CN1148227A - 核酸密码分析技术应用于防伪的方法 - Google Patents

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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Abstract

本发明主要是脱氧核糖核酸(DNA)片段溶于溶液中并加到各种固相载体上，干燥后核酸片段就附着在载体上，作为防伪标记可直接标志在各种固态商品、物件或其包装物或附属物上。载体可使用各种有机的或无机的材料，由于该隐形密码源于自然界极其庞大的基因库，使防伪标记绝无可能仿制，其控测检验方法是采用核酸分子杂交探针法或聚合酶链反应专一引物法。

Description

核酸密码分析技术应用于防伪的方法
本发明是把核酸密码分析技术应用在商品或其他物件的隐形防伪标记上，属于密码术方法的技术领域。
传统的防伪标记大多是物理或化学性质的制品，如激光全息、光学变色膜、图象扰频、热变油墨、磁条、软件等。目前国际上开始出现用生物技术制作的防伪产品，这些产品主要采用抗原抗体反应原理，比一般的防伪产品和方法准确、灵敏。但抗原抗体是蛋白质，稳定性较差，尤其在高温环境中容易失活，从而将降低防伪的灵敏度和可靠性。此外，抗原抗体反应变化少，一旦知道其中一种成分，就容易被仿制。
本发明的目的就是在防伪的技术领域克服已有标记容易被仿制的缺陷，设计出将基因工程中的核酸密码分析技术应用于防伪的隐形标记方法。
本发明是基于基因工作原理，提出全新的隐形仿伪设计和技术，其核心是生物大分子—核酸。人们知道，一切生命的遗传物质(基因)都是核酸，也就是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)核酸由四种碱基交互排列组成，其排列组合的差异，形成地球上生命类型的多种多样。一条仅仅1000碱基对(1kb)的DNA即可能有10603种排列组合方式。现存自然界的生物种类(动植物和微生物)在一百万种以上，因此可以利用作防伪的天然生物基因多不胜数。每个物种基因组的长度一般均大于104至106kb。假若设定用1kb长度的核酸作防伪标记，则可供选择的核酸密码就有106×(104～106)＝1010～1012之多。因此，生物多样性为防伪技术提供了取之不尽的来源。利用DNA这样巨大的信息量可以有数以亿万计的密码可用于防伪设计。
本发明是将预先选定的某种核酸片(主要是DNA片段，因其非常稳定)，以一定量(可少到10-8克)溶于溶液中并加到各种固相载体上，待蒸发干燥后核酸片段即附着在载体上。固相载体可以是各种各样的材料，如各种天然或人造纤维制成的纸张或薄膜、多孔颗粒或粉末，天然或合成的皮革、塑料或各种有机或无机多聚体和树脂、固体石腊、天然或合成的无机物质如陶瓷、玻璃、水晶、金属、硅藻土等。各种油墨和涂料也可作为防伪核酸的载体。也可以溶液形式加入制品中或封桨附在制品的包装上。为了保护固相载体上作为防伪标志的核酸片段，在含有核酸片段的载体表面加上保护层。例如可用塑料薄膜，海藻糖等，制成的这种核酸隐形防伪标记可固定在商品或物件上或其包装物及附属物上。当需要检验时，将防伪标记取下，揭去保护层，用缓冲液溶解附着在载体上的核酸片段。检测人员已知检测商品或物件上核酸防伪标记的种类，就可用特定的核酸分子杂交或聚合酶链反应(PCR)特定引物进行探测。如能显出杂交信号或具有正确长度的PCR产生(PCR特定引物法)，即能判定检测商品或物件为真品，否则为假冒的伪品或膺品。利用核酸密码作隐形防伪标记有如下优点：
1、不可仿制性：首先核酸密码无色，肉眼难以看到，其次，密码来自自然界庞大的基因库，即使知道是基因的密码但不知是哪一种，仿冒者也无法破译和仿造。而对检验人员来说，只要以专用的分析方法测试，真伪则一目了然。
2、可靠性：只有按预定的核酸密码设计的探针或PCR引物进行检验，才有可能探测出密码的存在与密码的种类。所以核酸密码具有极高的专一性。
3、多样性：可以很容易设计出千万种核酸密码作为防伪标记，每种都有自身相应的探针和引物，互不通用。所以核酸密码可为多种多样的商品和物件分别提供独特的防伪标记体系。
4、稳定性：DNA密码稳定，特别是干燥的DNA存放经久，不易分解，适于一些长期保存物件的防伪。
5、广泛的适用性：核酸密码只需极微量(10-8～10-10克)存在于商品或物件中即可探测出来，因此适用于各类贵重的商品和物件。如科学仪器和家用电器；高档服装、家具及文体、文娱用品；高级烟酒、食品及营养品；农业和园艺的珍奇或重要种子；重要的证件和文件；经鉴定的珍贵文物和艺术品等等，几乎所有固态的物件上都可适用。
探测检验手段用来辨别物件的真伪是核酸密码防伪方法不可分割的技术内容。已如前述，本发明采用特定的核酸分子杂交法或聚合链反应(PCR)法进行探测检验。
本发明提供两张附图：图1为核酸分子杂交法检验DNA防伪标记真伪图，图中，A为空白(无DNA)；B为其他非特异DNA，10微克；C为CAT编码基因，0.02微克。图2为PCR法检验DNA防伪标记真伪图，图中，A为空白(无DNA模板)；B为非特异DNA，1微克；C为lambda嗜菌体DNA模板。
下面结合附图就核酸密码分析防伪技术提出两项较佳实施例。
实施例1
防伪标记是否可靠专一，取决于精确的辩伪检验方法。本实施例采用核酸分子杂交的方法。DNA是两条走向相反而盘绕在一起的核苷酸链，为双螺旋结构。两条核苷酸链之间依赖腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)以及鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)四种碱基上的氢键维系。因此，DNA-DNA或DNA-RNA链之间的结合即所谓的“分子杂交”，其稳定性完全取决于双链碱基之间严格的互补性。即A与T互补(在DNA-RNA杂交中为A与U(尿嘧啶)互补)，G与C互补。单链DNA或RNA分子探针，只与其同源互补的DNA链杂交。当在某防伪标记内加入某种特定的DNA片段时，在辩伪过程中将DNA从防伪标记上洗脱下来，用该种DNA探针探测检验即可辩出真伪。其具体操作步骤如下：
1、样品处理：从防伪标记脱DNA(约0.02微克)，浓缩后点在杂交用的硝基纤维素膜或尼龙膜上；
2、变性、中和：膜上的DNA经0.5mol/L氢氧化钠变性，再用1mol/L缓冲液中和；
3、固相杂交：经变性的DNA膜置于杂交液中，加入核酸探针(同位素探针或非同位素化学发光探针)，在65℃杂交液中4小时或过夜，再经过洗涤去除非特异结合的探针，最后用X光底片曝光；
4、鉴定：X光底片显影后，如在杂交膜点样的位置上存在显影斑点如图1(C)所示，即证明样品中含有预设的防伪DNA，若如图1(A，B)所示未出现斑点，则证明其为假冒的伪品或赝品。
实施例2
聚合酶链反应(PCR)特定的引物同样可以用来对核酸防伪标记的探测。PCR的原理为：在两个专一性引物的引导下，经耐热菌DNA聚合酶(Tag DNA polymerase)催化，沿着专一性DNA模板大量拷贝新生的DNA链，产生可用琼脂糖凝胶电泳分离，染色显示。PCR反应是由专一性的一个或一对引物、一个模板DNA组成。极微量的DNA模板置于防伪物件的标记上，探测检验时取下DNA并溶于一定量的缓冲液中，在加入其专一性引物和Tag DNA聚合酶及其他反应液后，用PCR仪进行扩增反应。DNA扩增反应是防伪技术的关键，能使DNA扩增的酶类和其他可以使DNA扩增的方法也可达到目的。反应结束，取出一部分反应液进行电泳分析。其产生应是一个预定大小的扩增DNA片段，可用琼脂糖凝胶电泳分离，然后用溴乙啶染色，紫外灯下观察和鉴定，其操作过程简述如下：
1、反应成分：(1)DNA模板(约0.01微克)，(2)一个或一个以上专一性引物，(3)Tag DNA聚合或其他DNA聚合酶；(4)四种脱氧核苷酸三磷酸(dATP，dTTP，dCTP和dGTP)，(5)反应缓冲液。
2、反应温度和程序：
94℃  10秒  60℃  30秒         或
94℃  60秒  55℃  60秒  72℃  120秒
重复20-30次，最后延伸10分钟。
3、电泳分离：取10微升反应液，置2％琼脂糖凝胶(含溴乙啶染料)中，用100V直流电压进行电泳，电泳后将琼脂糖凝胶取出，置于250-300nm波长紫外灯下观察并摄影。
4、鉴定：如图2(C)所示显示预定大小的DNA带，以此条状带是否存在以及大小是否正确来判别鉴定物件的真伪。图2(A，B)未显示条状带则可认定为伪品。
需要说明的是实施例2只是一个通例，不是固定的操作程序。实际操作中，常随DNA模板和引物设计上的不同而有所变化，否则不能达到预期结果。这种严格的操作条件对于防伪又极为有利，因防冒者不知反应条件，无从破译密码。

