet werden. Zu diesen Verfahren gehören Verfah ren, die eine Farbreaktion zur Folge haben. Beispielsweise kann die Hybridisierungsprobe direkt oder indirekt mit einem Enzym gekoppelt sein, das ein Substrat zu einem unlöslichen Farbstoff umsetzt. Dieser Farbstoff kann dann als Präzipitat am Ort der Hybridisierung nachgewiesen werden. Die spezifi sche Hybridisierung kann darüber hinaus auch mittels einer Hybridisierungsprobe nachgewiesen werden, die direkt oder in direkt an Partikel gebunden ist. Die Immobilisierung der Par tikel am Ort der Hybridisierung wird dann zum Nachweis der spezifischen Hybridisierung genutzt.

Die Fäden, die Nukleinsäure-modifizierte Fasern enthalten, können als Sicherheitsfäden verwendet werden. Durch den Ein bau verschiedener Nukleinsäuremoleküle an einer oder mehreren Fasern wird die unberechtigte Nachahmung oder eine Verfäl schung der Markierung erschwert. Zu diesem Zweck können auch unspezifische Nukleinsäuresequenzen an die Faseroberfläche gebunden werden, so daß ein unspezifischer Nukleinsäurenach weis nicht zur Offenbarung der spezifischen Markierung führt.

Die Sequenz der an den Sicherheitsfäden fixierten Nukleinsäu remoleküle sollte nur berechtigten Personen bekannt sein. Die Markierung von Objekten mit derartigen Sicherheitsfäden kann an einer bestimmten Position auf oder in dem Objekt erfolgen. Es kann zusätzlich über optische sichtbare Markierungen ver fügen.

Die Sicherheitsfäden ermöglichen es somit, Textilien wie ins besondere Kleidungsstücke fälschungssicher zu kennzeichnen. Dazu wird zweckmäßigerweise zumindest ein Sicherheitsfaden in das Etikett eingearbeitet, das an der Textilie befestigt wird.

Die Fasern oder Fäden können auch zur Erzeugung von Mikro anordnungen der an die Faseroberfläche gebundenen Nukleinsäu remoleküle (N) verwendet werden. Mit einem textilen Gewebe aus den Fasern oder Fäden kann eine geeignete Anordnung der Nukleinsäuremoleküle (N) erreicht werden. Diese Gewebe können somit als Nukleinsäure-Mikroarrays eingesetzt werden, die den Vorteil haben, das sie vergleichsweise einfach und kostengün stig herstellbar sind.

Zur Bildung einer Matrix in Form eines textilen Gewebes kön nen die Nukleinsäure-modifizierten Fasern oder Fäden durch textiltechnische Verfahren wie Weben, Stricken, Häkeln, Kno ten, Nähen oder Sticken verarbeitet werden.

Die Fasern oder Fäden können jedoch auch, ohne ein Gewebe zu bilden, in einer bestimmten Anordnung, beispielsweise bür stenförmig oder büschelartig, auf eine feste Matrix an defi nierten Positionen aufgebracht werden. Als Matrix kann zum Beispiel eine Kunststofffläche verwendet werden, durch die senkrecht zur Fläche an definierten Positionen Fasern oder Fäden gezogen sind.

Eine Nukleinsäure-Mikroanordnung wird somit durch Herstellen von Nukleinsäure-modifizierten Fasern oder Fäden durch Anbin den bestimmter Nukleinsäuremoleküle (N) an definierte Berei che der Faseroberflächen und Bilden einer Matrix unter Ver wendung dieser Nukleinsäure-modifizierten Fasern oder Fäden hergestellt. Die Fasern können mit unterschiedlichen Nuklein säuren in verschiedenen Bereichen modifiziert werden. Über dies können unterschiedlich mit Nukleinsäuren modifizierte Fasern verwendet werden. Die Nukleinsäure-modifizierten Fäden können unterschiedlich modifizierte Fasern und auch nicht mit Nukleinsäuren modifizierte Fasern umfassen. Die Fasern und Fäden weisen die obengenannten Eigenschaften auf.

