CN1360055A - 一种利用pcr技术将核酸应用于仿伪的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新的将核酸应用于防伪的方法,将核酸制成防伪标记并利用聚合酶链式反应分析技术检测出真伪。本发明还公开了以此技术制作防伪标记的方法。本发明还公开了这种新方法的用途。

Description

一种利用PCR技术将核酸应用于仿伪的方法

本发明公开一种利用聚合酶链式反应分析技术将核酸应用于防伪的方法，属于生物防伪技术领域。

常用的防伪技术包括：激光全息防伪、磁性防伪、条形码防伪、荧光防伪、隐形防伪、核隐形防伪、等离子隐形防伪、紫外光防伪、喷码防伪、温致变防伪、计算机编码防伪等等。

传统的防伪标记大多是物理或化学性质的制品，如光学变色膜、图象扰频、热变油墨、磁条、软件等。

目前国际上开始将生物技术利用于防伪上，形成了多样的生物防伪技术和相应的生物防伪标记。这些防伪技术主要采用抗原抗体反应原理，比一般的防伪技术准确、灵敏。由于抗原抗体是蛋白质，稳定性较差，尤其在高温环境中容易失活，从而降低防伪的灵敏度和可靠性。此外，抗原抗体反应变化少，一旦知道其中一种成分，就容易被仿制。

本发明的一个目的是在生物防伪的技术领域克服已有标记容易被仿制的缺陷，设计出将聚合酶链式反应分析技术应用于防伪的方法。

本发明的另一个目的是提供一种新的防伪标记及检测其真伪的方法。

本发明提供了一种新的防伪技术和防伪标记，其核心是生物大分子——核酸。一切生命的基本遗传物质(基因)都是核酸，也就是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)核酸是由四种碱基交互排列组成，其排列组合的差异，形成地球上生命类型的多样性。一条含有1000个碱基对(1kb)的DNA链就可能有10⁶⁰³种排列组合方式。现在自然界的生物种类(动植物和微生物)在一百万种以上，因此可以利用作防伪的天然生物基因数不胜数。每个物种基因级的长度一般均大于10⁴至10⁶kb。假若设定用1kb长度的核酸作防伪标记，则可供选择的核酸密码就有10⁵×(10⁴--10⁶)＝10¹⁰--10¹²之多。因此核酸中所包含的的海量信息为防伪技术提供了取之不尽的来源。利用核酸密码序列这样巨大的信息量可以有数以亿万计的密码可用于防伪标记。

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)的原理为：聚合酶链式反应用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。在由DNA聚合酶催化的一系列合成反应中，使用了两段寡聚核苷酸作为反应的引物。一般情况下，这两段寡聚核苷酸引物的序列互不相同，并分别与模板DNA两条链上的各一段序列互补，而这两段模板序列又分别位于待扩增DNA区段的两侧。反应时，首先在摩尔数大大过量的两段寡聚核苷酸及4种dNTP参与下对模板DNA进行加热变性。随之，将反应混合液冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火。此后退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。如此反复进行变性、退火和DNA合成这一循环。由于一轮扩增的产物又充当下一轮扩增的模板，所以在这一周而复始的过程中每完成一个循环，就基本上使目的DNA产物增加1倍。

本发明是将筛选的一段核酸(可以是DNA，或是RNA)，以一定量(可少到10^-8克)固定到固相载体上。固相载体可以是各种各样的材料，如各种天然或人造纤维制成的纸张或薄膜、多孔颗粒或粉末，天然或合成的皮革、塑料或各种有机或无机多聚体和树脂、固体石腊、天然或合成的无机物质如陶瓷、玻璃、水晶、金属、硅藻土等。各种油墨和涂料也可作为防伪核酸的载体。

为了达到保护固相载体上作为防伪标记的核酸的目的，可以在含有核酸的固相载体表面加上保护层，例如可用塑料薄膜，海藻糖等制成保护层。这种核酸防伪标记可固定在商品或物件上或其包装物及附属物上。

当需要检验辨别真伪时，将本发明的防伪标记揭去保护层，用缓冲液溶解附着在载体上的核酸片段。检测人员已知检测商品或物件上核算防伪标记的种类，就可用特定的核酸分子杂交或聚合酶链式反应(PCR)特定引物进行探测。如能显出杂交信号或具有正确长度的PCR产生(PCR特定引物法)，即能判定检测商品或物件为真品，否则为假冒的伪品或赝品。

利用核酸制作防伪标记有如下优点：

1.不可仿制性：首先核酸密码无色，肉眼难以看到，其次，密码来自自然界庞大的基因库，即使知道是基因的密码但不知是哪一种，仿冒者也无法破译和仿造。而对检验人员来说，只要以专用的分析方法测试，真伪则一目了然。