Claims (8)

1.一种应用生物技术的防伪密码的方法，其特征在于把核酸片段，主要是把脱氧核糖核酸(DNA)片段溶于溶液中并使其附着在固相载体上用来作为隐形防伪标记，检验其真伪的方法采用核酸分子探针法或聚合链反应(PCR)引物法。
2.根据权利要求1所述的防伪密码的方法，其特征在于核酸片段的固相载体可以是天然或人造纤维、纸张、薄膜、皮革、塑料、多孔颗粒、粉末、树脂、固体石蜡、陶瓷、玻璃等有机或无机的固态材料。
3.根据权利要求1或2所述的防伪密码的方法，其特征在于附着在固相载体上的隐形防伪标记可直接固定在任何固态的商品、物件或其包装物及附属物上。
4.根据权利要求3所述的防伪密码的方法，其特征在于含有核酸片段的载体表面可以加覆塑料薄膜或海藻糖等保护层。
5.根据权利要求1所述的防伪密码的方法，其特征在于防伪标记辨别的探测检验方法可以采用核酸分子探针法，其步骤依次是：样品处理，变性、中和，固相杂交，X光显影鉴定。
6.根据权利要求1或5所述的防伪密码的方法，其特征在于核酸分子杂交所用的探针可以用同位素标记物，也可以用其他类型非同位素标记物。
7.根据权利要求1所述的防伪密码的方法，其特征在于防伪标记辨别的探测检验方法也可以采用聚合酶链反应(PCR)引物法，探测检验时取下DNA并溶于一定量缓冲液中，在加入专一性引物和Tag DNA聚合酶或其他聚合酶及其他反应液，用PCR仪进行扩增反应，取出反应液进入电泳分析，然后用溴乙啶染色，在紫外光下观察辨别鉴定DNA产物是否存在及大小是否正确。
8.根据权利要求7所述的防伪密码的方法，其特征在于PCR反应所用的Tag DNA聚合酶，也可以是其他任何一种DNA聚合酶或使DNA扩增的任何技术。
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