Nachfolgend werden Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen

Fig. 1 eine gerichtete Bindung von Nukleinsäuremole külen (N) an Fasern,

Fig. 2 einen spezifischen Nachweis von Nukleinsäure molekülen (N) durch komplementäre Nukleinsäu remoleküle (N'),

Fig. 3 eine Herstellung einer Faser, an die an defi nierten Abschnitten unterschiedliche Nuklein säuremoleküle (N) gebunden sind,

Fig. 4 einen spezifischen Nachweis von unterschied lichen Nukleinsäuremolekülen (N) einer Faser durch komplementäre Nukleinsäuremoleküle (N'),

Fig. 5 eine Synthese von Nukleinsäuremolekülen (N) an einer Faser,

Fig. 6 eine parallele Synthese unterschiedlicher Nu kleinsäuremoleküle (N) an einer Faser,

Fig. 7a bis c eine parallele Herstellung von Nukleinsäure- Arrays auf planaren Trägermaterialien,

Fig. 8a bis c schematisch ein Verfahren zur Herstellung von nukleinsäure-modifizierten Fäden aus Fasern,

Fig. 9a bis c eine erste Ausführungsform einer Markierung mit Nukleinsäure-modifizierten Fäden,

Fig. 10a bis d einen Nachweis der in Fig. 9 gezeigten Mar kierung und

Fig. 11a bis b eine zweite Ausführungsform einer Markierung mit Nukleinsäure-modifizierten Fäden.

In Fig. 1 ist die gerichtete Bindung von Nukleinsäuren N an eine Faser F dargestellt. In einem ersten Schritt werden an der Oberfläche der Faser durch eine geeignete Aktivierung oder Reaktion Linker-Gruppen L erzeugt, die für eine Kopplung an aktivierte Nukleinsäuren N geeignet sind. Dieser Schritt ist nicht erforderlich, wenn die Faseroberfläche bereits ge eignete funktionelle Gruppen aufweist. Bei Woll- oder Seide fasern sind beispielsweise freie Cystein- oder Aminogruppen zur Kopplung aktivierter Nukleinsäuren N geeignet. Alternativ können SH-Gruppen in den Woll- oder Seideproteinen durch Re duktion von Disulfid-Gruppen erzeugt werden.

In einem zweiten Schritt werden an die freien Linker- Gruppen L der Faser F Nukleinsäuren N gebunden, wodurch die Nukleinsäure-modifizierte Faser FN erhalten wird. Zu diesem Zweck sind die Nukleinsäuren N mit Kopplungsgruppen K modifi ziert worden. Als Kopplungsgruppen K eignen sich beispiels weise freie SH- oder Aminogruppen. Nukleinsäuremoleküle mit derartigen Kopplungsgruppen K können durch Oligonukleotid- Synthese erhalten werden. Bevorzugt befindet sich die Kopp lungsgruppe K am 3'- oder 5'-Ende des Oligonukleotids, das heißt der Nukleinsäure N. Die endständige Position der Kopp lungsgruppe K ermöglicht eine gute Zugänglichkeit der Nu kleinsäure N bei einer Hybridisierung mit einem komplementä ren Gegenstrang. Die Bindung der Nukleinsäure N an die Fa ser F kann auch über homo- oder heterofunktionelle Crosslin ker erfolgen.

Eine Bindung an Cellulose-haltige Fasern kann durch Oxidation von Zuckern zu Aldehyden erfolgen. Die Aldehyde können mit Aminohaltigen Nukleinsäuren N kovalent zu Schiff'schen Basen verknüpft und anschließend zu Amiden reduziert werden.