2.可靠性：只有按预定的核酸密码设计的探针或PCR引物进行检验，才有可能探测出密码的存在与密码的种类，所以核酸密码具有极高的专一性。

3.多样性：可以很容易设计出千万种核酸密码作为防伪标记，每种都有自身相应的探针和引物，互不通用。所以核酸密码可为多种多样的商品和物件分别提供独特的防伪标记体系。

4.稳定性：核酸(特别是DNA)稳定，特别是干燥的DNA存放经久，不易分解，适于一些长期保存物件的防伪。

5.广泛的适用性：核酸密码只需极微量(10^-8-10^-10克)存在于商品或物件中即可探测出来，因此适用于种类贵重的商品和物件。如科学仪器和家用电器；高档服装、家具及文体、文娱用品；高级烟酒、食品及营养品；农业和园艺的珍奇或重要种子；重要的证件和文件；经鉴定的珍贵文物和艺术品等等，几乎所有固态的物件上都可适用。

本发明提供一张附图：图1为聚合酶链式反应法检测DNA防伪标记真伪图，图中，A为空白(无DNA模板)；B为非特异性DNA，1微克；C为lambda噬菌体DNA模板。

下面结合附图就利用聚合酶链式反应分析技术将核酸应用于防伪提出一项实施例。

实施例

聚合酶链式反应(PCR)特定的引物同样可以用来对核酸防伪标记的探测。PCR的原理为：在两个专一性引物的引导下，经耐热菌DNA聚合酶(Tag DNA polymerase)催化，沿着专一性DNA模板大量拷贝新生的DNA链，产生可用琼脂糖凝胶电泳分离，染色显示。PCR反应是由专一性的一个或一对引物、一个模板DNA组成。极微量的DNA模板置于防伪防伪物件的标记上，探测检验时取下DNA并溶于一定量的缓冲液中，在假如其专一DNA扩增引物和Tag DNA聚合酶及其他反应液后，用PCR仪进行扩增反应。DNA扩增反应是防伪技术的关键，能使DNA扩增可酶类和其他可是使DNA扩增的方法也可达到目的。反映结束，取出一部分反应液进行电泳分析。其反映应是一个预定大小的扩增DNA片段，可用琼脂糖凝胶电泳分离，然后用溴乙啶染色，紫外灯下观察和鉴定，其操作过程简述如下：

1、反应成分：(1)DNA模板(约0.01微克)，(2)一个或一个以上专一性产物，(3)Tag DNA聚合或其他DNA聚合酶；(4)四种脱氧核苷酸三磷酸(dATP，dTTP，dCTP和dGTP)，(5)反应缓冲液。

2、反应温度和程序：

94℃-10秒 50℃-30秒 或 94℃-60秒 55℃-60秒 72℃-120秒

重复20-30次，最后延伸10分钟。

3、电泳分离：取10微升反应液，置2％琼脂糖凝胶(含溴乙啶染料)中，用100V直流电压进行电泳，电泳后将琼脂糖凝胶取出，置于250-300nm波长紫外灯下观察并摄影。

4、鉴定：如图1(C)所示显示预定大小的DNA带，以次条状带是否存在以及大小是否正确来判别鉴定物件的真伪。图2(A，B)未显示条状带则可认定为伪品。

需要说明的是实施例只是通例，不是固定的操作程序。实际操作中，常随DNA模板和引物设计上的不同而有所变化，否则不能达到预期结果。这种严格的操作条件对于防伪又极为有利，因防冒者不知反应条件，无从破译密码。

Claims (9)

1.一种利用聚合酶链式反应分析技术将核酸应用于防伪的方法，其特征在于将核酸或其片断，固定在固相载体上用来作为防伪标记，利用聚合酶链式反应分析技术检验真伪。

2.如权利要求1所述的防伪标记，其特征在于所述的防伪标记可直接固定在任何固态的物体上。

3.如权利要求1所述的防伪标记，其特征在于所述的防伪标记可以加覆塑料薄膜或海藻糖等保护层。

4.如权利要求1所述的固相载体，其特征在于所述的固相载体可以是天然或人造纤维、纸张、薄膜、皮革、塑料、多孔颗粒、粉末、树脂、固体石腊、陶瓷、玻璃等有机或无机的固态材料。

5.根据权利要求1所述的防伪方法，其特征在于防伪标记辨别的探测检验方法可以采用核酸分子探针法，其步骤依次是：样品处理，变性、中和，固相杂交，X光显影鉴定。

6.根据权利要求1或5所述的防伪方法，其特征在于核酸分子杂交所用的探针可以用同位素标记物，也可以用其他类型非同位素标记物。

7.根据权利要求1所述的防伪方法，其特征在于防伪标记辨别的探测检验方法也可以采用聚合酶链式反应(PCR)引物法，探测检验时取下DNA并溶于一定量缓冲液中，在加入专一性引物和TagDNA聚合酶或其他聚合酶及其他反应液，用PCR仪进行扩增反应，取出反应液进入电泳分析，然后用溴乙啶染色，在紫外光下观察辨别鉴定DNA产物是否在及大小是否正确。

8.根据权利要求7所述的防伪方法，其特征在于PCR反应所用的TagDNA聚合酶，也可以是其他任何一种DNA聚合酶或使DNA扩增的任何技术。

9.如权利要求1所述的检验防伪标记真伪的方法，其特征在于根据防伪标记上核酸的聚合酶链式反应分析结果与已知的聚合酶链式反应结果比较，即能判定防伪标记的真假。