Polycarbonat-Fasern können mittels Carbodiimid mit Amino haltigen Nukleinsäuren N verknüpft werden. Andere Kunststoffe wie Polypropylen können nach einer Aktivierung im Plasma ko valent mit Nukleinsäuren N verknüpft werden. Goldfäden können an Thiol-Gruppen-haltige Nukleinsäuren N gebunden werden. Glas- oder Quarzfasern können mittels Silanisierung aktiviert und anschließend mit den Nukleinsäuren N verbunden werden. Die Linker-Gruppe L kann auch über einen Spacer an die Faser gebunden werden. Als Spacer können Polyglycol, Polyimin, Dex tran, Polyether verwendet werden. Mit Hilfe der Spacer kann eine sterische Hinderung der Nukleinsäuren N bei einer Hybri disierung gemindert, eine bestimmte Oberflächenladung er zeugt, eine unspezifische Bindung an der Faser reduziert und die Anzahl der Kopplungsgruppen für die Nukleinsäuren N er höht werden.

In Fig. 2 ist der Nachweis der Nukleinsäuremoleküle N, die an die Faser F gebunden sind, durch Hybridisierung dargestellt. Dazu wird die Nukleinsäure-modifizierte Faser FN mit einer Nukleinsäure N' in Kontakt gebracht. Die Nukleinsäure N' be sitzt eine komplementäre Sequenz zu der Nukleinsäuren A, die an die Faser F gebunden ist. Die komplementäre Nukleinsäu re N' kann dabei eine Signalgruppe S aufweisen. Mittels der Signalgruppe S kann beispielsweise nach der Hybridisierung ein verändertes elektrisches oder optisches Signal erzeugt werden. Die Signalgruppe S kann ein Fluorophor, ein Antigen oder ein Enzym sein. Durch die Hybridisierung der Nukleinsäu re N' mit der Nukleinsäure N, die an die Faser F gebunden ist, wird die Signalgruppe S am Ort der Hybridisierung (Fig. 2 unten) fixiert und kann aufgrund ihrer Eigenschaften nachgewiesen werden.

In Fig. 3 ist die Herstellung einer Faser FN, an die an de finierten Abschnitten unterschiedliche Nukleinsäuren N1, N2, N3 gebunden sind, gezeigt. Eine Faser F, die Linker-Gruppen L aufweist, wird in räumlich getrennte Reaktionsbereiche RB1, RB2, RB3 unterteilt. Jeder Reaktionsbereich wird getrennt mit unterschiedlichen Nukleinsäuren N1, N2, N3 umgesetzt. Nach der Kopplung wird eine Faser FN1N2N3 erhalten, bei der an de finierten Abschnitten unterschiedliche Nukleinsäuren N1, N2, N3 gebunden sind.

Fig. 4 zeigt den spezifischen Nachweis von unterschiedlichen Nukleinsäuren N1, N2, N3, die an unterschiedliche Anschnitte einer Faser FN1N2N3 gebunden sind, durch Hybridisierung mit komplementären Nukleinsäuren N'1, N'2, N'3, wobei jede dieser Nukleinsäuren N' komplementär zu einer der gebundenen Nu kleinsäuren N1, N2, N3 ist. Dazu wird die Faser FN1N2N3 mit den Nukleinsäuren N'1, N'2, N'3 in Kontakt gebracht. Die spe zifische Hybridisierung kann anhand der Signalgruppen S1, S2, S3, die an die Nukleinsäuren N1, N2, N3 gebunden sind, nach gewiesen werden. Die Signalgruppen S1, S2, S3 können identi sche oder unterschiedliche Gruppen sein. Durch die Verwendung unterschiedlicher Signalgruppen, beispielsweise Fluorophore, können Muster auf der Faser erzeugt werden.

Fig. 5 stellt eine Synthese von Nukleinsäuren N an einer Fa ser F dar, wobei die Nukleinsäure N als Oligonukleotid aus einzelnen Nukleotiden synthetisiert wird. Eine Faser F wird kovalent mit Bildungsblöcken Ba für eine Anbindung weiterer Nukleotide versehen. In weiteren Schritten wird jeweils ein aktiviertes Nukleotid (b, c, d, e, f, g) an die bereits ge bundenen Nukleotide angefügt. Durch die Synthese wird eine Faser FBabcdefg, an der eine definierte Sequenz von Nukleoti den fixiert ist, erhalten.

Fig. 6 zeigt eine parallele Synthese unterschiedlicher Nu kleinsäuren N an einer Faser F. Dazu wird die Faser in Reak tionsbereiche RB1, RB2, RB3 aufgeteilt. Jeder Abschnitt wird getrennt mit unterschiedlichen aktivierten Bildungsblöcken Ba1, Ba2, Ba3 umgesetzt. In weiteren Schritten wird in jedem Reaktionsbereich jeweils ein aktiviertes Nukleotid (b, c, d, e, f, g) an das zuvor immobiliserte Nukleotid, angefügt. Durch die Synthese wird eine Faser FN1N2N3 erhalten, an der in definierten Abschnitten unterschiedliche Oligonukleotide N1, N2, N3 gebunden sind.

Fig. 7a bis c zeigen die parallele Herstellung von Nuklein säure-Arrays auf planaren Trägermaterialien M. Dazu wird eine Anzahl n von planaren Trägermaterialien M aufeinandergelegt (Fig. 7a). An definierten Positionen werden unterschiedliche Nukleinsäure-modifizierte Fäden FN1, FN2, FN3 in die Träger materialien M eingeführt, wobei de Fäden zwischen den Träger materialien M getrennt sind (Fig. 7b). Auf diese Weise wird ein Träger erhalten, auf denen an definierten Positionen Oli gonukleotide an Fäden fixiert sind.

Fig. 8a bis c zeigen schematisch ein Verfahren zur Herstel lung von Fäden Fd aus Fasern F. Die in Fig. 8a gezeigten Fa sern werden mit Nukleinsäuren N modifiziert, wodurch Fasern FN erhalten werden (Fig. 8b). Die Fasern FN werden in einer Spinnmaschine S zu Fäden Fd versponnen (Fig. 8c).

In Fig. 9a bis c ist eine erste Ausführungsform einer Markie rung 1 mit Nukleinsäure-modifizierten Fäden Fd dargestellt. Auf einen rechteckigen Grundkörper 2 sind vier parallele Nu kleinsäure-modifizierte Fäden Fd aufgebracht. Auf dem Grund körper 2 befindet sich weiterhin ein Saugkissen 2. Der Grund körper 2 wird von einer Matrix gebildet, die einen lateralen Fluß einer Flüssigkeit ermöglicht. Wird der Grundkörper 2 mit einer Flüssigkeit kontaktiert, so transportiert er die Flüs sigkeit zu den aufgebrachten Fäden Fd und dem Saugkissen 3. Der Grundkörper 2 kann demnach aus einem Gewebe, saugfähigem Papier oder Fließstoff gebildet sein, die zweckmäßigerweise auf einer flüssigkeitsundurchlässigen Kunststoffolie aufge bracht sind. Mit der Kunststoffolie wird der Austritt von Flüssigkeit in die Umgebung verhindert und die Markierung ge schützt. Eine klebende Kunststoffolie kann verwendet werden, um die Markierung 1 auf das zu kennzeichnende Objekt aufzu bringen.

Die Fäden Fd stehen in Kontakt mit dem Grundkörper 2, so daß ein Übertritt von Flüssigkeit, die auf den Grundkörper 2 auf gebracht wird, möglich ist. Das Saugkissen 3 nimmt den größ ten Teil der aufgebrachten Flüssigkeit auf, so daß in dem Grundkörper 1 nur ein minimaler Flüssigkeitsanteil verbleibt. Zu diesem Zweck ist das Saugkissen 3 aus einem Gewebe mit ho her Flüssigkeitsbindungskapazität gebildet.

Die Markierung 1 kann eine oder mehrere Nukleinsäure modifizierte Fäden Fd umfassen. An den Fäden Fd können Nu kleinsäuren N mit unterschiedlichen, aber bekannten Sequenzen gebunden sein. Darüber hinaus können unbekannte Stoffe wie beispielsweise zufallsgenerierte DNA gebunden sein, um die Analyse des Fadens zu erschweren. Dieser Faden bindet keine Nachweisflüssigkeit, so daß er zur Kontrolle der Nachweis flüssigkeit dient. Überdies können Fäden verwendet werden, die einen Stoff wie beispielsweise DEAE-Cellulose enthält, der unspezifisch Nukleinsäuren bindet. Dieser Faden, der jeg liche Nukleinsäuren N' bindet, dient zur Kontrolle der Nach weisflüssigkeit. Die Verwendung mehrerer Fäden Fd ermöglicht es, komplexe Markierungen zu bilden. Durch Verwendung mehre rer, unterschiedlich modifizierter Fäden Fd kann ein Muster gebildet werden, das nur offenbart wird, wenn alle Nuklein säuren an den Fäden Fd identifiziert werden. Die Fäden Fd können auch geometrische Muster bilden, beispielsweise Zah len, Buchstaben, Symbole Barcodes.

Fig. 9b zeigt die Markierung 1 mit einer Abdeckung 4. Die Ab deckung 4 besteht zweckmäßigerweise aus einem lichtundurch lässigen Material, das den Grundkörper 2 bedeckt und zwei Aussparungen 4.1 und 4.2 aufweist. Die Abdeckung 4 dient dem Schutz der Markierung 1 gegenüber mechanischer Beanspruchung, chemischer Beanspruchung oder Strahlung. Die erste Ausspa rung 4.1 zeigt den Ort an, den dem eine Nachweisflüssigkeit zum Zwecke der Offenbarung der Markierung 1 aufgetragen wird. Die Öffnung 4.1 kann mit einem Kunststoffilm verschlossen sein und nur dann geöffnet werden, wenn eine Identifizierung der Markierung 1 erfolgen soll. Der Verschluß dient dem Schutz der Öffnung 4.1 vor einer Verschmutzung z. B. durch Fett oder ähnlichen Stoffen, die das Fließverhalten des Grundkörpers 1 beeinträchtigen könnten. Die zweite Öff nung 4.2 stellt ein Sichtfenster dar, das den Blick auf die Fäden Fd ermöglicht. Das Sichtfenster kann zum Schutz der Markierungsfäden mit einer transparenten Folie verschlossen sein. Die Fäden Fd sind dann, wie in Fig. 9c dargestellt, durch das Sichtfenster 4.2 zu erkennen. Vor der Identifizie rung der Markierung 1 können die Fäden Fd für das Auge un sichtbar sein.

In Fig. 10a bis d ist die Verfahrensweise zum Nachweis der in Fig. 9 gezeigten Markierung 1 dargestellt, wobei die Markie rung 1 in Fig. 10a bis c zur besseren Veranschaulichung ohne Abdeckung dargestellt ist.

Wie in Fig. 10a dargestellt, wird zur Identifizierung der Markierung 1 durch die Öffnung 4.1 auf den Grundkörper 2 ein definiertes Volumen einer Nachweisflüssigkeit gegeben. Die Nachweisflüssigkeit enthält Nukleinsäuren N', die zu den Nu kleinsäuren N an den Fäden Fd komplementär sind. Die zum Nachweis verwendeten Nukleinsäuren N' können mittels Farb stoffmolekülen, Fluorogenen, Gold- oder Latex-Partikeln mar kiert sein, so daß der Nachweis einer spezifischen Hybridi sierung mit der fadengebundenen Nukleinsäure N erleichtert wird. Vorzugsweise hat die zum Nachweis verwendete einzel strängige Nukleinsäure eine Rückfaltung. Dies erhöht die Spe zifität der Hybridisierung.

In Fig. 10b ist der laterale Fluß der Nachweisflüssigkeit in Richtung des Saugkissens 3 durch einen Pfeil gekennzeichnet. Während des Flusses kommt die Nachweisflüssigkeit in Kontakt mit den Fäden Fd. Fig. 10c zeigt den Grundkörper nach Ende des lateralen Flusses. Der überwiegende Teil der Nachweisflüssig keit ist von dem Saugkissen 3 aufgenommen worden. Fäden Fd, die die Nukleinsäuren N' gebunden haben, sind durch die ver stärkten Linien dargestellt.

Fig. 10d zeigt die Markierung 1 mit Abdeckung 4 nach der Identifizierung der Markierung 1. Die dicker gezeichneten Fä den Fd zeigen den Nachweis der Markierung 1 an. Der Nachweis vorgang ist innerhalb einiger Sekunden bis Minuten abge schlossen. Bei einer Verwendung von farbigen Partikeln wie Gold-Partikeln, an die die Nukleinsäuren N' gebunden sind, ist zum Nachweis der Markierung nur das Auge und kein weite res Hilfsmittel wie z. B. ein photometrischer Detektor notwen dig. Damit kann auf giftige oder radioaktive Komponenten ver zichtet werden.

Fig. 11a bis b zeigt eine zweite Ausführungsform einer Mar kierung 1 mit Nukleinsäure-modifizierten Fäden Fd. In Fig. 11a sind auf einer Grundplatte 2 vier Nukleinsäure modifizierte Fäden Fd und ein Saugkissen 3 angeordnet. Auf der Grundplatte 2 ist eine Abdeckung 4 aufgebracht, die zwei Öffnungen 4.1, 4.2 aufweist (Fig. 11b). Die Aussparung 4.1 dient dem Auftragen der Nachweisflüssigkeit auf die Fäden Fd. Die Aussparung 4.2 dient der Beobachtung des Nachweises der Markierung 1. In dieser Ausformung dienen die Fäden selbst dem lateralen Fluß der Nachweisflüssigkeit.

Nachfolgend wird die Herstellung von Nukleinsäure-modifi zierten Fasern und deren Nachweis anhand eines Beispiels er läutert.

1. Aldehyd-Aktivierung von Cellulose-Fasern

100 mg gewaschene Baumwolle (Machery und Nagel) werden in 10 ml 100 mM NaJO₄ in PBS (pH 7,4) bei 37°C über Nacht inku biert. Das NaJO₄ wird durch fünfmaliges Waschen mit 10 ml PBS entfernt.

2. Bindung von Amino-Oligonukleotiden an Aldehyd-aktivierte Cellulose-Fasern

Zu der Aldehyd-aktivierten Baumwolle werden 10 µM syntheti sches Oligonukleotid N gegeben, das am 5'-Ende eine frei Ami nogruppe trägt. Die Mischung wird auf 20 mM Natriumcyanobor hydrid in einem Endvolumen von 2 ml gebracht und über Nacht bei Raumtemperatur unter Schwenken inkubiert. Zur Absättigung freier Aldehyd-Gruppen werden 2 ml 1 M TrisC1 (pH 8) zugefügt und weitere 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Zur Entfernung ungebundener Oligonukleotide wird die Baumwolle fünfmal mit 10 ml TBS gewaschen und 1 h in einer Elektrophoresekammer bei einer Spannung von 100 V in 10 mM Trisacetat, 1 mM EDTA (pH 8) inkubiert.

3. Hybridisierung von Oligonukleotiden an Cellulose-Fäden gebundene Oligonukleotide

Cellulose-Fäden mit gebundenen Oligonukleotiden N werden in 100 µl 10 mM TrisC1, 1 mM EDTA mit 1 µM Oligonukleotid N' bei 37°C 30 min inkubiert. Oligonukleotid N' besitzt die komple mentäre Sequenz zu Oligonukleotid N und ist mit einer Biotin gruppe am 5'-Ende markiert. Zur Entfernung ungebundener Oli gonukleotide wird die Baumwolle fünfmal mit 10 ml TBS gewa schen und 1 h in einer Elektrophoresekammer bei einer Span nung von 100 V in 10 mM Trisacetat, 1 mM EDTA (pH 8) inku biert.

4. Nachweis der Hybridisierung von gebundenen Oligonukleoti den N mit Oligonukleotiden N'

Cellulose-Fäden mit hybridisierten Oligonukleotiden werden mit Streptavidin-beschichteten, superparamagnetische Parti keln (Dynal) in 1 ml 10 mM TrisC1, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8) (TBST) bei Raumtemperatur 1 h unter Schwenken inkubiert. Ungebundene Partikel werden durch fünfmaliges Waschen mit 1 ml TBST unter zu Hilfenahme eines Magneten entfernt. Die Bindung der Partikel an den Fasern zeigt die Hybridisierung des Oligonukleotids N' an Oligonukleotid N an.

Bezugszeichenliste

1

Markierung

2

Grundkörper

3

Saugkissen

4

Abdeckung

4.1

,

4.2

Öffnungen in der Abdeckung
a, b, c, d, f, g Nukleotide
F Faser
FB_a

. . . FB_abcdefg

Faser, an die Nukleinsäuren N aus Nukleoti den synthesiert wurden
Fd Faden
FN Nukleinsäure-modifizierte Faser
K Kopplungsgruppe
L Linker-Gruppe
M Trägermaterial
N Nukleinsäure
N' Nukleinsäure, die zur Nukleinsäure N kom plementär ist
RB Reaktionsbereich
S Signalgruppe

Claims

1. Faser zur Markierung und Identifizierung, wobei Nuklein säuremoleküle (N) mit ihrem einen Ende an die Faseroberfläche gebunden sind und ihr anderes Ende frei ist, so daß an die Nukleinsäuremoleküle (N) komplementäre Nukleinsäuremoleküle (N') bindbar sind.

2. Faser nach Anspruch 1, wobei die Faser aus einem natür lichen Polymer gebildet ist.

3. Faser nach Anspruch 2, wobei das natürliche Polymer aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: Cellulose, Chitin, Sei de, Wolle, Baumwolle oder Derivate dieser Polymere.

4. Faser nach Anspruch 1, wobei die Faser aus einem synthe tischen Polymer gebildet ist.

5. Faser nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das synthetische Polymer aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: Nylon, Polypropylen, Polyvinylidenfluorid, Polycarbonat, Po lystyrol oder Derivate dieser Polymere.

6. Faser nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Nukleinsäuremolekül (N) über eine kovalente Bindung an die Faseroberfläche gebunden ist.

7. Faser nach Anspruch 6, wobei das Nukleinsäuremolekül (N) über eine Carboxy-, Phosphat-, Amino- oder Thiolgruppe an die Faseroberfläche gebunden ist.

8. Faser nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Nu kleinsäuremolekül (N) über eine Biotin/Spreptavidin-Bindung an die Faseroberfläche gebunden ist.

9. Faser nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei ver schiedene Nukleinsäuremoleküle (N) an die Faseroberfläche ge bunden sind.

10. Faser nach Anspruch 9, wobei die verschiedenen Nuklein säuremoleküle (N) an definierte Bereiche der Faseroberfläche gebunden sind.

11. Faser nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei deren Durchmesser 100 nm bis 100 µm beträgt.

12. Faden mit zumindest einer Faser nach einem der Ansprü che 1 bis 11.

13. Faden nach Anspruch 12, wobei er zumindest eine weitere Faser umfaßt.

14. Faden nach Anspruch 13, wobei die weitere Faser aus ei nem anderen Material bestehen und/oder eine andere Nuklein säure-modifizierte Faser ist.

15. Faden nach einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei dessen Durchmesser 1 µm bis 1 mm beträgt.

16. Textilie mit zumindest einer Faser oder einem Faden nach einem der Ansprüche 1 bis 15.

17. Textilie nach Anspruch 16, wobei sie unterschiedliche Nukleinsäure-modifizierte Fäden umfaßt.

18. Textilie nach einem der Ansprüche 16 oder 17, wobei nu kleinsäure-modifizierte Fäden ein Muster bilden, das mittels der komplementären Nukleinsäuremoleküle (N') nachweisbar ist.

19. Etikett für Textilien, wobei das Etikett zumindest eine Faser oder einen Faden nach einem der Ansprüche 1 bis 15 um faßt.

20. Etikett nach Anspruch 19, wobei es unterschiedliche Nu kleinsäure-modifizierte Fäden umfaßt.

21. Etikett nach einem der Ansprüche 19 oder 20, wobei die nukleinsäure-modifizierten Fäden ein Muster bilden, das mit tels der komplementären Nukleinsäuremoleküle (N') nachweisbar ist.

22. Verfahren zur Markierung und Identifizierung von Objek ten, wobei

a) das Objekt mit zumindest einer Faser oder einem Faden nach einem der vorstehenden Ansprüche 1 bis 15 versehen wird,
b) die Faser oder der Faden mit einem Nachweisstoff in Kon takt gebracht werden, der die komplementären Nukleinsäuremo leküle (N') enthält und
c) die Bindung der komplementären Nukleinsäuremoleküle (N') nachgewiesen wird.

23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei der Nachweis mittels spezifischer Hybridisierung erfolgt.

24. Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, wobei der Nachweis mittels molecular beacons erfolgt.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 24, wobei der Nachweis mittels enzymatischer Reaktion erfolgt.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 25, wobei der Nachweis mittels Mikropartikeln erfolgt.

27. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 26, wobei die Fasern oder Fäden ein Muster bilden, das durch den Nachweis stoff nachweisbar ist.

28. Verfahren nach Anspruch 27, wobei das Muster aus Fasern oder Fäden gebildet ist, die mit unterschiedlichen Nuklein säuremolekülen versehen sind.

29. Verfahren zur Herstellung einer Nukleinsäure- Mikroanordnung, umfassend die Schritte:

a) Herstellen von Nukleinsäure-modifzierten Fasern oder Fä den durch Anbinden von Nukleinsäuremolekülen (N) an definier te Bereiche der Faseroberflächen und
b) Bilden einer Matrix unter Verwendung der Nukleinsäure- modifizierten Fasern oder Fäden.

30. Verfahren nach Anspruch 29, wobei die Matrix durch tex tiltechnische Verarbeitung der Nukleinsäure-modifizierten Fa sern oder Fäden gebildet wird.

31. Verfahren nach Anspruch 30, wobei die Matrix durch We ben, Stricken, Häkeln, Knoten, Nähen oder Sticken gebildet wird.

32. Verfahren nach Anspruch 29, wobei die Matrix durch An ordnen der Fasern auf einer Grundplatte gebildet wird.

33. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 32, wobei die Nukleinsäure-modifizierten Fasern aus einem natürlichen Poly mer gebildet werden.

34. Verfahren nach Anspruch 33, wobei das natürliche Polymer aus der folgenden Gruppe ausgewählt wird: Cellulose, Chitin, Seide, Wolle, Baumwolle oder Derivate dieser Polymere.

35. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 33, wobei die Nukleinsäure-modifizierten Fasern aus einem synthetischen Po lymer gebildet werden.

36. Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß das synthetische Polymer aus der folgenden Gruppe ausgewählt wird: Nylon, Polypropylen, Polyvinylidenfluorid, Polycarbo nat, Polystyrol oder Derivate dieser Polymere.

37. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 36, wobei das Nukleinsäuremolekül (N) über eine kovalente Bindung an die Faseroberfläche gebunden wird.

38. Verfahren nach Anspruch 37, wobei das Nukleinsäuremole kül (N) über eine Carboxy-, Phosphat-, Amino- oder Thiolgrup pe an die Faseroberfläche gebunden wird.

39. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 36, wobei das Nukleinsäuremolekül (N) über eine Biotin/Spreptavidin-Bindung an die Faseroberfläche gebunden ist.

40. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 39, wobei ver schiedene Nukleinsäuremoleküle (N) an definierte Bereiche der Faseroberfläche gebunden sind.

41. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 40, wobei ver schiedene Nukleinsäure-modifizierte Fasern zur Bildung der Matrix verwendet werden.

42. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 41, wobei der Durchmesser der Nukleinsäure-modifizierten Fasern 100 nm bis 100 µm beträgt.

43. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 42, wobei die Nukleinsäure-modifizierten Fäden verschiedene Nukleinsäure modifizierte Fasern und/oder unmodifizierte Fasern umfassen.

44. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 43, wobei der Durchmesser der Nukleinsäure-modifizierten Fäden 1 µm bis 1 mm beträgt.